JP2013539972A - ヤトロファ(jatropha)メチルエステル(jme)作製の副生成物を利用した、脂質抽出のための、油を含有するクロレラ・バリアビリス(chlorellavariabilis)の作製のための統合プロセス - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
i.既知の方法によって、ヤトロファの種子の4〜6%(w/w)の窒素を有する脱油されたかすを提供するステップと、
ii.ステップ(i)において提供された、脱油されたかすを、熱酸性水溶液で加水分解し、続いてアルカリ性材料で5.5〜8.5の範囲内でpHを調整して、窒素に富んだヤトロファ油かす加水分解物(JOCH)を得るステップと、
iii.既知の方法によって、海洋クロレラ・バリアビリスのための増殖兼作製培地として、メタノールが除去されたグリセロール層を含有する1〜5%(w/v)の粗グリセロール(GL7およびGL8)を提供するステップと、
iv.1〜10%(v/v)の海洋クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(iii)において提供された増殖兼作製培地およびステップ(ii)において調製された1〜10%(v/v)のヤトロファ油かす加水分解物中に播種し、7.0〜8.0の範囲内のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、7〜15日間の範囲内の期間インキュベートして、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
v.任意に、1〜10%(v/v)の海洋クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに播種し、その後第4〜第10日目後にGL7を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vi.任意に、1〜10%(v/v)の海洋クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに播種し、その後第4〜第10日目後にGL8を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vii.脂質抽出のために、ステップ(iv〜vi)において得られたバイオマスを日光で乾燥させるか、または湿ったバイオマスを直接使用するステップと、
viii.既知の方法によって、ステップ(vii)において得られたバイオマスから脂質を抽出するステップと
を含む。
a.日光で乾燥された果実の殻を機械的に取り(deshell)、殻および種子を別々に回収するステップと、
b.既知の技法によって、油を種子から機械的に排出し;脱油されたかすは、従来技術[(Ghosh他 米国付与前公開(pre-grant publication)番号は、2006/0080891 A1である)(2009年9月7日付けの1838/DEL/2009)]において得られるステップと、
c.上記の(b)において生じた廃油の少量を、種子の殻のブリケッティングのための結合剤として利用するステップと、
d.上記の(b)において得られた脱油されたかすの一部を、酸で処置して、かすを加水分解し、窒素に富んだ加水分解物を得るステップと、
e.メタノールが除去されたグリセロール層のより大きい部分を、海洋クロレラ・バリアビリスのための脂質作製培地として、残りの残渣を、海洋細菌MTCC5345を通しての生分解性ポリマーすなわちポリヒドロキシアルカノエート(PHA)の作製(2009年9月7日付けの出願された特許1838/DEL/2009においてのように)のために利用するステップと、
f.1〜10%(v/v)の海洋クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(l)の1〜5%(w/v)の粗グリセロールおよびステップ(d)において調製された1〜10%(v/v)のヤトロファ油かす加水分解物を含有する増殖兼作製培地中に播種し、7.0〜8.0のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、(7〜15日間)の範囲内の期間インキュベートするステップと、
g.1〜10%(v/v)の海洋クロレラ種を、脂質作製のために、種培養物播種の第1日目には水道水、最初(4〜10日間)のインキュベーションでは海水のみおよび1:2で水道水で希釈した海水とともに、上記のヤトロファ油かす加水分解物に播種し、その後第4〜第10日目後にGL7を加えるステップと、
h.1〜10%(v/v)の海洋クロレラ種を、脂質作製のために、種培養物播種の第1日目には水道水、最初(4〜10日間)のインキュベーションでは海水のみおよび1:2で水道水で希釈した海水とともに上記のヤトロファ油かす加水分解物に播種し、その後第4〜第10日目後にGL8を加えるステップと、
i.脂質抽出およびバイオディーゼルの製造のために、バイオマスを日光で乾燥させるか、または湿ったバイオマスを直接使用するステップと
を含む。
クロレラ種が、最も効率的な藻類の1つであることを発見し、本発明において使用した。1リットルの蒸留水に溶解された、16.8グラムの重炭酸ナトリウム、0.5gのリン酸水素二カリウム、2.5グラムの硝酸ナトリウム、0.2gの硫酸マグネシウム、1.0グラムの塩化ナトリウム、0.01グラムの硫酸第一鉄、1.0gの硫酸カリウム、0.04グラムの塩化カルシウムおよび0.08gのEDTAを含む、200mlのZarrouk培地を、調製した。次いで、培地を、121℃で20分間オートクレーブした。培地に、20%のクロレラ培養物(540nmでOD1.4〜1.6)を、播種する。フラスコを、静置条件で、30℃で維持した。培養物の光学濃度を、3日間の一定間隔でモニターした。21日後、細胞を、遠心分離することによって収穫し、得られたペレットを60℃で炉乾燥して、0.13gおよび16.22%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有する、0.801gの細胞乾燥重量を得た。
