JP2014014288A - Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド - Google Patents
Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014014288A JP2014014288A JP2012152395A JP2012152395A JP2014014288A JP 2014014288 A JP2014014288 A JP 2014014288A JP 2012152395 A JP2012152395 A JP 2012152395A JP 2012152395 A JP2012152395 A JP 2012152395A JP 2014014288 A JP2014014288 A JP 2014014288A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hsf1
- rpa1
- amino acid
- peptide
- interaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
【課題】ＨＳＦ１が、がん治療のターゲットとして大きな注目を集めているが、現在なおＨＳＦ１の活性を抑える物質は見出されていない。本発明の課題は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有する物質や、かかる物質を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかる物質を含んでなる抗腫瘍剤や、かかる物質を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【解決手段】ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域がＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインと相互作用することを見出した。さらに、ＨＳＦ１におけるｗｉｎｇ領域のアミノ酸置換や、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸置換により、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との複合体の形成、つまりＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害すると、腫瘍細胞の一つであるメラノーマ細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【選択図】図６
【解決手段】ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域がＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインと相互作用することを見出した。さらに、ＨＳＦ１におけるｗｉｎｇ領域のアミノ酸置換や、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸置換により、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との複合体の形成、つまりＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害すると、腫瘍細胞の一つであるメラノーマ細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【選択図】図６
Description
本発明は、ＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）と
の相互作用阻害活性を有するペプチドおよびこのペプチドをコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡを含んだ組換えベクターや、かかるペプチドを含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかるペプチドを含んでなる抗腫瘍剤や、かかるペプチドに特異的に結合する抗体や、かかるペプチドを非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。
の相互作用阻害活性を有するペプチドおよびこのペプチドをコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡを含んだ組換えベクターや、かかるペプチドを含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかるペプチドを含んでなる抗腫瘍剤や、かかるペプチドに特異的に結合する抗体や、かかるペプチドを非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。
細胞は、細胞内のタンパク質の質と量を一定に保つ機構、つまりタンパク質ホメオスタシスの維持機構を有しており、維持機構は、主に、タンパク質が正しくフォールディングするのを介助する過程と、ミスフォールディングを行ったタンパク質を分解する過程からなる。この細胞内タンパク質のミスフォールディングに対する緩衝作用の容量は、タンパク質ホメオスタシス容量とよばれ、老化、神経疾患等のタンパク質ミスフォールディング病、さらにがんの発症と密接に関連していることが分ってきた。タンパク質ホメオスタシス容量の重要な調節機構の１つが熱ショック応答である。この応答は、タンパク質毒性を持つストレスに対して、タンパク質フォールディングや分解を担う熱ショックタンパク質であるＨＳＰ（heat shock protein）、及び、非ＨＳＰタンパク質の誘導を特徴とし、熱ショック因子であるＨＳＦ（heat shock factor）により転写のレベルで調節される。
ＨＳＦは哺乳動物細胞において３種類（ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４）が明らかにされているが、このうち、ＨＳＦ１が、はじめてがん治療のターゲットとして示唆されたのは前立腺がんにおけるその発現上昇の発見にさかのぼる（非特許文献１）。この発見は特定のがんにおけるＨＳＦ１発現量とがんとの相関関係を示したものであり、特別な例と考えられていた。しかし、２００７年のＤａｉらの発見により、ＨＳＦ１はがん治療のターゲットとして大きな注目を集めることとなった（非特許文献２）。彼らは、様々ながん細胞株の増殖がＨＳＦ１ノックダウンにより顕著に抑制されることを示し、がん細胞の増殖がＨＳＦ１に依存することを示した。ここで重要なことは、正常な細胞増殖はＨＳＦ１のノックダウンの影響は受けず、これはがん細胞に特異的な作用であったことである。発明者らも、新しくメラノーマ細胞株の増殖がＨＳＦ１に依存することを明らかにした（非特許文献３）。つまり、ＨＳＦ１をターゲットとしてがん細胞の増殖を抑制する化合物を見いだすことができれば、がんの治療に大きく貢献できると考えられた。その後、大規模な臨床解析が行われ、乳がんや肝細胞がんの患者組織でもＨＳＦ１の活性化ががん細胞の悪性度と関連することが明らかとなってきた（非特許文献４、５）。
ＨＳＦは哺乳動物細胞において３種類（ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４）が明らかにされているが、このうち、ＨＳＦ１が、はじめてがん治療のターゲットとして示唆されたのは前立腺がんにおけるその発現上昇の発見にさかのぼる（非特許文献１）。この発見は特定のがんにおけるＨＳＦ１発現量とがんとの相関関係を示したものであり、特別な例と考えられていた。しかし、２００７年のＤａｉらの発見により、ＨＳＦ１はがん治療のターゲットとして大きな注目を集めることとなった（非特許文献２）。彼らは、様々ながん細胞株の増殖がＨＳＦ１ノックダウンにより顕著に抑制されることを示し、がん細胞の増殖がＨＳＦ１に依存することを示した。ここで重要なことは、正常な細胞増殖はＨＳＦ１のノックダウンの影響は受けず、これはがん細胞に特異的な作用であったことである。発明者らも、新しくメラノーマ細胞株の増殖がＨＳＦ１に依存することを明らかにした（非特許文献３）。つまり、ＨＳＦ１をターゲットとしてがん細胞の増殖を抑制する化合物を見いだすことができれば、がんの治療に大きく貢献できると考えられた。その後、大規模な臨床解析が行われ、乳がんや肝細胞がんの患者組織でもＨＳＦ１の活性化ががん細胞の悪性度と関連することが明らかとなってきた（非特許文献４、５）。
しかしながら、今日までＨＳＦ１の活性を特異的に抑制する物質は見つかっていない。一般に、このような物質のスクリーニング方法として、熱ストレスを暴露した後の熱ショック遺伝子プロモーターを持つレポーターによるレポーターアッセイ法で調べるが、転写機構全般に作用する、あるいは他の経路に作用して細胞毒性がある場合などがあり、従来のスクリーニング系でＨＳＦ１を特異的にターゲットとする物質の同定が困難となっているのが現状である。近年、発明者らは、ＨＳＦ１とＲＰＡ１（replication protein A 1）の複合体はヌクレオソーム構造をとるＤＮＡにアクセスすることを明らかにしたが（非特許文献６）、この複合体とがん細胞の増殖との関係は全く明らかにされていなかった。
Hoang et al. Am. J. Pathol. 156, 857-864, 2000
Dai et al. Cell 130, 1005-1018, 2007
Nakamura et al. J. Dermatol. Sci. 60, 187-192, 2010
Santagata et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 118 no.45, 18378-18383, 2011
Fang et al. Cancer 118 no.7, 1782-1794, 2012
藤本ら、第３４回日本分子生物学会年会プログラムp161, 2011
ＨＳＦ１が、がん治療のターゲットとして大きな注目を集めているが、現在なおＨＳＦ１の活性を抑える物質は見出されていない。本発明の課題は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有する物質や、かかる物質を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかる物質を含んでなる抗腫瘍剤や、かかる物質を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することにある。
ＨＳＦ１の活性を抑える物質の開発が急がれる中で、本発明者らは、ＨＳＦ１に相互作用するタンパク質とがんとの関係に着目し、ＨＳＦ１のｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ-ｔｕｒｎ-ｈｅｌｉｘ型のＤＮＡ結合ドメイン（DNA-binding domain:DBD）のうち、ｗｉｎｇ領域がＲＰＡ１のｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（ssDNA）結合ドメインと相互作用することを見出した。さらに、ＨＳＦ１におけるｗｉｎｇ領域のアミノ酸置換や、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸置換により、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との複合体の形成、つまりＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害すると、腫瘍細胞の一つであるメラノーマ細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；のいずれかのペプチド又はその塩や、（２）ペプチドが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することを特徴とする上記（１）記載のペプチド又はその塩に関する。
また、本発明は、（３）（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡや、（４）上記（３）記載のＤＮＡを含み、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドを発現することができる組換えベクターに関する。
