JP2013535979A - 細胞特性評価 - Google Patents

Abstract

本発明は、特定の細胞特性および／またはプロファイルをモニターし、評価し、比較し、確立し、および／または判定する手段として、非コードＲＮＡプロファイルを活用し得るという発見に関する。したがって、本発明は、細胞を特性評価しおよび／またはプロファイリングするための非コードＲＮＡ分子の使用を提供する。

Description

本発明は、細胞を特性評価および／またはプロファイリングする方法における、非コードＲＮＡの使用を提供する。特に、本明細書に記載される使用および方法を活用して、細胞および／または細胞培養の品質、同一性、純度、効力、および安全性を評価してもよい。

生物工学および医学における迅速な進歩は、新しい治療と医薬品、中でも生存細胞含有製品の開発をもたらした。これらの新しい細胞ベースの製品は、医学的必要性が満たされていない様々な疾患治療において、大きな可能性を持っている。細胞製品は、幹細胞の場合は治療目的で直接使用され、または１つまたは複数の系統に、または特定系統の最終分化細胞に分化することを決定付けられた細胞である、幹細胞の均質な供給源を提供することにより、創薬を助ける研究ツールである。研究で使用される哺乳類細胞系が、基本的生物概念を理解するための不可欠なツールである一方、バイオプロセス用途で使用される細胞は、途研究目的または臨床用途で使用される巨大分子をもたらし得る。

現行の特性評価および安全性試験方法
幹細胞および細胞培養の品質、整合性、および効力を評価するために使用される、いくつかの方法がある。幹細胞では、これはそれらの自己再生能力として、特異性マーカーの発現によって特徴付けられる。所望の細胞集団の同一性は、規定されなくてはならない。目下、ｈＥＳＣ系は、表面抗原、特定の酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼ）の発現、遺伝子発現、エピジェネティックなマーカー、ゲノム安定性評価、細胞学および形態学、ならびに生体外（胚様体形成）および生体内分化可能性（奇形腫様異種移植片の形成）の一連の標準測定基準を使用して、そして測定可能な微生物学的感染の不在によって、特徴付けられる。しかしこれらの幹細胞特性を評価するのに使用される手順は熟練した職員を要するが、情報内容は比較的少なく、時間がかかり高価である。さらにそれらは、結果として生じる細胞の安全性プロファイルおよび／または目的適合性に関する、極めて重要な情報を明らかにしない。幹細胞では未分化細胞増殖を支持する条件下における細胞集団拡大をはじめとする、誘導時および継代培養下における、幹細胞系の品質および整合性に関する情報を提供する、高い技術を要せず低コストで情報に富むＱＣアッセイおよびキットに対する必要性がある。これらのＱＣチェックはまた、それらの期待できる目的適合性に関係のある生物学的情報と、臨床用途のために開発された場合は、それらの展開安全性とを提供すべきである。

細胞ベースの出発原料の製造中の変動を最小化するために、ヒトベースの細胞製品に固有の不均一性を継続的に評価する必要がある。同様に、細胞が医薬品として使用される場合、培養中の細胞の表現型ドリフトを報告し、それらの安全性プロファイルの可能性（例えば、腫瘍原性）のアセスメントを提供する、比較的単純なアッセイに対する必要性がある。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約１８〜２５ヌクレオチドの長さを有する一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、１９９３年にＶｉｃｔｏｒ Ａｍｂｒｏｓによって最初に記載され、それ以来、ｍｉＲＮＡに関して２，０００本を超える論文が発表されている。ヒトには約１，０００個のｍｉＲＮＡがあると予測されているが、その数を数万とする推定もある。ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されないが、それ代わり１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。公知の生物学は、目下、マイクロＲＮＡが特定の個々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡ群を標的とし、それによってそれらの翻訳を妨げ、またはｍＲＮＡ分解を加速することを示す。成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質と複合体を形成し、その標的遺伝子からのタンパク質コードｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）内の部分的相補的配列に結合する。

さらにタンパク質は、リクルートされてサイレンシング複合体を形成し、標的遺伝子産物の発現は、ｍＲＮＡの翻訳をブロックする機序によって抑制される。

ｍｉＲＮＡの生物学およびサイレンシング複合体の組成および作用機序については、未だに多くが解明されていないが、多数の遺伝子の調節にｍｉＲＮＡが関与していることは明白である。ＭｉＲＮＡは、全遺伝子の３０％をも翻訳レベルで調節すると考えられている（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，２００５）。ｍｉＲＮＡは複数の遺伝子を調節し得て、各遺伝子は複数のｍｉＲＮＡによって調節され得て、組織および細胞内のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡネットワーク間の複雑な相互関係を可能にする。

ｍｉＲＮＡの組織特異的発現は、分化する、および／または細胞または組織同一性を能動的に維持する、細胞の拘束を導くと考えられる。この広範な影響と、異なるｍｉＲＮＡ間の相互作用は、単一ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの小集団の無秩序な発現が、著しい生理学的または病態生理学的変化、および複雑な疾病特性をもたらすこともあることを示唆する（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ，２００５）。既知のヒトｍｉＲＮＡの５０％以上は、がん細胞中で変化しやすいゲノム領域内にある（Ｃａｌｉｎ ｅｔ ａｌ，２００４）。当然のことながら、ｍｉＲＮＡの発現パターンは、がんおよびその他の病態において変化する。この情報は、がんを分類して段階分けし、予後と応答の生物マーカーを明らかにし、治療的介入を導く主要決定因子を提供するのに使用されはじめている。

増大する一連の証拠は、異なる生理学的条件下に維持された、細胞型間または細胞型内で、個々のｍｉＲＮＡの発現レベルが顕著に変動し、したがって細胞型、細胞の生理学的状態を特徴付け、環境変化に対する応答をモニターするのに使用し得ることを立証する。

胚性および人工多能性幹細胞は、自己再生し、全ての細胞型に分化する能力を特徴とする。この過程の背後の分子機構は複雑であり、転写因子と、ｍｉＲＮＡをはじめとするエピジェネティックな調節因子と、シグナル伝達経路とのネットワーク間の相互作用に依存する。マイクロＲＮＡは、多分化能、増殖、および分化の維持に欠くことのできない役割を果たす。最近の研究は、胚性および人工多能性幹細胞の双方の自己再生および多分化能を制御する調節回路における、ｍｉＲＮＡの特定の役割を明確化しはじめている。これらの進歩は、体細胞を多能性細胞に再プログラミングする過程における、ｍｉＲＮＡの重要な役割を指摘する。

我々は、細胞のｍｉＲＮＡ発現プロファイル内に保持される情報内容から抽出される「フィンガープリント」パターンを使用して、細胞同一性および機能の維持をモニターした。ｍｉＲＮＡプロファイルは、細胞生物学に関するユニークな洞察を提供し、マイクロＲＮＡスクリーニングのための単一開発プラットフォームを使用した、複数継代にわたり、多分化能、細胞運命、細胞同一性、および表現型ドリフトをモニターするキットの開発を通じて、具体化し得る。

本発明は、細胞が開発された目的に対する、細胞の品質および適合性をモニタリングする、代案の方法を提供することを目標としている。

本発明は、細胞を特性評価し、および／または生体外細胞培養系の品質および安全性プロファイルをモニターする手段として、非コードＲＮＡ発現アッセイを用いる方法に関する。

本発明の実施形態としては、生体外細胞培養系の細胞および連続継代の非コードＲＮＡ／マイクロＲＮＡプロファイルを判定することが挙げられるが、これに限定されるものではない。「細胞」という用語は、あらゆる真核細胞を包含するものと理解される。例えば本発明の文脈における「細胞」は、例えば幹細胞またはｉＰＳ細胞をはじめとする、哺乳類（成人、胎児または胚性）細胞であってもよい。一実施形態では、本発明に従った「細胞系」は、（ｉ）多能性胚性幹（ＥＳ）細胞；（ｉｉ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）またはＥＳまたはｉＰＳ細胞および／または１つまたは複数の最終分化状態に分化中のそれらの中間段階；（ｉｉｉ）成人幹細胞（組織特異的始原細胞または間葉／間質細胞）または培養液中において、外的因子影響下で１つまたは複数の最終分化状態に分化中のそれらの中間体；様々な分化プロファイルがある細胞混合物；（ｉｖ）研究で使用される、または例えば臨床等級または研究等級の生物学的巨大分子を生産するバイオプロセシングのために遺伝子操作される、細胞系である（またはそれを含んでなる）。一実施形態では、「細胞」は、例えば酵母細胞などの真菌細胞であってもよい。細胞および細胞培養系は、最適増殖条件下において、および／または細胞の非コード／マイクロＲＮＡプロファイルに対する影響が判定されるように、細胞の増殖維持管理体制の重要要素の変更などの介入が変更される条件下において、モニターされてもよい。

本発明は、それらのマイクロＲＮＡ発現プロファイルに基づいてサンプルクラスタリングを明らかにして、統計学的に有効な非コード／マイクロＲＮＡの候補を同定し、それは、モニターされる細胞系の望ましくないまたは性質不明の変化の一貫性がある信頼できるマーカーであり、したがって意図される研究、治療またはバイオプロセシング用途に対する、細胞系の継続的有用性の重要な判定支援ツールを提供する。

本発明は、特定の細胞特性および／またはプロファイルをモニターし、評価し、比較し、確立し、および／または判定する手段として、非コードＲＮＡプロファイルを活用し得るという発見に関する。一実施形態では、本明細書に記載される様々な使用および／または方法を活用して、細胞の品質および／または安全性のマーカーでもある細胞特性を決定し、モニターし、確立し、比較し、および／または評価してもよい。

したがって第１の態様では、本発明は、細胞を特性評価しおよび／またはプロファイリングするための非コードＲＮＡ分子の使用を提供する。

発明者らは、非コードＲＮＡ分子発現のプロファイル（以下、非コードＲＮＡ発現プロファイルと称される）が、特定の細胞特性および／または特定の細胞プロファイルの存在と相関し、連結しまたはそれと一致し得る、「フィンガープリント」を提供すると断定した。１つまたは複数の細胞特性または特定の細胞プロファイルを示す非コードＲＮＡ発現プロファイルを確立することで、非コードＲＮＡ発現プロファイルの単純な比較によって、対応する特性および／またはプロファイルについてその他の細胞を評価することが可能になる。さらに発明者らは、驚くことに、標準分析技術によって（例えば、フローサイトメトリーおよび／または細胞表面／細胞質／核マーカー分析などによって）表現型的に同一と示される細胞が、本明細書に記載されるマイクロＲＮＡプロファイリング技術によって、遺伝子型的に（したがって九分通り表現型的に）個別／異なると示され得ることを発見した。細胞の安全性および品質が関与する場合、安全でない（例えば、腫瘍形成性）細胞または細胞群および／または低品質の細胞（恐らく特異的マーカーの発現を欠く）間の表現型の差は、標準的な技術によっては検出不能なこともある。本発明は、細胞または細胞系（例えば、細胞培養中の細胞集団）が、一連の所定基準に適合するか否かを確立する、高感度かつ正確な手段を提供する。当業者は、一連の所定の安全性および／または品質基準に適合することが知られている細胞のマイクロＲＮＡプロファイルが確立されているという条件で、マイクロＲＮＡの比較によって、同一タイプのその他の細胞を所定の安全性および／または品質基準への適合について評価し得ることを理解するであろう。

上記を鑑みて、本発明の一実施形態は、細胞を特性評価しおよび／またはプロファイリングするための非コードＲＮＡ分子の使用を提供し、細胞は、マイクロＲＮＡプロファイリング以外の方法では、参照細胞と表現型的に同一と示される。一実施形態では、細胞が参照細胞が同一であるとされる方法は、フローサイトメトリーであってもよい。この文脈で、参照細胞は、所定の安全性および／または品質基準セットに適合する細胞であってもよい。

一実施形態では、本発明によって提供される方法は、１つの分化細胞状態を他の状態から区別する、マイクロＲＮＡプロファイリングを活用する方法を除外してもよい。例えばいくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞のその他細胞型への分化を評価する、マイクロＲＮＡプロファイリングの使用を包含できない。

本発明の第２の態様は、前記細胞の非コードＲＮＡプロファイルを参照非コードＲＮＡ発現プロファイルと比較するステップを含んでなる、細胞を特性評価しおよび／またはプロファイリングする方法を提供する。一実施形態では、参照非コードＲＮＡ発現プロファイルは、存在すべき、および／または特性評価され／プロファイリングされる細胞によって呈示されるべき、特性および／またはプロファイルを保有する細胞に由来してもよい。

細胞「特性」または「プロファイル」は、同一性（タイプ）、形態学、遺伝子型、表現型、生存度、効力（例えば、多分化能の程度）、汚染物質レベル、安全性（例えば、腫瘍形成能）および／または品質などの細胞の特徴と関連していてもよいものと理解すべきである。特定の実施形態では、細胞「プロファイル」は、細胞の１つまたは複数の形態学、遺伝子型、表現型、生存度、効力（多分化能）、汚染物質レベル、安全性（腫瘍形成能）および／または品質の側面を確立することで判定されてもよい。当業者は、細胞「特性」および／または「プロファイル」という用語が、生物学的活性および／または化合物分泌／産生プロファイルと関連していてもよいことを理解するであろう。一例として、細胞特性および／またはプロファイルは、細胞が、天然または異種化合物、または例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、炭水化物、および／またはその他の小型有機化合物などの化合物を発現し、産生し、および／または分泌する能力と関連していてもよい。

「非コードＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子およびｍｉＲＮＡ前駆体と成熟ｍｉＲＮＡのいずれかまたはその双方を含んでもよい。用語は、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をさらに含んでもよい。本発明に従った「非コードＲＮＡ」は、非コードＲＮＡ発現のレポーターとして機能してもよい、遺伝子導入非コードＲＮＡをさらに含んでなってもよい。非コードＲＮＡはエピソーム性であってもよく、本明細書に記載される方法および／または使用は、その中でエピソームＤＮＡが本明細書に記載される細胞に導入され、その結果、エピソームＤＮＡが転写されて、プロファイリングされる非コードＲＮＡの全部または一部を構成する非コードＲＮＡが生成され得る、最初のステップを必要とすることもある。一実施形態では、「非コードＲＮＡ」という用語は、「ｔｅｌｏＲＮＡ」または「ｔｅｌｏＲＮＡマーク」として知られている非コードＲＮＡを含まない。

非コードＲＮＡ発現プロファイルは、少なくとも１つの非コードＲＮＡの発現および／または同一性と関連していてもよい。一実施形態では、非コードＲＮＡ発現プロファイルは、複数の非コードＲＮＡの発現に関連している。したがって非コードＲＮＡ発現プロファイルは、任意選択的に細胞内の１つまたは複数の非コードＲＮＡ発現レベルの定量的および／または定性的測定と共に、細胞によって発現される１つまたは複数の非コードＲＮＡの同一性の何らかの指標を含んでなってもよい。

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、非コードＲＮＡ発現プロファイルデータベースの使用を要することもある。このようなデータベースは、非コードＲＮＡ参照ライブラリーと称されることもある。本明細書に記載される非コードＲＮＡデータベースは、既知の特性／プロファイルを有する細胞に、および／または特定のプロトコルに準じて培養され、および／または既知のまたは規定の介入を受けた細胞に、それぞれ由来する、１つまたは複数の参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなってもよい。

一実施形態では、参照非コードＲＮＡプロファイルは、単離細胞、細胞培養に由来する細胞群、細胞系、および／または保存細胞調製品に由来してもよい。それに加えて、または代案として、参照非コードＲＮＡプロファイルは、１つまたは複数の規定のまたは所定の介入を受けた細胞、および／または特定の培養プロトコル、培養条件変更および／または１つまたは複数の介入を受けた細胞から得られてもよい。本明細書に記載される参照非コードＲＮＡプロファイルは、単一細胞型および／または複数の異なる細胞型に由来する、非コードＲＮＡプロファイルを含んでなってもよい。別の実施形態では、参照非コードＲＮＡプロファイルは、初代細胞培養および／または不死化細胞に由来してもよい。有利には、参照非コードＲＮＡプロファイルは、既知のおよび／または所望の特性、所望のおよび／または正しいプロファイルを呈示する細胞または細胞から、および／または特定の所定の品質および／または基準を持たす細胞または細胞群から得られる。

参照非コードＲＮＡ発現プロファイルは、既知の（望ましい）特性および／またはプロファイルを呈示する細胞に由来するので、当業者は、同等の非コードＲＮＡプロファイルを呈示するあらゆる細胞が、同様の特性または同様のプロファイルを保有するに違いないことを理解するであろう。

参照非コードＲＮＡ発現プロファイルは、既知の特性および／または既知のプロファイルを有する細胞の反復非コードＲＮＡ発現解析から、および／または既知のまたは認可された基準に適合する細胞の非コードＲＮＡ発現解析から得られる、複数のデータセットを使用して編纂されてもよい。

便宜上、本明細書に記載される参照マイクロＲＮＡプロファイルは、「比較マイクロＲＮＡプロファイル」と称されることもある。

特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質評価される細胞から得られる非コードＲＮＡ発現プロファイルを、本明細書に記載される（任意選択的にデータベース内に含まれる）参照非コードＲＮＡプロファイルと比較する過程は、非コードＲＮＡプロファイル間の相関の同定を伴ってもよい。特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質評価される細胞の非コードＲＮＡプロファイル間の相関は、典型的に、１つまたは複数の非コードＲＮＡの発現変化間の正または負の相関である。例えば正相関は、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞中の特定非コードＲＮＡプロファイルの同定と、参照非コードＲＮＡプロファイル（またはデータベース）中の同一非コードＲＮＡプロファイルの同定とを含んでなってもよい。負相関は、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞中における特定非コードＲＮＡプロファイルの同定と、対応する非コードＲＮＡの発現を呈示しながら、変動または差次的発現レベルを呈示する、参照非コードＲＮＡプロファイル中における同定とを含んでなってもよい（すなわち参照プロファイル中の特定の非コードＲＮＡの発現が、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞中で同定される同一非コードＲＮＡの発現を下回ることもある）。

本明細書に記載される参照非コードプロファイルおよび／またはデータベースは、参照非コードＲＮＡプロファイル中に存在する類似性に基づいて分類（クラスター化またはグループ分け）された、非コードＲＮＡ発現プロファイルを含んでなってもよい。例えば特定の細胞型に、および／または特定の方法で培養された細胞に関連したデータは、特性評価され、プロファイリングされ、品質管理される細胞の非コードＲＮＡプロファイルとの相関についてデータベースを探索するのを容易にするように、一つのグループにまとめられてもよい。

上記を鑑みて、本発明によって提供される参照非コードプロファイル内に含まれる非コードＲＮＡプロファイルは、１つまたは複数のタイプの細胞、様々な培養段階の細胞、特定のプロトコルによって培養された細胞、および／または恐らくは培養中に起きた介入である１つまたは複数の介入を受けた細胞のプロファイルに相当してもよい。

「介入」という用語は、化合物または化合物群を細胞に投与する行為を含むと解釈されてもよい。別の実施形態では、介入は、培養液の変更、１つまたは複数の培地補給剤の添加、ならびに例えば時間、温度、ｐＨおよび／または浸透圧などの培養条件の変更を含んでもよい。介入はまた、恐らく細胞植え継ぎ手順の結果としての、１つの培養容器から別の培養容器への細胞の移動を含んでもよい。

本発明は、１つまたは複数の細胞介入またはプロトコルが、細胞培養の細胞に有害効果を及ぼさなかったことの確証が必要なこともある、細胞培養分野において特定の用途がある。例えば、１つまたは複数のプロトコルに従った成功裏の培養の前、最中および／または後に、好ましいまたは所望の特性を呈示する細胞の参照非コードプロファイルを編纂することで、非コードＲＮＡプロファイルの単純な比較によって、同一プロトコルに従って培養したその他の細胞が、培養の前、最中および／または後に、同一特性を呈示するかどうかを確立し得てもよい。

参照非コードＲＮＡプロファイルが、培養されている細胞の特性および／または特徴を表すことが意図される場合、非コードＲＮＡプロファイルは、連続継代される（分割および／または継代培養される）細胞培養から、各継代時またはその最中のいずれかで、および／または培養中の様々なその他の時点で得られてもよい。それに加えて、または代案としては、培養条件が変更され、または培養の細胞が介入（恐らくは栄養補給剤（抗生物質、栄養素などの添加）を受ける際に、参照非コードＲＮＡ発現プロファイルを得てもよい。

このようにして、培養物中の細胞の非コードＲＮＡプロファイルを反映する、１つまたは複数の参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなるデータベースを構築することが可能である。当業者は、細胞培養からの細胞の非コードＲＮＡプロファイルと、データベースの参照非コードＲＮＡプロファイルとを比較することで、このようなデータベースを使用して、細胞培養をモニターおよび／または評価してもよいことを理解するであろう。

一実施形態では、本発明によって提供される方法を使用して、細胞および細胞培養に対する、特定培養基質（またはその成分）の効果を評価してもよい。例えば本発明の方法は、幹細胞の多分化能または特定の分化状態を維持するのに使用し得る、ナノファイバー／ナノスケール増殖表面の性能を評価し、またはモニタリングする手段として利用してもよい。このような場合には、細胞が多能性または正しい分化を維持するかどうかを判定するために、多能性細胞または正しく分化した細胞を示すマイクロＲＮＡプロファイルを得て、ナノファイバー／ナノスケール増殖表面で培養された細胞のマイクロＲＮＡプロファイルと比較する。

その他の実施形態では、本発明によって提供されるマイクロＲＮＡプロファイリング法を利用して、凍結乾燥技術の有効性、またはこのよう処理を受けた細胞の生存度を評価してもよい。この場合もやはり、比較マイクロＲＮＡプロファイルが、凍結乾燥処理前後の細胞から、および／または凍結乾燥処後に生存可能な細胞から得られる。このような技術は、赤血球凍結乾燥プロトコルに応用し得る。

なおもさらなる実施形態では、本発明によって提供されるマイクロＲＮＡプロファイリングを使用して、別の細胞型から１つの細胞型への分化を強制するプロトコルの有効性を評価してもよい。このようなプロトコルは、多能性中間体のない分化を引き起こすものを含んでもよい。一例として、本発明のマイクロＲＮＡプロファイリング法を使用して、線維芽細胞／赤血球分化プロトコルの成功を評価してもよく、比較マイクロＲＮＡプロファイルは、正しく分化した赤血球細胞から得られる。

非コードＲＮＡ発現プロファイルは、非コードＲＮＡの特定群またはサブセット内の各非コードＲＮＡについて、測定または判定してもよい。それに加えて、または代案としては、非コードＲＮＡ発現プロファイルは、個々の非コードＲＮＡの同定、およびその発現の測定および／または判定を含んでなってもよい。

発現レベルは、例えば細胞ゲノムに組み込まれる遺伝子導入レポーターコンストラクトなどのレポーターコンストラクトの量または活性化レベルを測定することで、間接的に測定してもよい。

本発明の方法および使用は、細胞の品質管理および／または安全性解析手順において、特定の用途があることもある。本分野の当業者は、主に、保存細胞および／または顧客に流通する細胞が、特定の所定基準を満たすことを確実にするために、細胞、特に保存細胞系に由来する細胞の商業生産、販売、および流通が、厳密な品質および安全管理の対象であることを理解するであろう。例えば保存細胞系から培養された細胞が、（同一性および形態学の双方の観点から）記載のとおりであり、生存可能であって、特定の特性（特徴および／または形質）を示すことを確実にすることが必要なこともある。

現在の細胞品質管理法または手順は、そのそれぞれが、所定の規格を細胞が満たすことを確認するようにデザインされた、一連の複雑で時間がかかる高価な試験を伴うこともある。このような試験は、細胞系を顧客に発送する前に実施されることもあり、また貯蔵または培養中にも定期的に実施されることもある。一例として細胞品質管理手順は、細胞同一性／形態学、細胞表現型、細胞遺伝子型、細胞汚染レベル、多分化能の程度、細胞生存度、および／または細胞安全性を評価するようにデザインされた試験を含んでなってもよい。このような試験は、ＤＮＡプロファイリング技術、免疫組織化学、アルカリホスファターゼ染色、フローサイトメトリー、遺伝子発現解析（恐らく発現アレイなどを使用した）、血液型判定、核学、微生物スクリーニング（ＰＣＲおよび免疫学ベースの技術を使用した）、奇形腫および胚様体形成（幹細胞の多分化能が試験される場合に特に妥当である）、および生存度を判定する単純な生／死（トリパンブルー）染色の使用を伴ってもよい。

特定の細胞「基準」または「品質基準」を示す参照または比較非コードＲＮＡプロファイルを確立することで、非コードＲＮＡプロファイルの比較によって、細胞を品質管理することが可能である。一例として、保存細胞系から培養された細胞の非コードＲＮＡプロファイルを、１つまたは複数の所定基準を満たすことが知られている同一タイプの細胞の非コードＲＮＡプロファイル（すなわち参照非コードＲＮＡプロファイル）と比較してもよい。培養された細胞の非コードＲＮＡプロファイルが、１つまたは複数の所定基準を満たすことが知られている細胞に由来する（参照）非コードＲＮＡプロファイルと同等でありまたはそれに一致する場合、培養された細胞は同一基準を満たすと結論し得る。

「基準」または「品質基準」という用語は、使用（ありとあらゆる様式での）、販売または流通に先だって、所与の細胞が呈示すべき規定の基準または特徴に関連していてもよいものと理解すべきである。このような基準は、規制機関によって定められてもよいが、また例えばアッセイ用途などの特定用途に対して、細胞を適するものにする、地域的に判定される細胞特徴および／または特性に関わってもよい。

上記を鑑みて、本発明は、細胞品質管理における非コードＲＮＡプロファイルの使用を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、品質管理される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを、参照非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップを含んでなる、細胞を品質管理する方法を提供する。一実施形態では、参照非コードＲＮＡプロファイルは、特定の品質基準を満たすことが知られている細胞または細胞群に由来してもよい。参照非コードＲＮＡプロファイルは、１つまたは複数の所定基準を満たす細胞に由来するので、参照非コードＲＮＡプロファイルに対応する非コードＲＮＡプロファイルを呈示するあらゆる細胞は、同様の品質基準を有するはずである。一実施形態では、品質管理される細胞の非ＲＮＡプロファイルを、１つまたは複数の参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなるデータベースと比較してもよい。

一実施形態では、品質管理手順は、保存および／または培養細胞の同一性、表現型、遺伝子型、汚染レベル、生存度、および／または多分化能を確立するステップを含んでなる。

有利には、本明細書に記載される参照非コードＲＮＡプロファイルは、同一性が既知であり、規定の表現型および／または遺伝子型、既知の汚染レベル（低／無汚染、中程度または高レベル汚染）、規定の多分化能（例えば、完全、部分的または無多分化能）、および規定の生存度レベルを有する細胞に由来してもよい。

例えば細胞の多分化能を評価する方法は、多分化能が未知である細胞の非コードＲＮＡプロファイルを、既知の多分化能レベルを有する同一タイプの細胞の非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップを含んでなってもよい。

同様に、細胞同一性は、細胞（恐らく同一性が未知の細胞）の非コードＲＮＡプロファイルを、同一性が既知である細胞の非コードＲＮＡプロファイルと比較することで確認されてもよい。未知の細胞の非コードＲＮＡプロファイルが、いずれかの既知の細胞の非コードＲＮＡプロファイルに対応しまたはそれと一致する場合、未知の細胞は、対応するまたは一致する非コードＲＮＡプロファイルが由来する細胞と、同一であると結論付けてもよい。

一実施形態では、本明細書に記載される方法を利用して、細胞または細胞群中のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染のレベルを確立する。当業者は、比較または参照マイクロＲＮＡプロファイルが、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染が存在しないことが知られている、対応する細胞型または細胞集団から得られてもよいことを理解するであろう。

当業者は、本発明、特に細胞品質管理に関する実施形態が、細胞培養分野、特に多数の細胞が保存され培養される商業的細胞培養において、特定用途があることを理解するであろう。

細胞を培養する場合、定期検査を行って、培養物が特定の所定基準を満たす細胞を含んでなることを確実にすることが、重要であることが多い。例えば、培養細胞が正しい細胞型であることを確立するのに加えて、細胞が特定のマーカーを発現し、または細胞が特定の化合物または化合物群を発現し、または細胞培養中に起きる介入が細胞に有害効果を及ぼさないことを確実にすることが必要なこともある。細胞培養が幹細胞を含んでなる場合、培養の細胞が、継代全体を通じて多能性を維持する細胞を含んでなり、および／または細胞が特定の分化経路に従うことを確実にすることが必要なこともある。培養細胞の非コードＲＮＡプロファイルを、既知のまたは所定の培養基準に適合する培養細胞の非コードＲＮＡプロファイルと比較することで、培養細胞がこれらの同一基準を満たすことを確実にすることが可能である。

一実施形態では、１つまたは複数の参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなるデータベースは、連続的に継代されて、様々な培養段階にある細胞から得られる、非コードＲＮＡプロファイルを含んでなってもよい。例えばデータベースは、初期、中期および／または後期継代または培養の、またはその間のあらゆるその他の時点の、１つまたは複数の異なるタイプの細胞の非コードＲＮＡプロファイルを含んでなってもよい。それに加えて、または代案としては、データベースは、培養条件のある種の変更（例えば、時間、温度、ｐＨ、栄養素および／または代謝産物可用性の変更）に曝露した細胞の非コードＲＮＡプロファイルを含んでもよい。その他の実施形態では、データベースは、例えばビタミン、栄養素、核酸、抗生物質、候補薬剤化合物、検査薬、抗体、炭水化物、タンパク質、ペプチドおよび／またはアミノ酸をはじめとする増殖培地補給剤などの様々な作用物質と接触した、１つまたは複数の細胞から得られる非コードＲＮＡプロファイルを含んでもよい。データベースは、多様な異なる細胞型から得られる、多数のこのような非コードプロファイルを含んでもよいものと理解すべきである。

当業者は、例えば統計学的数学的方法などのデータ処理／解析技術の助けを借りて、参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなるデータを、試験される細胞からのデータと比較してもよいことを理解するであろう。例えば、主成分分析またはパターン認識アルゴリズムなどの技術を使用して、データベース内に含まれるデータと、試験される細胞から得られる非コードＲＮＡ発現プロファイルの間の相関を同定してもよい。

その他の態様では、本発明は、細胞を特性評価し、プロファイリングし、および／または品質管理するためのキットを提供してもよく、前記キットは、１つまたは複数の参照非コードＲＮＡプロファイルのデータベースと、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞から非コードＲＮＡプロファイルを得るのに必要なアッセイシステム、装置および／または試薬を含んでなる。使用者は、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを単に得て、非コードＲＮＡプロファイルをデータベースの非コードＲＮＡプロファイルと単に比較してもよい。

さらなる態様では、本発明は、サービス提供者が、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞を第三者から受領する、細胞の特性評価、プロファイリング、および／または品質管理サービスに関連してもよい。サービス提供者は、第三者によって提供される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを比較するのに使用し得る、本明細書に記載されるタイプの１つまたは複数の非コードＲＮＡデータベースを有してもよい。ひとたび第三者によって提供される細胞の非コードＲＮＡプロファイルが、データベースの非コードＲＮＡプロファイルと比較されると、細胞の特性、プロファイル、および／または品質に関する情報を詳述する報告が第三者に提供される。

このようなサービスは、細胞の保存および／または培養に関わる第三者に特に有用なこともある。サービスは、保存または培養中の細胞の定期検査を行って、細胞同一性／細胞型、細胞表現型／遺伝子型、生存度、多分化能、汚染レベルなどを判定する必要がある者にとって、特に役立つこともある。さらに本明細書に記載されるサービスを使用して、特定の介入または培養プロトコルに曝露した細胞が、プロトコルおよび／または介入の実行前、最中、および後に、必要な特性を保有することを確実にしてもよい。

第三者は、細胞を培養するのに使用される培養プロトコルに関する情報、および／または特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞が有すべき、特定の特徴、形質および／または特性に関する情報をさらに提供してもよい。

詳細な説明
本発明をここで以下の図を参照して、詳細に説明する。

本発明に従った方法の流れ図である。 マイクロアレイおよびＱＰＣＲデータパネルの双方による、ｈＥＳＣｓの長期生体外継代における、ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ−２１０の発現低下、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ＊の発現増大である。図２ａは、左パネル：主成分分析は、ヒト胚性幹細胞系ＲＣＭ１における細胞継代数に基づいて、サンプルの隔たりを明らかにする。右パネル：継代間で発現が顕著に変化しない、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０とその他の３つのマイクロＲＮＡに関する、マイクロＲＮＡマイクロアレイ発現データ（アレイからのシグナル強度について正規化される）の発現プロファイル解析である。 マイクロアレイおよびＱＰＣＲデータパネルの双方による、ｈＥＳＣｓの長期生体外継代における、ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ−２１０の発現低下、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ＊の発現増大である。図２ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲデータによる、重要なマイクロＲＮＡ発現の差異の確認である。 長期生体外継代による、ヒトがん由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）の表現型「ドリフト」である。図３ａは、連続継代ヒト腫瘍由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）におけるマイクロＲＮＡプロファイルの変化であり、マイクロＲＮＡデータセットの主成分分析は、ＭＣＦ−７細胞中の細胞継代数に基づいて、サンプルの隔たりを明らかにする。 長期生体外継代による、ヒトがん由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）の表現型「ドリフト」である。図３ｂおよび下のプロファイル解析（図３ｃ）は、ＭＣＦ−７細胞の連続継代培養中に、２０個のｍｉＲＮＡが変化したことを示す。２０個のｍｉＲＮＡは全て、モニターされた７代の継代にわたって遺伝子発現の有意な低下を示す。変化は、最初期の継代（Ｐ３）細胞と比較した、相対変化（変化倍数）として示される。 長期生体外継代による、ヒトがん由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）の表現型「ドリフト」である。図３ｂおよび下のプロファイル解析（図３ｃ）は、ＭＣＦ−７細胞の連続継代培養中に、２０個のｍｉＲＮＡが変化したことを示す。２０個のｍｉＲＮＡは全て、モニターされた７代の継代にわたって遺伝子発現の有意な低下を示す。変化は、最初期の継代（Ｐ３）細胞と比較した、相対変化（変化倍数）として示される。 長期生体外継代による、ヒトがん由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）の表現型「ドリフト」である。図３ｄおよび下のプロファイル解析（図３ｅ）は、ＨｅＬａ細胞の連続継代培養中に、２０個のｍｉＲＮＡが変化することを示す。２０個のｍｉＲＮＡは全て、モニターされた７代の継代にわたってｍｉＲＮＡ発現の有意な変化を示す。変化は、最初期の継代（Ｐ３）細胞と比較した、相対変化（変化倍数）として示される。 長期生体外継代による、ヒトがん由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）の表現型「ドリフト」である。図３ｄおよび下のプロファイル解析（図３ｅ）は、ＨｅＬａ細胞の連続継代培養中に、２０個のｍｉＲＮＡが変化することを示す。２０個のｍｉＲＮＡは全て、モニターされた７代の継代にわたってｍｉＲＮＡ発現の有意な変化を示す。変化は、最初期の継代（Ｐ３）細胞と比較した、相対変化（変化倍数）として示される。 同一培養条件下で長期継代が維持された、２つのｈＥＳＣ集団のフローサイトメトリーの結果である。 中度および高度継代ｈＥＳＣ集団のｍｉＲＮＡプロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）である。 中度継代（Ｐ５１）および高度継代（Ｐ１０３）細胞間のマイクロＲＮＡの差次的発現を表す。２以上の変化倍数の差がある差次的発現する５つのｍｉＲＮＡは、赤丸で囲まれる。 Ｐ５１およびＰ１０３ ｈＥＳＣ培養物間の２倍を超える差次的発現を実証する、５つのマイクロＲＮＡ（図４で赤丸で囲まれる）の同定である。 視覚化は、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルの差に基づいて、異なるサンプル群のクラスター形成を明らかにする。図５Ａは、矢印が分化の軌跡を示す、主成分分析（ＰＣＡ）を使用した視覚化である。 視覚化は、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルの差に基づいて、異なるサンプル群のクラスター形成を明らかにする。Ａ．矢印が分化の軌跡を示す、主成分分析（ＰＣＡ）を使用した視覚化である。図５Ｂは、階層的クラスター形成および色分け地図を使用した、サンプル関係性の視覚化である。

実施例１
本発明の実例応用では、ｍｉＲＮＡ発現データセットのデータベース（測定される非コードＲＮＡ発現プロファイルに由来する発現データセットの一例）を作成する。図１に関して述べると、既知の方法によって適切なヒト胚性幹細胞を長期間培養し、それらの誘導後の３時点、すなわち継代の３８、５１、および１０３代目に試料採取する。次に各継代時の細胞サンプルを使用してｍｉＲＮＡ発現プロファイルを測定し、処理細胞中のいくつかのｍｉＲＮＡのそれぞれの発現レベルを判定する。

ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを測定する２つの代案の方法である、マイクロアレイ分析および定性的リアルタイムＰＣＲ分析を下に記載する。

（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析
Ｖｅｄｂａｅｋ，ＤｅｎｍａｒｋのＥｘｉｑｏｎＡ／Ｓからのカラムベースのキットを使用して、参照細胞（ｎ＝３）から全ＲＮＡを単離する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイによって、各サンプルからの２μｇの全ＲＮＡを分析した。標識、ハイブリダイゼーション、スキャニング、正規化、およびデータ分析を含むｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析は、例えばＥｘｉｑｏｎＡ／Ｓなどのいくつかの供給元から市販される。簡単に述べると、ＲＮＡ品質管理は、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００マイクロ流体プラットフォームを使用して実施される（ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの登録商標である）。提供される使用説明に従って、ＡｇｉｌｅｎｔからのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｈｙｂキットを使用して、サンプルを標識する。

（２）定量的リアルタイムＰＣＲ
上のオプション（１）と同様に、製造会社の使用説明書に従って、Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースのキットを使用して、全細胞ＲＮＡを抽出する。製造会社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって説明されるようにして、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡの定量化を実施する（ＴａｑＭａｎはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の登録商標である）。簡単に述べると、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キットおよびｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した逆転写（ＲＴ）のために、１０ｎｇのＲＮＡをテンプレートとして使用する。ＲＴ産物のアリコート（１．５μＬ）を２０μＬのＰＣＲ反応に導入し、９５℃のＡＢＩ ７９００ＨＴサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の９６ウェルプレート内で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルでインキュベートする。Ｕ４８ ＲＮＡ（小型非コードＲＮＡ）（またはＵ４８がサンプル間で変動することが分かればＵ６ ＲＮＡ）の発現値に基づいて、異なるサンプル間で標的遺伝子発現を正規化する。

実験的知見およびそれらの意味
我々は、記載される方法を使用して、ｍｉＲＮＡ発現データの分類に基づいて、細胞の表現型ドリフトの同定をモニターする新規方法を決定することが可能であることを確立した。さらに方法を用いて特定のｍｉＲＮＡを同定し得て、それは、多分化能および腫瘍形成能をはじめとする細胞機能の可能な変化を示す、発現レベルを有する。これらのｍｉＲＮＡは、調査される特定の終点に応じて使用される、ｍｉＲＮＡの全レパートリーでない特定のサブセットによって、比較的少数のｍｉＲＮＡ群の発現レベル変化を解析して、細胞生理機能／病態生理中の重要な変化を同定する、将来の介入スクリーニングを可能にする。

選択された少数のｍｉＲＮＡ群を使用して、ヒト胚性幹細胞集団の可能性のある安全性を判定する一例を下述する。

材料と方法
ＲＣＭ１細胞培養
誘導
細胞系ＲＣＭ−１は、新鮮に受領された６日齢の胚盤胞に由来した。Ｓｗｅｍｅｄ幹細胞切断ツール（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ、カタログ番号１４６０１）を使用して、それを手動で開けて内部細胞集団を単離し、ヒト線維芽細胞（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）上に播種した。線維芽細胞は、ヒトラミニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ４５４４）層でプレコートされた組織培養ウェル上に予備播種されていた。２４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｈｂＦＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＨＧ０２６１）を含有する馴化培地中で、細胞を培養した。結果として生じた増殖物をＳｗｅｍｅｄ幹細胞切断ツールを使用して手動で継代し、初期拡大を通じて、ｈｂＦＧＦ添加ラミニン／支持細胞培養系上にある間は、典型的な未分化形態が呈示され続けた。
細胞系の特性は、オンラインで入手できる要約文書に示される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓｌｉｎｃｅｌｌｓ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｐｉｘ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＲＣＭ−ｌ．ｐｄｆ
拡大
次に、８ｎｇｍｌのｈｂＦＧＦを含有するＳｔｅｍＰＲＯ（ＳＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０００７０１）培地を用いた、ＣｅｌｌＳＴＡＲＴマトリックス（ＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０１４２−０１）の無支持細胞培養系にＲＣＭ−１を適応させ、これらの条件下では未分化形態が維持された。酵素的方法に優先して機械的／手動方法を使用し、いくつかの継代を通じて細胞系を拡大した。ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０７９３０）を使用して、記載されるように、そして製造会社の使用説明書に従って、細胞系の拡大中の様々な継代段階で細胞を冷凍保存した。

冷凍保存からの回復
初期、中期、および後期の３つの継代時、すなわち継代Ｐ３８、Ｐ５１、およびＰ１０３に、試験するために解凍した。

バイアルを三連で−１５０℃の冷凍庫から取り出して、３７℃で迅速解凍した。次に解凍細胞を予備加温した培地で２回洗浄してから、新鮮予備加温培地に再懸濁し、８ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦを含有するＳｔｅｍＰＲＯ（ＳＰ）培地を用いた、ＣｅｌｌＳＴＡＲＴマトリックス（ＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培養系内のウェル上に播種した。培地を繰り返し交換して細胞を７日間（図１）培養し、ＲＮＡ抽出（下記参照）のために収穫した。

フローサイトメトリー分析
ＲＮＡ抽出のために収集された細胞はまた、多分化能および分化の複数マーカーの発現を判定するためにも試料採取された。

培養中に残る細胞から単一細胞懸濁液を作成し、分化または未分化状態のいずれかと関連付けられている、様々なマーカーについて染色した。ヒトおよびマウス多能性幹細胞分析キット（ＢＤ、カタログ番号５６０４７７）を使用して染色されたマーカーは、次のとおりであった。上方制御が分化状態を示す段階特異的胚性抗原１（ＳＳＥＡ−１）、上方制御が未分化状態を示す段階特異的胚性抗原４（ＳＳＥＡ−４）、および胚性幹（ＥＳ）細胞と胚芽細胞中で発現され、その発現が細胞自己再生と多分化能を維持するために必要である３４ｋＤａのＰＯＵ転写因子であるＯｃｔ３／４。

染色細胞はフローサイトメトリーを使用して分析され、得られる結果は、マーカー分析される細胞系の状態を数値と図表の双方で示す。図４ａ。

腫瘍由来細胞系
標準法を使用して、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞を培養し継代した（植え継ぎした）。

ＲＮＡ抽出
ｍｉＲＮＡプロファイリング解析に先だって、全ＲＮＡを細胞から単離して品質を分析しなくてはならない。Ｅｘｉｑｏｎ（Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手できるｍｉＲＣＵＲＹ ＲＮＡ単離キットを使用して、異なる継代数の幹細胞の全ＲＮＡを単離する。製造会社の使用説明書に従って、特定の溶解緩衝液を使用して細胞を組織培養皿内で溶解してカラムに移し、そこでＲＮＡを洗浄し、次に溶出する。Ｎａｎｏｄｒｏ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００マイクロ流体ベースのプラットフォーム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡの量および質を検査する。

異なる継代数の幹細胞サンプルのマイクロＲＮＡ発現プロファイルは、これらのサンプルから全ＲＮＡを単離して、それらを（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイ、および（２）定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）の２つの方法によって分析することで判定し得る。

マイクロアレイを使用して、ヒト８５１ ｍｉＲＮＡの発現レベルに関するデータを同時に収集することで、サンプルの完全ｍｉＲＮＡプロファイルを得る。ＱＰＣＲを使用して、発現レベルの差を判定し得るように、いくつかのサンプル中の個々のｍｉＲＮＡ対象をデータ照会する。

（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析
質について検査され、適切な濃度に希釈された全ＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプラットフォーム上における、ｍｉＲＮＡプロファイリングのための出発原料として使用される。各サンプルからの１００ｎｇの全ＲＮＡをマイクロアレイプロトコルを通じて処理し、マイクロＲＮＡを標識し、アレイにハイブリダイズして、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンする。Ａｇｉｌｅｎｔの「ｍｉＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＆ Ｈｙｂキット」を使用して、サンプルをＣｙ３ダイで標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ ｍｉＲＮＡアレイ上で一晩ハイブリダイズし、その８個が各スライドガラス上に見られる。アレイ上で、各ｍｉＲＮＡは、少なくとも２つの異なるプローブによって１６回表される。これに加えて、ｓｐｉｋｅ−ｉｎ対照を使用して、反応の標識およびハイブリダイゼーション効率を評価する。アレイのスキャン画像は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアの入力を構成し、それは画像上の各スポットを分析して、それを特定ｍｉＲＮＡに割り当て、放出蛍光シグナルの値を計算する。この処理からの出力は、アレイ処理の質を評価する一連のＱＣ報告、および生マイクロアレイデータを含むテキストファイルである。これらのテキストファイルは、異なるサンプル間のｍｉＲＮＡ発現の変化を同定するのに使用される、統計学的分析の基礎を形成する。最良の実験デザインのために、生物学的複製（ｎ＝３）を異なるスライド上で処理し、再現性を確実にする。マイクロアレイデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および／またはＯｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｌｕｎｄ，ＳｗｅｄｅｎのＱｌｕｃｏｒｅ）、およびＳｉｓｔｅｍｉｃの社内統計法などの統計学的分析プログラムによって解釈される（下記参照）。

ＲＮＡ抽出
手順に従って、Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースのキットを使用して、これらの細胞からＲＮＡを単離して精製した。細胞がその上で培養された培地を吸引し、細胞単層を適量のＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳをさらに吸引した。３５０μＬの溶菌液を培養プレートに直接添加した。培養皿を穏やかに叩いて、緩衝液をプレート表面に５分間旋回させて、細胞を溶解した。次に溶解産物をマイクロ遠心管に移した。溶解産物に２００μＬの９５〜１００％エタノールを添加して、ボルテックスによって１０秒間混合した。キット中で提供される管の１本を使用して、カラムを組み立てた。６００μＬの溶解産物／エタノールをカラムに注入し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄して、スピンカラムをその収集管と共に再組立てした。４００μＬの提供される洗浄液をカラムに注入し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄して、スピンカラムをその収集管と共に再組立てした。別の４００μＬの洗浄液を入れて、１４，０００×ｇで１分間遠心分離して、カラムをさらに２回洗浄した。通過物を廃棄して、スピンカラムをその収集管と共に再組立てした。カラムを１４，０００×ｇで２分間遠心沈殿させて、樹脂を完全に乾燥させ、収集管を廃棄した。カラムをキットによって提供される１．７ｍＬの溶出管と共に組み立てた。５０μＬの溶出緩衝液をカラムに入れて、２００×ｇで２分間、続いて１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。得られた精製ＲＮＡサンプルは、２、３日間は−２０℃で保存し得た。サンプルの長期保存のためには、−７０℃で保存した。

（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析
標識
Ａｇｉｌｅｎｔからの標識キットを使用して、精製ＲＮＡサンプルを標識した。１×ＴＥ ｐＨ７．５中で、全ＲＮＡサンプルを５０ｎｇ／μＬに希釈した。２μＬの希釈全ＲＮＡを１．５ｍＬマイクロ遠心管に入れて、氷上にのせた。使用直前、０．４μＬの１０×仔ウシ腸管ホスファターゼ緩衝液、１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水、および０．５μＬの仔ウシ腸管ホスファターゼを穏やかに混合して、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを調製した。２μＬの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを各サンプル管に入れて全反応体積を４μＬにし、ピペット操作によって穏やかに混合した。反応体積を循環水浴内で３０分間、３７℃でインキュベートした。２．８μＬの１００％ＤＭＳＯを各サンプルに添加した。サンプルを循環水浴内で１００℃で５〜１０分間インキュベートして、次に即座に氷浴に移した。

１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液を３７℃に加温して、全沈殿が溶解するまで遠心沈殿させた。使用直前に、１μＬの１０×Ｔ４ＲＮＡリガーゼ緩衝液、３μＬのシアニン３−ｐＣｐ、および０．５μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼを穏やかに混合して、ライゲーションマスターミックスを作成して、氷上にのせた。４．５μＬのライゲーションマスターミックスを各サンプル管に添加して、全反応体積を１１．３μＬにした。ピペット操作によってサンプルを穏やかに混合し、遠心沈殿させた。次にサンプルを循環水浴内で２時間、１６℃でインキュベートした。次に４５〜５５℃の真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させ、管を弾いてもペレットが動いたり広がったりしなければ、サンプルは乾燥していると判定された。

ハイブリダイゼーション
Ａｇｉｌｅｎｔキットで提供される凍結乾燥１０×ＧＥブロック剤を含有するバイアルに、１２５μＬのヌクレアーゼ非含有水を添加し混合した。乾燥サンプルを１８μＬのヌクレアーゼ非含有水に再懸濁した。４．５μＬの１０×ＧＥブロック剤を各サンプルに添加した。２２．５μＬの２×Ｈｉ−ＲＰＭハイブリダイゼーション緩衝液を各サンプルに添加して、良く混合した。得られたサンプルを１００℃で５分間インキュベートし、次に即座に氷浴に移してさらに５分間置いた。ガスケットスライドがチャンバーベースと確実に同一平面になるにようにして、清潔なガスケットスライドをＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーベースに装入した。ハイブリダイゼーションサンプルをガスケット上に、泡立たないように細心の注意を払って分注した。

ＳｕｒｅＨｙｂガスケットスライド上に、活性面を下側にしてアレイをのせて、ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーカバーと共に組み立てて、組み立てチャンバーを形成した。組み立てチャンバーを５５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンに入れ、その温度で２０時間２０ｒｐｍで回転させた。

引き続いて、提供されるＧＥ洗浄緩衝液を使用して、スキャン前にアレイを洗浄した。
（２）定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲは、３段階で実施される。最初の２つの段階は、全ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを合成するためにｑＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する。第３段階のＱＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰｅｒｆｅＣＴａ Ｌｏｗ Ｒｏｘ反応ミックス（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する。

ポリ（Ａ）テーリング反応
全ＲＮＡサンプル（１００ｎｇ〜１ｇ）を新鮮な０．５ｍｌ管内でアリコートにして、ヌクレアーゼ非含有水で７μＬにする。２μＬの５×ＰＡＰ（ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）テーリング緩衝液および１μＬのポリ（Ａ）ポリメラーゼを各管に添加し、次に管をボルテックスして遠心分離する。次にサンプルを３７℃で２０分間、次に７０℃で５分間の条件下で、サーマルサイクラー内においてインキュベートする。この反応に続いて、サンプルを氷上にのせる。

ｃＤＮＡ合成反応
各サンプルが、９μＬのｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ反応Ｍｉｘと１μＬのｑＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を受領するように、ＲＴのマスターミックスを調製する。１０μＬのこのミックスを各サンプルに添加し、次に管をボルテックスして遠心分離する。次にサンプルを４２℃で２０分間、次に８５℃で５分間の条件下で、サーマルサイクラー内においてインキュベートする。この反応に続いて、サンプルを氷上にのせ、次に１×ＴＥ緩衝液で５倍に希釈する。

ＱＰＣＲ反応
各サンプルウェルが以下のキット構成要素を受領するように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ反応ミックスとプライマーとのマスターミックスを調製する。
・１０μＬの２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰｅｒｆｅＣＴａ Ｌｏｗ Ｒｏｘ反応ミックス
・０．４μＬのＵＡ３ＰＡ普遍的逆方向プライマー（１０μＭ）
・０．４μＬのｍｉＲＮＡ特異的プライマー（１０μＭ）
・４．２μＬのヌクレアーゼ非含有水
各ウェルに、５μＬのｃＤＮＡを添加する。全てのウェルを充填して、プレートをプラスチック光学蓋で密封したら、遠心分離して気泡を除去する。プレートをＡｇｉｌｅｎｔ ＭＸ３００５Ｐサーモサイクラーに装入し、以下のサイクル条件下で処理する。
・９５℃で２分間
・（９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間）×４０サイクル
・各アニーリング／延長段階の終わりに蛍光データを収集する
データ分析
これらの双方の技術からのデータを各プレートのｓｐｉｋｅ−ｉｎ ｍｉＲＮＡスポットに対して正規化し、別個のアレイからのデータを比較できるようにした。正規化データは、当業者に良く理解される標準技術である主成分分析を使用して分析され、ｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の相関が同定されて、観察されたデータのあらゆるグループ分けは、個々のｍｉＲＮＡの発現に対する、元の細胞の特定試験条件の作用の帰結と判定された。

図１は、マイクロＲＮＡの発現プロファイルを得る方法の流れ図である。
図２は、マイクロアレイ分析によって同定され、成熟マイクロＲＮＡのＱＰＣＲ測定で確認された、継代数間のｈａｓ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ１２７４ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ＊の変化を示す。

図３は、連続継代ヒト腫瘍由来細胞系（ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７）中のマイクロＲＮＡプロファイルの変化を示す。

図２に見られるように、結果は明らかにグループ分けされ、この分類は、その中でｍｉＲＮＡが発現される細胞の継代数に従う。換言すれば、完全に同じように継代された細胞の複製サンプルが、類似しているが異なったｍｉＲＮＡ発現プロファイルを有すると判定することが可能である。

細胞継代数の多数の比較を実施して得られたｍｉＲＮＡ発現の変化を分析することで、ｍｉＲＮＡ発現パターンのデータベースを構築し得る。このようなデータベースは、バイオプロセシングで使用される多能性幹細胞または細胞系中の表現型ドリフトを同定して、幹細胞の場合は多能性であり、細胞系の場合は所望の高分子産生である、最適機能性の喪失が示せるようにする。さらにｍｉＲＮＡ発現データのデータベースの構築が、細胞生理機能の好ましくないまたは未定義の変化を示す、特定のｍｉＲＮＡのサブセットを明らかにしてもよい。ひとたび指標ｍｉＲＮＡのサブセットが同定されたら、細胞によって産生される全範囲のｍｉＲＮＡでなく、指標ｍｉＲＮＡ発現プロファイルのサブセットの発現プロファイル見ることで、新しい細胞系の将来の試験を実施し得る。細胞生理機能に同様の影響を有することが知られまたは仮定される生物学的介入、または介入群を区別するために、ｍｉＲＮＡをそれらの発現レベルの関連性順に格付けしてもよい。細胞に同様の影響を有することが知られまたは仮定される介入、または介入群を区別するために、ｍｉＲＮＡにそれらの発現レベルの関連性を示す数値を割り当ててもよい。例えば数値は、主成分の分散に対するｍｉＲＮＡ発現レベルの貢献度に関連していてもよい。主成分分析などの統計学的方法を使用したｍｉＲＮＡ発現プロファイル比較の代案として、またはそれに加えて、各限定的ｍｉＲＮＡ群（例えば、１０〜５０個）の発現に対する細胞培養継代の影響を同定し、それぞれのｍｉＲＮＡ発現に対する生物学的介入の効果に、１群のコードから選択されるコードを割り当てるのに使用してもよい。得られたコードを比較して、実質的類似性を同定してもよい。

例えば比較（例えば、細胞継代数）のために、格付けされた各ｍｉＲＮＡに対するコードとして、以下に基づいて３桁の２進数を割り当ててもよい。

１．生物学的介入に応えてｍｉＲＮＡ発現が無変化（実験的変動の正常範囲内）の場合、第１のビットは０に設定される。発現が顕著に変化した場合、第１のビットは１に設定される。

２．発現レベルの変化が同定され、変化が増大した場合、第２のビットは１に設定される。生物学的介入に起因する変化が低下した場合、第２のビットは０に設定される。

３．発現レベルの変化が４倍を超える場合、第３のビットは１に設定され、そうでなければそれは０に設定される。

したがってｍｉＲＮＡ発現に対する、細胞継代または培養条件間の差異の影響には、可能な５つの値の内１つを有するコードが割り当てられる。

１．発現に変化なし−０００
２．発現の大きな増大−１１１
３．発現の小さな増大−１１０
４．発現の大きな低下−１０１
５．発現の小さな低下−１００
１群のｍｉＲＮＡ発現レベルに対する長期培養（すなわち継代数の増大）の影響は、付随コードによって特性評価されてもよく、主成分分析から即座に明らかにならない発現レベル変化の同定を可能にし、試験条件または介入の類似性をスコア付けする代案の方法を可能にし、得られた発現データを目視検査によって理解できるようにする。

細胞維持体制の効果を特性評価し、異なる生物学的介入のｍｉＲＮＡ発現に対する影響間の相関を判定する別の方法は、発現アッセイを実施して、各ｍｉＲＮＡ群（典型的に１０〜５０個）の発現に対する介入の効果を判定し、例えば群内で最大の発現増大を有するｍｉＲＮＡから、群内で最大の発現低下を有するｍｉＲＮＡの順に、またはその逆順で、効果順にその群内のｍｉＲＮＡを格付けすることである。得られた格付けは、特定の試験点または介入の効果を示す。したがってｍｉＲＮＡ群に対するその他の介入の効果を測定し、群内のｍｉＲＮＡを効果順に格付けしてもよい。得られた格付けを比較して、介入効果間の相関を同定できるようにしてもよい。

指標ｍｉＲＮＡのサブセットを試験するのに使用可能なプレートを含んでなるキットを提供し、それによって可能な新規治療用途について、細胞継代および／または介入の効果をスクリーニングし得る効率および速度を顕著に増大させてもよい。

さらなるバリエーションおよび修正を本明細書で開示される本発明の範囲内で加えてもよい。

参考文献
１．Ｘｉｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ３’−ＵＴＲｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍａｍｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３４（７０３１）：ｐ．３３８−４５
２．Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｓｏｍｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡｓ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００５． ４３３（７０７２）：ｐ．７６９−７３
３．Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ａｃｉ ＵＳＡ，２００４．１０１（３２）：ｐ．１ １７５５−６０
実施例２
要約
１．連続継代幹細胞のマイクロＲＮＡプロファイリングは、多分化能と分化の細胞表面および内部タンパク質抗原マーカーを評価する、フローサイトメトリーおよび市販のキットを使用して「同一」集団と評価される細胞中の差異を明らかにする（図４）。

２．同等の発達段階の成人ＣＤ３４＋造血性幹細胞との比較のために、マイクロＲＮＡを使用して、ヒト胚性細胞系（ｈＥＳＣｓ）の指向性分化によって誘導されたＣＤ３４＋細胞の２集団からのｍｉＲＮＡプロファイルを比較することで、ｈＥＳＣから赤血球への分化をモニターし得る（ＨＳＣ；図５）。

方法
方法は上の実施例１に概説される（「フローサイトメトリー」および「データ」と題されたセクション、特にＰＣＡを参照されたい）。

Ｑｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＱｌｕｃｏｒｅＡＢ）を使用して、データの階層的なクラスター形成および色分け地図視覚化を達成した。

火山型プロットは、複製データから構成される、大型データセットの変化を迅速に同定するのに使用されるグラフ表示である。それはｙおよびｘ軸それぞれの変化倍数と対比して、有意性をプロットする。火山型プロットは、ｈＥＳＣデータセットのＡＮＯＶＡ分析結果を使用して作成された。ＡＮＯＶＡ分析および火山プロットは、どちらもＰａｒｔｅｋ’ｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ）を使用して作成された。

結果および考察
１．他の方法では同一と評価される多能性ｈＥＳＣ細胞集団のｍｉＲＮＡの差異の同定
Ｒｏｓｌｉｎ Ｃｅｌｌａｂは、ヒト胚性ステム細胞系ＲＣＭ１を用いた。細胞は、中期継代５１（Ｐ５１）および後期継代（Ｐ１０３）で得られ、個々の代（すなわち細胞を植え継ぐ間の期間）は約１週間であった。フローサイトメトリーによる分析およびｍｉＲＮＡプロファイリングのために十分な細胞を生成するため、液体窒素保存からの蘇生後に細胞を最大３回継代培養した。

フローサイトメトリー、マイクロＲＮＡプロファイリング、およびデータ分析
Ｒｏｓｌｉｎ Ｃｅｌｌｓによって実施されるフローサイトメトリーを使用して、各継代からの細胞を分析した。この分析は、双方の細胞集団が、市販の試験で使用される多分化能および分化マーカーについて、識別不能であることを示唆する（図４ａ）。しかし下の図４ｂに見られるように、各継代での生物学的複製（ｎ＝３）は、その中でｍｉＲＮＡが発現される細胞の継代数に従って、明らかに共にグループ分けされる。換言すれば、完全に同じように継代された細胞の複製サンプルが、類似しているが異なったｍｉＲＮＡ発現プロファイルを有すると判定することが可能である。

変化倍数に２以上の差がある、５個の差次的発現されるｍｉＲＮＡが図４ｃにあり、これらのｍｉＲＮＡの同一性を図４ｄに示す。

２．赤血球への分化を方向付けられたｈＥＳＣ由来および成人造血性幹細胞のモニタリング
最も変わりやすいｍｉＲＮＡ転写物トップ５０のＰＣＡを下の図５Ａに示す。サンプルは、明らかに細胞型と段階に基づいてクラスター化しており、それは図５Ｂの色分け地図からも明らかである。第Ｉ期には、ｈＥＳＣおよび成人ＨＳＣのカテゴリーは、ＰＣＡプロットの別個の空間を占め、これらの細胞型が際立って異なる特性を有することが暗示される。しかし第ＩＩ期には、ｈＥＳＣおよび成人ＨＳＣカテゴリーは、ほぼ一緒にグループ分けされて、サンプルのｍｉＲＮＡプロファイルの類似性が高いことが実証される。

以下のサンプル群を分析した。
第０期ｈＥＳＣ：未分化ｈＥＳＣ
第１期ｈＥＳＣ：分化プロトコル１０日目のｈＥＳＣ
第２期ｈＥＳＣ：分化プロトコル２４日目のｈＥＳＣ
第Ｉ期成人ＨＳＣ：第Ｉ期ｈＥＳＣに相当する分化段階の成人ＨＳＣ細胞
第ＩＩ期成人ＨＳＣ：第ＩＩ期ｈＥＳＣ（分化誘導１４日後）に相当する分化段階の成人ＨＳＣ細胞
本発明の実施形態は、
ｉ．細胞系統を連続継代培養として増殖させ、規定介入に続いて、または増殖条件に変更がない場合は細胞が試料採取される各継代で、例えばマイクロアレイによってマイクロＲＮＡ発現プロファイルを判定するステップと、
ｉｉ．例えば主成分分析などの適切な統計学的試験を使用して、継代数、増殖条件変更、薬剤またはその他の外的因子による処理、遺伝子の形質移入／ウイルス性形質導入に基づく、サンプル間の隔たりを定義するステップと、
ｉｉｉ．試験条件間の変動を特徴づけるマイクロＲＮＡを判定するステップと
を含んでなる方法に関連していてもよい。

これらのｍｉＲＮＡは、至適多能性、至適分化、および／または至適増殖細胞集団からの、および／またはバイオプロセシング、創薬または再生医療におけるそれらの目的にとって安全なものからの細胞の「ドリフト」情報を提供し得て、すなわち以下の場合に、細胞集団の同一性、純度、効力または安全性（幹細胞の腫瘍形成能、微生物学的汚染）に関する重要な情報を明らかにする。

細胞が哺乳類（場合によりヒトおよび／または齧歯類）である場合、未分化多能性胚性細胞またはｉＰＳ細胞（ｉＰＳ細胞（誘導性多能性幹細胞）は、１つまたは複数の形質導入されたベクターからの外来性ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ／ｍｉＲの誘導発現によって、再プログラム化された成人体細胞と定義される）。それらの生産に必要な化学物質を含んでもよい組み合わせ中の。

細胞が、ｈＥＳＣまたはｉＰＳ細胞に由来する、１つまたは複数の一次胚葉または始原細胞の混合物である場合。

細胞が、（Ｍｅｌｌｏ Ｉｎｃからの）ｍｉｒＰＳ細胞であり、または１つまたは複数の形質導入ベクターを形成する外来性ｍｉＲＮＡの直接発現によって再プログラム化されたその他の細胞である場合。

生体系が、制御された様式でｈＥＳＣゲノムに挿入されたプラスミドに基づくアッセイ系に相当し、それらを多能性に、ならびに遺伝子改変細胞に由来する分化系統中で活発に発現させる場合。

組織特異的幹細胞を使用し、分化を誘導する生物学的因子および／または化学化学物質への曝露に続いて、１つまたは複数の最終分化系統を生成する場合。

細胞が、ヒトまたは動物多性能間葉系幹細胞、またはあらゆるその他の成人幹細胞集団である場合。

細胞が、ヒトまたは動物組織に由来する初代細胞培養である場合。
細胞が、遺伝子修飾ありまたはなしの確立された細胞系である場合、（例えば、外来性酵素、タンパク質またはペプチドのウイルスまたはプラスミドベースの発現がある）。

増殖条件の変更が、二次元から三次元培養系への変更と、細胞培地組成と、化粧品で使用されるものをはじめとする異種成分、薬剤、賦形剤、および化学薬品の添加と、生物学的作用物質およびそれらのバイオシミラーへの曝露と、生理的状態（例えば、温度、照射など）の変動とをはじめとする、細胞マトリックスの変更を含む場合。

単独または組み合わせのいずれかでの小型分子および生物学的因子（生物製剤またはバイオシミラー）への曝露に続く、特定系統への分化決定をモニターする。

特にバイオプロセシング用途では、ｐＨ、浸透圧などに起因する、変化の効果をモニターする。

マイクロＲＮＡ変化の様式、すなわち正または負の相関ならびにマイクロＲＮＡ変化の組み合わせに関連するその他のもの、すなわちｍｉＲ変化のパターンは細胞表現型の変更を特徴づける。

Claims (15)

1. 細胞を特性評価し、プロファイリングし、および／または品質評価するための非コードＲＮＡ分子の使用。
2. 細胞の非コードＲＮＡプロファイルを参照非コードＲＮＡ発現プロファイルと比較するステップを含んでなり、前記参照非コードＲＮＡ発現プロファイルが、既知のまたは規定の特性、プロファイルおよび／または性質を有する細胞に由来する、細胞を特性評価し、プロファイリングし、および／または品質評価する方法。
3. 前記特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質評価される細胞が、
   （ｉ）非マイクロＲＮＡプロファイリングベースの技術によって、参照細胞と表現型的におよび／または遺伝的に同一であると示される細胞、
   （ｉｉ）単離細胞または細胞群、
   （ｉｉｉ）細胞系および／または保存細胞調製品からの細胞または細胞群、
   （ｉｖ）細胞培養からの細胞または細胞群、
   （ｖ）規定プロトコルによって培養された細胞群の細胞、
   （ｖｉ）改変された培養パラメータ（例えば、改変された温度（上昇または低下）、培養持続期間、ｐＨ、浸透圧など）に曝露した細胞、および
   （ｖｉｉ）１つまたは複数の介入を受けた細胞
   からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記参照非コードＲＮＡプロファイルが由来する細胞が、
   （ｉ）単離細胞または細胞群（初代細胞培養および／または不死化細胞を含む）、
   （ｉｉ）１つまたは複数の所定の基準、品質基準および／または特性に適合する細胞、
   （ｉｉｉ）細胞系および／または保存細胞調製品からの細胞または細胞群、
   （ｉｖ）細胞培養からの細胞または細胞群、
   （ｖ）規定プロトコルによって培養された細胞群の細胞、
   （ｖｉ）改変された培養パラメータ（例えば、改変された温度（上昇または低下）、培養持続期間、ｐＨ、浸透圧など）に曝露した細胞、および
   （ｖｉｉ）１つまたは複数の介入を受けた細胞
   からなる群から選択される１つまたは複数の細胞である、請求項２または３に記載の方法。
5. 特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質評価される細胞、および／または参照非コードＲＮＡプロファイルが由来する細胞が、
   （ｉ）真核生物および／または原核生物細胞、
   （ｉｉ）哺乳類、昆虫、真菌、原生動物および／または細菌細胞、
   （ｉｉｉ）成人および／または胚性／胎児細胞、および
   （ｉｖ）幹細胞、多能性細胞および／またはｉＰＳ細胞
   からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用または方法。
6. 前記参照非コードＲＮＡプロファイルが由来する細胞が、既知のおよび／または規定の同一性および／またはタイプであり、および／または規定の表現型、規定の遺伝子型、規定の効力、既知の汚染レベル、規定の生存度、規定の安全性（例えば、腫瘍形成能）および／または既知の品質を有する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項に２〜６のいずれか一項によって提供される方法で使用するための参照非コードＲＮＡプロファイルを含んでなる、例えばデジタル式記憶媒体などの記憶媒体。
8. 特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質評価される細胞を得るステップと、それらの非コードＲＮＡプロファイルを参照非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップとを含んでなる、細胞特性評価、プロファイリングおよび／または品質評価サービス。
9. 既知の特性および／または既知のプロファイルを有する細胞から得られた非コードＲＮＡプロファイルのデータベースと、特性評価され、プロファイリングされ、および／または品質管理される細胞から非コードＲＮＡプロファイルを得るためのアッセイおよび／または試薬とを含んでなるキット。
10. （ｉ）評価される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを判定するステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で判定された非コードＲＮＡプロファイルを、適切なおよび／または正しい同一性、純度、効力および／または安全性を有する細胞または細胞群に由来する参照非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップと
    を含んでなる、細胞の品質、同一性、純度、効力および／または安全性を評価する方法であって、
    前記評価される細胞が、前記参照非コードＲＮＡプロファイルと同等のまたはそれと一致する非コードＲＮＡプロファイルをもたらす場合、前記評価される細胞は、適切なおよび／または正しい、同一性、純度、効力および／または安全性を有する、方法。
11. 前記評価される細胞が、細胞培養および／またはその継代培養に由来する請求項１０に記載の方法。
12. （ｉ）評価される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを判定するステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で判定された非コードＲＮＡプロファイルを、さらなる使用に適することが知られている細胞または細胞群に由来する参照非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップと
    を含んでなる、さらなる使用のために細胞の適合性を評価する方法であって、
    前記評価される細胞が、前記参照非コードＲＮＡプロファイルと同等のまたはそれと一致する非コードＲＮＡプロファイルをもたらす場合、前記評価される細胞もまた、さらなる使用に適する、方法。
13. （ｉ）評価される細胞の非コードＲＮＡプロファイルを判定するステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で判定された非コードＲＮＡプロファイルを、汚染がないことが知られている細胞または細胞群に由来する参照非コードＲＮＡプロファイルと比較するステップと
    を含んでなる、細胞汚染レベルを評価する方法であって、
    前記評価される細胞が、前記参照非コードＲＮＡプロファイルと同等のまたはそれと一致する非コードＲＮＡプロファイルをもたらす場合、前記評価される細胞は汚染がない、方法。
14. 前記参照非コードＲＮＡプロファイルが、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染がないことが知られている細胞または細胞群に由来する、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染レベルを評価するための請求項１３に記載の方法。
15. 試験細胞の非コードＲＮＡプロファイルを参照細胞のマイクロＲＮＡプロファイルと比較するステップを含んでなる、非マイクロＲＮＡプロファイリングベースの方法によって、参照細胞と表現型的におよび／または遺伝子型的に同一であると示される試験細胞を特性評価し、プロファイリングし、および／または品質評価する方法であって、前記試験細胞のマイクロＲＮＡプロファイルが、前記参照細胞のマイクロＲＮＡプロファイルと一致するか、またはそれと同等である場合、前記試験細胞と参照細胞は同一である、方法。