クロレラ・バリアビリスを、静置条件で、光インキュベーション(light incubation)下で、200mlの海水において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉(60℃)において16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.347gであり、0.0506グラム、および14.58%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、静置条件で、暗所下で、海水において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、28℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.217gであり、0.0312g、および14.37%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、1%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、撹拌条件で、海水において増殖させ、12:12hの暗:明周期を有する白色蛍光管によって提供される60μEm−2s−1の光強度下でインキュベートさせた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。クロレラ種の乾燥されたバイオマス0.367gから、0.054gの脂質含有量、すなわち14.71%の細胞乾燥重量。
クロレラ・バリアビリスを、2%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、撹拌条件で、海水において増殖させ、12:12hの暗:明周期を有する白色蛍光管によって提供される60μEm−2s−1の光強度下でインキュベートさせた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、27℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。クロレラ種の乾燥されたバイオマス0.420gから、0.077gの脂質含有量、すなわち18.33%の細胞乾燥重量。
クロレラ・バリアビリスを、1%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、撹拌条件で、光インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、26℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.387gであり、0.087mg、および22.48%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、2%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、撹拌条件で、光インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.453gであり、0.097g、および21.41%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、1%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、光インキュベーション下で、海水において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.447gであり、0.085g、および19.01%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、2%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、光インキュベーション下で、海水において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において、60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.407gであり、0.074g、および18.18%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、1%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、光インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.463gであり、0.125g、および26.99%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、2%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、光インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.487gであり、0.163g、および33.47%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、1%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、暗所インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.398gであり、0.0863g、および21.68%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、2%のヤトロファバイオディーゼル廃棄物残渣(GL8/BWR3)とともに、静置条件で、暗所インキュベーション下で、希釈した海水(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉において60℃で終夜乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、0.378mgであり、0.0839g、および22.19%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