さらに、本発明は、（５）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、（６）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤や、（７）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩に特異的に結合する抗体や、（８）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法に関する。
また、本発明は、（９）（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ１とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程；を順次備えたことを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法や、（１０）ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることを特徴とする、上記（９）記載のスクリーニング方法に関する。
本発明によると、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害することができるペプチドを提供することができ、また、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用体が腫瘍細胞の増殖にも関与することが明らかになったことから、前記ペプチドは抗腫瘍剤として用いることができる。さらに、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用部位が明らかになったことから、従来は細胞を用いたレポーターアッセイによるスクリーニング系であったものを、特異的なタンパク質相互作用をターゲットとするスクリーニング系にすることで、多くの化合物ライブラリーからの抗腫瘍剤のスクリーニングが短時間で可能となる。
本発明のペプチドとしては、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドであれば、特に限定されない。
ここで、「ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用阻害活性を有するペプチド」は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用を阻害する活性を有するペプチドであれば、その具体的な作用機構は特に限定されないが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することが好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することがより好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１の２３８位若しくは２６９位との相互作用阻害活性を有することが特に好ましい。また、本発明において「相互作用」とは、「タンパク質分子間での非共有結合による複合体形成」を意味する。
ここで、「ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用阻害活性を有するペプチド」は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用を阻害する活性を有するペプチドであれば、その具体的な作用機構は特に限定されないが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することが好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することがより好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１の２３８位若しくは２６９位との相互作用阻害活性を有することが特に好ましい。また、本発明において「相互作用」とは、「タンパク質分子間での非共有結合による複合体形成」を意味する。
本発明における配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒトＨＳＦ１タンパク質の８４位から９６位のアミノ酸配列に相当し、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒトＲＰＡ１タンパク質の２２８位から３９１位のアミノ酸配列に相当する。
本発明のペプチドには、１）配列番号１の４番目のグリシン（ヒトＨＳＦ１タンパク質の８７位に相当するグリシン）残基を除くアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドや、２）配列番号２の１１番目若しくは４２番目のフェニルアラニン（ヒトＲＰＡ１タンパク質の２３８位若しくは２６９位に相当するフェニルアラニン）を除くアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜５個、中でも１〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害する活性を有するものも含まれ、これらペプチドは、当該アミノ酸配列情報や当該アミノ酸をコードする塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
本発明のペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、本発明のペプチドは、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを調製することができる。
本発明のペプチドは、必要に応じて、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させ、融合ペプチドとすることができる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。
かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではなく、本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害する活性を有するペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩；酢酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等を例示することができる。
本発明のＤＮＡは、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡであれば特に限定されない。ここで、「ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用阻害活性を有するペプチド」は、前述した通りである。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離する、あるいは常法に従って化学合成により調製することができる。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離する、あるいは常法に従って化学合成により調製することができる。
具体的には、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブをその塩基配列情報に基づいて作製し、かかるプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト、マウス、ラット等の動物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
本発明のＤＮＡとして、上記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのペプチドをコードする限りは、配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列と９０％以上相同性を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列と８５％以上相同性を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができるが、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするヒト由来のＤＮＡの塩基配列である配列番号３に示すＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするヒト由来のＤＮＡの塩基配列である配列番号４に示すＤＮＡを挙げることができる。
上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡであって、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡであって、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドを発現する組換えベクターであれば特に制限されない。本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができ、本発明の遺伝子を適切なプロモーターの下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcDNA3（Stratagene社製）、pCMV-FLAG6a（Sigma-Aldrich社製)、pEGFP-C3（Clontech社製)、pcDM8（フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133, 1990〕、pAS3-3（特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840, 1987〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製)、pREP4（Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Biochem., 101, 1307, 1987〕、pAGE210等を例示することができる。
動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトＣＭＶ)のＩＥ（immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトＣＭＶ)のＩＥ（immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。
酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもべーリンガーマンハイム社より市販)、pGEX4T(AmershamBioscience社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669, 1984〕、PLSA1〔Agric. Bio1. Chem., 53, 277, 1989〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306, 1985〕、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagen社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。
細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤としては、本発明のペプチドを含むものであれば特に制限されず、本発明のペプチドを有効成分として含むものでもよい。必要に応じて、その他の成分などを適宜選択することができる。
本発明の抗腫瘍剤としては、上記本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤を含んでなるものであれば特に制限されず、「抗腫瘍剤」には、抗腫瘍組成物が含まれ、予防剤、予後改善剤、治療剤、再発防止剤も含まれる。さらに、本発明の抗腫瘍剤を有効成分として含むものでもよい。
