JP2013538357A - クロマトグラフィーにおける生成物と複合体形成した夾雑物の分離方法 - Google Patents
クロマトグラフィーにおける生成物と複合体形成した夾雑物の分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013538357A JP2013538357A JP2013529417A JP2013529417A JP2013538357A JP 2013538357 A JP2013538357 A JP 2013538357A JP 2013529417 A JP2013529417 A JP 2013529417A JP 2013529417 A JP2013529417 A JP 2013529417A JP 2013538357 A JP2013538357 A JP 2013538357A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- target molecule
- solid support
- apatite
- complexed
- derivatized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 title claims abstract description 122
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title abstract description 16
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 155
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 154
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 127
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 82
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 67
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 59
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 59
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 53
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 53
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 51
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 46
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 42
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 41
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 40
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 40
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 39
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 29
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 29
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 29
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 28
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 27
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 21
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 12
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims description 7
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 7
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 150000004763 sulfides Chemical class 0.000 claims description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 7
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011651 chromium Substances 0.000 claims description 6
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 6
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 6
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 66
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- -1 antibody Proteins 0.000 description 8
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 8
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 7
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 4
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 3
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 2
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010064063 CHARGE syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100038215 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKXRQWHWPWHKOP-UHFFFAOYSA-N [K].OCl(=O)(=O)=O Chemical compound [K].OCl(=O)(=O)=O OKXRQWHWPWHKOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910001576 calcium mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012483 derivatization solution Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229940077441 fluorapatite Drugs 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- 229910052585 phosphate mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
本出願は、すべての目的で参照により組み入れられる、2010年9月20日に出願された米国特許仮出願第61/384,565号に対して優先権の恩典を主張する。
治療または診断目的の、抗体、他の治療用タンパク質、ウイルスおよびウイルス様粒子、ならびにDNAプラスミドなどの生物学的分子の精製は、精製されるべき生物学的分子が夾雑物と化学的に複合体形成している時に妨害される。複合体形成した夾雑物は、精製過程の効率を低下させ、精製過程の再現性を低下させ、かつ、精製された生物学的分子の安定性および薬力学に影響を及ぼす。
(a)標的分子および複合体形成した夾雑物を含む試料を、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより標的分子(「結合した標的分子」)を固体支持体に非共有結合で結合させる段階;
(b)結合した標的分子を、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままである条件の下で、複合体形成した夾雑物を標的分子から移動させる薬剤で洗浄する段階;および
(c)標的分子を固体支持体から溶出する段階であって、溶出された標的分子が、複合体形成した夾雑物を実質的に含まない、段階。
i. 尿素および塩化ナトリウム;
ii. 尿素および塩化ナトリウムおよびシステイン;
iii. 塩および有機溶剤;または
iv. 塩および界面活性剤。
(a)標的分子および夾雑物の凝集体を含む試料を、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより標的分子(「結合した標的分子」)を固体支持体に非共有結合で結合させる段階;
(b)結合した標的分子を、夾雑物の凝集体を成分夾雑物に分離する薬剤で洗浄する段階であって、洗浄が、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままの条件の下である、段階;および
(c)標的分子を固体支持体から溶出する段階であって、溶出された標的分子が、夾雑物を実質的に含まない、段階。
i. 尿素および塩化ナトリウム;
ii. 尿素および塩化ナトリウムおよびシステイン;
iii. 塩および有機溶剤;または
iv. 塩および界面活性剤。
(a)標的分子凝集体を含む試料を、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより標的分子凝集体(「結合した標的分子凝集体」)を固体支持体に非共有結合で結合させる段階;
(b)結合した標的分子凝集体を、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままである条件の下で、標的分子凝集体を構成要素に分ける薬剤で洗浄する段階;および
(c)標的分子を単量体として固体支持体から溶出する段階であって、溶出された標的分子が、標的分子凝集体を実質的に含まない、段階。
i. 尿素および塩化ナトリウム;
ii. 尿素および塩化ナトリウムおよびシステイン;
iii. 塩および有機溶剤;または
iv. 塩および界面活性剤。
(a)不適当なジスルフィド結合を有する標的分子を含む試料を、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより不適当なジスルフィド結合を有する標的分子(「結合した標的分子」)を固体支持体に非共有結合で結合させる段階;
(b)結合した標的分子を、結合した標的分子中のジスルフィド結合を還元し、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままである条件の下で、少なくとも1種のさらなる薬剤との組み合わせで、還元剤で洗浄する段階;
(c)標的分子を、標的分子が適当なジスルフィド結合を有するようにリフォールディングさせる条件に供する段階;および
(d)適当なジスルフィド結合を有する標的分子を固体支持体から溶出する段階であって、適当なジスルフィド結合を有する溶出された標的分子が、不適当なジスルフィド結合を有する標的分子を実質的に含まない、段階。
i. 尿素および塩化ナトリウム;
ii. 塩および有機溶剤;または
iii. 塩および界面活性剤。
本発明がより容易に理解され得るように、用語が定義される。追加的な定義は、詳細な説明を通して示される。
I. 序文
