JP2013536693A - 脂肪生成および筋線維芽細胞分化を制御する薬剤についての細胞培養スクリーニング - Google Patents
脂肪生成および筋線維芽細胞分化を制御する薬剤についての細胞培養スクリーニング Download PDFInfo
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- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
Abstract
Description
本出願は、2010年9月3日に出願された米国特許出願第61/380,125号、および2010年9月1日に出願された米国特許出願第61/379,265号に基づく優先権、およびこれらの出願の利益を主張し、前記出願の両方のその全体が、全ての目的のために、参照によって本明細書に援用される。
本発明は、エネルギー省によって与えられた、協定(Agreement)番号LB09005060および契約番号DE−AC02−05CH11231に基づき、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
「脂肪生成活性」という用語は、脂肪生成、すなわち脂肪生成能を有する細胞の脂肪細胞への分化を誘導する、薬剤の能力を指す。
本明細書において記載されるアッセイにおいて、試験薬剤(複数の場合もある)の脂肪生成活性を評価するために使用される細胞は、典型的には、脂肪生成能を有する細胞である。この文脈において、脂肪生成能は、適切な条件下で、脂肪細胞の表現型を実質的にまたは完全に獲得する(例えば、脂肪細胞へと実質的にまたは完全に分化する)、前記細胞の能力を指す。分化は、in vivoで起こるものであっても良く、またはin vitroで起こるものであっても良い(例えば、適切な試薬の投与によって)。
本明細書において記載されるアッセイは、「試験」細胞を、脂肪生成のために予備刺激するが、前記細胞に、脂肪細胞への最終的な分化を行わせないことを伴う。これは、前記細胞を、脂肪細胞への最終的な分化を誘導するために必要とされる1つまたは複数の因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させること(例えば、前記細胞を、前記脂肪細胞分化混合物において培養すること)によって、達成することができる。
集密状態にある前脂肪細胞を、所定の脂肪細胞分化混合物(脂肪生成カクテル)によって、同調的に分化させることができる。様々な実施形態において、最大の分化が、インスリン、グルココルチコイド(グルココルチコイドアゴニスト)、細胞内cAMPレベルを上昇させる薬剤、および適切な培養培地(例えば、ウシ胎児血清を含む培地)の組合せを用いる処理によって、達成される。インスリンは、インスリン様増殖因子1(IGF−1)受容体を介して作用することが知られており、IGF−1を、前記脂肪生成カクテルにおいて、インスリンの代わりに用いることができる(非特許文献16)。
脂肪生成能を有する細胞は、前記細胞を、脂肪細胞への最終的な分化に必要とされる1つまたは複数の因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させること(例えば、前記細胞を、前記脂肪細胞分化混合物において培養すること)によって、予備刺激するが、脂肪細胞への分化を行わせないことができる。一つの例示的な実施形態では、予備刺激混合物/カクテルは、インスリンを含有しない(および、好ましくは、インスリン受容体および/またはIGF−1受容体と結合する薬剤を含有しない)。したがって、一つの例示的な実施形態では、前記予備刺激カクテルは、デキサメタゾンおよびIBMXを含む。
前記細胞を、上で記載されるような1つまたは複数の試験薬剤と接触させ、前記細胞を、脂肪細胞への分化を行わせるのに十分な時間培養した後、前記細胞は、脂肪細胞の表現型および/または遺伝子型についてスクリーニングされ、ここで、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である。
前記薬剤は、実際上、任意の化学的化合物であり得る。前記薬剤は、単一の単離化合物として存在していも良く、または、化学(例えば、コンビナトリアル)ライブラリの成員であっても良い。例示的な試験薬剤は、タンパク質、ペプチド模倣物、核酸(例えば、siRNA)、レクチン、抗体、小有機分子等を含むが、これらに限定されない。
本明細書において記載されるアッセイは、多数の形式のいずれかで行うことができる。ある特定の実施形態では、前記細胞は、2次元(2D)細胞培養として、多ウェルプレート(例えば、12ウェル形式、24ウェル形式、96ウェル形式、384ウェル形式、1536ウェル形式等)で培養される。2次元培養システムは、(3Dシステムより)単純であり、手動による介入をあまり必要とせず、ハイスループットスクリーニング(HTS)システムに十分に適する。
様々な実施形態において、本明細書において記載されるアッセイは、前記試験薬剤(複数の場合もある)への曝露が、前記試験細胞において、脂肪細胞の表現型の1つまたは複数の特徴をもたらす場合、陽性の結果を示すと判断される。ある特定の実施形態では、前記アッセイは、前記試験薬剤(複数の場合もある)への曝露が、皮膚に特徴的な試験細胞(例えば、皮下の前脂肪細胞)において、脂肪細胞の表現型の1つまたは複数の特徴(例えば、脂質の蓄積)をもたらし、内臓の組織由来の試験細胞(例えば、内臓の前脂肪細胞)において、より低い効果をもたらすか、または効果をもたらさない場合、陽性の結果を示すと判断される。
本明細書において記載されるアッセイは、「ハイスループット」様式に適している。従来的には、有用な特性(例えば、皮下の前脂肪細胞に対する脂肪生成活性)を有する新たな化学的実体は、望ましい特性または活性(例えば、RHAMMの発現および/または活性の阻害)を有する化学的化合物(「リード化合物」と称される)を同定すること、前記リード化合物の変異体を創出すること、ならびにこれらの変異体化合物の特性および活性を評価することによって、作製される。しかしながら、現在の傾向は、薬剤発見の全ての局面についてのタイムスケールを短縮することである。多数のものを迅速且つ効率的に試験することができるため、ハイスループットスクリーニング(HTS)方法は、従来のリード化合物同定方法に取って代わりつつある。