本発明の抗腫瘍剤の対象となる「がん」としては、特に制限されないが、例えば食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、肝臓がん、すい臓がん、胆のう・胆管がん等の消化器がん；悪性黒色腫；肺がん；乳がん；卵巣がん；子宮がん；腎がん；前立腺がん等を例示することができる。このように幅広い「がん」が対象となることは、これまでにＨＳＦ１の活性阻害が、乳腺上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、前立腺上皮細胞、末梢神経鞘細胞、腎上皮細胞、色素細胞等の様々なヒトがん由来の細胞株の増殖を顕著に抑制すること、及びヒト前立腺がん、乳がん、肝細胞がんの組織でＨＳＦ１の活性が増強していることが明らかとなっていることから裏付けられる。つまり、ＨＳＦ１の活性の増強が多くのがんの発症および進展を促進しているためである。一般に、がん細胞は細胞内タンパク質の代謝が亢進していると考えられており、タンパク質ホメオスタシスの維持を担うＨＳＦ１の働きの増強を必要としていると考えられているため、本発明が様々な「がん」の抗腫瘍剤となりうる。
これらの抗腫瘍剤を用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射剤として非経口投与することができ、上記ペプチドを２種類以上用いてもよい。
本発明の抗体としては、上記本発明のペプチド又はその塩に特異的に結合する抗体であれば特に制限はされず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。
本発明の抗体は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用部位に特異的に結合することにより、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を特異的に阻害することが考えられる。また、本発明の抗体は、上記本発明のペプチドとの抗原抗体反応により、組織細胞、血清などにおけるＨＳＦ１又はＲＰＡ１遺伝子にかかわる疾患の検出に用いることができる。本発明の抗体を用いた免疫学的測定には、例えばＲＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＦＲＥＴ法等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
本発明の抗体は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用部位に特異的に結合することにより、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を特異的に阻害することが考えられる。また、本発明の抗体は、上記本発明のペプチドとの抗原抗体反応により、組織細胞、血清などにおけるＨＳＦ１又はＲＰＡ１遺伝子にかかわる疾患の検出に用いることができる。本発明の抗体を用いた免疫学的測定には、例えばＲＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＦＲＥＴ法等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のペプチドを含むその断片、又は本発明のペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）oyobiEBV-haiburido-mahou (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができる。
本発明の腫瘍の予防・治療法は、上記本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤を非ヒト動物に投与する方法であり、異なる態様の腫瘍の予防・治療法として本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤をヒトに投与する方法を挙げることができる。
投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、投与量も適宜選択することができる。
投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、投与量も適宜選択することができる。
本発明の抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ1とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程；を順次備えていれば特に制限されないが、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることが好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることがより好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１の２３８位若しくは２６９位のフェニルアラニンとの接触であることが特に好ましい。
このような本発明のスクリーニング方法によれば、抗腫瘍剤を効率良くスクリーニングすることができる。被検物質の存在下で、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法やＦＲＥＴ法を挙げることができる。
このような本発明のスクリーニング方法によれば、抗腫瘍剤を効率良くスクリーニングすることができる。被検物質の存在下で、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法やＦＲＥＴ法を挙げることができる。
上記ＥＬＩＳＡ法を用いる検出方法を以下に示す。
１）ライブラリーの化合物をリコンビナントタンパク質とともに一定の濃度でＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレートに添加し、吸光度を測定してＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用と競合する活性があるかどうかを調べ、次に、競合活性を認めたものについて、濃度を変えて活性を調べる方法が挙げられる。
２）ヒトメラノーマ細胞（ＨＭＶ-１、ＭｅＷｏ）は、ＨＳＦ１のノックダウンによる細胞増殖が顕著に阻害される。この細胞に、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用への競合活性をもつ化合物を添加して、細胞増殖を評価する方法、あるいはヌードマウスにヒトメラノーマ細胞等を接種して腫瘍を作らせる実験系を用いて、マウスに化合物を投与して腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が挙げられる。
１）ライブラリーの化合物をリコンビナントタンパク質とともに一定の濃度でＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレートに添加し、吸光度を測定してＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用と競合する活性があるかどうかを調べ、次に、競合活性を認めたものについて、濃度を変えて活性を調べる方法が挙げられる。
２）ヒトメラノーマ細胞（ＨＭＶ-１、ＭｅＷｏ）は、ＨＳＦ１のノックダウンによる細胞増殖が顕著に阻害される。この細胞に、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用への競合活性をもつ化合物を添加して、細胞増殖を評価する方法、あるいはヌードマウスにヒトメラノーマ細胞等を接種して腫瘍を作らせる実験系を用いて、マウスに化合物を投与して腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が挙げられる。
また、ＦＲＥＴ法を用いる検出方法を以下に示す。
１）Ｈｉｓ−ＨＳＦ１、及びＧＳＴ−ＲＰＡ１の精製リコンビナントタンパク質を準備し、テルビウム（Ｔｂ）標識抗Ｈｉｓ抗体でＨＳＦ１を色素標識し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＧＳＴ抗体でＲＰＡ１を色素標識する。そして、ＴｂとＡＰＣとの蛍光相互作用を、ＴｅｃａｎインフィニットＭ１０００モノクロメーター方式プレートリーダーを用いて検出装置で取得する。ＨＳＦ１とＲＰＡ１のリコンビナントタンパク質は、相互作用部位を含むいくつかの断片を作成し、蛍光相互作用が最適なものを同定することでＴＲ−ＦＲＥＴ法を確立する。次に、化合物ライブラリーの中から蛍光相互作用を阻害するものをスクリーニングする。
２）がん細胞の増殖における活性の評価はＥＬＩＳＡ法のときと同様に行うことができる。
１）Ｈｉｓ−ＨＳＦ１、及びＧＳＴ−ＲＰＡ１の精製リコンビナントタンパク質を準備し、テルビウム（Ｔｂ）標識抗Ｈｉｓ抗体でＨＳＦ１を色素標識し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＧＳＴ抗体でＲＰＡ１を色素標識する。そして、ＴｂとＡＰＣとの蛍光相互作用を、ＴｅｃａｎインフィニットＭ１０００モノクロメーター方式プレートリーダーを用いて検出装置で取得する。ＨＳＦ１とＲＰＡ１のリコンビナントタンパク質は、相互作用部位を含むいくつかの断片を作成し、蛍光相互作用が最適なものを同定することでＴＲ−ＦＲＥＴ法を確立する。次に、化合物ライブラリーの中から蛍光相互作用を阻害するものをスクリーニングする。
２）がん細胞の増殖における活性の評価はＥＬＩＳＡ法のときと同様に行うことができる。
以下に、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
［ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体の形成領域］
これまでに、本発明者らは、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用によるＨＳＦ1−ＲＰＡ１複合体が存在し、ヌクレオソーム構造をとるＤＮＡに結合できることを明らかにしている（藤本ら、「ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体はヌクレオソーム構造をとるＤＮＡにアクセスする」、第３４回日本分子生物学会年会プログラムp161, 2011）。今回、ＨＳＦ１とＲＰＡ１とがどの領域を介して相互作用するかを以下の方法により詳細に検討した。
これまでに、本発明者らは、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用によるＨＳＦ1−ＲＰＡ１複合体が存在し、ヌクレオソーム構造をとるＤＮＡに結合できることを明らかにしている（藤本ら、「ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体はヌクレオソーム構造をとるＤＮＡにアクセスする」、第３４回日本分子生物学会年会プログラムp161, 2011）。今回、ＨＳＦ１とＲＰＡ１とがどの領域を介して相互作用するかを以下の方法により詳細に検討した。
（１）発現ベクターの構築
大腸菌でのＧＳＴ融合タンパク質の発現ベクターを構築するために、ｈＨＳＦ１（ACCESSION番号；NM_005526 XM_937718、VERSION番号；NM_005526.2 GI:132626772）、ｈＨＳＦ１の変異体（ＨＳＦ１−Ｎ１、ＨＳＦ１−Ｎ２、ＨＳＦ１−Ｎ３、ＨＳＦ１−Ｃ１、ＨＳＦ１−Ｃ２、ＨＳＦ１−Ｃ３）（配列番号５〜１１）、マウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）、ｍＲＰＡ１の変異体（ＲＰＡ１−Ｎ１、ＲＰＡ１−Ｎ２、ＲＰＡ１−Ｎ３、ＲＰＡ１−Ｎ４、ＲＰＡ１−Ｎ５、ＲＰＡ１−Ｃ１、ＲＰＡ１−Ｃ２、ＲＰＡ１−Ｃ３、ＲＰＡ１−Ｃ４）（配列番号１２〜２１）。のｃＤＮＡをpGEX-2Tベクター（GE Healthcare社製）へ挿入したまた、Ｃ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）標識したタンパク質の発現ベクターの構築のために、ｃＤＮＡをpET21a（Novagen社製）へ挿入した。
大腸菌でのＧＳＴ融合タンパク質の発現ベクターを構築するために、ｈＨＳＦ１（ACCESSION番号；NM_005526 XM_937718、VERSION番号；NM_005526.2 GI:132626772）、ｈＨＳＦ１の変異体（ＨＳＦ１−Ｎ１、ＨＳＦ１−Ｎ２、ＨＳＦ１−Ｎ３、ＨＳＦ１−Ｃ１、ＨＳＦ１−Ｃ２、ＨＳＦ１−Ｃ３）（配列番号５〜１１）、マウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）、ｍＲＰＡ１の変異体（ＲＰＡ１−Ｎ１、ＲＰＡ１−Ｎ２、ＲＰＡ１−Ｎ３、ＲＰＡ１−Ｎ４、ＲＰＡ１−Ｎ５、ＲＰＡ１−Ｃ１、ＲＰＡ１−Ｃ２、ＲＰＡ１−Ｃ３、ＲＰＡ１−Ｃ４）（配列番号１２〜２１）。のｃＤＮＡをpGEX-2Tベクター（GE Healthcare社製）へ挿入したまた、Ｃ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）標識したタンパク質の発現ベクターの構築のために、ｃＤＮＡをpET21a（Novagen社製）へ挿入した。
