JP2013542730A - 生体分子の特徴を評価するためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本方法は、前記損傷部位で標識を組み込む工程と、前記損傷の存在および程度を決定するために前記標識をイメージングする工程とを含む。本システムは、単一分子上で損傷評価を実施できる機器を含む。
【選択図】 図2
Description
本研究は、米国立衛生研究所助成金番号第2R44H004199−03−NIH/NHGRI号、米国立標準技術研究所助成金番号第70NANB7H7O27N NIST−ATP 2007号、および米国立衛生研究所助成金番号第1R43HG004817−01 NIH/DHHS号による支援を受けた。よって米国政府は、本開示に所定の権利を有するものである。
本出願は、2010年10月27日付で出願された米国特許出願第61/407,302号、「Nanoanalyzer Systems and Methods」、2010年10月20日付で出願された米国特許出願第61/394,915号、「DNA Damage Detection in Nanochannel Array」、2010年10月27日付で出願された米国特許出願第61/407,182号、「Single Molecule DNA Nanochannel Analysis for Genomic Studies」、および2010年12月1日付で出願された米国特許出願第61/418,516号、「DNA Damage Detection in Nanochannel Array」に対する優先権を主張するものである。これらの出願は、ありとあらゆる目的のためにこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本システムは、様々な波長の複数の照明(例、レーザ)光源を含むことができる。各光源は、順に様々なスペクトル特徴を備える蛍光色素を蛍光的に励起することができる。レーザは、ダイオード励起の固体レーザおよびダイオードレーザを含む、同一または異なるタイプのレーザであってよい。典型的な波長は、UVから赤外線の範囲にわたる。非レーザ光源、例えばランプおよびLEDsもまた蛍光イメージングのための励起光源として使用できる。複数の波長を使用すると、蛍光を発光する、またはさもなければ相違する波長で相互から視認できる標識またはタグを照明することができる。例えば、300nmまたは500nmでの放射線の適用はユーザにそれらの波長の内の1つで蛍光を発光するプローブ(もしあれば)の位置を特定することを可能にする。この方法で、ユーザは、特定プローブ(例、アデノシド塩基に付着したプローブ)が前記サンプル上または特定の位置にさえ存在するかしないかを迅速に決定するためにサンプルへ様々な波長を適用することができる。様々なプローブを様々な塩基に付着させることによって、ユーザは次に、サンプルを照明して前記ユーザがサンプル内に組み込もうとした特定塩基の位置(若しくは不在)を適切に決定することができる。
ナノチャネルアレイの広範囲の照明を達成するために、本システムは、レーザビームの直径を拡大して視野をより均一に照明するためにビーム拡大光学機器をさらに含むことができる。ケプラー式およびガリレイ式ビームエクスパンダのどちらも使用できる。典型的な拡大率は、1×〜30×の範囲に及ぶ。必要に応じて、高レーザ強度を必要とする用途のためには、ビーム走査光学機器を組み込むことができる。ビーム走査は、走査ミラー、マイクロミラーまたは当業者には公知の他のビーム偏向システムによって実施できる。
ここに開示したシステムの一部の実施形態のまた別の特徴は、蛍光単一分子を連続してイメージングするための広範囲落射照明の使用である。多数の単一分子イメージング用途では、イメージングのために内部全反射(total internal reflection:TIRF)スキームが使用される。そのようなスキームでは、入射励起光線は前記サンプル領域内に前記光線のほんの一部分だけが浸透することを許容する角度で前記イメージング平面に衝突する。
オートフォーカスシステムは、イメージングレンズとサンプル表面との間隔を監視するための多位置センサと結合された別個の赤外線レーザを使用できる。本システムは、本システムの全ての他の部品から自律的にランし、一次フォーカシング(つまり、正確な焦点位置を見つける)を実施して、いったん見いだした焦点位置を追跡することができる。本システムは、100Hzの周波数では10nmの精度で補正できるが、100nm、または1000若しくは5000nmさえの精度が適切であるので、そのような精度は要件ではない。100Hz未満(例えば、50Hz、20Hz、10Hz、または5若しくは1Hzさえ)の周波数が適切である。そのような精度調整は、主イメージングレンズの動作を正確にコントロールする圧電駆動部を使用して達成される。本オートフォーカスシステムは、ナノチャネルアレイとともに作動するように適応させることができる。前記アレイの特定形状は、オートフォーカスユニットによって対応されなければならない光学的応答を生じさせる。100nm未満の特徴は珍しくない。各視野の明確な焦点は、1、10、20、50、または100フレーム/秒の捕捉率でイメージングしながら対物レンズの上方で前記アレイを動的に移動させることによって維持することができる。本オートフォーカスシステムは、サンプルの信頼できる堅固なイメージングおよび画像分析を可能にする。典型的なシステムは、2010年5月18日付で出願され、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第PCT/US2010/035253号、「Devices And Methods For Dynamic Determination Of Sample Spatial Orientation And Dynamic Repositioning」に規定されている。