使用済みのグリセロール層、GL7を、脂質の微細藻類の作製のための栄養源として利用した。GL7を、微細藻類クロレラにおける脂質の蓄積のために直接利用した。4〜6%(w/w)のNを有するヤトロファ油かすを、H3PO4/H2SO4の熱酸性水溶液で処置し、その後pHを、アルカリ性材料、例えば粗グリセロール層、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムで適切に調節することによって、ヤトロファ油かす加水分解物(JOCH)を抽出して、緩衝作用を有し、また加水分解物の栄養価に寄与する塩を得た。単離された微細藻類クロレラ・バリアビリスを、GL−7およびJOCHを使用して、増殖および作製のための細胞内の脂質の蓄積のために使用した。
クロレラ・バリアビリスを、水道水とともに、1%のJOCH、2%のJOCH、5%のJOCHおよび10%のJOCHとともに増殖させて、光のある静置条件下で、クロレラ・バリアビリスの細胞を増殖させた。増殖速度を、最大21日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。21日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉(60℃)において16時間乾燥させた。脂質を、重さを量った乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。1%のJOCHにおいて、最も高いバイオマスが得られたが、脂質含有量の%はより少ない。
クロレラ・バリアビリスを、水道水とともに、1%のGL7、2%のGL7、5%のGL7とともに増殖させて、光のある静置条件で、クロレラ・バリアビリスの細胞を増殖させた。増殖速度を、最大21日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。21日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉(60℃)において16時間乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。2%のGL7において、最も高いバイオマスが得られたが、脂質含有量の%はより少ない。
クロレラ・バリアビリスを、水道水における2%のGL7とともに、2%、5%、10%のJOCHの組合せとともに増殖させて、光のある静置条件で、クロレラ・バリアビリスの細胞を増殖させた。増殖速度を、最大21日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。21日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水で2回洗浄し、炉(60℃)において16時間乾燥させた。脂質を、重さを量った乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。2%のGL7および10%のJOCHにおいて、最も高いバイオマス3.1グラムが、22.58%(0.7グラム)の脂質含有量で得られた。
クロレラ・バリアビリスを、200mlの培地におけるGL7およびJOCHの異なる濃度とともに、静置条件で、光インキュベーションで、海水において増殖させた。増殖速度を、最大21日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。1つのセットにおいて、JOCHを最初に加え(0日)、GL−7を増殖の10日後に加え、バイオマスおよび脂質組成変化を観察する。21日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉において16時間乾燥させた。脂質を、重さを量った乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。クロレラのバイオマスおよび脂質含有量は、海水における1%のJOCH(0日)および第10日目に加えるGL7を含有する培地において最大であることがわかった。
0.33%の濃度で使用する2,5−チオフェンジイルビス(5−tert−ブチル−1,3−ベンゾオキサゾール)クラスの色素を通しての、紫外線損傷からの、クロレラ・バリアビリスの保護を、紫外線光の供給源から10cmおよび50cmの距離で維持した50mlの培養物を、層流の紫外線ランプ(30W)下で12時間暴露することによって、研究室条件下で試験した。細胞損傷を、紫外線可視分光光度計(540nmでのOD)および紫外線蛍光試験(540nmでの励起)を通して、定量的に決定した;クロレラの乾燥細胞集団および脂質含有量に及ぼす紫外線の効果を試験し、以下の結果が明らかになった。
0.33%の濃度で使用する2,5−チオフェンジイルビス(5−tert−ブチル−1,3−ベンゾオキサゾール)クラスの色素を通しての、紫外線損傷からの、クロレラ・バリアビリスの保護を、特にGujaratにおける、インドの夏条件のピーク期間中に、テラスでの屋外培養下で、以下の照射データ(表xy an)とともに試験した。100mlの培養物を2日間直射日光下に暴露した。総紫外線照射を、1日を通して、Eppley TUVR(図に示すように)を使用して、wm−2において測定した。細胞損傷を、紫外線可視分光光度計(540nmでのOD)および紫外線蛍光試験(540nmでの励起)を通して、定量的に決定した。
クロレラ・バリアビリスを、200mlの培地とともに、バイオディーゼル副生成物(BWR6およびJOCH)の異なる濃度とともに、静置条件で、光インキュベーションで、海水において増殖させた。増殖速度を、最大18日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。JOCHを最初に加え(0日)、BWR−6を増殖の10日後に加え、バイオマスおよび脂質組成変化を観察する。18日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉において16時間乾燥させた。脂質を、重さを量った乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。
クロレラ・バリアビリスを、200mlの培地とともに、バイオディーゼル副生成物(BWR6およびJOCH)の異なる濃度とともに、静置条件で、光インキュベーションで、海水において増殖させた。増殖速度を、最大10日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。JOCHを最初に加え(0日)、BWR−6を増殖の04日後に加え、バイオマスおよび脂質組成変化を観察する。10日後;細胞集団を、11,000rpmで、30℃、10分間の遠心分離によって収穫し、細胞ペレットを蒸留水によって2回洗浄し、炉において16時間乾燥させた。脂質を、重さを量った乾燥させた集団から、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。
クロレラ・バリアビリスを、540nmでの0.6ODの10%の接種物とともに、覆いのないプラスチックタンク(l×b×h 1.47m×0.74m.0.22m)における100リットルの培地において、希釈したZarrouk培地(水道水において1:2)において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、H3PO4を使用して、pH調整pH4.5によって安定させ、その後、脱水した細胞を日光で乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、100リットルにおいて401.21グラムであり、97.29グラムすなわち24.25%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、540nmでの0.6ODの10%の接種物とともに、覆いのないプラスチックタンク(l×b×h 1.47m×0.74m.0.22m)における100リットルの培地において、水道水における2%のBWR−3において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、H3PO4を使用して、pH調整pH4.5によって安定させ、その後、脱水した細胞を日光で乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、100リットルにおいて380.12グラムであり、90.53グラムすなわち23.81%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
クロレラ・バリアビリスを、540nmでの0.6ODの10%の接種物とともに、覆いのないプラスチックタンク(l×b×h 1.47m×0.74m.0.22m)における100リットルの培地において、海水:水道水(1:2)における2%のBWR−3において増殖させた。増殖速度を、最大16日間分光光度的に(540nmでのOD)測定した。16日後;細胞集団を、H3PO4を使用して、pH調整pH4.5によって安定させ、その後、脱水した細胞を日光で乾燥させた。脂質を、乾燥させたバイオマスから、クロロホルム:メタノール(2:1)を使用して抽出し、溶媒の蒸発後、総脂質を得た。得られたバイオマスは、100リットルにおいて440.01グラムであり、150.61グラムすなわち34.23%の細胞乾燥重量の脂質含有量を有していた。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
[1]
ヤトロファの種子全体からのヤトロファメチルエステル(JME)作製の副生成物を利用した、脂質抽出のための、油を含有するクロレラ・バリアビリスの作製のための統合プロセスであって、
i.既知の方法によって、ヤトロファの種子の4〜6%(w/w)の窒素を有する、ヤトロファメチルエステル(JME)作製の副生成物としての脱油されたかすを提供するステップと、
ii.ステップ(i)において提供された前記脱油されたかすを、熱酸性水溶液で加水分解し、続いてアルカリ性材料で5.5〜8.5の範囲内にpHを調整して、窒素に富んだヤトロファ油かす加水分解物(JOCH)を得るステップと、
iii.既知の方法によって、メタノールが除去されたグリセロール層を含有する粗グリセロール(GL7およびGL8)を提供するステップと、
iv.ステップ(iii)において提供された、1〜5%(w/v)の前記メタノールが除去されたグリセロール層を含有する粗グリセロール(GL7およびGL8)を、ステップ(ii)において得られた、1〜10%(v/v)のヤトロファ油かす加水分解物に加えて、クロレラ・バリアビリスのための増殖兼作製培地を調製するステップと、
v.1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(iv)において得られた増殖兼作製培地中に播種し、7.0〜8.0の範囲内のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、7〜15日間の範囲内の期間インキュベートして、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vi.または代わりに、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに、播種し、その後第4〜第10日目後にGL7を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vii.または代わりに、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに播種し、その後第4〜第10日目後にGL8を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