（２）共沈降
発現ベクターを導入された大腸菌にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を０．２ｍＭまたは０．４ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間または２５℃で１０時間インキュベートし、リコンビナントタンパク質を誘導した。その抽出液から、Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare社製）、あるいはNi Sepharose6 Fast Flow（GE Healthcare社製）のアフィニティーカラムを用いてＧＳＴあるいはＨｉｓ標識されたリコンビナントタンパク質を精製した。それらをＮＴバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＮＰ４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ｓｔａｔｉｎ）の中で混合し、Glutathione Sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合タンパク質とともに共沈降するＨｉｓ標識タンパク質をＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４、あるいはＲＰＡ１によるウエスタンブロッティングにより検出した。沈降してきたＧＳＴタンパク質はＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。
発現ベクターを導入された大腸菌にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を０．２ｍＭまたは０．４ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間または２５℃で１０時間インキュベートし、リコンビナントタンパク質を誘導した。その抽出液から、Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare社製）、あるいはNi Sepharose6 Fast Flow（GE Healthcare社製）のアフィニティーカラムを用いてＧＳＴあるいはＨｉｓ標識されたリコンビナントタンパク質を精製した。それらをＮＴバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＮＰ４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ｓｔａｔｉｎ）の中で混合し、Glutathione Sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合タンパク質とともに共沈降するＨｉｓ標識タンパク質をＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４、あるいはＲＰＡ１によるウエスタンブロッティングにより検出した。沈降してきたＧＳＴタンパク質はＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。
（３）ＨＳＦ１とＰＲＡ１との共沈降結果
大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及びＧＳＴ−マウスＲＰＡ１欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５、ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合ＲＰＡ１タンパク質を沈降し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓが共沈降するかどうか調べた（GST-pull down assay）。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）または抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。抗ＨＳＦ１抗体は、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem.283, 29961-29970, 2008）。
図１上段に大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）の構造を示し、図１下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ４、Ｎ５、Ｃ３、Ｃ４では抗ＨＳＦ１抗体によるバンドが検出されず、ＨＳＦ１が共沈降していなかった。従って、図１のＣ４の右下に記載した横線に示すように、マウスＲＰＡ１の１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン（ｓｓＤＮＡ結合ドメイン）Ａ−Ｂにおける２２８位から３９１位のアミノ酸がヒトＨＳＦ１と相互作用することが明らかとなった。
大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及びＧＳＴ−マウスＲＰＡ１欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５、ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合ＲＰＡ１タンパク質を沈降し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓが共沈降するかどうか調べた（GST-pull down assay）。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）または抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。抗ＨＳＦ１抗体は、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem.283, 29961-29970, 2008）。
図１上段に大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）の構造を示し、図１下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ４、Ｎ５、Ｃ３、Ｃ４では抗ＨＳＦ１抗体によるバンドが検出されず、ＨＳＦ１が共沈降していなかった。従って、図１のＣ４の右下に記載した横線に示すように、マウスＲＰＡ１の１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン（ｓｓＤＮＡ結合ドメイン）Ａ−Ｂにおける２２８位から３９１位のアミノ酸がヒトＨＳＦ１と相互作用することが明らかとなった。
次に、大腸菌で合成したＧＳＴ−ヒトＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及びＧＳＴ−ヒトＨＳＦ１の欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ３）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したマウスＲＰＡ１（ＲＰＡ１−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合ＨＳＦ１タンパク質を沈降し、ＲＰＡ１−Ｈｉｓが共沈降するかどうか調べた。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＲＰＡ１抗体（sc-28304, Santa Cruze社製）または抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。
図２上段に合成したＧＳＴ−ＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及び欠損変異体Ｎ１−Ｎ３，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ３）の構造を示し、図２下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３では抗ＲＰＡ１抗体によるバンドが検出されず、ＲＰＡ１が共沈降していなかった。従って、図２のＣ３の下側に記載した横線に示すように、ヒトＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）における１位から１２０位のアミノ酸がマウスＲＰＡ１と相互作用することが明らかとなった。
図２上段に合成したＧＳＴ−ＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及び欠損変異体Ｎ１−Ｎ３，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ３）の構造を示し、図２下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３では抗ＲＰＡ１抗体によるバンドが検出されず、ＲＰＡ１が共沈降していなかった。従って、図２のＣ３の下側に記載した横線に示すように、ヒトＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）における１位から１２０位のアミノ酸がマウスＲＰＡ１と相互作用することが明らかとなった。
［ＨＳＦ１とＰＲＡ１との相互作用領域の特定］
ＨＳＦ１とＰＲＡ１との相互作用領域をさらに特定するために、他のＨＳＦ群との相互作用を調べた。
ＨＳＦ１とＰＲＡ１との相互作用領域をさらに特定するために、他のＨＳＦ群との相互作用を調べた。
（１）マウスＲＰＡ１とヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）、ヒトＨＳＦ２（ｈＨＳＦ２）、ヒトＨＳＦ４（ｈＨＳＦ４）との相互作用
大腸菌で合成したＧＳＴ、マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ５）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ２（ＨＳＦ２−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ４（ＨＳＦ４−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4Bカラムを用いてGST-pull down assayを行った。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）、抗ＨＳＦ２抗体（α−ｍＨＳＦ２−４）、抗ＨＳＦ４抗体（α−ｈＨＳＦ４ｂ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。α−ｍＨＳＦ１ｊ、α−ｍＨＳＦ２−４及びα−ｈＨＳＦ４ｂについては、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 283, 29961-29970, 2008）。
結果を図３上段Ａに示す。マウスＲＰＡ１はヒトＨＳＦ１と共にヒトＨＳＦ４とは相互作用するが、ヒトＨＳＦ２とは相互作用しないことが明らかとなった。
大腸菌で合成したＧＳＴ、マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ５）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ２（ＨＳＦ２−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ４（ＨＳＦ４−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4Bカラムを用いてGST-pull down assayを行った。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）、抗ＨＳＦ２抗体（α−ｍＨＳＦ２−４）、抗ＨＳＦ４抗体（α−ｈＨＳＦ４ｂ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。α−ｍＨＳＦ１ｊ、α−ｍＨＳＦ２−４及びα−ｈＨＳＦ４ｂについては、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 283, 29961-29970, 2008）。
結果を図３上段Ａに示す。マウスＲＰＡ１はヒトＨＳＦ１と共にヒトＨＳＦ４とは相互作用するが、ヒトＨＳＦ２とは相互作用しないことが明らかとなった。