本システムは、様々な波長の蛍光シグナルを検出するために設計されている。多位置高速フィルタホイールは、多重化を可能にする複数(例、10)の蛍光色の識別を可能にする。有機蛍光体、量子ドット、デンドリマー、蛍光ビーズ、および金属ドットを含む多数の様々な蛍光部分を使用できる。本システムは、単一蛍光体レベルでの感度を送達できる。最適構造は、蛍光部分の性質およびアッセイの要件に左右されることになる。これはユーザが、一部の実施形態では、サンプル中に存在する単一標識(例、塩基に結合した蛍光体)の存在を検出することを可能にする。
本システムは、個別蛍光分子の画像を記録するためのカメラもまた含むことができる。蛍光染色および染料の全発光スペクトルをカバーする高量子効率を備える電子増倍CCDカメラが特に適切であると考えられる。だが他のタイプのカメラおよび検出器具もまた性能および効率の弱点に適応させることができる。カメラは、さらに熱の衝撃を最小限に抑えて電子雑音を最小限に抑えるために室温より低い温度に冷却されてもよい。カメラを冷却するためには、約−20℃〜約−100℃の温度を使用できる。蛍光感度に関する要求が少ない用途のためには、電子増倍能力を備えない検出器が適切である。これらには、従来型CCDs、CMOS検出器、光電子増倍管、およびフォトダイオードが含まれる。本システムは、光子計数能力を含むことができ、その能力は所定の単一分子分析用途のために有用である。そのような適切な器具の供給業者には、Princeton Instruments Cascade社、浜松ホトニクス(Hamamatsu)ImagEM社、Andor iXon社、およびNeo SCMOS社が含まれる。
本システムは、適切には1つの視野から次の視野へ移動する場合に100nm未満の精度が可能なXYステージを含むが、数十nm、数百nm、または数千nmさえの範囲内の精度が適切である。本ステージは、ナノチャネル・アレイ・チップに適応させることができる。データ収集中、本ステージ(一部の実施形態では)は、その間にナノチャネルアレイが部分的または全体的にイメージングされるラスタ走査ルーチンを実行する。ナノチャネルのアレイ全体を扱えるように複数の画像を収集できる。これらの画像は、次にアレイ全体の複合図を生成するためにとじ合わされる。ステージの精度は、画像のとじ合わせを可能にする。とじ合わされた画像は、単一視野、つまりDNAの1MBフラグメントより大きな生体分子の検出を可能にする。典型的な画像は図11に図示されており、この図はポリヌクレオチドの様々な領域上の様々な標識の存在の視覚表示を示している。様々なポリヌクレオチドセグメントは、例えば前記ポリヌクレオチドの消化生成物であってよい。各セグメントは次に、様々なタイプの損傷に対応する標識の存在または非存在について処理されたセグメントを調査することによって様々なタイプの損傷の存在または非存在について評価することができる。ユーザは、次に様々なセグメントをポリヌクレオチド全体の凝集マップに組み立てることができ、このマップは、前記ポリヌクレオチドが経験している可能性のある様々なタイプの損傷の位置を含んでいる。
本システムは、グラフィカル・ユーザ・インタフェースを含むことができる。そのようなインターフェースは、ユーザのニーズに依存して、ISO 13485およびFDA 12 CFR 11ガイドラインに準拠してよい。このインターフェースは、別個のユーザレベルでのログインを支持できる。グラフィック・ユーザ・インタフェースを使用すると、ユーザ相互作用を最小限に抑え、ラン・レシピ・セットアップを単純化することができる。抵抗膜方式タッチスクリーンを使用すると、ユーザの入力をラン・レシピ・セットアップ・パラメータに翻訳することができる。ランレシピおよび操作はユーザ定義可能であり、類似のランからの結果との容易な比較を可能にするために、特定の実験または用途に合わせて調整することができる。ランの結果はオンボードで分析できる、または別個のコンピュータワークステーション上でのアーカイブ分析若しくは詳細分析のためにデータをエクスポートできる。
スレーブとして機能する別個のマイクロコントローラは、高速画像取得のために必要なイベントを管理および同期化するために使用できる。コントローラは、レーザをカメラ露光と同期化するように作動することができ、画像取得直後にフィルタホイールおよびXYステージが応答することを保証する。マイクロコントローラは、ユーザによって実行可能なコマンドの配列に入力されたラン・レシピ・パラメータを解明する。これらのコマンドは、サンプル電圧負荷条件、レーザ配列順序、ならびにレーザパルス時間分、走査反復回数などを提供する。
ソフトウエアアプリケーションはオンボードコンピュータ上でランすることができ、このアプリケーションは、マイクロコントローラスレーブにとってのマスタとして作動する。この特注ソフトウエアアプリケーションは、ユーザのランレシピ入力にデータ分析パラメータを加えたものを翻訳し、直接サブアッセンブリ部品が相互作用するためのパイプを提供する。このソフトウエアアプリケーションは、ユーザのニーズに依存して、ISO 13485およびFDA 21 CFR 11に適切に準拠してよい。
一部の例では、ナノチャネル・サンプル・リザーバの蒸発は、ラン結果に強い影響を与えることがある。電極束を使用すると、サンプルリザーバの蒸発を軽減およびコントロールすることができる。
現行の単一分子イメージングアプローチは、単一分子感度を達成するためにTIRFに依存する。この構成では、励起光はある角度(TIRF角)で入射してイメージング平面の表面近くでエバネッセント電磁場を生じさせる。このエバネッセント場は、典型的には前記イメージング表面の100nm上方に広がる。この場に曝露させられた蛍光部分は蛍光励起されるので、適切な蛍光検出器を使用して検出できる放射光を生成する。このエバネッセント場の範囲外の蛍光物体は、励起されないので、そこでバックグラウンド蛍光シグナルの一因とはならない。