生物学的生成物調製品において標的の生物学的分子に化学的に複合体形成している夾雑物の分離および除去のために、アパタイトクロマトグラフィー支持体を使用する方法が提供される。本発明の方法は、複合体形成した夾雑物および異種性の「超夾雑物(supercontaminant)」、または、凝集体を構成する成分夾雑物のクロマトグラフ保持特性とは異なるクロマトグラフ保持特性を有する夾雑物の凝集体を除去するため、それにより標的分子の精製度を増大するために有用である。
本発明は、脱複合体化剤との組み合わせでアパタイト固体支持体を使用して、標的分子を生物学的試料から精製する段階を提供する。アパタイトクロマトグラフィー支持体はまた、脱複合体化機能を提供し、かつ、アパタイトクロマトグラフィー支持体の非存在下での本明細書において記載されるものと同一の脱複合体化剤の使用と比較して達成され得る、複合体分離および夾雑物除去のより高い程度を達成することを助長する。
いくつかの態様において、天然のヒドロキシアパタイトおよび/またはフルオロアパタイトは、リン酸の非存在下での可溶性金属カチオンへの曝露により、金属カチオンで誘導体化された形態に変換され、それによりアパタイト支持体の選択性を変化させる。天然のアパタイトの誘導体化に適する金属カチオンの例は、マグネシウム、亜鉛、鉄、カルシウム、ニッケル、コバルト、マンガン、銅、およびクロムを含むが、それらに限定されない。
いくつかの態様において、天然のヒドロキシアパタイトおよび/またはフルオロアパタイトは、リン酸の非存在下での可溶性ポリカチオンへの曝露により、ポリカチオンで誘導体化された形態に変換され、それによりアパタイト支持体の選択性を変化させる。天然のアパタイトの誘導体化に適するポリカチオンの例は、ポリエチレンイミン(PEI)、ならびに、ポリエタノールアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、およびポリアリルアミンなどのポリアミンを含むが、それらに限定されない。
本発明は、標的分子を生物学的試料から精製する方法を提供する。いくつかの態様において、生物学的試料における標的分子は、1種もしくは複数の夾雑物、または夾雑物の凝集体と複合体形成している。いくつかの態様において、生物学的試料における標的分子は、標的分子の凝集体である。いくつかの態様において、生物学的試料における標的分子は、標的分子が不適当なジスルフィド結合を有するか、および/または不適当にフォールディングされている形態で存在する。
いくつかの態様において、本発明の方法は、標的分子の精製を増強するために、標的分子と複合体形成している1種または複数の夾雑物を脱複合体化するのに有用である。夾雑物の例は、タンパク質、核酸、脂質、種々の細胞培養培地構成成分および添加物、金属イオン、多糖類、エンドトキシン、チオレドキシン、ならびに硫化物(例えば、標的分子のジスルフィド結合中に硫黄原子の挿入を導き得る、細胞培養中、例えば、哺乳動物細胞培養におけるIgGモノクローナル抗体の産生中に細胞により作製され、かつ不安定な三硫化物を結果としてもたらす硫化物)を含むが、それらに限定されない。
本発明の方法は、標的分子を生物学的試料から精製するためにアパタイトクロマトグラフィーを使用する。一般に、本発明の方法は、標的分子を含む試料を、金属で誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより標的分子をアパタイト支持体に非共有結合で結合させる段階;結合した標的分子を、本明細書において記載されるような1種または複数の薬剤で洗浄する段階であって、標的分子がアパタイト支持体に実質的に結合したままである段階;および、標的分子をアパタイト支持体から溶出する段階、を含む。
標的分子を含む試料をアパタイト支持体(例えば、アパタイトカラム)と接触させる段階の準備において、カラム内部の化学的環境を平衡化することが通常必要である。これは、適切なpH、伝導率、塩の濃度、および/または同一性、分子量、ならびに、含まれる場合、非イオン性有機ポリマーの濃度を確立するように、カラムを通して平衡化緩衝液を流すことにより達成される。
標的分子のアパタイト固体支持体への結合に続いて、結合した標的分子を、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままである条件の下で、複合体形成した夾雑物を標的分子から、もしくは標的分子の不適当なジスルフィド結合を移動させ、夾雑物の凝集体を標的分子から分離し、または標的分子凝集体を構成要素に分ける1種または複数の薬剤で洗浄する。本発明の範囲を限定することを意図せずに、薬剤が、標的分子を夾雑物または凝集体から、それらの間の会合(すなわち共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用)を弱めることにより脱複合体化すると確信される。脱複合体化剤は、それ自体が夾雑物または凝集体を標的分子から分離するかまたは移動させるように機能するアパタイト固体支持体との組み合わせで、作用する。いくつかの場合において、例えば、標的分子が不適当なジスルフィド結合を有する時、または標的分子凝集体または標的分子-夾雑物複合体がジスルフィド結合により安定化されている時、脱複合体化剤は、標的分子の構造を弛緩し、不適当なおよび/または不自然なジスルフィド結合がより容易に移動されるようにし、かつ、適当な天然のジスルフィド結合を自己復元する標的分子の能力を増強し得る。
塩化ナトリウム:0.1〜5 M、例えば、0.5〜2.0 M。
アルギニン:0.05〜1.00 M、例えば、200〜600 mM。
KCl:NaClと同一。
グアニジン:大部分の場合について(例えば、IgG精製について)100 mM〜1 Mであるが、より困難な場合は2 Mまでである。タンパク質アンフォールディングが心配ではない状況においては、6Mまでである。
過塩素酸塩:100 mM〜1 M、極端な場合は飽和状態まで。
チオシアン酸塩:100 mM〜1 M、極端な場合は飽和状態まで。
尿素:1〜2 M。二次的な範囲は200 mM〜4 M。極端な場合は10 Mまで使用することができる。
有機溶媒:エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)1〜50%、例えば、2〜20%。DMFはより低い:0.1〜10%、例えば、0.1〜1%。
エチレングリコールまたはプロピレングリコール:5〜50%、例えば、15〜25。
界面活性剤:一般に、かなり変動するそれらの臨界ミセル濃度より低い。いくつかの態様において、tween/triton/ポリソルベートでは、0.01%より低く、CHAPS、CHAPSOでは、例えば0.1%までである。