（２）ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列比較
次に、ヒトＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した。図３下段Ｂにおいて、すべてで一致するアミノ酸を黒背景、２つのみで一致するアミノ酸を灰色背景で示し、αヘリックス（Ｈ１−Ｈ３）、βシート（β１−β４）、８４位から９６位の１３アミノ酸からなるｗｉｎｇ領域、ｌｉｎｋｅｒを示す。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。
真核細胞のＨＳＦ群のＤＮＡ結合ドメインはｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘ型の構造を持ち進化の過程でよく保存されている。そのドメインを構成するアミノ酸のうち、ヒトＨＳＦ１とヒトＨＳＦ４で一致するが、ヒトＨＳＦ２で異なるものは１５カ所になる。その中から類似のアミノ酸を除いた１０カ所の場所のヒトＨＳＦ１のアミノ酸をそれぞれヒトＨＳＦ２のアミノ酸に置換し（図３下段Ｂのドット）、ＨＥＫ２９３細胞でのマウスＲＰＡ１との相互作用を以下の方法で調べた。
次に、ヒトＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した。図３下段Ｂにおいて、すべてで一致するアミノ酸を黒背景、２つのみで一致するアミノ酸を灰色背景で示し、αヘリックス（Ｈ１−Ｈ３）、βシート（β１−β４）、８４位から９６位の１３アミノ酸からなるｗｉｎｇ領域、ｌｉｎｋｅｒを示す。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。
真核細胞のＨＳＦ群のＤＮＡ結合ドメインはｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘ型の構造を持ち進化の過程でよく保存されている。そのドメインを構成するアミノ酸のうち、ヒトＨＳＦ１とヒトＨＳＦ４で一致するが、ヒトＨＳＦ２で異なるものは１５カ所になる。その中から類似のアミノ酸を除いた１０カ所の場所のヒトＨＳＦ１のアミノ酸をそれぞれヒトＨＳＦ２のアミノ酸に置換し（図３下段Ｂのドット）、ＨＥＫ２９３細胞でのマウスＲＰＡ１との相互作用を以下の方法で調べた。
（３）ベクターの作製
Ｃ末端にＨＡ標識した野生型ヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、変異体（Ｅ８５Ｄ−ＨＡ：８５位のグルタミン酸をアスパラギン酸、Ｇ８７Ｓ−ＨＡ：８７位のグリシンをセリン、Ｐ９２Ｑ−ＨＡ：９２位のプロリンをグルタミン、Ｇ８７Ａ−ＨＡ：８７位のグリシンをアラニンに置換）を挿入したヒトＨＳＦ１−ＨＡのｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）をＰＣＲにより作製し、pcDNA3.1/Neoベクター（Invitrogen社製）へ挿入して細胞での発現ベクターを構築した。
Ｃ末端にＨＡ標識した野生型ヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、変異体（Ｅ８５Ｄ−ＨＡ：８５位のグルタミン酸をアスパラギン酸、Ｇ８７Ｓ−ＨＡ：８７位のグリシンをセリン、Ｐ９２Ｑ−ＨＡ：９２位のプロリンをグルタミン、Ｇ８７Ａ−ＨＡ：８７位のグリシンをアラニンに置換）を挿入したヒトＨＳＦ１−ＨＡのｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）をＰＣＲにより作製し、pcDNA3.1/Neoベクター（Invitrogen社製）へ挿入して細胞での発現ベクターを構築した。
（４）細胞培養
本発明の実施例に用いる野生型及びＨＳＦ１−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＨＥＫ２９３、ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａは、１０％胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
本発明の実施例に用いる野生型及びＨＳＦ１−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＨＥＫ２９３、ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａは、１０％胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
（５）ＨＥＫ２９３細胞への導入及び免疫沈降
ＨＥＫ２９３細胞へヒトＨＳＦ１−ＨＡあるいはその変異体の発現ベクターをリン酸カルシウム法で導入して細胞抽出液を作製した。その後抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を用いて抗ＲＰＡ抗体、あるいは抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットした。
ＨＥＫ２９３細胞へヒトＨＳＦ１−ＨＡあるいはその変異体の発現ベクターをリン酸カルシウム法で導入して細胞抽出液を作製した。その後抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を用いて抗ＲＰＡ抗体、あるいは抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットした。
図４Ａに示す通り、８７番目のグリシンをセリンに置換すると複合体形成がなくなることがわかった。さらに、同じアミノ酸をアラニン置換しても複合体形成を認めなかった。つまり、ヒトＨＳＦ１は８７番目のグリシンが存在するｗｉｎｇ領域を介してマウスＲＰＡ１と相互作用することが示された。
（６）ゲルシフトアッセイによるＤＮＡ活性
次に、ＨＳＦ１欠損（−／−）ＭＥＦ細胞（Inouye et al. J. Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）へ（３）ベクターの作製に記載したｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）およびＧＦＰのｃＤＮＡ（配列番号２７）をpShuttle-CMVベクター(Stratagene社製)へ挿入して作製したアデノウイルスベクターを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異体、またはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。この細胞あるいは野生型ＭＥＦ細胞の抽出液を作製し、３２Ｐ−ＨＳＥオリゴヌクレオチドをプローブとしてゲルシフトアッセイを行うことでＤＮＡ結合活性を調べた。ＨＳＦ１の結合活性（ＨＳＦ１）とフリー（ｆｒｅｅ）のプローブの位置を示す。また、ウエスタンブロットによりＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチン（actin）のタンパク質量を調べた。結果を図４Ｂに示す。
このｗｉｎｇ領域はＤＮＡ結合ドメインの一部であるが、その変異はＤＮＡ結合活性には影響を及ぼさないことが明らかとなった。つまり、ｗｉｎｇ領域はＨＳＦ１と相互作用する役割を特異的に担うことが強く示された。
次に、ＨＳＦ１欠損（−／−）ＭＥＦ細胞（Inouye et al. J. Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）へ（３）ベクターの作製に記載したｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）およびＧＦＰのｃＤＮＡ（配列番号２７）をpShuttle-CMVベクター(Stratagene社製)へ挿入して作製したアデノウイルスベクターを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異体、またはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。この細胞あるいは野生型ＭＥＦ細胞の抽出液を作製し、３２Ｐ−ＨＳＥオリゴヌクレオチドをプローブとしてゲルシフトアッセイを行うことでＤＮＡ結合活性を調べた。ＨＳＦ１の結合活性（ＨＳＦ１）とフリー（ｆｒｅｅ）のプローブの位置を示す。また、ウエスタンブロットによりＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチン（actin）のタンパク質量を調べた。結果を図４Ｂに示す。
このｗｉｎｇ領域はＤＮＡ結合ドメインの一部であるが、その変異はＤＮＡ結合活性には影響を及ぼさないことが明らかとなった。つまり、ｗｉｎｇ領域はＨＳＦ１と相互作用する役割を特異的に担うことが強く示された。
（７）真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の比較
真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した（図４Ｃ）。すべての種で一致するアミノ酸を黒背景、一部の種で一致するアミノ酸を灰色背景で示す。ｈ、ヒト；ｍ、マウス；ｃ、ニワトリ；Ｃｅ、線虫；Ｓｃ、出芽酵母。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。黒ドットは、ｗｉｎｇ領域のうちすべての種で保存されたアミノ酸（グリシン、ヒトＨＳＦ１の８７番目のアミノ酸）を示す。
興味深いことに、この８７番目のグリシンは、酵母からヒトまですべての種のＨＳＦ１で保存されており、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が真核細胞で普遍的であることを示唆する。
真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した（図４Ｃ）。すべての種で一致するアミノ酸を黒背景、一部の種で一致するアミノ酸を灰色背景で示す。ｈ、ヒト；ｍ、マウス；ｃ、ニワトリ；Ｃｅ、線虫；Ｓｃ、出芽酵母。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。黒ドットは、ｗｉｎｇ領域のうちすべての種で保存されたアミノ酸（グリシン、ヒトＨＳＦ１の８７番目のアミノ酸）を示す。
興味深いことに、この８７番目のグリシンは、酵母からヒトまですべての種のＨＳＦ１で保存されており、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が真核細胞で普遍的であることを示唆する。
［ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体の遺伝子発現制御］
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体が遺伝子発現制御を行っているかを明らかにする目的で、まずマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）において、以下の方法によりマウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）又はマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）それぞれの遺伝子ノックダウン後にＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体が遺伝子発現制御を行っているかを明らかにする目的で、まずマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）において、以下の方法によりマウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）又はマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）それぞれの遺伝子ノックダウン後にＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
（１）ＲＮＡ干渉、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮＡ定量