ここに開示したシステムは、単一分子感度を備える高速イメージングに適応することができる。フィルタホイール、カメラ、XYステージおよびレーザは、10、20、30、またはそれ以上のフレーム/秒でのイメージングを許容するように適切に選択および構成される。適切なステージは、例えば、Aerotech社、Physik Instrumente社、およびApplied Scientific Imaging社から入手できる。適切なフィルタホイールは、例えば、Sutter Instrument Company社、Finger Lakes Instrumentation社、およびApplied Scientific Imaging社から入手できる。適切なレーザは、例えば、Cobolt AB社、Crystal Laser社、および他の光学装置の供給会社から購入できる。各個別機器の速度は、イメージングルーチン中の様々な作動を順序付けるマイクロコントローラによって協調させることができる。1つの実施形態では、1枚の画像を獲得するために、XYステージはそのポイントで励起レーザが発射される関心視野へ移動し、カメラは画像獲得のためにセットされる。ナノチャネルアレイ全体がイメージングされるまで、このラスタタイプのシーケンスが繰り返される。
本システムは、広範囲のサンプルタイプに適応させることができるという意味においてオープンプラットフォームとしても設計される。適切なサンプルには、生物学的サンプル、例えばDNA、RNA、タンパク質、バイオポリマー、およびそのような種を含む他の複合体が含まれる。他の高分子、例えばポリマー、デンドリマー、オリゴマーなどもまた分析できる。サンプル分析が特定の環境条件、例えば加熱または冷却を必要とする可能性がある場合は、そのような要件もまた前記サンプルタイプおよび特定要件に適応させることができるが、それは加熱器、冷却器、および流体/気体源もまたここに開示したシステム内に組み込めるからである。
1つのモデルシステムでは、DNAサンプルは様々なDNAサンプル調製キットを用いて調製され、Gentra PureGene(商標)キットを使用する口腔スワブDNAB、Gentra PureGene(商標)キットを使用する培養細胞DNA、Easy DNA(商標)キットを使用する培養細胞DNAを含んでいる。
UV線によって誘発された一本鎖DNA切断は、上述したようにナノチャネルアレイ内で測定できる。1つの実施形態では、DNAポリメラーゼの作用によってこれらの切断部位で蛍光色素ヌクレオチドを組み込むことができるが、このポリメラーゼは標識ヌクレオチドを前記切断部位で組み込むように作用する。標識DNA分子は、次にナノチャネルアレイ内で(例えば、直鎖形に)伸長させられ、蛍光顕微鏡を使用して個別にイメージングすることができる。DNAバックボーンに沿ったこれらの蛍光標識の位置を決定することによって、一本鎖切断の分布および密度を正確に確定することができる。
エンドヌクレアーゼIVは、DNA内の様々な酸化的損傷に作用することができる。この酵素は、DNA中で無傷APを加水分解するアプリン/アプリミジン(AP)エンドヌクレアーゼであると特徴付けられている。AP部位は傷害に対して5’側である第1ホスホジエステル結合で切断され、3’末端ではヒドロキシル基および5’末端ではデオキシリボース5’−ホスフェートを残す。この酵素はさらに3’−ジエステラーゼ(diesterease)活性を有し、DNAの3’末端からホスホグリコアルデヒド、無傷デオキシリボース5−ホスフェートおよびホスフェートを遊離させることができる。
また別の開示は、以下の特許出願文献の中に見いだされ、それらの各々はこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2007年7月19日付で出願された国際出願第PCT/US2007/016408号、「Nanonozzle Device Arrays:Their Preparation And Use For Macromolecular Analysis」、2008年3月28日付で出願された国際出願第PCT/US2008/058671号、「Methods Of Macromolecular Analysis Using Nanochannel Arrays」、2009年6月5日付で出願された国際出願第PCT/US2009/046427号、「Integrated Nanofluidic Analysis Devices And Related Methods」、2009年6月30日付で出願された国際出願第PCT/US2009/049244号、「Methods And Devices For Single−Molecule Whole Genome Analysis」、2009年11月19日付で出願された国際出願第PCT/US2009/064996号、「Polynucleotide Mapping And Sequencing」、2010年5月18日付で出願された国際出願第PCT/US2010/035253号、「Devices And Methods For Dynamic Determination Of Sample Spatial Orientation And Dynamic Repositioning」、2010年9月27日付で出願された国際出願第PCT/US2010/050362号、「Nanochannel Arrays And Near−Field Illumination Devices For Polymer Analysis And Related Methods」、2010年10月21日付で出願された国際出願第PCT/US2010/053513号、「Methods And Related Devices For Single Molecule Whole Genome Analysis」。
