CN102482642A - 人皮肤外植体培养系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人皮肤外植体培养系统及其用途。

Description

人皮肤外植体培养系统及其用途
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2009年8月21日的美国临时申请61/235,923的优先权。上述相关美国专利申请的全部公开内容据此以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及人皮肤外植体培养系统以及使用所述系统测试组合物对皮肤代谢活性的作用。
背景技术
体外模型系统一直是基础研究和应用研究的重要构成部分。由于最新的欧盟法规禁止使用动物测试化妆品成分，因此为皮肤建立此类模型系统越发重要。
人皮肤外植体已在培养条件下研究50多年，主要研究领域为表皮生物学和上皮癌研究。然而，这些模型系统主要针对表皮活性，无法重现真皮层和脂肪层的代谢活性以及组织结构。
论文“Repair of UVA-Induced Elastic Fiber and Collagen Damage by0.05％Retinaldehyde Cream in an ex vivo Human Skin Model”(在体外人皮肤模型中使用0.05％视黄醛霜剂修复UVA诱导的弹性纤维和胶原损伤)(由S.Boisnic等人提交于1998年10月7日在第七届欧洲皮肤性病学会年会(Nice，France)召开的卫星研讨会的、题名为“New Concepts for TopicalUse of Natural Retinoids，Retinaldehyde in Perspective”(天然类视色素、视黄醛局部用药前景的新概念)的论文集(编辑：J.-H.Saurat，Geneva，Switzerland；A.Vahlquist，Uppsala，Sweden))讨论了视黄醛对皮肤外植体培养物中的胶原的作用。
最近发表的论文“Effect of Green Coffea Arabica L.Seed Oil onExtracellular Matrix Components and Water-channel Expression in in vitro andex vivo Human Skin Models”(Journal of Cosmetic Dermatology，2009Mar；8(1)：56-62，Velazquez Pereda Mdel C et al.)(绿咖啡豆种子油对体内和体外人皮肤模型中细胞外基质组分和水通道蛋白表达的作用(《美容皮肤病学杂志》，2009年3月；第8卷第1期，第56-62页，Velazquez PeredaMdel C等人))的作者没能说明在外植体培养物中起到的作用。因此，他们用人皮肤组织切片与其受试试剂共同温育，再进行免疫染色，以证实在合成胶原、弹性蛋白和其他细胞外基质组分时的刺激作用。
不管这些论文的教导内容如何，一直需要这样的人皮肤外植体模型系统：其最能代表所有皮肤区室的生理复杂性、代谢活性和结构完整性。
还需要增加所培养的活检组织的表面积，以便能够研究试剂和组合物的局部施用。直径4mm的标准活检组织大小不支持此类研究。“A HumanFull-Skin Culture System for Interventional Studies”(Eplast.2009；9：e5.Published online 2009 January 9，by Lars Steinstraesser et al.)(用于干预性研究的人全层皮肤培养系统(Eplast.2009；第9卷第e5页，由LarsSteinstraesser等人于2009年1月9日网上发表))描述了较大皮肤活检组织的培养并证实皮肤外植体的组织学特性保留了4周。然而，在该外植体系统的转基因表达模式研究中，却发现并不与体内观察到的代谢活性类似。
一直需要这样的人皮肤外植体模型系统：其最能代表所有皮肤区室的生理复杂性、代谢活性和结构完整性，并且具有足够的表面积以便能够用受试试剂和组合物进行局部处理。
发明内容
本发明涉及人皮肤外植体培养系统，所述培养系统包含置于特定培养基中的直径高达约25mm的人皮肤活检组织，所述培养基包含约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基、约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物、约0.5重量％至约5重量％的胎牛血清、1至20μg/ml的胰岛素、1至20ng/ml的氢化可的松、1至20ng/ml的表皮生长因子以及1×抗生素-抗真菌溶液。
本发明还提供了一种用于确定组合物在局部施用到皮肤时的作用的方法，所述方法包括：将直径高达约25mm的皮肤活检组织培养在特定培养基中，所述培养基包含：约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基、约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物、约0.5重量％至约5重量％的胎牛血清、1至20μg/ml的胰岛素、1至20ng/ml的氢化可的松、1至20ng/ml的表皮生长因子以及1×抗生素-抗真菌溶液，从而建立皮肤外植体培养系统；将组合物局部施用到皮肤活检组织；以及分析皮肤活检组织对组合物的生物学响应。在另一个实施例中，将组合物或受试试剂施用到上述培养基中，以便将组合物对不同皮肤区室的生物学作用与局部递送的作用区分开。
具体实施方式
本发明的培养系统用于延长皮肤外植体的存活期并且用于确保全层皮肤外植体都有代谢活性，进而能够对局部施用的组合物的作用进行研究。
通常，皮肤外植体采用的形式为尺寸为直径2-4mm的皮肤活检组织，因为在标准培养条件下更大的外植体在组织中心会发生坏死。然而，具有此类小尺寸的皮肤外植体不适合局部施用。现已鉴定了用以支持更大的人皮肤外植体的完整性的最佳培养基，从而使局部施用的皮肤学活性的评估得以实现。
培养系统包含培养基，该培养基包含具有高蔗糖含量的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(“DMEM”)。达尔伯克氏改良伊格尔培养基可以达尔伯克氏改良伊格尔培养基(D-MEM)(1X)，液体(高糖)/目录号：11965(Dulbecco′s Modified Eagle Medium(D-MEM)(1X)，liquid(high glucose)/cat#：11965)得自例如Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)。
DMEM的含量可在培养基的约40至约60体积％的范围内，例如约50体积％。
培养基还包含F-12营养混合物(“F-12”)。F-12营养混合物可以F-12营养混合物(Ham)(1X)，液体12/目录号：11765(F-12 Nutrient Mixture(Ham)(1X)，liquid12/cat#：11765)得自例如Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)。
F-12营养混合物的含量可在培养基的约40至约60体积％的范围内，例如约50体积％。
培养基还包含牛血清，例如胎牛血清。牛血清可以胎牛血清，合格，热灭活/目录号：10082-139(Fetal Bovine Serum，Certified，Heat-Inactivated/cat#：10082-139)得自例如Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)。
牛血清的含量可在培养基的约0.5至约5重量％的范围内，例如约2重量％。
培养基补充有胰岛素、氢化可的松、表皮生长因子(“EGF”)和抗生素-抗真菌溶液(“ABAM”)。
胰岛素的含量可在1至20μg/ml的范围内，例如10μg/ml。胰岛素可以人胰岛素溶液/目录号：I9278(insulin solution human/cat#：I9278)得自例如Sigma(St.Louis，MO，USA)。
氢化可的松的含量可在1至20ng/ml的范围内，例如10ng/ml。氢化可的松可以氢化可的松粉末，经γ辐射/目录号：H0135(hydrocortisonepowder，γ-irradiated/cat#：H0135)得自例如Sigma(St.Louis，MO，USA)。
表皮生长因子的含量可在1至20ng/ml的范围内，例如10ng/ml。表皮生长因子可以重组人表皮生长因子(EGF)/目录号：PHG0311(RecombinantHuman Epidermal Growth Factor(EGF)/cat#：PHG0311)得自例如InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA，USA)。
抗生素-抗真菌溶液的含量为1×。抗生素-抗真菌溶液可以抗生素-抗真菌溶液(100X)，液体/目录号15240-062(Antibiotic-Antimycotic(100X)，liquid/Cat.No.15240-062)得自例如Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)。
将高达约25mm直径(例如约2至约25mm、或约4至约25mm，或在某些实施例中，约12mm直径)的人皮肤外植体置于培养基中。培养基液面应与外植体高度相当。
在一个实施例中，将外植体在约32℃至约37℃下温育，例如在约32℃下温育。意外地发现，将培养温度从37℃(标准温度)降低至约32℃，可使外植体存活更久并且提高了其完整性和代谢活性。还意外地发现，在培养的首个24小时内将培养温度从37℃(标准温度)降低至约32℃，然后再将外植体培养于37℃，也可使外植体存活更久并且提高了其完整性和代谢活性。
在另一个实施例中，胎牛血清的含量从5％降低至2％。这也可使所培养的外植体存活更久，并且提高了其组织完整性和代谢活性。
在另一个实施例中，将外植体在含有5体积％的CO2的标准湿润气氛中温育。
每天更换培养基。也就是说，去除并更换培养基和营养物质。
本发明所使用的培养基可确保组织存活性。如本文所用，“可确保组织存活性”是指可保证组织在培养过程中存活并防止可导致细胞和组织死亡的组织损伤，例如防止组织坏死。
可通过对组织学染色的组织切片进行组织学分析并说明组织结构完好且正常，来证实组织存活性。
也可通过分析已知对细胞存活性至关重要的基因的基因表达，来测定组织存活性。这些基因包括但不限于定义为“管家基因”的一组基因。管家基因通常为组成性基因，它们在许多或所有已知条件下都以相对恒定的水平转录。通常需要管家基因的产物来维持细胞。一般认为无毒试剂的局部处理不会影响管家基因的表达。管家基因的例子包括但不限于肌动蛋白、GAPDH、18S RNA和泛素。也可采用本领域技术人员已知的任何方法测定组织存活性。
本发明的培养系统使得研究组合物在局部施用到皮肤时的作用得以实现。可测定皮肤外植体在分子、细胞和/或生理水平上对受试组合物的响应。可通过组织学、分子分析、生物标记物分析等方法分析皮肤外植体。
具体地讲，本发明使在皮肤外植体所有区室内的代谢活性水平更高，更类似于体内皮肤的代谢活性。可使用根据本发明培养的外植体测定皮肤三个区室的代谢活性。如本文所用，“代谢活性”是指活性基因表达、或基因产物合成、或蛋白质(例如酶)活性以及终产物的生成，这种活性为这些组织区室所专有，但不是决定组织存活性的唯一因素。
在一个实施例中，通过组织特异性基因的基因表达来分析根据本发明培养的外植体的代谢活性。
对于皮肤的表皮区室，此类基因包括但不限于角质细胞表达的基因，例如特定角蛋白(如角蛋白5、14、1和10)、PAR-2、或KGFR，以及黑素细胞特异性基因，例如酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2及其他黑素生成基因。
对于皮肤的真皮区室，此类基因包括但不限于弹性蛋白、弹性蛋白辅助蛋白(例如微纤维蛋白-1和扣针蛋白-5)和胶原(例如胶原1α1和胶原4)。
对于皮肤的脂肪层，此类基因包括但不限于生脂基因(例如PPAR-γ、瘦素、GLUT4、FABP4、AdPLA2和Pref-1)和脂解基因(例如PPAR-α、酰基CoA脱氢酶、磷酸二酯酶、CPT肉毒碱棕榈酰基转移酶和GPR81)。
在本发明的另一个实施例中，通过对根据本发明培养的外植体的组织切片进行组织学或免疫组织化学染色，来分析皮肤的真皮层的代谢活性。此类染色的例子包括但不限于展现高弹性蛋白纤维网络的Luna弹性蛋白染色、或展现新胶原合成情况的前胶原免疫组织化学染色。
在另一个实施例中，通过分析分泌到根据本发明外植体的培养基中的参与脂质代谢的分子，来测定这些外植体的脂肪层的代谢活性。此类分子的例子包括但不限于分泌蛋白(例如瘦素)和脂质分子分泌物(例如甘油和非酯化脂肪酸)。
除非另有规定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域普通技术人员公知的相同含义。除非另外指明，否则无论何时使用的任何百分比均为重量/重量(w/w)。
以下说明了本发明的实例。不应将本发明理解为受到其细节的限制。
实例1
在得到知情同意后，从接受整形手术的健康个体获得人腹部皮肤。依照US HIPAA法规的规定，未公开患者身份以保护保密权。首先用补充有青霉素/链霉素(200单位/ml青霉素、200μg/ml链霉素)、两性霉素B(5μg/ml)和庆大霉素(20μg/ml)的DMEM在室温下对钻取活检组织(直径为4和12mm)消毒30分钟，所有这些试剂均得自Invitrogen(Carlsbad CA)。将外植体置于表1中列出的不同培养基中，其中补充有抗生素和表2中所列的生长因子混合物，再放置在37℃加湿室中，使之处于5％CO2气氛下。每天更换培养基。
培养基A-G为对比物。培养基1根据本发明配制。
表1-所测试的培养基(除非另外指明，否则所有材料均购自 Invitrogen)
Figure BPA00001515519700071
表2-培养基补充物
Figure BPA00001515519700072
在规定时间段后收获皮肤外植体，将其放在10％福尔马林(Richard-Allan scientific(Kalamazoo，MI))中固定过夜，然后保存在70％乙醇中。然后将样品包埋于石蜡块中并切片(5μm)，使用标准工序处理后，进行苏木精与伊红(H&E)染色。使用Leica显微镜(Leitz DM1L，Leica，Allendale，NJ)和QiCAM相机(QIMAGING，Surrey，BC，Canada)获得染色切片的图像。由专家评级系统对来自每个测试条件的至少12张图像的组织完整性进行评级，主要关注表皮细胞完整性和真皮胶原降解情况。
4mm(标准尺寸)或12mm(大尺寸)外植体在培养于培养基1时在多达12天时间内都未观察到坏死。在多达12天培养时间内，只在表皮中观察到极少空泡细胞或未观察到空泡细胞，并且未在真皮中检测到细胞外基质降解。相反，使用培养基A-G培养12天时或在更早的时间点就观察到坏死、真皮基质降解和空泡表皮细胞。
表3提供了由比较培养基1和培养基A的代表性实验得出的数据。用表1中列出的其他对比培养基和表2中列出的补充物进行的类似研究证实了培养基1更具优势。表3中示出的每个数据点代表3个大的活检组织(12mm)。这些研究的评级标准范围为1-5，其中5表示组织完整性最佳。对于每个研究，将培养之前不久(此处称为“预培养”)的组织完整性定义为5。
表3
Figure BPA00001515519700081
*第12天的研究在单独的实验中进行。
表3中的数据表明，在保持活皮肤器官培养物存活更长时间方面，根据本发明的培养基1(含有5％FBS)优于对比培养基A。
实例2
根据实例1所述的方法在含有2％FBS的培养基1中构建人皮肤外植体培养物(12mm)。将外植体培养物在37℃下温育或在32℃下温育，使之处于5％CO2气氛中。每天更换培养基。从实验开始算起经过预定时间段后，收获皮肤外植体，将其用于组织学染色并根据实例1所述的方法进行评估。表4示出了由比较37℃与32℃的代表性实验得出的数据。每个数据点代表3个活检组织。
表4
Figure BPA00001515519700091
表4中的数据表明，低温(32℃)温育12天的皮肤外植体培养物相比标准温度(37℃)温育的来自同一供体皮肤的外植体，其具有更优的代谢活性。此外，使用本发明具有低含量血清(2％)的培养基实现了皮肤外植体培养物更长的存活期(如表3中说明的，含5％FBS的培养基1，以及如表4中说明的，含2％血清的培养基1)。另外，将皮肤外植体在首个24小时在低温下(32℃)温育，然后转换至标准温度(37℃)，可使其存活期长于连续在37℃下温育的外植体。
实例3
由于活组织外植体可具有代谢活性、或仅具有较低代谢活性、或可能处于休眠状态，并且由于希望使用具有代谢活性的皮肤组织培养物对皮肤病试剂进行评估，我们测试了在本发明的最佳培养条件下培养时维持培养物代谢活性的能力。
根据实例1中所述的方法使用培养基1构建皮肤外植体培养物。将外植体在37℃下温育，使之处于5％CO2气氛中。将皮肤外植体在培养基1中保持未处理状态或用TGF-β(一种已知用来提高弹性蛋白产量的试剂)处理。每天更换培养基。经过预定时间段后，收获皮肤外植体，再按照如下方式处理以进行组织学、免疫组织化学和基因表达评估。
1.使用LUNA染色，从组织学角度展现弹性蛋白纤维，如Kligman，Am.J.of Dermatopathology，3(2)：199-201，1981(Kligman，《美国皮肤病理学杂志》，第3卷第2期，第199-201页，1981年)所述。弹性蛋白纤维质量的评级范围为1-5，其中5表示最佳纤维质量。
2.Ki67用作细胞增殖标记物，利用Ki67的兔单克隆抗体(购自Thermo Scientific(Pittsburgh，PA))实施免疫组织化学技术。根据制造商说明书进行免疫组织化学染色。Ki67的评级范围为1-5，其中5代表培养之前皮肤样品的正常Ki67水平。
3.使用QPCR评估弹性蛋白表达水平(mRNA水平)。根据制造商说明书，使用Trizol(Invitrogen(Carlsbad CA))从皮肤外植体提取总RNA。使用Superscript
Figure BPA00001515519700101
III逆转录酶(Invitrogen(Carlsbad，CA))将RNA转化为cDNA，然后使用7300实时PCR系统(AppliedBiosystems(Foster City，California))进行QPCR分析。弹性蛋白引物：正向：GGTATCCCATCAAGGCCCC反向：TTTCCCTGTGGTGTAGGGCA。20μl体积的QPCR反应体系包含10μl QPCR预混合液(Applied Biosystems(Foster City，CA))、1.5μl正向或反向引物(5μM)、5μl cDNA和2μl H2O。将未处理对照物归一化为100％。
表5提供了由代表性实验得出的数据。
表5
Figure BPA00001515519700102
表5中的数据表明，根据本发明培养的皮肤外植体的真皮区室具有代谢活性。组织对TGF-β的阳性响应也证实它们具有代谢活性，因为在最佳培养条件下响应于TGF-β而诱导了弹性蛋白。
实例4
激活的PPAR-γ是脂肪细胞增殖、分化、维持和存活的重要调节因子(Anghel，et al，J.of Biol.Chem.，282(41)，29946-57，2007(Anghel等人，《生物化学杂志》，第282卷第41期，第29946-29957页，2007年))。罗格列酮(一种PPAR-γ拮抗剂)诱导脂肪细胞分化(Patel et al.，Diabetes.52(1)：43-50，2003(Patel等人，《糖尿病》，第52卷第1期，第43-50页，2003年))。另一方面，共轭亚油酸抑制脂肪生成并诱导脂肪酸氧化(Evans et al.，J Nutr.；132(3)：450-5，2002(Evans等人，《营养杂志》，第132卷第3期，第450-455页，2002年)；Brown et al.，J Nutr.；131(9)：2316-21，2001(Brown等人，《营养杂志》，第131卷第9期，第2316-2321页，2001年))。
为了检测皮下脂肪层的代谢活性，根据实例1所述的方法，使用含5％血清的最佳培养基构建外植体培养物。过夜培养后，将皮肤外植体在培养基中保持未处理状态或者用20μM罗格列酮或50μM共轭亚油酸处理，以评估它们对皮下脂肪层的脂肪生成和脂肪分解的作用。将外植体在37℃下温育，使之处于5％CO2气氛中。
为了评估脂肪生成，将皮肤外植体培养于含有20μM罗格列酮和C-14标记的乙酸盐的培养基中24小时。然后收集皮下脂肪，根据文献(Pappaset al.，JID 118(1)164-171，2002(Pappas等人，《传染病杂志》，第118卷第1期，第164-171页，2002年))描述的方法通过HPTLC测定甘油三酯含量。
为了评估脂肪分解，将皮肤外植体培养于含有50μM共轭亚油酸的培养基中，并在指定时间点收集培养基。根据制造商说明书，使用游离甘油试剂和试剂盒(Sigma)测定释放到培养基中的甘油含量。
表6中示出了代表性研究的结果。
表6
Figure BPA00001515519700121
表6中的数据表明，根据本发明培养的皮肤外植体的脂肪层具有代谢活性。皮肤外植体对罗格列酮(甘油三酯增加)和共轭亚油酸(甘油释放增加)的阳性响应证实所培养皮肤外植体的脂肪层具有代谢活性。

Claims (16)

1.一种人皮肤外植体培养系统，所述培养系统包含置于培养基中的直径高达约25mm的人皮肤活检组织，所述培养基包含：
约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基；
约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物；
约0.5重量％至约5重量％的胎牛血清；
1至20μg/ml的胰岛素；1至20ng/ml的氢化可的松；1至20ng/ml的表皮生长因子；以及1×抗生素-抗真菌溶液。
2.根据权利要求1所述的培养系统，包含约50体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基，约50体积％的F-12营养混合物以及约2重量％的胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的培养系统，包含约10ng/ml的表皮生长因子。
4.根据权利要求1所述的培养系统，在约32℃至约37℃下温育。
5.根据权利要求1所述的培养系统，在约32℃下温育。
6.根据权利要求1所述的培养系统，在约32℃下温育24小时后再在约37℃下温育。
7.一种测定组合物在局部施用到皮肤时的作用的方法，包括：
将直径高达约25mm的皮肤活检组织培养于培养基中，所述培养基包含：
约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基；
约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物；
约0.5重量％至约5重量％的胎牛血清；
1至20μg/ml的胰岛素；1至20ng/ml的氢化可的松
Figure FPA00001515519600011
1至20ng/ml的表皮生长因子；以及1×抗生素-抗真菌溶液，
从而构建皮肤外植体培养系统；
将所述组合物局部施用到所述皮肤活检组织上；以及
分析所述皮肤活检组织对所述组合物的生物学响应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统包含约10ng/ml的表皮生长因子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32℃下温育。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32℃至约37℃下温育。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32℃下温育24小时后再在约37℃下温育。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为真皮分析，所述真皮分析包括通过选自以下的方法监测弹性蛋白纤维生成：LUNA染色；对弹性蛋白或弹性蛋白辅助蛋白的基因进行的QPCR或转录分析；对弹性蛋白或弹性蛋白辅助蛋白的基因进行的蛋白检测；组织学染色；以及免疫组织化学染色。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为真皮分析，所述真皮分析包括通过选自以下的方法监测胶原合成：不同胶原基因的转录；不同胶原蛋白的蛋白检测；组织学染色；以及免疫组织化学染色。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括用脂肪细胞分化试剂处理后对甘油三酯含量进行生化分析以监测脂肪生成。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括在使用促脂肪生成试剂后测定游离甘油的释放以证实脂肪分解。
16.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括通过选自以下的方法监测瘦素代谢：所述瘦素基因的转录；分泌瘦素的蛋白检测；以及免疫组织化学染色。
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