viii.任意に、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(iii)において得られた増殖兼作製培地中に播種し、屋外でのバイオマス作製中に、紫外線特異的色素を加えて、40℃〜50°の範囲内の温度で、紫外線損傷から保護し、前記培養物の生存能を維持し、7.0〜8.0の範囲内のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、7〜15日間の範囲内の期間インキュベートして、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
ix.脂質抽出のために、ステップ(iv〜vii)において得られた前記バイオマスを日光で乾燥させるか、または前記湿ったバイオマスを直接使用するステップと、
x.既知の方法によって、ステップ(viii)において得られたバイオマスから前記脂質を抽出するステップと
を含む統合プロセス。
[2]
使用する酸が、H 3 PO 4 およびH 2 SO 4 からなる群から選択される、[1]に記載の統合プロセス。
[3]
前記アルカリ性材料が、粗グリセロール層、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムからなる群から選択される、[1]に記載の統合プロセス。
[4]
使用する前記紫外線色素が、2,5−チオフェンジイルビス(5−tert−ブチル−1,3−ベンゾオキサゾール)である、[1]に記載の統合プロセス。
[5]
既知の方法によって、メタノールが除去されたグリセロール層が、グリセロール層からエタノールを一掃することによって得られる、[1]に記載の統合プロセス。
[6]
細胞乾燥重量に対する脂質の収量が、20から35%の範囲内である、[1]に記載の統合プロセス。
Claims (6)
- ヤトロファの種子全体からのヤトロファメチルエステル(JME)作製の副生成物を利用した、脂質抽出のための、油を含有するクロレラ・バリアビリスの作製のための統合プロセスであって、
i.既知の方法によって、ヤトロファの種子の4〜6%(w/w)の窒素を有する、ヤトロファメチルエステル(JME)作製の副生成物としての脱油されたかすを提供するステップと、
ii.ステップ(i)において提供された前記脱油されたかすを、熱酸性水溶液で加水分解し、続いてアルカリ性材料で5.5〜8.5の範囲内にpHを調整して、窒素に富んだヤトロファ油かす加水分解物(JOCH)を得るステップと、
iii.既知の方法によって、メタノールが除去されたグリセロール層を含有する粗グリセロール(GL7およびGL8)を提供するステップと、
iv.ステップ(iii)において提供された、1〜5%(w/v)の前記メタノールが除去されたグリセロール層を含有する粗グリセロール(GL7およびGL8)を、ステップ(ii)において得られた、1〜10%(v/v)のヤトロファ油かす加水分解物に加えて、クロレラ・バリアビリスのための増殖兼作製培地を調製するステップと、
v.1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(iv)において得られた増殖兼作製培地中に播種し、7.0〜8.0の範囲内のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、7〜15日間の範囲内の期間インキュベートして、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vi.または代わりに、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに、播種し、その後第4〜第10日目後にGL7を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
vii.または代わりに、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、種培養物播種の第1日目に水道水とともに、最初の4〜10日間のインキュベーションでは海水のみまたは1:2で水道水で希釈した海水とともに播種し、その後第4〜第10日目後にGL8を加えて、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
viii.任意に、1〜10%(v/v)の前記クロレラ・バリアビリスの種培養物を、ステップ(iii)において得られた増殖兼作製培地中に播種し、屋外でのバイオマス作製中に、紫外線特異的色素を加えて、40℃〜50°の範囲内の温度で、紫外線損傷から保護し、前記培養物の生存能を維持し、7.0〜8.0の範囲内のpHで、25〜40℃の範囲内の温度で、7〜15日間の範囲内の期間インキュベートして、脂質を含有するバイオマスを得るステップと、
ix.脂質抽出のために、ステップ(iv〜vii)において得られた前記バイオマスを日光で乾燥させるか、または前記湿ったバイオマスを直接使用するステップと、
x.既知の方法によって、ステップ(viii)において得られたバイオマスから前記脂質を抽出するステップと
を含む統合プロセス。 - 使用する酸が、H3PO4およびH2SO4からなる群から選択される、請求項1に記載の統合プロセス。
- 前記アルカリ性材料が、粗グリセロール層、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムからなる群から選択される、請求項1に記載の統合プロセス。
- 使用する前記紫外線色素が、2,5−チオフェンジイルビス(5−tert−ブチル−1,3−ベンゾオキサゾール)である、請求項1に記載の統合プロセス。
- 既知の方法によって、メタノールが除去されたグリセロール層が、グリセロール層からエタノールを一掃することによって得られる、請求項1に記載の統合プロセス。
- 細胞乾燥重量に対する脂質の収量が、20から35%の範囲内である、請求項1に記載の統合プロセス。
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