Claims (92)
- 方法であって、
ポリヌクレオチド上の第1部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる第1部分に転換させる工程と、
前記第1部位またはその近位で第1標識を組み込めるように前記第1部分で伸長を実行する工程と、
前記第1標識を含む前記ポリヌクレオチドの1つの部分を直鎖化する工程と、
前記第1標識をイメージングする工程と
を有する方法。 - 請求項1記載の方法において、前記直鎖化する工程は、前記第1標識を含む前記ポリヌクレオチドの1つの部分をナノチャネル内に限定することによって実行されるものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記第1部位は、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、シクロブタン−ピリミジン二量体、6−4光分解生成物、チミン二量体、酸化ピリミジン、脱塩基部位、上記のいずれかの原子価異性体、上記のいずれかのデュワー(Dewar)原子価異性体、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記転換させる工程は、アピリミジン部位、アプリン部位、伸長不可能な一本鎖切断、またはそれらのいずれかの組み合わせを生じさせるものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第1部位を、アプリン部位を加水分解し、アピリミジン部位を加水分解し、またはその両方を実施する酵素と接触させる工程を有するものである方法。
- 請求項5記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第1部位を、N−グリコシラーゼ、アルカリ処理、またはその両方と接触させる工程を有するものである方法。
- 請求項6記載の方法において、前記N−グリコシラーゼは、エンドヌクレアーゼIII、T4エンドヌクレアーゼV、エンドヌクレアーゼVIII、紫外線DNAエンドヌクレアーゼ、ホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
- 請求項3記載の方法において、前記第1部位は脱塩基部位を有し、前記脱塩基部位は、前記脱塩基部位を一本鎖切断に転換するようにアルカリ溶液と接触させられるものである方法。
- 請求項3記載の方法において、前記第1部位は一本鎖切断を有し、前記一本鎖切断は、前記一本鎖切断を二本鎖切断に転換するようにアルカリ溶液と接触させられるものである方法。
- 請求項4記載の方法において、この方法は、さらに、
前記アピリミジン部位、前記アプリン部位、前記伸長不可能な一本鎖切断、またはその両方をアプリン/アプリミジンリアーゼ、ホスホジエステラーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせと接触させる工程を有するものである方法。 - 請求項10記載の方法において、前記リアーゼはエンドヌクレアーゼIVを有するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記伸長は、前記ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼおよび前記第1標識を有するヌクレオチドと接触させる工程によって実行されるものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記第1部分は、ポリメラーゼ伸長を支持できる3’−OH構造を有するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの構造的特徴を特徴付ける工程を有するものである方法。 - 請求項14記載の方法において、前記特徴付ける工程は、前記ポリヌクレオチド上の少なくとも1つの標識の位置を特定する工程を有するものである方法。
- 請求項15記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチド上の2若しくはそれ以上の標識の相対位置を決定する工程を有するものである方法。 - 請求項14記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの長さにおける標識の数を計算する工程を有するものである方法。 - 請求項1記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドを含有するサンプル中に存在する標識の数を決定する工程を有するものである方法。 - 請求項1記載の方法において、前記第1標識は、蛍光体を有するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、この方法は、さらに、
前記第1部位またはその近くで第2標識を組み込む工程を有するものである方法。 - 請求項20記載の方法において、前記第1および第2標識は、構造において相互に相違するものである方法。
- 請求項21記載の方法において、前記第1および第2標識は、異なる波長の照明で蛍光を発光するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記転換または実行する工程の少なくとも1つは、前記ポリヌクレオチドが多孔性マトリックス内に存在する間に行われるものである方法。
- 請求項23記載の方法において、前記マトリックスは、アガロースゲルを有するものである方法。