還元剤:DTT、メルカプトエタノール、システイン:1〜50 mM、例えば、5〜25 mM。
洗浄段階に続いて、標的分子をアパタイト固体支持体から溶出する。いくつかの態様において、標的分子が溶出されるアパタイト固体支持体は、洗浄段階の後であるが標的分子の溶出より前に、金属カチオン(例えば、カルシウム)で誘導体化された形態から誘導体化されていない形態に変換される。金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体は、アパタイト固体支持体をリン酸緩衝液と接触させることにより、誘導体化されていない形態に変換され得る。いくつかの態様において、誘導体化されたアパタイトは、アパタイト固体支持体を、約10 mMリン酸を約pH 7で含む緩衝液と接触させることにより、誘導体化されていない条件に変換される。
CHTタイプI 40ミクロンを、20 mM Hepes、20 mM MES、5 mM塩化カルシウム、pH7で平衡化した。塩化カルシウムを、5 mMの最終カルシウム濃度になるようにカチオン交換精製されたIgGに添加し、IgGをCHTカラム上にローディングした。対照として、10 mMリン酸の20 CVの塩化ナトリウム直線勾配(1 M NaCl, pH 7)での溶出より前に、アパタイト支持体をその天然の(カルシウムで誘導体化されていない)形態に復元するためにカラムを10 mMリン酸で洗浄する、参照ランを行った。カラムを次に、500 mMリン酸、pH 7で清浄した。実験を、254および280 nmでモニタリングした。溶出した最後のピークは、約2/1の254/280比を有し、主にDNAから構成されていることを示す。
実験を実施例1におけるように繰り返し、今回は、試料のローディング後に、4 M尿素、20 mM Hepes、20 mM MES、5 mMカルシウム、pH 7の10 CVの脱複合体化薬洗浄を挿入した。カラムを次に、上述のように、10 mMリン酸で洗浄することにより天然のアパタイトに復元し、NaCl勾配で溶出し、および500 mMリン酸で清浄した。脱複合体化薬洗浄の追加により、清浄段階において溶出されたDNAの量がやや増加し、従って、溶出されたIgGのDNA含量はより低かった。
実験を実施例1におけるように繰り返し、今回は、試料のローディング後に、2M NaCl、20 mM Hepes、20 mM MES、5 mMカルシウム、pH 7の10 CVの脱複合体化薬洗浄を挿入した。カラムを次に、上述のように、10 mMリン酸で洗浄することにより天然のアパタイトに復元し、NaCl勾配で溶出し、および500 mMリン酸で清浄した。脱複合体化薬洗浄の追加により、清浄段階において溶出されたDNAの量が大きく増加し、従って、溶出されたDNAのIgG含量はより低かった。この実験は、脱複合体化剤としてアパタイトクロマトグラフィー支持体自体の有効性を増強するNaClの能力を強調する。
実験を実施例1におけるように繰り返し、今回は、試料のローディング後に、1.6 M NaCl、3.2 M尿素、20 mM Hepes、20 mM MES、5 mMカルシウム、pH 7の10 CVの脱複合体化薬洗浄を挿入した。カラムを次に、上述のように、10 mMリン酸で洗浄することにより天然のアパタイトに復元し、NaCl勾配で溶出し、および500 mMリン酸で清浄した。2種の脱複合体化剤を含む脱複合体化薬洗浄の追加により、尿素またはNaClのいずれか単独よりも、清浄段階において溶出されたDNAの量が増加し、従って、溶出されたIgGのDNA含量は比例してより低かった。この実験は、脱複合体化薬の組み合わせが、個々の脱複合体化薬よりも有効であり得ることを強調する。
上記の実験の各々における溶出パターンを比較すると、脱複合体化薬洗浄は、非抗体夾雑物の溶出パターンを変化させ、同時に夾雑物ピークサイズを減少させたことが、さらに明らかである。これは、脱複合体化薬洗浄が「超夾雑物」をその個々の構成要素に分離できるという、上記で考察された点を実証する。本発明者らの結果は、これらの個別化された夾雑物のいくつかが、脱複合体化薬洗浄中に完全に除去(溶出)され得、それによりさらにより大きな程度まで精製を増強し得ることを、さらに示唆する。
この抗体での以前の研究は、カチオン交換→アニオン交換→天然のヒドロキシアパタイト精製過程(ヒドロキシアパタイトは実施例1と同一の条件の下で溶出された)が、DNAを除去できず、かつIgGを高度に凝集した状態のままにしたことを示している。具体的には、凝集体が全IgGの約3分の1に達し、かつ断片が別の約3分の1に達し、かつ最終産物におけるDNAが、依然として40 ppmより多く存在していた。対照的に、カチオン交換および実施例4に記載される条件の下での金属で誘導体化されたヒドロキシアパタイトにより精製されたこの抗体の分析用サイズ排除プロファイルのクロマトグラムによって、2段階のみの過程により精製されたにもかかわらず、3段階過程(カチオン交換→アニオン交換→天然のヒドロキシアパタイト精製過程)よりも少ない夾雑を示し、かつ実質的により多くの単量体形態の抗体を有した(90%より多い単量体、3%未満の二量体、1%未満の凝集体、および明らかな断片は無い)ことが例証される。
以前には理解されていなかった理由から、天然のヒドロキシアパタイトを用いたアパタイトクロマトグラフィー支持体上での凝集体除去は、常に有効というわけではなく、過程の開発者に困難かつ高価な課題を生む。実施例4に示される実験結果は、誘導体化されたアパタイトを使用しかつ脱複合体化薬洗浄を含むことが、「抵抗性の」抗体からでさえ凝集体を除去する能力をアパタイトクロマトグラフィー媒質に与えることを示す。さらに、実験の観察により、少なくともいくつかのIgGはその天然の形態に復元されるが、脱複合体化薬の非存在下で天然のヒドロキシアパタイトにより精製されたIgGでのように、非共有結合性凝集体は実際には除去されないことが示される。脱複合体化薬の使用は、回収率における改善になり、潜在的に価値を有する経済的利点を伴う。複合体分離洗浄に還元剤を含むことは、共有結合性凝集体からでさえ天然のIgGを復元できる可能性がある。これらの結果は、DNA複合体形成が、凝集体の形成および安定化に直接的な役割を果たすことを示唆し、かつ、DNAの除去自体が、凝集体除去に新規かつ有効な作戦を提供し得ることをさらに示唆する。