本発明の実施例に用いるヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）、マウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）、そしてマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のアデノウイルス発現ベクターは、以下の文献の記載に従って作製した（Fujimoto et al. Mol. Biol. Cell 21, 106-116, 2010）。ＭＥＦ細胞に、作製したAd-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して７０時間維持して細胞を回収した。RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いてＲＮＡを抽出し、GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array（28,853遺伝子をカバー）（Affymetrix社製)を用いて遺伝子発現解析を行った。遺伝子のfold−changeの解析には、ソフトウエアーPartek Genomics Suite 6.5（Partek社製）を用いた。
遺伝子発現を確認するために、まずＭＥＦ細胞に作製したAd-sh-SCR、Ad-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して２２時間維持した。次に、Ad-GFP、Ad-hHSF1-HA、Ad-hHSF1G87S-HA、Ad-hHSF1G87A-HAを２時間感染させて新しい培地に交換して４６時間維持した。これらの細胞を回収してＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen社製）を用いてＲＮＡを回収し、以下の文献の記載に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った（Inouye et al. Ｊ.Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）。一部の細胞からはタンパク質を抽出してウエスタンブロッティングを行った。
本発明の実施例に用いるヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）、マウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）、そしてマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のアデノウイルス発現ベクターは、以下の文献の記載に従って作製した（Fujimoto et al. Mol. Biol. Cell 21, 106-116, 2010）。ＭＥＦ細胞に、作製したAd-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して７０時間維持して細胞を回収した。RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いてＲＮＡを抽出し、GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array（28,853遺伝子をカバー）（Affymetrix社製)を用いて遺伝子発現解析を行った。遺伝子のfold−changeの解析には、ソフトウエアーPartek Genomics Suite 6.5（Partek社製）を用いた。
遺伝子発現を確認するために、まずＭＥＦ細胞に作製したAd-sh-SCR、Ad-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して２２時間維持した。次に、Ad-GFP、Ad-hHSF1-HA、Ad-hHSF1G87S-HA、Ad-hHSF1G87A-HAを２時間感染させて新しい培地に交換して４６時間維持した。これらの細胞を回収してＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen社製）を用いてＲＮＡを回収し、以下の文献の記載に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った（Inouye et al. Ｊ.Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）。一部の細胞からはタンパク質を抽出してウエスタンブロッティングを行った。
（３）解析結果
結果を図５Ａに示す。発現が１．３倍以下となるものは、ｍＲＰＡ１ノックダウンで１，６７０遺伝子、ｍＨＳＦ１ノックダウンで５６４遺伝子であった。驚くべきことに、ｍＨＳＦ１ノックダウンで発現低下する遺伝子のうち、７０％もの遺伝子がｍＲＰＡ１ノックダウンで発現低下していた。このことは、同じ遺伝子の発現をＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が制御することを示唆している。
ノックダウンによって発現が２．０倍以下となる顕著なものは３３遺伝子あり、そのうち５遺伝子(Sncaip、Lrrn4、Fmod、Abi3bp、Slc44a5)についてその発現をさらに詳細に検討した（図５Ｂ、Ｃ）。
結果を図５Ａに示す。発現が１．３倍以下となるものは、ｍＲＰＡ１ノックダウンで１，６７０遺伝子、ｍＨＳＦ１ノックダウンで５６４遺伝子であった。驚くべきことに、ｍＨＳＦ１ノックダウンで発現低下する遺伝子のうち、７０％もの遺伝子がｍＲＰＡ１ノックダウンで発現低下していた。このことは、同じ遺伝子の発現をＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が制御することを示唆している。
ノックダウンによって発現が２．０倍以下となる顕著なものは３３遺伝子あり、そのうち５遺伝子(Sncaip、Lrrn4、Fmod、Abi3bp、Slc44a5)についてその発現をさらに詳細に検討した（図５Ｂ、Ｃ）。
図５Ｂの遺伝子のうち発現変化が顕著な５つ(Sncaip、Lrrn4、Fmod、Abi3bp、Slc44a5)の遺伝子についてＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体への依存性を詳細に解析した。ＭＥＦ細胞にアデノウイルスを用いてマウスＨＳＦ１あるいはマウスＲＰＡ１の遺伝子ノックダウンを行った。
ＨＳＦ１をノックダウンした細胞へ、やはりアデノウイルスを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異型ＨＳＦ１（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）、あるいはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。これらの細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を調べた。ＨＳＦ１、ＲＰＡ１、ＧＦＰ、β−アクチンの量はウエスタンブロッティングで調べた。結果を図５Ｃに示す。まず、ｍＨＳＦ１あるいはｍＲＰＡ１のノックダウンは確かにそれらの遺伝子発現を低下させた。ｍＨＳＦ１をノックダウンしたＭＥＦ細胞へ、ｈＨＳＦ１を再導入すると発現は元のレベルまで回復した。しかし、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は遺伝子発現を回復させることはなかった。この結果は、ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体による遺伝子発現の調節にｗｉｎｇ領域を介した相互作用が必要であることが示された。
ＨＳＦ１をノックダウンした細胞へ、やはりアデノウイルスを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異型ＨＳＦ１（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）、あるいはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。これらの細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を調べた。ＨＳＦ１、ＲＰＡ１、ＧＦＰ、β−アクチンの量はウエスタンブロッティングで調べた。結果を図５Ｃに示す。まず、ｍＨＳＦ１あるいはｍＲＰＡ１のノックダウンは確かにそれらの遺伝子発現を低下させた。ｍＨＳＦ１をノックダウンしたＭＥＦ細胞へ、ｈＨＳＦ１を再導入すると発現は元のレベルまで回復した。しかし、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は遺伝子発現を回復させることはなかった。この結果は、ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体による遺伝子発現の調節にｗｉｎｇ領域を介した相互作用が必要であることが示された。
［ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用とがん細胞の増殖］
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１の特異的な相互作用とがん細胞の増殖とが関連するかを調べた。
（１）がん細胞の増殖と腫瘍形成
ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬaに、まずＳＣＲ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡ）あるいはＨＳＦ１ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを２時間感染させて培地を替えて２２時間維持した。次に、ＧＦＰ、野生型ＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、あるいは変異体（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）のアデノウイルス発現ベクターを２時間感染させ、培地を替えて４６時間維持した（この時点で合計７２時間）。この細胞をまき直して時間を追って細胞数を計測した（図６上段）。＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定）。また、ウエスタンブロッティングにより合計７２時間の時点でのＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチンの発現量を調べた（図６下段）。さらに、ＨＭＶ-１細胞を用いて胸腺を持たないヌードマウスへの移植実験を行った。上記の通り処理した細胞（２×１０６ ｉｎ １００ｍｌ ＰＢＳ）を等量のマトリゲル（BD Biosciences社製）と混合し、２３ゲージの注射針を用いて５週齢のヌードマウスの皮下へ注入した。腫瘍の容量（高さ×幅２÷２）は皮下中の後２８日まで計測した。２８日後には腫瘍を取り出し重量を計測した。
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１の特異的な相互作用とがん細胞の増殖とが関連するかを調べた。
（１）がん細胞の増殖と腫瘍形成
ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬaに、まずＳＣＲ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡ）あるいはＨＳＦ１ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを２時間感染させて培地を替えて２２時間維持した。次に、ＧＦＰ、野生型ＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、あるいは変異体（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）のアデノウイルス発現ベクターを２時間感染させ、培地を替えて４６時間維持した（この時点で合計７２時間）。この細胞をまき直して時間を追って細胞数を計測した（図６上段）。＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定）。また、ウエスタンブロッティングにより合計７２時間の時点でのＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチンの発現量を調べた（図６下段）。さらに、ＨＭＶ-１細胞を用いて胸腺を持たないヌードマウスへの移植実験を行った。上記の通り処理した細胞（２×１０６ ｉｎ １００ｍｌ ＰＢＳ）を等量のマトリゲル（BD Biosciences社製）と混合し、２３ゲージの注射針を用いて５週齢のヌードマウスの皮下へ注入した。腫瘍の容量（高さ×幅２÷２）は皮下中の後２８日まで計測した。２８日後には腫瘍を取り出し重量を計測した。
（２）がん細胞の増殖結果
ヒトメラノーマ細胞株であるＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａにおいてＨＳＦ１をノックダウンすると増殖が著しく低下したが（図６上段）、これらの細胞へｈＨＳＦ１を再導入すると増殖はかなりのレベルまで回復した。ところが、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は細胞増殖をまったく回復させることはなかった。つまり、ヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。なお、野生型のｈＨＳＦ１を再導入した場合でも全体としては完全なレベルにまでは回復しないのは、遺伝子導入高率には、個々の細胞によって差があるためである。
ヒトメラノーマ細胞株であるＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａにおいてＨＳＦ１をノックダウンすると増殖が著しく低下したが（図６上段）、これらの細胞へｈＨＳＦ１を再導入すると増殖はかなりのレベルまで回復した。ところが、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は細胞増殖をまったく回復させることはなかった。つまり、ヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。なお、野生型のｈＨＳＦ１を再導入した場合でも全体としては完全なレベルにまでは回復しないのは、遺伝子導入高率には、個々の細胞によって差があるためである。
（３）ＨＭＶ−１細胞を用いたヌードマウスへの移植実験結果
図７Ａは、代表的な腫瘍を形成したマウス及び摘出した腫瘍の写真（２８日後）を２個体ずつ示し、図７Ｂは、腫瘍の容量変化の時間経過を示し、（＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定））、図７Ｃは、腫瘍の重量（２８日後）を示す。Ｂａｒは平均値を示す。本実験から、マウスにおいてもヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。個体での腫瘍形成には、細胞増殖以外にも血管形成、細胞浸潤など宿主との相互作用を含む多くの要因が関係している。この実験結果は、複合的な要因が関連するヒトのがんの進展においてＨＳＦ１が重要な役割を担うことを強く示すだけでなく、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用阻害剤のがん進展への抑制効果を実証する優れた実験系を提供する。
図７Ａは、代表的な腫瘍を形成したマウス及び摘出した腫瘍の写真（２８日後）を２個体ずつ示し、図７Ｂは、腫瘍の容量変化の時間経過を示し、（＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定））、図７Ｃは、腫瘍の重量（２８日後）を示す。Ｂａｒは平均値を示す。本実験から、マウスにおいてもヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。個体での腫瘍形成には、細胞増殖以外にも血管形成、細胞浸潤など宿主との相互作用を含む多くの要因が関係している。この実験結果は、複合的な要因が関連するヒトのがんの進展においてＨＳＦ１が重要な役割を担うことを強く示すだけでなく、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用阻害剤のがん進展への抑制効果を実証する優れた実験系を提供する。
［ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用を阻害するポリペプチド］
これまでの結果から、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物はがん細胞の増殖を抑制できることが示された。そこで、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域あるいはＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−Ｂがこのような化合物のターゲットとなりうるかを明らかに知るために、ＥＬＩＳＡ法を用いてＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用の競合実験を行った。
これまでの結果から、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物はがん細胞の増殖を抑制できることが示された。そこで、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域あるいはＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−Ｂがこのような化合物のターゲットとなりうるかを明らかに知るために、ＥＬＩＳＡ法を用いてＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用の競合実験を行った。
（１）ＥＬＩＳＡ法
９６−ウェルプレートに精製したＨＳＦ１-Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＧＳＴあるいはＧＳＴ-ＲＰＡ１（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）を混合した。ウサギ抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）及びペルオキシダーゼ結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（Catalog番号:55676、 Cappel社製）で処理し、o-phenylenediamineを基質として発色させて吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。競合実験を行う際は、ヒトＲＰＡ１の２２８位から３９１位のペプチドからなるＲＰＡ１であるＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはヒトＲＰＡ１の２３８位及び２６９位のフェニルアラニンをアラニンに変異させた変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）をＧＳＴ-ＲＰＡとともに９６−ウェルプレートへ混合した。
一方、ＨＳＦ１の一部分との競合実験を行うために、９６−ウェルプレートに精製したＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）と共にＨＳＦ１−ＤＢＤ（１−１２９）−Ｈｉｓあるいはその８７位のグリシンをセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓ、または配列番号１に記載の１３アミノ酸からなる合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいは配列番号１の４番目のグリシン残基をセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（純度９０％以上、株式会社スクラム社委託品）を混合した。一次抗体には抗ＨＳＦ１抗体を用いた。結果を図８に示す。
９６−ウェルプレートに精製したＨＳＦ１-Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＧＳＴあるいはＧＳＴ-ＲＰＡ１（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）を混合した。ウサギ抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）及びペルオキシダーゼ結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（Catalog番号:55676、 Cappel社製）で処理し、o-phenylenediamineを基質として発色させて吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。競合実験を行う際は、ヒトＲＰＡ１の２２８位から３９１位のペプチドからなるＲＰＡ１であるＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはヒトＲＰＡ１の２３８位及び２６９位のフェニルアラニンをアラニンに変異させた変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）をＧＳＴ-ＲＰＡとともに９６−ウェルプレートへ混合した。
一方、ＨＳＦ１の一部分との競合実験を行うために、９６−ウェルプレートに精製したＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）と共にＨＳＦ１−ＤＢＤ（１−１２９）−Ｈｉｓあるいはその８７位のグリシンをセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓ、または配列番号１に記載の１３アミノ酸からなる合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいは配列番号１の４番目のグリシン残基をセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（純度９０％以上、株式会社スクラム社委託品）を混合した。一次抗体には抗ＨＳＦ１抗体を用いた。結果を図８に示す。
ＥＬＩＳＡ法によりＨＳＦ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＲＰＡ１（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μg）の相互作用を定量化した（図８Ａ）。図８Ａから分かるように、ＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＲＰＡ１は０．５μｇで定量性があった。次に、ＨＳＦ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＧＳＴ−ＲＰＡ１（０．５μｇ）の相互作用に対するＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはその変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）の競合活性を調べた。ＧＳＴ−ＲＰＡ１とＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）のモル比を示す（図８Ｂ）。
また、ＥＬＩＳＡ法によりＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μg）の相互作用を定量化した（図８Ｃ）。図８Ｃから分かるように、ＨＳＦ１−Ｈｉｓは０．５μｇで定量性があった。次に、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対するＨＳＦ１−ＤＢＤ−Ｈｉｓあるいはその変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓの競合活性を調べた（図８Ｄ）。ＨＳＦ１−ＨｉｓとＨＳＦ１−ＤＢＤ−ＨｉｓあるいはＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−ＨｉｓＲＰＡ１（２２８−３９１）のモル比を示す。
さらに、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対する合成ポリペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはその変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（ともに１３アミノ酸からなる）の競合活性を調べた。ＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕのモル比を示す。Ｂ、Ｄ、Ｅともに＊はＰ＜０．０１を示している（図８Ｅ）。