- 請求項23記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。 - 請求項23記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの部分を前記マトリックスに付着させる工程を有するものである方法。 - 請求項26記載の方法において、前記付着させる工程はビオチン−アビジン反応、受容体−リガンド反応、抗体−抗原反応、またはそれらのいずれかの組み合わせによって実行されるものである方法。
- 請求項1記載の方法において、前記イメージングする工程は、前記ポリヌクレオチドを1若しくはそれ以上の波長の照明で照明する工程を有するものである方法。
- 請求項1記載の方法において、この方法は、さらに、
前記第1標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。 - 請求項29記載の方法において、この方法は、さらに、
2若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。 - 分析システムであって、
1nm〜約250nmの範囲内の特徴的寸法を有する1若しくはそれ以上のナノチャネルを有する流体チップを受け入れるように構成されたサンプルステージと、
前記流体チップ内に配置されたサンプルを照明するように構成された照明光源と、
前記流体チップ内に配置された照明されたサンプルの画像を収集するように構成された画像収集装置と
を有するシステム。 - 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第1ビームを検出できる検出器を有するものであるシステム。 - 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第1および第2ビームの位置を検出できる検出器を有するものであるシステム。 - 請求項32記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第1ビームの位置に応答して前記ステージを平行移動させるように構成されたコントローラを有するものであるシステム。 - 請求項33記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第1ビームの位置に応答して前記ステージを平行移動させるように構成されたコントローラを有するものであるシステム。 - 請求項35記載のシステムにおいて、前記コントローラは、前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第1または第2ビームのうちの少なくとも1つの第1および第2位置の間の間隔を入力として受信するものであるシステム。
- 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルに提供された照明の波長を変化させるように前記照明の経路内に配置できる少なくとも1つのフィルタを有するものであるシステム。 - 請求項31記載のシステムにおいて、前記システムは、2若しくはそれ以上の照明光源を有するものであるシステム。
- 請求項38記載のシステムにおいて、少なくとも2つの照明光源は、異なる波長の照明を提供するように構成されるものであるシステム。
- 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明光源と前記サンプルとの間の照明経路内に配置されたビームエクスパンダを有するものであるシステム。
- 請求項40記載のシステムにおいて、前記ビームエクスパンダは、ケプラー式(Keplerian)ビームエクスパンダ、ガリレイ式(Galilean)ビームエクスパンダ、またはその両方を有するものであるシステム。
- 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記サンプルに適用された、または前記サンプルから反射された照明をフィルタリングするように構成されたフィルタホイールを有するものであるシステム。
- 請求項31記載のシステムにおいて、前記システムは、流体サンプルを前記流体チップのナノチャネル内に誘導するように構成された電場源を有するものであるシステム。
- 請求項31記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、流体チップ上に配置された1若しくはそれ以上の表示に一致して前記システムを構成するように構成されたリーダを有するものであるシステム。
- 方法であって、
ポリメラーゼ伸長を支持できる第1部分を生じさせるようにポリヌクレオチド内の第1一本鎖切断をアルカリホスファターゼと接触させる工程と、
前記ポリオリゴヌクレオチド内に標識を組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と、
ナノチャネル内に前記第1標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの部分を直鎖化する工程と、
前記第1標識をイメージングする工程と
を有する方法。 - 請求項45記載の方法において、前記アルカリホスファターゼは、エビアルカリホスファターゼを有するものである方法。
- 請求項45記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識ヌクレオチドの存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 請求項47記載の方法において、この方法は、さらに、2若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 方法であって、
伸長不可能な一本鎖切断をポリメラーゼ伸長可能な部位に転換させられるようにポリヌクレオチド内の一本鎖切断に3’〜5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを適用する工程と、