ある特定の実施形態では、コンビナトリアル化学ライブラリを、新たなリード化学的化合物の作製において支援するために使用することができる。コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬等の多数の化学的な「構成要素」を組み合わせることによる、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって作製された、多様な化学的化合物の収集物である。例えば、線形(linear)コンビナトリアル化学ライブラリ、例えばポリペプチドライブラリは、所与の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)に対して、考え得るあらゆる方法で、アミノ酸と呼ばれる一組の化学的構成要素を組み合わせることによって、形成される。何百万種類の化学的化合物を、化学的構成要素の、そのようなコンビナトリアル混合を介して、合成することができる。例えば、一人の評論家が、100種類の互換的な化学的構成要素の体系的なコンビナトリアル混合が、1億種類の四量体化合物または100億種類の五量体化合物の理論的合成をもたらすことを観察した(非特許文献21)。
本明細書において記載される脂肪生成活性についてのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。ある特定の好ましいアッセイは、前記試験薬剤(複数の場合もある)との接触によってもたらされる、脂質の蓄積の検出によって、および/または特徴的なタンパク質マーカーの上方調節によって、脂肪細胞の分化の増大を検出する。
様々な実施形態において、本明細書において記載されるアッセイを行うための細胞培養システムが、提供される。ある特定の実施形態では、前記細胞培養システムは、脂肪生成能を有する哺乳動物細胞を含有する、1つまたは複数の細胞培養容器を含み、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない。様々な実施形態において、前記細胞は、急性の(acute)培養物中に存在するが、他の実施形態においては、前記細胞は、多数回継代された樹立細胞株である。例示的な細胞は、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞/間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、血管の脂肪細胞前駆体等を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、前記細胞は、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも1つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物中において、準備される。
ある特定の実施形態では、上で記載される、細胞に基づく(in vitroの)アッセイにおいて、陽性の結果を示す試験薬剤(複数の場合もある)は、in vivo動物モデルにおいて、さらに検証される。例えば、in vivoでの脂肪生成の効果的な促進因子である試薬を同定するための、前記スクリーニングのフィデリティを、前記試験薬剤(複数の場合もある)を、動物モデルにおいて(例えば、7月齢の雌のラットの皮膚の下に注射した場合に)、皮下脂肪の蓄積を促進するそれらの能力について、スクリーニングすることによって、試験することができる。ある特定の実施形態では、外耳における注射が行われる。この部位における注射が良好なデータをもたらすことが観察されている。間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する、試験薬剤(複数の場合もある)の能力が、in vivoでラットの皮膚(または、他の動物モデル)における皮下脂肪の蓄積を促進する、これらの試薬の能力と非常に密接に対応することが見出されている。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるアッセイを実施するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、前記キットは、脂肪生成能を有する1つまたは複数の細胞種(例えば、前脂肪細胞)を含有する。前記キットは、前記細胞を、脂肪生成のために予備刺激するが、前記細胞に、脂肪細胞への最終的な分化を行わせないための試薬混合物をさらに含み得る。前記キットは、前記細胞を増殖および/または維持するための培地をさらに含有していても良い。前記キットは、分化した脂肪細胞を検出するための、1つもしくは複数の試薬、および/またはそのような検出を容易化するためのソフトウェアをさらに含んでいても良い。前記キットは、本明細書において記載されるアッセイの実施を容易化するための、任意の試薬および/または装置を任意に含んでいても良い。そのような試薬は、緩衝剤、標識、標識された抗体、標識された核酸、蛍光標識の可視化のためのフィルターセット、ブロッティング膜等を含むが、これらに限定されない。
脂肪生成アッセイ
細胞種:
ある特定の実施形態では、任意の前脂肪生成細胞、真皮線維芽細胞、多能性線維芽細胞(例えば、3T3−L細胞)または間葉系幹細胞が、このアッセイに好適である。
細胞は、96ウェルまたは他の多ウェル組織培養プレートにおいて、培養することができる。
脂肪生成開始/予備刺激培地を調製するために、IBMX標準溶液(0.5mM)を、1:1000で希釈し、デキサメタゾン標準溶液(1μMデキサメタゾン標準溶液(DMSO中))を、DMEM+10%FCSにおいて1:10000で希釈する。抗生物質の典型的なカクテルを、微生物の増殖を制限するために添加することができる。この開始培地は、4℃で最大6週間保存することができる。
陽性対照進行培地を調製するために、標準インスリン溶液(10μg/mlのインスリン)を、DMEM+10%FCSにおいて1:1000で希釈する。最適な抗生物質を、微生物の増殖を制御するために添加する。この対照進行培地は、4℃で最大6週間保存することができる。
一つの好適な3D脂肪生成アッセイは、非特許文献53に記載されるアッセイの変法である。ヒトの皮膚の前脂肪細胞を含む前脂肪細胞、網状線維芽細胞、間葉系幹細胞、および脂肪生成能を有する他の細胞種を、DMEM(低グルコース)+10%ウシ胎児血清添加物において、組織培養プラスチック表面上で集密状態まで培養する。細胞を、脂肪細胞へと分化するまで、脂肪生成を促進する因子のカクテルに曝露する。分化した脂肪細胞を、DMEM(低グルコース)+10%FCSにおいて維持し、マトリゲルを、脂肪細胞の単層の最上部に重層する。網状および乳頭状線維芽細胞を、重合したマトリゲル層の表面上に、低密度(例えば、1ml当たりの細胞数5×103個)で播種し、マトリゲル中に浸潤させる。ケラチノサイト(初代または細胞株)を、マトリゲルの表面上に播種し、引き続き、上清培養培地を除去し、それによって、ケラチノサイトが、マトリゲル層の表面上に拡散し、角質化する。このアッセイは、皮膚に典型的な3層の形成をもたらす:分化した皮下脂肪層、線維芽細胞を含有する真皮層、および分化したケラチノサイトの表面層。このアッセイは、無傷の皮膚の条件に類似するまたはこれのモデルとなる条件下で、ヒト前脂肪細胞の分化に影響を及ぼす因子を評価するのに、特に有用である。
ヌードモルモットにおける皮下の脂肪生成に対する、RHAMMの機能を遮断する抗体(R−6836−B)、およびRHAMM合成ペプチドBの効果を、以下の試薬を使用して、評価した:1)抗RHAMM抗体(R−6836−B)(0.025mg/ml)、2)RHAMM合成ペプチド(1mg/ml)、3)ラット尾I型コラーゲン(1mg/ml)、および4)重炭酸ナトリウム。ある特定の実施形態では、RHAMMペプチドおよび抗体の量は、約0.1から約250μg/mlまで、より好ましくは約0.25から約100μg/mlまでの範囲である。
コラーゲン溶液のpHは、重炭酸ナトリウム溶液を添加することによって、7から8に調節した(1mlのコラーゲン溶液に対して30μlの重炭酸ナトリウムを添加する)。その処理中、コラーゲン溶液は氷上に維持した。
各々の条件について1匹の動物を使用した(合計4匹のヌードモルモットおよび2匹のスプラーグドーリーラット)。各々のヌードモルモットの5つの位置(背中の2箇所、乳腺の脂肪体の近くの胃の2箇所、および頸部の背部の1箇所)に、試薬を注射した。G20からG22の皮下用注射針を有する1mlのシリンジを、注射に使用した。動物を、イソフルランガス(レベル1から1.5。O2と混合)を用いて鎮静化した。動物の注射部位を、アルコールワイプを用いて清浄化した(スプラーグドーリーラット上の注射部位は、注射の前に剪毛した)。0.25μgの抗体を含有するコラーゲン溶液1mlを、動物の背中または胃において、皮膚の下に、非常にゆっくりと注射した。各々の注射の後、各々の動物を、最大5分間、同じ姿勢で留まらせた。注射部位に、油性シャーピーペンを用いて、マークを付した。
細胞の維持
細胞株の供給業者からの取扱説明書の通りに、細胞ストックを維持する。最良の結果のために、DMEM+10%CS(FCSではなく)において細胞を維持する。細胞を、培養の集密によって起こるバックグラウンドの脂肪生成を低減するために、低い培養密度(例えば、ディッシュ100mm当たり4×105個の細胞)に常に維持する。
脂肪生成スクリーニングのための細胞は、以下の通りに蒔くことができる:細胞を、トリプシン処理し、引き続き、1mlのDMEM+10%CSに再懸濁して、トリプシンを中和する。細胞を引き続き計数する。ある特定の実施形態では、DMEM+10%CS 1ml当たり約30000個の細胞を蒔く。細胞を、1から2日間、この培地中に放置する。ある特定のウェル、例えば、細胞を含まない1行のウェルを、ブランク(複数の場合もある)をもたらすために、維持することができる。
ラット間葉系細胞およびマウス胚性前脂肪生成線維芽細胞(例えば、3T3−L細胞)が、進行培地においてインスリンに曝露すると、脂肪生成を起こした(ラット間葉系幹細胞が図1に示される)。脂質の蓄積の程度を、520nmで検出されるオイルレッドOの量を測定することによって、定量した。この程度を、100%として示す。脂肪生成に対するRHAMM機能を遮断する抗体(抗ペプチドB抗体)の効果を、図1の上パネルに示し、ELISAにおいて、RHAMMペプチドBおよびRHAMM模倣ペプチドP15の効果と併せて定量する(結果を、図1の下パネルに示す)。RHAMM抗ペプチドB抗体の効果は、インスリンの5倍の大きさであり、RHAMMペプチド配列Bおよび模倣ペプチドは、それぞれ3倍および2倍の大きさである。陰性対照の細胞は、DMEM+CS中で増殖させ、開始培地または進行培地のいずれにも曝露しなかった。
in vivoでの脂肪生成の効果的な促進因子である試薬を同定するための、スクリーニングのフィデリティを、培養スクリーニングにおける試薬の順位付けを、7月齢の雌のラットの皮膚の下に注射した場合に、皮下脂肪の蓄積を促進する、それらの相対的な能力と比較することによって、試験した。ラットにおけるRHAMMの機能を遮断する試薬の注射によってもたらされる、皮下の脂肪体の蓄積を、図3に示す。間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する、試薬の能力は、in vivoでのラットの皮膚における皮下脂肪の蓄積を促進する、これらの試薬の能力と非常に密接に対応する。
前脂肪細胞の、2D脂肪生成分化。
前脂肪細胞、または脂肪由来の幹細胞、または間葉系幹細胞(MSC)を分化させるための、GIBCOから市販されているキット(STEMPRO(登録商標)脂肪生成分化キット)。
継代回数の少ない脂肪由来の幹細胞およびMSC(継代回数8から10回未満)は、より強い多能性を示す。培養が、60から80%の集密度に到達した時に、継代を行うべきである(集密状態は、また、多能性を低減する可能性がある)。
前脂肪細胞の3D培養および脂肪分化
以下の表2に従って、好ましくは使用の前日、1週間前以後に、プレミクス溶液を調製する。この溶液は氷上で調製し、使用前に0.22μmのフィルターを用いて滅菌ろ過し、1N HCl溶液を用いてpHを7.5に調節する。
全ての試薬を予め冷却する。ヒト前脂肪細胞を、80%未満の集密度で回収し、細胞数を決定する。脂肪生成分化培地を、引き続き、細胞に添加し、細胞濃度を、例えば培地1ml当たり細胞数2×105個の播種密度に、調節する。
Claims (72)
- 試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングする方法であって、
脂肪生成能を有する哺乳動物の試験細胞を準備する工程であって、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、工程;
前記細胞を、前記試験薬剤と接触させる工程;および
前記試験細胞を、脂肪細胞の表現型についてスクリーニングする工程であって、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である、工程
を含む、方法。 - 脂肪生成能を有する前記細胞が、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞/間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉からなる群から選択される細胞である、請求項1に記載の方法。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である、請求項2に記載の方法。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、内臓の前脂肪細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記前脂肪細胞が、褐色前脂肪細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記前脂肪細胞が、白色前脂肪細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記前脂肪細胞が、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である、請求項4に記載の方法。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、皮下の前脂肪細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞が、3T3−L1細胞、3T3−F422A細胞、1246細胞、Ob1771細胞、TA1細胞および30A5細胞からなる群から選択される細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞が、肥満または痩身の傾向のある動物由来の細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記準備する工程が、前記細胞を、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも1つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させる工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、IBMX、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、IGF−1およびインスリンからなる群から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、IBMX、デキサメタゾン、IGF−1およびインスリンからなる群から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、インスリン、IGF−1、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物からなる群から選択される1つまたは複数の薬剤を含まない、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、インスリンおよび/またはIGF−1を含まない、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、抗ウイルス薬を含まない、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スクリーニングする工程が、脂肪細胞によって特異的に発現されるタンパク質を検出または定量する工程を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および、脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記スクリーニングする工程が、前記細胞における脂質の蓄積を検出または定量する工程を含み、脂質の蓄積が、前記細胞が、脂肪細胞の特徴を獲得したことを示す、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質の蓄積を検出または定量する工程が、脂質の染色を検出または定量する工程を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記スクリーニングする工程が、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、完全な脂肪細胞分化混合物と接触した同じ細胞種を含む陽性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陽性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全な脂肪細胞分化混合物が、IBMX、デキサメタゾンおよびインスリンを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記スクリーニングする工程が、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陰性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有しないことの指標である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験細胞が、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の試験薬剤が、アッセイされ、異なる試験薬剤が、異なる容器またはウェルに配列される、請求項24に記載の方法。
- 複数の試験薬剤が、単一のウェルまたは容器に存在する、請求項24に記載の方法。
- 試験薬剤を含有する各々のウェルまたは容器が、単一の試験薬剤を含有する、請求項24に記載の方法。
- 1つまたは複数の容器またはウェルが、陽性対照細胞を含有する、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の容器またはウェルが、陰性対照細胞を含有する、請求項24から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイが、24ウェル形式、96ウェル形式、384ウェル形式または1536ウェル形式で実施される、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、2D細胞培養で培養される、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、3D細胞培養で培養される、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、集密状態まで増殖する、請求項31または32に記載の方法。
- 前記試験細胞が、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含み、
前記スクリーニングする工程が、皮下の前脂肪細胞において、脂肪生成を誘導し、且つ、内臓の前脂肪細胞において、より少ない量の脂肪生成を誘導するか、または脂肪生成を誘導しない試験薬剤を、陽性と判定する工程を含む、
請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。 - 線維芽細胞を、前記試験薬剤と接触させる工程;および
前記線維芽細胞を、筋線維芽細胞の活性の変化についてスクリーニングする工程
をさらに含み、脂肪生成活性と筋線維芽細胞の活性の阻害とを示す試験薬剤が、セルライトの治療または予防のための候補薬剤である、
請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、ハイスループット形式で行われる、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
- 陽性であるとスクリーニングされた試験薬剤が、非ヒト哺乳動物における皮下注射によってさらに検証される、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
- 試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングするための細胞培養システムであって、
脂肪生成能を有する哺乳動物細胞を含有する、1つまたは複数の細胞培養容器を含み、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、
細胞培養システム。 - 脂肪生成能を有する前記細胞が、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞/間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉からなる群から選択される細胞である、請求項38に記載の細胞培養システム。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である、請求項39に記載の細胞培養システム。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、内臓の前脂肪細胞である、請求項39に記載の細胞培養システム。
- 前記前脂肪細胞が、褐色前脂肪細胞である、請求項41に記載の細胞培養システム。
- 前記前脂肪細胞が、白色前脂肪細胞である、請求項41に記載の方法。
- 前記前脂肪細胞が、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である、請求項41に記載の細胞培養システム。
- 脂肪生成能を有する前記細胞が、皮下の前脂肪細胞である、請求項39に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、3T3−L1細胞、3T3−F422A細胞、1246細胞、Ob1771細胞、TA1細胞および30A5細胞からなる群から選択される細胞である、請求項38に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、肥満または痩身の傾向のある動物由来の細胞である、請求項38から45のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも1つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物において培養される、請求項38から47のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、IBMX、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、IGF−1およびインスリンからなる群から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項48に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、IBMX、デキサメタゾン、IGF−1およびインスリンからなる群から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項48に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、以下:インスリン、IGF−1、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物のうち1つまたは複数を含まない、請求項48から50のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、インスリンおよび/またはIGF−1を含まない、請求項48から51のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、抗ウイルス薬を含まない、請求項48から52のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、脂肪細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質の存在を示す指示物と接触する、請求項38から53のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記指示物が、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および、脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子からなる群から選択されるタンパク質と結合する抗体を含む、請求項54に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、脂質の存在を示す指示物と接触する、請求項38から55のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞培養システムが、完全な脂肪細胞分化混合物と接触した同じ細胞種を含む陽性対照細胞をさらに含む、請求項38から56のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記脂肪細胞分化混合物が、IBMX、デキサメタゾンおよびインスリンを含む、請求項57に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞培養システムが、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照細胞をさらに含む、請求項38から58のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記試験細胞が、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される、請求項38から59のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 異なる試験薬剤が、異なる容器またはウェルに存在する、請求項60に記載の細胞培養システム。
- 複数の試験薬剤が、単一のウェルに存在する、請求項60に記載の細胞培養システム。
- 試験薬剤を含有する各々のウェルが、単一の試験薬剤を含有する、請求項60に記載の細胞培養システム。
- 1つまたは複数の容器またはウェルが、陽性対照細胞を含有する、請求項38から63のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 1つまたは複数の容器またはウェルが、陰性対照細胞を含有する、請求項60から64のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記培養システムを構成する細胞が、12ウェル形式、24ウェル形式、96ウェル形式、384ウェル形式または1536ウェル形式で存在する、請求項60から65のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、2D細胞培養で培養される、請求項38から66のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、3D細胞培養で培養される、請求項38から66のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が、集密状態まで増殖する、請求項67または68に記載の細胞培養システム。
- 前記試験細胞が、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含む、請求項38から69のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 線維芽細胞をさらに含む、請求項38から70のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
- 前記システムが、ハイスループットスクリーニングのために構成される、請求項38から71のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
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