Claims (27)
- 以下の段階を以下の順序で含む、標的分子を生物学的試料から精製する方法:
(a)標的分子および複合体形成した夾雑物を含む試料を、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体に接触させ、それにより標的分子(「結合標的分子」)を固体支持体に非共有結合で結合させる段階;
(b)結合標的分子を、標的分子が固体支持体に実質的に結合したままである条件の下で、複合体形成した夾雑物を標的分子から移動させる薬剤で洗浄する段階;および
(c)標的分子を固体支持体から溶出する段階であって、溶出された標的分子が、複合体形成した夾雑物を実質的に含まない、段階。 - 溶出段階より前に、薬剤を固体支持体から洗浄する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 固体支持体が、溶出段階(c)中に、誘導体化されていないアパタイト固体支持体であるように、洗浄段階(b)と溶出段階(c)との間に、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体を誘導体化されていないアパタイトに変換する段階を含む、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持体が、溶出段階(c)中に、金属カチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体またはポリカチオンで誘導体化されたアパタイト固体支持体である、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
- アパタイトが、ヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- アパタイトが、ヒドロキシアパタイトCHTタイプI、20ミクロン;ヒドロキシアパタイトCHTタイプI、40ミクロン;ヒドロキシアパタイトCHTタイプI、80ミクロン;ヒドロキシアパタイトCHTタイプII、20ミクロン;ヒドロキシアパタイトCHTタイプII、40ミクロン;ヒドロキシアパタイトCHTタイプII、80ミクロン;フルオロアパタイトCFTタイプI、40ミクロン;およびフルオロアパタイトCFTタイプII、40ミクロンからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 標的分子が、タンパク質、抗体、リンタンパク質、ウイルス、ウイルス様粒子、または核酸より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子が抗体である、請求項7記載の方法。
- 核酸がDNAまたはRNAである、請求項7記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が、タンパク質、核酸、脂質、金属イオン、硫化物、多糖類、およびエンドトキシンからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 薬剤が、アルギニン、尿素、グアニジン、塩化ナトリウム、有意なカルシウム親和性が欠如している塩、有機溶剤、界面活性剤、および還元剤からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶剤が、エチレングリコール、プロピレングリコール、アルコール、DMSO、およびDMFからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤、Triton界面活性剤、CHAPS界面活性剤、CHAPSO界面活性剤、およびオクタグルコシドからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 還元剤が、システイン、DTT、DTE、またはメルカプトエタノールからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 洗浄段階(b)が、標的分子を結合した固体支持体を、複合体形成した夾雑物を移動させる2種またはそれより多い異なる薬剤を含む溶液と接触させる段階を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 2種またはそれより多い異なる薬剤が以下を含む、請求項15記載の方法:
i. 尿素および塩化ナトリウム;
ii. 尿素および塩化ナトリウムおよびシステイン;
iii. 塩および有機溶剤;または
iv. 塩および界面活性剤。 - 金属カチオンが、マグネシウム、亜鉛、鉄、カルシウム、ニッケル、コバルト、マンガン、銅、およびクロムからなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 金属カチオンがカルシウムである、請求項17記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が、標的分子と非共有結合で複合体形成している、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が、標的分子と共有結合で複合体形成している、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が、ジスルフィド結合を介して標的分子と共有結合で複合体形成しており、かつ、洗浄段階(b)における薬剤が、還元剤以外の少なくとも1種の薬剤との組み合わせで還元剤を含み、それによりジスルフィド結合を還元する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が固体支持体に結合しているが、標的分子が固体支持体から溶出される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
- 複合体形成した夾雑物が固体支持体から溶出された後に、標的分子が固体支持体から溶出される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子が核酸であり、かつ夾雑物が非核酸分子を含む、請求項23記載の方法。