前記ポリヌクレオチド内に標識を組み込めるようにDNAポリメラーゼおよび標識デオキシヌクレオチドを適用する工程と
を有する方法。 - 請求項49記載の方法において、前記標識は、蛍光体、放射性部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
- 請求項49記載の方法において、前記ポリメラーゼは、本質的に遊離デオキシヌクレオチドの非存在下で適用されるものである方法。
- 方法であって、
脱塩基部位を有するポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、
前記脱塩基部位を前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断に転換させられるように、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断に転換させられるように、またはその両方のために、前記ポリヌクレオチドをアルカリ性物質と接触させる工程と、
前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、またはその両方を、ポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程と、
1若しくはそれ以上の標識を前記ポリヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と
を有する方法。 - 請求項52記載の方法において、前記ポリヌクレオチドは、細胞内に配置されるものである方法。
- 請求項52記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記細胞を溶解させる工程、前記ポリヌクレオチドを増幅する工程、前記ポリヌクレオチドを消化する工程、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
- 請求項52記載の方法において、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を転換させる工程は、前記一本鎖切断を、3’ホスホジエステラーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼと接触させる工程を有するものである方法。
- 請求項52記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。
- 請求項52記載の方法において、この方法は、さらに、1若しくはそれ以上の標識をイメージングする工程と、前記イメージングされた標識を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程とを有するものである方法。
- 方法であって、
ポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、
ポリヌクレオチド上の第1部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる第1部分に転換させる工程と、
前記第1部位またはその近位で第1標識を組み込めるように前記第1部分で伸長を実行する工程と、
ナノチャネル内に前記第1標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの部分を直鎖化する工程と、
前記第1標識をイメージングする工程と
を有する方法。 - 請求項58記載の方法において、前記ポリヌクレオチドは、細胞内に配置されるものである方法。
- 請求項59記載の方法において、前記細胞は、前記多孔性マトリックス物質内に配置されるものである方法。
- 請求項60記載の方法において、前記細胞は、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように溶解されるものである方法。
- 請求項58記載の方法において、この方法は、さらに、(a)前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記細胞を溶解する工程、(b)前記ポリヌクレオチドを増幅させる工程、(c)前記ポリヌクレオチドを消化する工程、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
- 請求項58記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。
- 請求項58記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第1部位をN−グリコシラーゼと接触させることにより実行されるものである方法。
- 請求項64記載の方法において、前記伸長は、前記ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび前記第1標識を含むヌクレオチドと接触させることによって実行されるものである方法。
- 請求項58記載の方法において、この方法は、さらに、前記第1標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 請求項66記載の方法において、この方法は、さらに、2若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- キットであって、
ある量のN−グリコシラーゼと、
ある量のアプリン/アプリミジンリアーゼ、3’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、
ある量のポリメラーゼと、
ある量の標識ヌクレオチドと