これらの結果、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２２８から３９１）だけでなく、１３アミノ酸からなる短い合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇもＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用と競合することが明らかとなった。この結果は、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域及びＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−ＢがＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物のターゲットとなりうることを示している。
また、ＥＬＩＳＡ法によりＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μg）の相互作用を定量化した（図８Ｃ）。図８Ｃから分かるように、ＨＳＦ１−Ｈｉｓは０．５μｇで定量性があった。次に、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対するＨＳＦ１−ＤＢＤ−Ｈｉｓあるいはその変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓの競合活性を調べた（図８Ｄ）。ＨＳＦ１−ＨｉｓとＨＳＦ１−ＤＢＤ−ＨｉｓあるいはＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−ＨｉｓＲＰＡ１（２２８−３９１）のモル比を示す。
さらに、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対する合成ポリペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはその変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（ともに１３アミノ酸からなる）の競合活性を調べた。ＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕのモル比を示す。Ｂ、Ｄ、Ｅともに＊はＰ＜０．０１を示している（図８Ｅ）。
これらの結果、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２２８から３９１）だけでなく、１３アミノ酸からなる短い合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇもＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用と競合することが明らかとなった。この結果は、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域及びＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−ＢがＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物のターゲットとなりうることを示している。
これまでの研究と本発明をまとめると、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体はいくつかの因子を呼び込むことでヌクレオソーム構造をとるＤＮＡに結合し、構成的な遺伝子発現を誘導する（図９）。それががん細胞の増殖を支えることが明らかとなった。
本発明のペプチド又はその塩は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害することで、抗腫瘍剤や、非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法に利用される。
Claims (10)
- 以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのペプチド又はその塩。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド； - ペプチドが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することを特徴とする請求項１記載のペプチド又はその塩。
- 以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド； - 請求項３記載のＤＮＡを含み、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドを発現することができる組換えベクター。
- 請求項１又は２記載のペプチド又はその塩を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤。
- 請求項１又は２記載のペプチド又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤。
- 請求項１又は２記載のペプチド又はその塩に特異的に結合する抗体。
- 請求項１又は２記載のペプチド又はその塩を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法。
- 次の工程（Ａ）、（Ｂ）を順次備えたことを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ１とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；
（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程； - ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることを特徴とする、請求項９記載のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012152395A JP6019530B2 (ja) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012152395A JP6019530B2 (ja) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014014288A true JP2014014288A (ja) | 2014-01-30 |
| JP6019530B2 JP6019530B2 (ja) | 2016-11-02 |
Family
ID=50109606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012152395A Expired - Fee Related JP6019530B2 (ja) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6019530B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012511048A (ja) * | 2008-12-08 | 2012-05-17 | ノースウェスタン ユニバーシティ | Ｈｓｆ−１の改変方法 |
-
2012
- 2012-07-06 JP JP2012152395A patent/JP6019530B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012511048A (ja) * | 2008-12-08 | 2012-05-17 | ノースウェスタン ユニバーシティ | Ｈｓｆ−１の改変方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6016011050; ＢＭＢ２０１０ 講演要旨集 , 2010, 講演番号：２Ｔ８-１（１Ｐ-０７００） * |
| JPN6016011051; Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ．１５， ｎｏ．６, 1995, ｐｐ．３３５４-３３６２ * |
| JPN6016011054; Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ：８９６９４７, 2011, ｐｐ．１-１４ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6019530B2 (ja) | 2016-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5589149B2 (ja) | 癌に関与するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列 | |
| KR101031025B1 (ko) | 사람 결장암에 관계하는 유전자 및 폴리펩티드 | |
| JP5167464B2 (ja) | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド | |
| JP2006517783A (ja) | ヒト骨髄性白血病に関連する遺伝子およびポリペプチド | |
| US20120041175A1 (en) | Novel autography regulators atg14l and rubicon | |
| JP2010531662A (ja) | Ｐ５３のモジュレータ及び癌の標的であるｔｒｉｍ２４（ｔｉｆ−１ａ） | |
| JP6019530B2 (ja) | Ｈｓｆ１とｒｐａ１との相互作用阻害ペプチド | |
| RU2465330C1 (ru) | СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ ИЛИ МИГРАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ СНИЖЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО УРОВНЯ ЛИЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ВЕКТОРА ЭКСПРЕССИИ ИЛИ АНТИТЕЛА ПРОТИВ KRS ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ ИЛИ МИГРАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК | |
| WO2005111213A1 (ja) | Ｍｙｃ標的遺伝子mimitin | |
| US20100008926A1 (en) | Novel proteins and use thereof | |
| Al Moussawi et al. | Mutant Ras and inflammation-driven skin tumorigenesis is suppressed via a JNK-iASPP-AP1 axis | |
| US20090087423A1 (en) | Novel protein complex and use thereof | |
| US20070275888A1 (en) | Preventive/Remedy for Cancer | |
| JP4530631B2 (ja) | 新規タンパク質および癌の予防・治療剤 | |
| US7723496B2 (en) | Preventives/remedies for cancer | |
| WO2004058969A1 (ja) | がんの予防・治療剤 | |
| WO2005030805A1 (ja) | 新規タンパク質複合体およびその用途 | |
| JP2005120082A (ja) | 新規タンパク質複合体およびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150619 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160229 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160324 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160511 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160905 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160916 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6019530 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |