JP2014031339A - StAR EXPRESSION INHIBITOR - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、皮脂分泌抑制効果を奏するＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制等に関する。 The present invention relates to a StAR expression inhibitor exhibiting a sebum secretion inhibitory effect, a sebum secretion inhibitor, and the like.
皮膚や頭皮の皮脂腺から分泌される皮脂は、皮膚や毛髪の保護のために重要であり、皮膚の水分維持に寄与し、また細菌感染を防ぐ役割も果たしている。しかし、過剰な皮脂分泌は、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭いなどの原因となる。
皮脂の分泌に影響を与える主な因子として、アンドロゲンやエストロゲン等のステロイドホルモン関連因子、ＰＰＡＲ等の核内受容体、サブスタンスＰ等の神経ペプチド等が知られているが、中でも皮脂腺細胞ではアンドロゲン合成系が活発に働いていることが報告されており(非特許文献１)、ステロイドホルモン関連因子との関係は重要視されている。
Sebum secreted from the sebaceous glands of the skin and scalp is important for the protection of the skin and hair, contributes to maintaining moisture in the skin, and also plays a role in preventing bacterial infection. However, excessive sebum secretion causes seborrheic dermatitis, acne, rosacea (red face), dandruff, hair loss, and even odor.
As main factors affecting the secretion of sebum, steroid hormone-related factors such as androgens and estrogens, nuclear receptors such as PPAR, neuropeptides such as substance P, etc. are known. It has been reported that the system works actively (Non-patent Document 1), and the relationship with steroid hormone-related factors is regarded as important.
一方、ＳｔＡＲ（steroidogenic acute regulatory protein）は、ステロイドホルモン合成の律速段階にあたるステップに関わる因子として知られ（非特許文献２）、ＳｔＡＲによりコレステロールのミトコンドリア外膜から内膜への移行が促進され、ミトコンドリア内膜に存在するＣＹＰ１１Ａ１によりコレステロールはプレグネノロン（pregnenorone）に転換され、アンドロゲン、エストロゲン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドといった以後のステロイド合成が行われることが明らかにされている。 On the other hand, StAR (steroidogenic acute regulatory protein) is known as a factor involved in the rate-limiting step of steroid hormone synthesis (Non-patent Document 2), and StAR promotes the transition of cholesterol from the outer mitochondrial membrane to the inner membrane. It has been clarified that CYP11A1 present in the inner membrane converts cholesterol into pregnenorone, and subsequent steroid synthesis such as androgen, estrogen, glucocorticoid, mineral corticoid is performed.
また、ＳｔＡＲのノックアウトマウスでは、血中のステロイドホルモン濃度が著しく低下しており、生後間もなく副腎皮質不全で死亡することが報告され（非特許文献３）、さらに、アンドロゲンの合成器官である精巣のライディッヒ細胞においても、ＳｔＡＲがテストステロンの合成に中心的な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献４）。また最近、本発明者らは、皮膚におけるＳｔＡＲの発現量が、皮膚組織中のテストステロン濃度と正相関することを報告している（非特許文献５）
したがって、ＳｔＡＲの発現を制御することによって、テストステロンの合成量を制御することが可能であると考えられ、ＳｔＡＲの発現の抑制は、皮脂分泌の抑制、毛髪や体毛の伸長を制御可能であると考えられる。
In addition, in StAR knockout mice, blood steroid hormone levels are significantly reduced, and it has been reported that death occurs soon after birth due to adrenal cortical insufficiency (Non-patent Document 3). Also in Leydig cells, it has been reported that StAR plays a central role in testosterone synthesis (Non-patent Document 4). Recently, the present inventors have reported that the expression level of StAR in the skin is positively correlated with the testosterone concentration in the skin tissue (Non-patent Document 5).
Therefore, it is considered that the amount of testosterone synthesized can be controlled by controlling the expression of StAR, and the suppression of StAR expression can control the sebum secretion and the elongation of hair and body hair. Conceivable.
ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）は、ゴマノハグサ科の植物で、鼻炎、結膜炎、やけど等の治療に用いられており、ラクンタイ（Ｃｒｉｎｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ Ｌ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍ Ｂａｋ．）は、ヒガンバナ科の植物で、皮膚潰瘍、捻挫、骨折等の治療に古くから使用され、最近では保湿効果、美白効果、中性脂肪蓄積抑制効果を有することが報告されている（特許文献１）。また、ハチセンカ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ）は、ユキノシタ科の植物で、抗マラリア作用等を有することが知られている。 Baotou (Paulonia fortunei (Seem.) Hemsl.) Is a plant belonging to the family Aceraceae and is used for the treatment of rhinitis, conjunctivitis, burns, etc. It has been used for a long time in the treatment of skin ulcers, sprains, fractures, etc. in plants, and recently it has been reported that it has a moisturizing effect, whitening effect, and neutral fat accumulation suppressing effect (Patent Document 1). Hachisenka (Hylangea macrophylla (Thunb.) Series) is a plant belonging to the family Chironomidae and is known to have an antimalarial action and the like.
しかしながら、これらの植物とＳｔＡＲの発現抑制、皮脂分泌抑制、育毛との関係については全く知られていない。 However, the relationship between these plants and StAR expression suppression, sebum secretion suppression, and hair growth is not known at all.
本発明は、ＳｔＡＲ発現を抑制し、皮脂の過剰分泌を抑制することが可能な、ＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制剤等を提供することに関する。 The present invention relates to providing a StAR expression inhibitor, a sebum secretion inhibitor and the like capable of suppressing StAR expression and suppressing excessive secretion of sebum.
本発明者は、皮脂分泌におけるＳｔＡＲの機能について、研究を進めた結果、ＳｔＡＲの発現を抑制することにより、皮脂の蓄積が有意に抑制されることを明らかにした（参考例１）。そして、ＳｔＡＲのプロモーター配列を利用した転写活性評価系を構築し、ＳｔＡＲの発現を抑制する素材について探索したところ、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカに優れたＳｔＡＲ発現抑制作用があり、これらが過度の皮脂分泌に起因する疾患や症状、頭髪に対する育毛等のために利用できることを見出した。 As a result of research on the function of StAR in sebum secretion, the present inventor has revealed that the accumulation of sebum is significantly suppressed by suppressing the expression of StAR (Reference Example 1). Then, when a transcriptional activity evaluation system using the StAR promoter sequence was constructed and a search was made for materials that suppress StAR expression, StAR expression was excellent in Baotou, Rakkuntai and Hachisenka, and these were excessive sebum secretion. It has been found that it can be used for diseases and symptoms caused by hair growth, hair growth for hair, etc.
すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）に係るものである。
（１）ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳｔＡＲ発現抑制剤。
（２）ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
（３）ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
（４）ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする育毛剤。
（５）ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするアンドロゲン合成抑制剤。
That is, the present invention relates to the following (1) to (5).
(1) A StAR expression inhibitor comprising as an active ingredient at least one plant selected from Baotou, Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof.
(2) A sebum secretion inhibitor comprising as an active ingredient at least one plant selected from Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof.
(3) An acne prevention or improvement agent comprising one or more plants selected from Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof as an active ingredient.
(4) A hair restorer comprising as an active ingredient at least one plant selected from Baotou and Hachisenka or an extract thereof.
(5) An androgen synthesis inhibitor comprising one or more plants selected from Baotou, Rakkuntai, and Hachisenka as an active ingredient.
本発明のＳｔＡＲ発現抑制剤等は、ＳｔＡＲの発現抑制し、皮脂分泌抑制効果を発揮することから、過度の皮脂分泌に起因する、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭い（皮脂の臭い）などの予防又は改善、或いは頭髪（頭頂部）に対する育毛、男性型脱毛症の予防又は改善、体毛やひげなどに対する抑毛効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品、化粧品として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。 Since the StAR expression inhibitor of the present invention suppresses the expression of StAR and exhibits sebum secretion suppression effect, seborrheic dermatitis, acne, rosacea (red face), dandruff, caused by excessive sebum secretion, Pharmaceuticals and pharmaceutical departments that can exhibit hair loss, prevention or improvement of odor (smelling sebum), etc., or hair growth for head hair (top of head), prevention or improvement of androgenetic alopecia, hair removal effect on body hair, beard, etc. It is useful as an external product, cosmetic, or as a material or formulation for blending with these.
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。 In the present specification, “non-therapeutic” is a concept that does not include a medical act, that is, a treatment act on the human body by treatment.
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。 As used herein, “improvement” refers to improvement of a disease, symptom or condition, prevention or delay of worsening of the disease, symptom or condition, or reversal, prevention or delay of progression of a disease or symptom.
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。 As used herein, “prevention” refers to preventing or delaying the onset of a disease or symptom in an individual, or reducing the risk of developing an individual's disease or symptom.
本明細書において、「ＳｔＡＲ発現抑制」とは、ＳｔＡＲ（steroidogenic acute regulatory protein）のｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現を抑制することを意味し、ＳｔＡＲのプロモーター活性を抑制することが包含される。 In the present specification, “StAR expression suppression” means suppression of StAR (steroidogenic acute regulatory protein) mRNA expression and protein expression, and includes suppression of StAR promoter activity.
本明細書において、ホウトウとは、ゴマノハグサ科キリ属のＰａｕｌｏｗｎｉａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．（和名：ココノエギリ、キリ）を指し、ラクンタイとは、ヒガンバナ科ハマオモト属のＣｒｉｎｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ Ｌ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍ Ｂａｋ．（和名：ハマオモト）を指し、ハチセンカとは、ユキノシタ科アジサイ属のＨｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ（和名：アジサイ）を指す。 In this specification, Baotou refers to Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl. (Japanese name: Kokono Egiri, Kiri). Rakkuntai refers to Crimsia asiaticum L. var. sinicum Bak. (Japanese name: Hamamoto), Hachisenka refers to Hydrangea macrophylla (Thunb.) Series (Japanese name: Hydrangea) belonging to the genus Hydrangeaceae Hydrangea.
斯かる植物は、いずれの任意の部位、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実、菌核若しくは樹脂等、又はそれらの組み合わせを使用することができるが、ホウトウは花、ラクンタイは葉、ハチセンカは枝葉をそれぞれ用いるのが好ましい。
斯かる植物は、そのまま又は乾燥・粉砕等して用いることができる。また、上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。該抽出物は天然成分由来であり安全性も高い。
Such a plant can be any part, for example, whole grass, leaves, stems, buds, flowers, buds, wood parts, bark, lichens, roots, rhizomes, corms, corms, tubers, seeds, fruits, mycorrhiza or Resin or the like or a combination thereof can be used, but it is preferable to use flowers for Baotou, leaves for Rakuntai, and branch leaves for Hachisenka.
Such a plant can be used as it is or after being dried, ground or the like. Moreover, the said site | part may be attached | subjected to an extraction process as it is, or may be attached | subjected to an extraction process, after grind | pulverizing, cut | disconnecting, or drying. The extract is derived from natural ingredients and has high safety.
抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１００〜４００ｒ／ｍｉｎで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
Specific examples of the extraction means for obtaining the extract include solid-liquid extraction, liquid-liquid extraction, immersion, decoction, leaching, reflux extraction, ultrasonic extraction, microwave extraction, and stirring. In order to shorten the extraction time, solid-liquid extraction with stirring is desirable. Examples of suitable conditions for this solid-liquid extraction include stirring at 100 to 400 r / min for 1 to 30 minutes.
In order to prevent the oxidation of the extract, a means for extracting under a so-called non-oxidizing atmosphere while removing dissolved oxygen by bubbling degassing or inert gas such as nitrogen gas may be used in combination.
抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。 As the solvent for extraction, either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used. Specific examples of the solvent include water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; methyl acetate and ethyl acetate Esters; linear and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether; polyethers such as polyethylene glycol; hydrocarbons such as squalane, hexane, cyclohexane and petroleum ether; aromatic hydrocarbons such as toluene; dichloromethane and chloroform And halogenated hydrocarbons such as dichloroethane; and supercritical carbon dioxide; pyridines; organic solvents such as oils and fats, other oils such as wax; and mixtures thereof. Preferable examples include water, alcohols, alcohol-water mixtures and hydrocarbons, with alcohol-water mixtures and hydrocarbons being more preferred. As the alcohol, an alcohol having 1 to 5 carbon atoms is preferable, and ethanol is more preferable. Hexane is preferred as the hydrocarbon.
抽出のための溶剤としてアルコール−水混合液を使用する場合には、アルコール類と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０がさらに好ましく、３０〜７０：７０〜３０がさらにより好ましく、４０〜６０：６０〜４０がなお好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が４０〜６０容量％であることが好ましい。 When an alcohol-water mixture is used as a solvent for extraction, the blending ratio (volume ratio) of alcohols and water is preferably 0.001 to 100: 99.999-0, preferably 5 to 95. : 95-5 is more preferable, 20-80: 80-20 are more preferable, 30-70: 70-30 are still more preferable, 40-60: 60-40 are still more preferable. In the case of an ethanol aqueous solution, the ethanol concentration is preferably 40 to 60% by volume.
溶剤の使用量としては、それぞれの植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬ、更に８〜５０ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜３日間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。 As a usage-amount of a solvent, 1-100 mL with respect to 1 g of each plant (dry mass conversion), Furthermore, 8-50 mL is preferable, As extraction time, 1 minute-100 days are preferable, and 1 minute-3 days are more preferable. The extraction temperature at this time is 0 ° C. to the boiling point of the solvent, more preferably 20 to 100 ° C., and further preferably 40 to 90 ° C.
斯くして得られる植物抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
また、植物の抽出物は市販品を使用することもできる。
The plant extract thus obtained may be used as it is as the extract or fraction, may be used as a diluted solution diluted with an appropriate solvent, or may be a concentrated extract or dry powder, or prepared in a paste form. It may be a thing. Also, freeze-dry and dilute with a solvent usually used for extraction, such as water, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, water / ethanol mixture, water / propylene glycol mixture, water / butylene glycol mixture, etc. It can also be used. It can also be used by encapsulating in vesicles such as liposomes or microcapsules.
Moreover, the plant extract can also use a commercial item.
本発明の植物の抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。 The plant extract of the present invention may be a crude product as long as it conforms to food and pharmaceutical acceptable standards and exhibits the effects of the present invention, and the obtained crude product is publicly known. These separation and purification methods may be combined as appropriate to increase their purity. Examples of the purification means include organic solvent precipitation, centrifugation, ultrafiltration membrane, high performance liquid chromatograph, column chromatograph and the like.
後記実施例で示すとおり、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＳｔＡＲの発現を抑制する作用を有する（実施例１）。皮脂腺細胞において、ＳｔＡＲの遺伝子発現を抑制（ｓｉＲＮＡ）した場合、皮脂の蓄積は有意に抑制されることから（参考例１）、本発明の植物又はそれらの抽出物は、皮脂分泌抑制作用を有すると云え、実際に、ハムスター皮脂腺細胞において、皮脂蓄積量を抑制する作用を有することが確認された（実施例２）。
したがって、本発明の植物又はそれらの抽出物は、過度の皮脂分泌に起因する疾患や症状、例えば、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭いなどの予防又は改善に有効である。
また、皮膚におけるＳｔＡＲの発現量は、皮膚組織中のテストステロン濃度と正相関する（前記非特許文献３）。テストステロンは毛の伸長と密接に関与することが知られており(Dermatol. Ther. 2008; 21: 314-328. )、頭髪や体毛、ひげといった毛の成長を制御する（Mol Cell Endocrinol (2002) 198, 89-95）。また、本発明者らは、ＳｔＡＲの発現量が異なる頭頂部と側頭部の頭皮における毛の密度が、ＳｔＡＲの発現が高い部位（頭頂部）では低いことを明らかにしている（参考例２）。
したがって、ＳｔＡＲの発現を抑制することによってテストステロンの生合成を抑制でき、当該毛の成長を制御できると考えられる。すなわち、ＳｔＡＲの発現抑制作用を有する本発明の植物又はそれらの抽出物は、テストステロン合成抑制剤ともなり得、頭髪（頭頂部）に対する育毛、男性型脱毛症の予防又は改善、体毛、ひげなどに対する抑毛等の効果を有すると考えられる。
As shown in Examples below, the plant of the present invention or an extract thereof has an action of suppressing the expression of StAR (Example 1). In the sebaceous gland cells, when StAR gene expression is suppressed (siRNA), the accumulation of sebum is significantly suppressed (Reference Example 1). Therefore, the plant of the present invention or an extract thereof has a sebum secretion inhibitory action. However, it was actually confirmed that hamster sebaceous gland cells have an action of suppressing the sebum accumulation amount (Example 2).
Therefore, the plant of the present invention or an extract thereof prevents diseases and symptoms caused by excessive sebum secretion, such as seborrheic dermatitis, acne, rosacea (red face), dandruff, hair loss, and further smell. Or it is effective for improvement.
Moreover, the expression level of StAR in the skin has a positive correlation with the testosterone concentration in the skin tissue (Non-patent Document 3). Testosterone is known to be closely involved in hair elongation (Dermatol. Ther. 2008; 21: 314-328.) And controls hair growth such as head hair, body hair, and beard (Mol Cell Endocrinol (2002) 198, 89-95). In addition, the present inventors have clarified that the hair density in the scalp of the parietal region and the temporal region where the expression level of StAR is different is low at the site where the expression of StAR is high (parietal region) (Reference Example 2). ).
Therefore, it is considered that by suppressing the expression of StAR, the biosynthesis of testosterone can be suppressed and the hair growth can be controlled. That is, the plant of the present invention having an action of suppressing the expression of StAR or an extract thereof can also be a testosterone synthesis inhibitor, and is used for hair growth on the hair (the top of the head), prevention or improvement of male pattern baldness, body hair, whiskers, etc. It is thought that it has effects such as hair-loss
以上より、本発明の植物又はその抽出物は、ＳｔＡＲの発現抑制のために、或いは皮脂分泌抑制のために、或いはニキビの予防又は改善のために、或いは育毛のために、或いはテストステロン合成抑制のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。 As described above, the plant of the present invention or the extract thereof can suppress StAR expression, suppress sebum secretion, prevent or improve acne, grow hair, or suppress testosterone synthesis. Can be used for. The use can be in humans or non-human animals, or specimens derived therefrom, and can be therapeutic or non-therapeutic.
また、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビの予防又は改善剤、育毛剤、テストステロン合成抑制剤（以下、ＳｔＡＲ発現抑制剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＳｔＡＲ発現抑制剤等には、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択される製剤担体等の許容されるものを使用してもよい。 The plant of the present invention or an extract thereof is used as an StAR expression inhibitor, sebum secretion inhibitor, acne prevention or improvement agent, hair restorer, testosterone synthesis inhibitor (hereinafter referred to as StAR expression inhibitor, etc.). And can be used to produce these agents. At this time, as the StAR expression inhibitor, etc., the plant of the present invention or an extract thereof is used alone, or in addition to this, an acceptable one such as a pharmaceutical carrier appropriately selected as necessary is used. Also good.
当該ＳｔＡＲ発現抑制剤等は、それ自体、ＳｔＡＲ発現抑制、皮脂分泌抑制、ニキビの予防又は改善、育毛、テストステロン合成抑制の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料、食品又は飼料であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。食品としては、ＳｔＡＲ発現抑制、皮脂分泌抑制果等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。 The StAR expression inhibitor itself is a human or veterinary drug, quasi-drug, cosmetic, which exhibits the effects of StAR expression suppression, sebum secretion suppression, acne prevention or improvement, hair growth, and testosterone synthesis suppression. It may be a food, a food or a feed, or it may be a material or a preparation used in combination with the pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic or the like. Foods include the concept of physiological functions such as StAR expression suppression, sebum secretion suppression fruit, etc., including foods and drinks, functional foods and drinks, foods and drinks for the sick, foods for specified health use, etc., as necessary. To do.
上記医薬品（医薬部外品も含む）は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
The pharmaceuticals (including quasi drugs) can be administered in any dosage form. Examples of the dosage form include parenteral administration such as injections, suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, external preparations, or oral administration such as tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like.
To prepare such pharmaceutical preparations of various dosage forms, the plant of the present invention or an extract thereof is used alone or other pharmaceutically acceptable excipients, binders, extenders, disintegrants. , Surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, flavoring agents, fragrances, coating agents, carriers, diluents, and the like can be used in appropriate combinations.
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、製剤中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。 Among these dosage forms, the preferred form is oral administration, and the content of the plant of the present invention or the extract thereof in the preparation (in terms of the dried product of the extract) is generally 0.00001 to 10% by mass. And is more preferably 0.0001 to 1% by mass.
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１〜１００質量％とするのが好ましく、０．１〜１００質量％とするのがより好ましく、更に好ましくは１〜１００質量％とするのが好ましい。
The form of the food may be solid, semi-solid or liquid, for example, various foods such as breads, cakes, noodles, confectionery, jelly, frozen foods, ice creams, dairy products, beverages, Examples include the same forms (tablets, capsules, syrups, etc.) as the above-mentioned oral administration preparations.
In order to prepare various forms of food, the plant of the present invention or an extract thereof is used alone or other food materials, solvents, softeners, oils, emulsifiers, preservatives, fragrances, stabilizers, colorings. An agent, an antioxidant, a humectant, a thickener and the like can be used in appropriate combination. The content of the plant of the present invention or the extract thereof in the food (in terms of dry matter of the extract) is generally preferably 0.01 to 100% by mass, and 0.1 to 100% by mass. More preferably, it is more preferably 1 to 100% by mass.
上記医薬品等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明の植物又はそれらの抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、特に０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。 The dose or intake of the above-mentioned pharmaceuticals and the like may vary according to the condition, weight, sex, age or other factors of the subject, but in the case of oral administration or intake, the plant of the present invention or an extract thereof per adult As dry matter, it is preferably 0.01 mg to 100 mg / kg, more preferably 0.1 mg to 10 mg / kg per day.
上記化粧料（医薬部外品も含む）の形態は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種と、皮膚化粧料に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類等）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。 The form of the cosmetic (including quasi-drugs) can be a skin external preparation, a cleaning agent, a makeup cosmetic, and the like. Depending on the method of use, lotion, emulsion, gel, cream, ointment, It can be provided in various dosage forms such as powder and granules. Such cosmetics in various dosage forms include at least one selected from the group consisting of the plant of the present invention and extracts thereof, and oily ingredients, moisturizers, powders, which can be blended in skin cosmetics. Pigments, emulsifiers, solubilizers, detergents, UV absorbers, thickeners, drugs (eg anti-inflammatory agents, bactericides, antioxidants, vitamins, etc.), fragrances, resins, antibacterial and antifungal agents, plants It can be prepared by appropriately combining extracts, alcohols and the like.
当該化粧料の全量中の、本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。 The content of the plant of the present invention or the extract thereof in the total amount of the cosmetic is usually 0.0001 to 20% by mass, preferably 0.001 to 10% by mass in terms of the dry matter of the extract. 0.01 to 5% by mass is more preferable.
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳｔＡＲ発現抑制剤。
＜２＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
＜３＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
＜４＞ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする育毛剤。
＜５＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするテストステロン合成抑制剤。
With respect to the above-described embodiment, the following aspects are disclosed in the present invention.
<1> A StAR expression inhibitor comprising as an active ingredient at least one plant selected from Baotou, Rakuntai, and Hachisenka, or an extract thereof.
<2> A sebum secretion inhibitor comprising as an active ingredient one or more kinds of plants selected from raccoon tie and bee-senka or extracts thereof.
<3> An acne preventive or ameliorating agent comprising as an active ingredient one or more kinds of plants selected from raccoon tai and bee-senka or extracts thereof.
<4> A hair restorer comprising as an active ingredient at least one plant selected from Baotou and Hachisenka or an extract thereof.
<5> A testosterone synthesis inhibitor comprising as an active ingredient at least one plant selected from Baotou, Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof.
＜６＞ＳｔＡＲ発現抑制剤を製造するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜７＞皮脂分泌抑制剤を製造するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜８＞ニキビ予防又は改善剤を製造するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜９＞育毛剤を製造するための、ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜１０＞テストステロン合成抑制剤を製造するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜１１＞ＳｔＡＲ発現抑制に使用するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１２＞皮脂分泌抑制に使用するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１３＞ニキビ予防又は改善に使用するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１４＞育毛に使用するための、ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１５＞テストステロン合成抑制に使用するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１６＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するＳｔＡＲ発現抑制方法。
＜１７＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取する皮脂分泌抑制方法。
＜１８＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するニキビ予防又は改善方法。
＜１９＞ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取する育毛方法。
＜２０＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するテストステロン合成抑制方法。
＜２１＞非治療的な方法である前記＜１６＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の方法。
＜２２＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物の使用部位は、好適には、ホウトウは花、ラクンタイは葉、ハチセンカは枝葉である。
＜２３＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適には、水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、又は水−アルコール系混合溶剤である。ここで、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールがより好ましく、エタノールがさらに好ましく、また、多価アルコール類としてはブチレングリコールがより好ましい。
＜２４＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適にはアルコール−水混合液であり、さらに好適には、アルコールの濃度が５％（ｖ／ｖ）以下、２０％（ｖ／ｖ）以上、３０％（ｖ／ｖ）以上、４０％（ｖ／ｖ）以上、そして６０％（ｖ／ｖ）以下、７０％（ｖ／ｖ）以下、８０％（ｖ／ｖ）以下、９５％（ｖ／ｖ）以下である。
＜２５＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物は、好適には、植物体１質量部に対して８質量部以上５０質量部以下の抽出溶剤を用い、４０℃以上９０℃以下にて１分間以上３日間以下抽出されるものである。
<6> Use of one or more kinds of plants selected from Baotou, Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof for producing a StAR expression inhibitor.
<7> Use of one or more kinds of plants selected from Rakuntai and Hachisenka or an extract thereof for producing a sebum secretion inhibitor.
<8> Use of one or more kinds of plants selected from raccoon tie and gentian or an extract thereof for producing an acne prevention or amelioration agent.
<9> Use of at least one plant selected from Baotou and Hachisenka or an extract thereof for producing a hair restorer.
<10> Use of at least one plant selected from Baotou, Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof for producing a testosterone synthesis inhibitor.
<11> One or more kinds of plants selected from Baotou, Raccoontai, and Hachisenka, or an extract thereof, for use in suppressing StAR expression.
<12> One or more kinds of plants selected from Rakuntai and Hachisenka or extracts thereof for use in suppressing sebum secretion.
<13> One or more kinds of plants or extracts thereof selected from raccoon tie and gentium for use in preventing or improving acne.
<14> One or more plants selected from Baotou and Hachisenka, or an extract thereof, for use in hair growth.
<15> One or more kinds of plants selected from Baotou, Rakkuntai and Hachisenka, or an extract thereof, for use in inhibiting testosterone synthesis.
<16> A StAR expression suppression method comprising administering or ingesting one or more plants selected from Baotou, Raccoontai, and Hachisenka, or an extract thereof.
<17> A method for suppressing sebum secretion, comprising administering or ingesting one or more plants selected from Rakkuntai and Hachisenka or an extract thereof.
<18> A method for preventing or improving acne, which comprises administering or ingesting one or more plants selected from raccoon tie and bee-senka or extracts thereof.
<19> A hair-growth method for administering or ingesting one or more plants selected from Baotou and Hachisenka or an extract thereof.
<20> A method for inhibiting testosterone synthesis, comprising administering or ingesting one or more plants selected from Baotou, Raccoontai, and Hachisenka or an extract thereof.
<21> The method according to any one of <16> to <20>, which is a non-therapeutic method.
<22> In the above items <1> to <21>, the use site of the plant is preferably a flower for Baotou, a leaf for raccoon tie, and a branch leaf for Hachisenka.
<23> In the above items <1> to <21>, the extraction solvent for obtaining the plant extract is preferably water, an alcohol-based (alcohol and / or polyhydric alcohol) solvent, or a water-alcohol system. It is a mixed solvent. Here, methanol, ethanol, propanol, and butanol are more preferable as alcohols, ethanol is more preferable, and butylene glycol is more preferable as polyhydric alcohols.
<24> In the above items <1> to <21>, the extraction solvent for obtaining the plant extract is preferably an alcohol-water mixture, and more preferably an alcohol concentration of 5% (v / v). ), 20% (v / v) or more, 30% (v / v) or more, 40% (v / v) or more, and 60% (v / v) or less, 70% (v / v) or less, 80 % (V / v) or less and 95% (v / v) or less.
<25> In the above <1> to <21>, the plant extract preferably uses an extraction solvent of 8 to 50 parts by mass with respect to 1 part by mass of the plant body, and 40 to 90 ° C. 1 to 3 days or less.
参考例１ 皮脂分泌におけるＳｔＡＲの機能
１．細胞培養
ハムスターの耳介部由来の皮脂腺培養細胞 Ｈａ−ＳＥ（クラボウ社）は、増殖状態を保つために皮脂腺細胞増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ；添加剤としてヒトｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を用いて増殖させ、その後、分化を誘導（皮脂合成を促進）するために皮脂腺細胞分化誘導培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＢＤ；添加剤としてインスリン）を用いて培養を行った。
Reference Example 1 Function of StAR in sebum secretion Cell culture Sebaceous gland cultured cells derived from the hamster auricle Ha-SE (Kurabo Co., Ltd.) are grown using a culture medium for sebaceous gland cells (Humdia-BG; human epidermal growth factor) as an additive. Thereafter, in order to induce differentiation (stimulate sebum synthesis), culture was performed using a sebaceous gland cell differentiation induction medium (HuMedia-BD; insulin as an additive).
２. ｓｉＲＮＡ処理
Ｈａ−ＳＥを6−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、４８時間後（９０％コンフルエント）にＳｔＡＲの遺伝子発現をノックダウンするために、ｓｉＲＮＡを製品添付のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞に導入した（２０ｎＭ ｓｉＲＮＡ, ５μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）。設計したｓｉＲＮＡの配列は表１に示した。また陰性Ｃｏｎｔｒｏｌには上記のｓｉＲＮＡと等量のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を細胞に導入した。導入２４時間後に分化誘導培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤに培地を交換し、培養を継続した。
2. siRNA treatment To inoculate Ha-SE into a 6-well plate at a cell density of 1.0 × 10 5 cells / well and knock down the gene expression of StAR 48 hours later (90% confluent). Was introduced into the cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the protocol attached to the product (20 nM siRNA, 5 μl Lipofectamine 2000). The sequence of the designed siRNA is shown in Table 1. In addition, to the negative control, the same amount of Steal RNAi Negative Control Duplexes (Invitrogen) as the above siRNA was introduced into the cells. 24 hours after the introduction, the medium was changed to Humeria-BD, which is a differentiation induction medium, and the culture was continued.
３. ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ
導入３日後に細胞を回収し、 ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて、添付のマニュアルに従いＲＮＡ抽出を行った。１μｇのＲＮＡを鋳型にして、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付のマニュアルに従いｃＤＮＡ合成を行った。ＴａｑＭａｎR Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて内在性Ｃｏｎｔｒｏｌである１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現を定量した。一方でＳＹＢＲR Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び表２に示したｐｒｉｍｅｒを用いて、ＳｔＡＲの発現量を定量した。ＳｔＡＲの発現量を１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量で補正し、相対発現量として評価した。
3. RNA extraction, cDNA synthesis, Real-time PCR
Three days after the introduction, the cells were collected, and RNA extraction was performed using RNeasy mini kit (QIAGEN) according to the attached manual. Using 1 μg of RNA as a template, cDNA was synthesized according to the attached manual using Quantitect Reverse Transcription Kit (QIAGEN). Expression of 18S ribosomal RNA, an endogenous control, was quantified using TaqMan® Universal PCR Master Mix, Taqman probe (Applied Biosystems). On the other hand, the expression level of StAR was quantified using SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) and the primers shown in Table 2. The expression level of StAR was corrected with the expression level of 18S ribosomal RNA and evaluated as a relative expression level.
４. 脂質定量
導入１４日後に、オイルレッド染色の強度を指標とした脂質合成測定キット（クラボウ社）を用いて、添付のマニュアルに従い脂質の定量を行った。
５．結果
ＳｔＡＲの発現抑制により皮脂の蓄積が有意に抑制されることが確認された（図１）。
4. Lipid quantification 14 days after introduction, lipids were quantified using a lipid synthesis measurement kit (Kurabo) using the intensity of oil red staining as an index according to the attached manual.
5. Results It was confirmed that the accumulation of sebum was significantly suppressed by suppressing the expression of StAR (FIG. 1).
参考例２ ＳｔＡＲ発現と毛の関係
１．ヒト頭皮標本
同一個人（男性１０人）より採取した側頭部と頭頂部の皮膚は、適当な大きさに切り分け、１０％のホルマリン溶液に浸漬し、２４時間置いた後、パラフィンで包埋した。
Reference Example 2 Relationship between StAR expression and hair Human scalp specimens The temporal and parietal skins collected from the same individual (10 males) were cut into appropriate sizes, immersed in 10% formalin solution, placed for 24 hours, and then embedded in paraffin. .
２．ＨＥ染色と毛髪密度の測定
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックより、それぞれの検体において切片を作成した後に、ＨＥ染色を実施した。ＨＥ染色切片上に存在する毛包数を顕微鏡下で測定し、その数を組織の長さで除いたものを毛髪密度とした。
2. HE staining and measurement of hair density After preparing sections from each formalin-fixed paraffin-embedded block, HE staining was performed. The number of hair follicles present on the HE-stained section was measured under a microscope, and the number obtained by removing the number by the length of the tissue was taken as the hair density.
３．ＳｔＡＲの免疫染色
免疫組織化学にはヒストファインキット(ニチレイ社)を用いた。ＳｔＡＲの抗原賦活化はクエン酸バッファー（２ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸、９ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸三ナトリウム二水和物、ｐＨ ６．０）中で２０分間マイクロウェーブ処理を行った。一次抗体原液の希釈率はＳｔＡＲ: １／５００とした。発色はＤＡＢ溶液（１ｍＭ ＤＡＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ ７．６)、０．００６％ 過酸化水素）を用いて行い、カウンター染色にはヘマトキシリン溶液を用いた。陰性コントロールには一次抗体の代わりにウサギのＩｇＧを用いた。ＳｔＡＲの染色強度は、Breast Cancer Res. Treat. (2002) 74, 47-53に記載された改変版Ｈ−ｓｃｏｒｅ法を用いて目視評価を行った）。
４．結果
ＳｔＡＲの発現が高い部位は、毛髪密度が低いことが確認された（図２）。
3. StAR immunostaining Histofine kit (Nichirei) was used for immunohistochemistry. Antigen activation of StAR was performed by microwave treatment for 20 minutes in citrate buffer (2 mmol / L citrate, 9 mmol / L trisodium citrate dihydrate, pH 6.0). The dilution ratio of the primary antibody stock solution was StAR: 1/500. Color development was performed using DAB solution (1 mM DAB, 50 mM Tris-HCL buffer (pH 7.6), 0.006% hydrogen peroxide), and hematoxylin solution was used for counterstaining. Rabbit IgG was used instead of the primary antibody as a negative control. The staining intensity of StAR was evaluated visually using a modified H-score method described in Breast Cancer Res. Treat. (2002) 74, 47-53).
4). Results It was confirmed that the site with high StAR expression had low hair density (FIG. 2).
製造例 植物抽出物の調製
（製造例１）ホウトウ抽出物の調製
ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）の花２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ホウトウの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ホウトウの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
Production Example Preparation of Plant Extract (Production Example 1) Preparation of Baitou Extract 15 grams (3 L) of 50 (v / v)% ethanol-water was added to 200 g of Baotou (Paulonia fortunei (Seem.) Hemsl.) Flowers. The mixed solution was added and extracted at 85 ° C. for 3 hours. After insoluble matters were filtered off, an extract was obtained and concentrated under reduced pressure to obtain a dried dried bait product.
This extracted solid was dissolved in 50 (v / v)% ethanol to prepare a 1 (w / v)% ethanol extract of potato.
（製造例２）ラクンタイ抽出物の調製
ラクンタイ（Ｃｒｉｎｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ Ｌ． ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍ Ｂａｋ．）の葉２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ラクンタイの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ラクンタイの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
(Manufacture example 2) Preparation of a rakuntai extract To 200 g of leaves of Lakuntai (Crinum asiaticum L. var. Sinicum Bak.), 15 times amount (3 L) of 50 (v / v)% ethanol-water mixed solution was added, and 85 Extraction was carried out at 3 ° C. for 3 hours, and the insoluble material was filtered off to obtain an extract, followed by concentration under reduced pressure to obtain a dry product of Rakuntai.
This extracted solid was dissolved in 50 (v / v)% ethanol to prepare a 1 (w / v)% ethanol extract of Rakkuntai.
（製造例３）ハチセンカ抽出物の調製
ハチセンカと（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ）の枝葉１００ｇに、２０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ハチセンカの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ハチセンカの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
(Production Example 3) Preparation of Hachisenka Extract To 100 g of branches and leaves of Hachisenka and (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Serige), 20 times (2 L) of 50 (v / v)% ethanol-water mixed solution was added, and 85 ° C. Extraction was performed in 3 hours, and the insoluble material was filtered off to obtain an extract, which was concentrated under reduced pressure to obtain an extract dried solid product of Hachisenka.
The extracted solid content was dissolved in 50 (v / v)% ethanol to prepare a 1 (w / v)% ethanol extract of chinscapa.
実施例１ 各抽出物におけるＳｔＡＲ発現抑制作用
（１）ＳｔＡＲのプロモーターアッセイ
ＳｔＡＲのプロモーター領域（−９８０／＋６１）をホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込み、副腎皮質癌細胞株であるＨ２９５Ｒ細胞に導入して過剰発現させた。そこにＳｔＡＲの発現を亢進させる薬剤ｃＡＭＰを添加した条件下で、被験物質を添加しＳｔＡＲのプロモーター活性が抑制された場合において、ルシフェラーゼの活性が減少する評価系を構築した。
Example 1 StAR expression inhibitory action in each extract (1) StAR promoter assay The StAR promoter region (-980 / + 61) was incorporated upstream of the firefly luciferase gene and introduced into H295R cells, which are adrenocortical cancer cell lines. Overexpressed. An evaluation system was constructed in which the activity of luciferase decreased when the test substance was added and the StAR promoter activity was suppressed under the condition where the drug cAMP that enhances the expression of StAR was added thereto.
＜材料＞
ｐＧＬ４．１０及びｐＲＬ−ＣＭＶは、Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入した。
ｐＧＬ４．１０ (ＳｔＡＲ)は、ＳｔＡＲのプロモーター領域（−９８０／＋６１）を以下のプライマーを用いてヒトゲノムより増幅し、ＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＧＬ４．１０に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐｌａｓｍｉｄを構築した。
プライマー配列：
Ｆｏｗａｒｄ ：GCTCGCTAGCCTCGAGTCTCTACTGCCTGGTAAACACC（配列番号６）
Ｒｅｖｅｒｃｅ：CCGGATTGCCAAGCTTTCATGTTGCGCATGTGTCTGTA（配列番号７）
<Material>
pGL4.10 and pRL-CMV were purchased from Promega.
pGL4.10 (StAR) was obtained by amplifying the StAR promoter region (−980 / + 61) from the human genome using the following primers, and cleaving with XhoI and HindIII into pGL4.10. ) Was used to construct plasmid.
Primer sequence:
Forward: GCTCGCTAGCCTCGAGTCTCTACTGCCTGGTAAACACC (SEQ ID NO: 6)
Reverse: CCGGATTGCCAAGCTTTCATGTTGCGCATGTGTCTGTA (SEQ ID NO: 7)
＜評価方法＞
Ｈ２９５Ｒ細胞を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１１．０×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％ チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を交換し、ｐＧＬ４．１０（ＳｔＡＲ）、及びｐＲＬ−ＣＭＶをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、ｃＡＭＰ溶媒（終濃度２５μＭ）、及び製造例１〜３で調製した各植物抽出物（０．５％（ｖ／ｖ）、１．０％（ｖ／ｖ）)のいずれかを添加し、さらに２４時間培養を行った。ホタルルシフェラーゼ（ＳｔＡＲのプロモーター活性の指標）、及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄの導入効率の指標）の活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTM Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。
<Evaluation method>
H295R cells were seeded on a 96-well plate at a cell density of 11.0 × 10 4 cells / well, and 12 hours later, the culture medium (DMEM / F12 containing 5% charcoal-treated serum) was replaced with pGL4.10 ( StAR) and pRL-CMV were introduced into cells using Lipofectamine 2000 (Invtrogen) according to the protocol attached to the product. 24 hours after introduction, any of cAMP solvent (final concentration 25 μM) and each plant extract prepared in Production Examples 1 to 3 (0.5% (v / v), 1.0% (v / v)) Was added and further cultured for 24 hours. The activity of firefly luciferase (an indicator of StAR promoter activity) and Renilla luciferase (an indicator of plasmid introduction efficiency) was measured using Dual-Glo ™ Luciferase Assay System (Promega) according to the attached protocol. The emission intensity of firefly luciferase divided by the emission intensity of Renilla luciferase was calculated as a relative light unit (RLU).
＜結果＞
本発明の植物抽出物は、コントロールと比較して７０％以下にＳｔＡＲの発現（ＳｔＡＲのプロモーター活性）を抑制する作用が認められた（図３）。
<Result>
The plant extract of the present invention was found to have an effect of suppressing the expression of StAR (StAR promoter activity) to 70% or less compared to the control (FIG. 3).
実施例２ 皮脂蓄積抑制作用
本発明の植物抽出物の皮脂蓄積抑制効果を確認すべく、ハムスター皮脂腺細胞に対してインスリンを用いて分化誘導し、そこに製造例２及び３で調製した各植物抽出物を添加して皮脂の蓄積をナイルレッド染色の蛍光強度を指標に評価を行った。
Example 2 Sebum Accumulation Inhibitory Action In order to confirm the sebum accumulation inhibitory effect of the plant extract of the present invention, hamster sebaceous gland cells were induced to differentiate using insulin, and each plant extract prepared in Production Examples 2 and 3 was induced there. Substances were added and the accumulation of sebum was evaluated using the fluorescence intensity of Nile Red staining as an index.
＜材料＞
ハムスター皮脂腺細胞はクラボウ社より購入した。
<Material>
Hamster sebaceous gland cells were purchased from Kurabo Industries.
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、陰性対照であるＤｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、皮脂蓄積を抑制することが知られているａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ａｔＲＡ）、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、及び製造例２、３で調製した植物抽出物のいずれかを、それぞれ１（ｖ／ｖ）％となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、ＣＯ2 ５％の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
<Evaluation method>
Hamster primary cultured sebaceous gland cells (Kurabo) were seeded on a 24-well plate to 1 × 10 5 cells / well, cultured for 3 days in Humdia-BG (Kurabo), then Dimethylsulfoxide (control) ), All trans retinoic acid (atRA), adapalene, and plant extracts prepared in Production Examples 2 and 3, which are known to suppress sebum accumulation, are each 1 (v / v) Further, the cells were further cultured for 3 days in Humedia-BD (Kurabo Co., Ltd.) added to a concentration of 1%. After culturing, each well was washed twice with PBS, 10 μg / ml Nile Red staining solution was added dropwise, and the mixture was stained for 30 minutes at 37 ° C. and CO 2 5%. After staining, the plate was washed twice with PBS, applied with an excitation wavelength of 485 nm, and the fluorescence intensity at a wavelength of 565 nm was measured.
＜結果＞
本発明の植物抽出物は、ハムスター皮脂腺細胞における皮脂の蓄積を抑制した（表１）。
<Result>
The plant extract of the present invention suppressed the accumulation of sebum in hamster sebaceous gland cells (Table 1).
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