を有するキット。 - 請求項68記載のキットにおいて、前記キットは、前記キットの試薬の1若しくはそれ以上の分注を実行できる器具と係合するように構成されたパッケージ内に配置されるものであるキット。
- 請求項68記載のキットにおいて、前記アプリン/アプリミジンリアーゼは、エンドヌクレアーゼIVを有するものであるキット。
- キットであって、
ある量のアルカリ性物質と、
ある量のアプリン/アプリミジンリアーゼ、3’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、
ある量のポリメラーゼと、
ある量の標識ヌクレオチドと
を有するキット。 - システムであって、
キットであって、(a)ある量のポリメラーゼと、(b)ある量の標識ヌクレオチドと、(c)ある量の1若しくはそれ以上のアプリン/アプリミジンリアーゼ、3’−ホスホジエステラーゼ、またはエンドヌクレアーゼIVとを含み、
前記キットは、サンプルイメージャと係合するように構成され、
1若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップと係合するように構成されるサンプルステージを有するサンプルイメージャと、
前記流体チップのナノチャネル内に配置されたサンプルとの光通信が可能な照明光源と、
前記ナノチャネル内に配置された、照明されたサンプルの画像を収集できる画像収集装置と
を有するシステム。 - 方法であって、
少なくとも1つの標識を含むポリヌクレオチドの領域を直鎖化する工程を有し、
前記標識はポリメラーゼ伸長によって前記ポリヌクレオチド内に組み込まれるものであり、
前記ポリメラーゼ伸長は脱塩基部位、一本鎖切断、またはその両方から転換された部分で実行されるものである方法。 - 請求項73記載の方法において、この方法は、さらに、前記少なくとも1つの標識をイメージングする工程を有するものである方法。
- 請求項73記載の方法において、前記脱塩基部位は、アプリン部位、アピリミジン部位、またはその両方を有するものである方法。
- 請求項73記載の方法において、前記直鎖化する工程は、ナノチャネル内に少なくとも1つの標識を含有するポリヌクレオチドの領域を限定することによって実行されるものである方法。
- 請求項73記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 請求項77記載の方法において、この方法は、さらに、2若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 方法であって、
ポリヌクレオチド上の損傷部位またはその近くで標識を組み込む工程と、
前記標識を含む前記ポリヌクレオチドの領域を直鎖化する工程と、
前記標識をイメージングする工程と
を有する方法。 - 請求項79記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチド上の2若しくはそれ以上の標識の存在、間隔、またはその両方を決定する工程を有するものである方法。
- 請求項79記載の方法において、前記組み込む工程は、前記損傷部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程を有するものである方法。
- 請求項81記載の方法において、前記転換させる工程は、さらに、前記損傷部位を中間体に転換させる工程を有し、前記中間体はポリメラーゼ伸長を支持できる部分への1若しくはそれ以上の工程によって転換されるものである方法。
- 請求項81記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- 請求項83記載の方法において、この方法は、さらに、2若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
- システムであって、
流体チップを受け入れるように構成された基部と、
前記流体チップ内に配置されたポリヌクレオチドサンプルを照明するように構成された照明器と、
前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドサンプルから画像を収集するように構成された画像収集装置と
を有するシステム。 - 請求項85記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明器を前記流体チップ内に配置されたサンプルと光通信するように配置する光学媒体を有するものであるシステム。
- 請求項86記載のシステムにおいて、前記光学媒体は、ファイバ、レンズ、ミラー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものであるシステム。
- 請求項85記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明器によって前記ポリヌクレオチドサンプルに供給される照明の波長を変化させることができる1若しくはそれ以上のフィルタを有するものであるシステム。
- 請求項85記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドサンプルと通信できる勾配源を有するものであるシステム。
- 請求項89記載のシステムにおいて、前記勾配源は、圧力源、電位源、電流源、磁場源、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものであるシステム。
- 請求項85記載のシステムにおいて、前記照明器は、レーザを有するものであるシステム。
- 請求項85記載のシステムにおいて、前記システムは、2若しくはそれ以上の波長の照明を前記ポリヌクレオチドサンプルに適用するように構成されているものであるシステム。
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