- 標的分子がタンパク質であり、かつ夾雑物が非タンパク質分子を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子がタンパク質であり、かつ夾雑物が標的分子タンパク質以外のタンパク質を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子がウイルスまたはウイルス様粒子であり、かつ夾雑物が非ウイルス分子を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38456510P | 2010-09-20 | 2010-09-20 | |
US61/384,565 | 2010-09-20 | ||
PCT/US2011/052377 WO2012040216A1 (en) | 2010-09-20 | 2011-09-20 | Dissociation of product-complexed contaminants in chromatography |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013538357A true JP2013538357A (ja) | 2013-10-10 |
JP5903101B2 JP5903101B2 (ja) | 2016-04-13 |
Family
ID=45874128
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013529417A Active JP5903101B2 (ja) | 2010-09-20 | 2011-09-20 | クロマトグラフィーにおける生成物と複合体形成した夾雑物の分離方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9193760B2 (ja) |
EP (1) | EP2619217B1 (ja) |
JP (1) | JP5903101B2 (ja) |
CA (1) | CA2812058C (ja) |
WO (1) | WO2012040216A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017119230A (ja) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Jnc株式会社 | 吸着剤およびその製造方法 |
JP6898535B1 (ja) * | 2020-06-16 | 2021-07-07 | HOYA Technosurgical株式会社 | アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2134360T3 (en) | 2007-03-14 | 2016-02-22 | Takeda Vaccines Inc | Purification of virus-like particle |
EP2707383B1 (en) | 2011-05-13 | 2018-04-18 | Biogen MA Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
US20130267690A1 (en) * | 2011-09-20 | 2013-10-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Removal of virucidal agents from biomolecule preparations |
CN104507953B (zh) * | 2012-05-31 | 2018-05-18 | 新加坡科技研究局 | 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法 |
JOP20130186B1 (ar) * | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
GB201506870D0 (en) * | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003528884A (ja) * | 2000-03-27 | 2003-09-30 | ジェネティックス・インスチチュート・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 高アニオン性タンパク質の精製方法 |
WO2009092010A1 (en) * | 2008-01-18 | 2009-07-23 | Gagnon Peter S | Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography |
WO2010051360A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Wyeth Llc | Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7999085B2 (en) * | 2007-01-09 | 2011-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enhanced capacity and purification of protein by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers |
CN102971337B (zh) * | 2010-04-01 | 2016-09-21 | 昂考梅德药品有限公司 | 卷曲蛋白结合药剂及其应用 |
US8895707B2 (en) * | 2010-08-18 | 2014-11-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
-
2011
- 2011-09-20 EP EP11827361.4A patent/EP2619217B1/en active Active
- 2011-09-20 WO PCT/US2011/052377 patent/WO2012040216A1/en active Application Filing
- 2011-09-20 JP JP2013529417A patent/JP5903101B2/ja active Active
- 2011-09-20 CA CA2812058A patent/CA2812058C/en active Active
- 2011-09-20 US US13/237,294 patent/US9193760B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003528884A (ja) * | 2000-03-27 | 2003-09-30 | ジェネティックス・インスチチュート・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 高アニオン性タンパク質の精製方法 |
WO2009092010A1 (en) * | 2008-01-18 | 2009-07-23 | Gagnon Peter S | Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography |
WO2010051360A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Wyeth Llc | Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017119230A (ja) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Jnc株式会社 | 吸着剤およびその製造方法 |
US10960380B2 (en) | 2015-12-28 | 2021-03-30 | Jnc Corporation | Adsorbent and method for producing the same |
JP6898535B1 (ja) * | 2020-06-16 | 2021-07-07 | HOYA Technosurgical株式会社 | アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 |
WO2021255835A1 (ja) * | 2020-06-16 | 2021-12-23 | HOYA Technosurgical株式会社 | アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012040216A1 (en) | 2012-03-29 |
CA2812058C (en) | 2019-04-16 |
EP2619217A4 (en) | 2014-09-10 |
US20120252098A1 (en) | 2012-10-04 |
EP2619217A1 (en) | 2013-07-31 |
JP5903101B2 (ja) | 2016-04-13 |
CA2812058A1 (en) | 2012-03-29 |
EP2619217B1 (en) | 2016-11-09 |
US9193760B2 (en) | 2015-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5903101B2 (ja) | クロマトグラフィーにおける生成物と複合体形成した夾雑物の分離方法 | |
US10919930B2 (en) | Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography | |
JP5243450B2 (ja) | 水溶性の非イオン性有機高分子の存在下での混合モードクロマトグラフィーによる抗体の能力の増大および精製方法 | |
ES2449148T3 (es) | Purificación de inmunoglobulinas | |
US20100069617A1 (en) | Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions | |
EP2961761B1 (en) | Protein purification in the presence of nonionic organic polymers at elevated conductivity | |
EP2958931B1 (en) | Materials and methods for removing endotoxins from protein preparations | |
JP5773454B2 (ja) | アパタイトの表面中和方法 | |
US20110166332A1 (en) | Enhanced antibody aggregate removal with capto adhere in the presence of protein-excluded zwitterions | |
JP2016507588A (ja) | 非イオン性有機ポリマーおよび電気陽性表面の存在下でのタンパク質精製 | |
US20130267690A1 (en) | Removal of virucidal agents from biomolecule preparations | |
CN107365388B (zh) | 多聚体蛋白的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140407 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141119 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20141119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150217 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150529 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150722 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160222 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160311 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5903101 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |