JP2013532951A - Rnf8−fhaドメイン改変タンパク質及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
RNF8のFHAドメインの立体構造(図1、PDB code:2PIE)を基にして、RNF8のFHAドメイン(図2、配列番号1)の4つのループをランダム化(NNS)したループを含むRNF8ライブラリーを設計し、140塩基以下の断片として化学合成した(FASMAC)。ランダム化する部分は、図2において四角で囲った、RNF8タンパク質の41−43番目のアミノ酸残基、53−60番目のアミノ酸残基、80−82番目のアミノ酸残基及び109−114番目のアミノ酸残基部分である。また、ライブラリー遺伝子は高タンパク質発現を目的としていわゆる最適コドン(図2大文字表記)を採用した。さらに、リボソームディスプレイを実施する上で必要となる、3’末端にFLAG配列を付加したT7プロモーターおよびSD配列を含む5’UTR配列も化学合成した(FASMAC)。下線部位はそれぞれのオリゴDNAが相補する(オーバーラップする)領域を示す。
N-Term (配列番号2: GACTATAAAGATGACGATGACAAAggcgagcctggcttcttcgtcaccggagaccgcgccggtggccgctcatggtgcctgcgccgcgtgggcatgagcgccggctggctgcttctcgaggatggtTGCgaagttac)
C-Term (配列番号3: cCgaagaagactgggaAacCatTtatccttgtcttAGcccTaagaatgaTcaaatgatTgaaaaGaatGAATTCggtggcagcggaggtgaatatcaaggccaatcgtctgac)
LOOPs 1&2 (配列番号4: ctTctCgaGgatggTTGCgaAgtTacCgtTggTNNSNNSNNSggtgtcacCtaccaGctggtatcaaaannsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsaaccactgCgttCtTaagcaAaatcctgag)
LOOP 3 (配列番号5: ccactgCgttCtTaagcaAaatcctgagggccaatggacCattatggacaacaagNNSNNSNNSggtgtttggctgaacCgAgcgcgCctggaacctttGCgCgtctatAGcattcatcagggTgac)
LOOP 4 (配列番号6: GCgCgtctatAGcattcatcagggTgactacatccaacttggTNNSNNSNNSNNSNNSNNSgagaatgcCgagtatgaatatgaagttacCgaagaagactgggaAaccatttatcc)
5’ UTR (配列番号7: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggactataaagatgacgatgacaaa)
化学合成したそれぞれの遺伝子断片(5‘UTR, N−Term, Loop1&2, Loop3, Loop4,C−term)とg3pの遺伝子をそれぞれ1pmol、KOD Plus DNA Polymerase (TOYOBO) を含むPCR反応液(トータル500μL)を調製し、15サイクルのPCR反応(変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒)を実行した後、5’プライマー(配列番号10: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag)10pmol、プライマーSecMstop(配列番号11: ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg)10pmol、KOD Plus DNA Polymerase 1μLを反応液(50μL×10本)に追加で加え、更に10サイクルのPCR反応(変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒)を実行した。1%アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)で精製して最終的なランダム配列を含む遺伝子ライブラリーとした。
精製した遺伝子ライブラリーDNA1μgを20μLのin vitro transcription Kit(RibomaxTM Large Scale RNA Production System−T7, Promega)によってmRNAとし、カラム精製した(RNeasy mini カラム、QIAGEN)。
タンパク質合成反応試薬である無細胞翻訳系(PUREシステム)は既報[Shimizu et al. (2005), Methods, vol.36, pp.299-304]に従い調製した。調製した反応液(100μl)に10pmolのmRNAライブラリーを加え、37℃で30分間インキュベートした。氷冷したWash緩衝液[50mM Tris−OAc, pH7.5、150mM NaCl、50mM Mg(OAc)2、0.5% Tween20、1μg/mL Saccharomyces cereviseae total RNA (Sigma)]を500μL加え、Blocking緩衝液[50mM Tris−OAc, pH7.5、150mM NaCl、50mM Mg(OAc)2、0.5% Tween20、100μg/mL Saccharomyces cereviseae totalRNA (Sigma)、5%SuperBlock (PIERCE)]500μLを加えた。予め5%SuperBlockで4℃で一晩ブロッキングしておいたDynabeads MyOne streptavidin T1磁性体ビーズ(100μLスラリー、Invitrogen)を、500μL Wash緩衝液でMagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて2回洗浄後、全量の翻訳後反応液(リボソームディスプレイライブラリー溶液)を加え、磁性体ビーズ及びストレプトアビジンへの前吸着操作を4℃、60分行った。その後、MagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて上清を回収した。
Sigmaより購入した抗原タンパク質(ヒトErk2および大腸菌チオレドキシン:Trx)は、EZ−Link NHS−PEO4−Biotin(PIERCE)の標準プロトコールに従ってビオチン化した。ビオチン化したそれぞれの抗原タンパク質はSDS−PAGEによるバンドの移動度のシフトよりビオチン化が確認され、BCA Protein Assay Kit(PIERCE)を用いて濃度を決定した。
予め5%SuperBlockで4℃で一晩ブロッキングしておいたDynabeads MyOne streptavidin T1磁性体ビーズ(100μLスラリー、Invitrogen)を、500μL Wash緩衝液でMagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて2回洗浄後、100nmolのビオチン化抗原タンパク質を加え、4℃で磁性体ビーズに固定化した。30分後、500μL Wash緩衝液でMagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて3回洗浄後、回収した磁性体ビーズに前吸着処理後の翻訳反応液を加え4℃で1時間ローテーションによって攪拌した。MagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)によって上清を廃棄し、回収した磁性体ビーズに1mL のWash緩衝液を加え、4℃で5分ローテーションによって攪拌した。この操作を30回繰り返した後、100μL Elution緩衝液(50mM Tris−OAc, pH7.5、150mM NaCl、50mM EDTA)を回収した磁性体ビーズに加え、4℃で10分静置する事によって、複合体を磁性体ビーズから遊離させた。MagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)によって上清を回収し、RNeasy Micro(QIAGEN)によってmRNAを回収、精製した。
回収したmRNAはTranscription High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche)によってcDNAとした後、KOD Plus DNA Polymeraseを用いてRT−PCR(トータル250μL、変性:94℃、10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃、60秒、35サイクル)を行った。なお、使用したプライマーを以下に示す。
逆転写リバースプライマー:C−term R(配列番号12: GTCAGACGATTGGCCTTGATATTC)、
PCRプライマー:5’プライマー(配列番号10: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag)及びC−term R(配列番号12: GTCAGACGATTGGCCTTGATATTC)
RT−PCR後の反応液は1%アガロースを使用して電気泳動し、対応するサイズのバンドを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて精製した。
セカンドラウンド以降のリボソームディスプレイ用遺伝子の再構築は以下のように行った。RT−PCR後の精製遺伝子、5’UTR、g3p遺伝子のそれぞれを1pmol、5’プライマー(配列番号10: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag)10pmol、プライマーSecMstop(配列番号11: ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg)10pmol、KOD Plus DNA Polymerase(TOYOBO)を含むPCR反応液(トータル250μL)を調製し、15サイクルのPCR反応(変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒)を実行した後、1%アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)で精製した。
4ラウンド後、回収した遺伝子を大腸菌発現ベクターpET−MalStrep(図3)にクローニングした。すなわち、4ラウンドのRT−PCRの後、5’側にEcoRIを導入したプライマーEco1−(−M)−FLAG_F(配列番号13: CCgaattcGACTATAAAGATGACGATGACAAAggC)、3’側にHindIIIを導入したプライマーRNF8−Hind3_R(配列番号14: ggAAGCTTattCttttcAatcatttgAtcattc)、及びKOD Plus DNA Polymerase (TOYOBO)を含む反応液(トータル100μL)を使用してPCRを行った。PCR反応液を20サイクルの増幅(変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒)に供した後、QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を用いて精製した。精製した遺伝子1μgおよび発現ベクターを制限酵素EcoRI−HindIIIで37℃、1時間処理し、1%アガロースを使用した電気泳動によって対応するバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)で精製した。インサート遺伝子とベクター遺伝子を3:1(モル比)で混合し、LigaFast Rapid DNA Ligation Kit(Promega)を用いて、室温で30分反応後、予め調製(Z−competent E.Coli Transformation Buffer Set:ZYMO RESEARCH)しておいた大腸菌BL21(DE3)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン(終濃度 50μg/mL)を含むLB寒天プレート上で37℃、一晩培養した。
一晩培養した後、LB寒天プレートから95個のシングルコロニーをアンピシリン(終濃度 50μg/mL)を含む100μLの2×YT培地に植菌し、37℃で3−5時間培養(OD600=0.5−0.8)後、IPTG(終濃度0.1mM)を添加し、25℃、一晩培養した。培養した大腸菌溶液10μLに、90μLのPBSおよび40μLの溶菌試薬(20μL BugBuster Protein Extraction Reagent:Novagen、20μL Lysozyme溶液 2.5mg/mL)を加え、室温で1時間溶菌した。溶菌した溶液に12.5%スキムミルク溶液(PBS)を40μL加え、室温で1時間ブロッキングした。平行して、1well当たり100ng/20μLで抗原タンパク質を4℃で一晩固定しておいた384穴プレートを100μL PBSで2回洗浄し、5% スキムミルク溶液(PBS)を100μL加え、室温で1時間ブロッキングした後、100μL PBSで2回洗浄して抗原固定プレートとした。このプレートにブロッキング済みの大腸菌抽出液を20μL加え、室温でプレートミキサーを使用して緩やかに攪拌した。1時間後、100μL PBSで5回プレートを洗浄し、20μL(1:2000希釈)のanti−FLAG M2−HRPコンジュゲート(Sigma)を加えて室温で1時間プレートミキサー上で緩やかに攪拌した。さらにプレートを100μL PBSで5回洗浄し、20μLの発色基質(0.4mg/mL 3,3’,5,5’−Tetramethyl−benzidine, 0.01%過酸化水素)によって検出した。室温で15分間反応させた後、20μLの2N HClを加えて反応を停止させ、プレートリーダー(TECAN)を用いて450nmにおける吸光度を測定した。
ELISA解析でポジティブであったクローンについてDNA配列を解析した。各ELISAポジティブクローンを培養し、プラスミドを回収(QIAprep Spin MiniPrep kit:QIAGEN)してDNA配列解析に供した。その際に使用したシーケンス用プライマーはpET−MALseqF:(配列番号15: CCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATC)であった。
結合活性が確認された各クローンを、アンピシリン(終濃度 50μg/mL)を含む200 mLの2×YT培地に植菌し、37℃で3−5時間培養(OD600=0.5−0.8)後、IPTG(終濃度0.1 mM)を添加し、25℃で一晩培養した。培養した大腸菌を遠心分離機によって回収し、60mLのLysisバッファー(20mM Tris HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM β−メルカプトエタノール, 5mM MgSO4, 10U/mL DNase)で再懸濁し、超音波破砕機(Bioruptor USD−250)によって破砕した。遠心分離によって上清を回収し、0.22μmのフィルターを通した後、MBPTrap(5mL×2本、GE Healthcare)によるアフィニティー精製(AKTA Purifier, GE Healthcare)を行った。精製後、タンパク質溶液を透析膜を用いてPBSにバッファー交換した。SDS−PAGEによって単一バンドであることを確認し、BCAプロテインアッセイキット(PIERCE)を用いて濃度を決定した。
PBSで希釈した精製した各結合クローン(500ng/well)を予め抗原を固定した384穴プレートに加え、上述したELISA(1次スクリーニングELISA)と同様の方法によって、結合クローンの結合比活性を比較した。
精製した各クローンの親和性は、BIACORE3000システムを使用して測定し、すべての操作はBiacoreの取扱説明書に従った。なお、ビオチン化した抗原タンパク質(Erk2及びチオレドキシン)のセンサーチップへの固定は、ストレプトアビジンを介したSA センサーチップ(Biacore)を使用して行った。
6wellプレートで予め培養しておいたHEK293T細胞を0.1% Triton X−100、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を含むPBS 500μLを加えて4℃、10分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをx10000gで10分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。50μLの細胞溶解液に5μgのErk2タンパク質と10μgのErk2結合クローン(Erk2 clone N)又はコントロールクローン(Trx clone A)を加えた。得られた溶液に40μl の洗浄(500μL PBS×3回)済みFLAG M2 Agarose Resin(Sigma)を加えて室温でローテーションにより緩やかに攪拌した。1時間後、MicroSpin Column(GE Healthcare)を使用してResinを回収し、500μL PBSで3回洗浄した後、50μLのFLAG Peptide溶液(500μg/mL)を加えて、結合複合体を室温で5分間溶出した。最後にMicroSpin Column(GE healthcare)を使用して上清を回収し、それらのうち10μLをSDS−PAGE、1μLをウエスタンブロットで解析した。ウエスタンブロットは、1次抗体に1:1000希釈した抗ERK抗体(Cell Signaling Technology)、2次抗体に1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(GE Healthcare)と1:10000希釈したanti−FLAG M2−HRPコンジュゲート(Sigma)を用いて行った。検出は、ECL advance(GE Healthcare)を用いて標準の方法で行った。
pcDNA3.1−RNF8−V5/His哺乳動物細胞発現プラスミドの調製:図4
発現ベクターpcDNA3.1−V5/His(Invitrogen)のEcoRI / XhoIサイトにRNF8の各クローン(Trx clone A, Erk2 clone A, Erk2 clone C, Erk2 clone N)のDNA断片を挿入することによりpcDNA3.1−RNF8−V5/Hisを作製した(各RNF8断片の3’末端にSalIを付加し、ベクターのXhoIの連結させた)。制限酵素サイトを付加した各RNF8クローンのDNA断片はEcoRI−RNF8−for(配列番号16: 5’− gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc −3’)及びSalI−RNF8−rev(配列番号17: 5’− gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc −3’)のプライマーセットを使用するPCR反応(KOD Plus DNA polymerase:TOYOBO、変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒、サイクル:30回)により作製した。各PCR産物はQIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を用いて精製した後、制限酵素処理を行った。制限酵素処理済みのDNA断片は1%アガロースゲル電気泳動を行い、対応するバンドを切り出した後、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製を行った。精製済みのベクターおよびインサートのDNA断片はTaKaRa Ligation kit Mighty Mix (TaKaRa)を用いて標準の方法でライゲーションを行った。ライゲーション産物は大腸菌TG1 F−にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、QIAprep Spin MiniPrep kit(QIAGEN)を用いてプラスミドの回収を行った。
6wellプレートでHEK293T細胞にpcDNA3.1−RNF8−V5/Hisをトランスフェクトし、24時間後に培地を廃棄し、0.1% Triton X−100、10mM イミダゾール及びプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を含むPBS 500μLを加えて4℃、10分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをx10000gで10分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。TALON Metal Affinity Resin (TaKaRa) 10μLを細胞溶解液に加えた。4℃で2時間インキュベートした後、レジンを500μL PBSで5回洗浄した。洗浄済みのレジンに20μLのSDS−PAGE sample buffer(50 mM Tris−HCl pH6.8, 2%SDS, 5% β−メルカプトエタノール, 10%グリセロール, 少量のBromophenol Blue)を加えた。この混合物を煮沸した後、10μLをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。ウエスタンブロットは、1次抗体に1:1000希釈した抗ERK抗体(Cell Signaling Technology)、2次抗体に1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(GE Healthcare)を用いて行った。検出は、ECL advance(GE Healthcare)を用いて標準の方法で行った。
はじめにEGFPのDNA断片を発現ベクターpCS2+のXhoI/XbaIサイトに挿入したプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドのEcoRI/XhoIサイトに各クローン(Trx clone A, Erk2 clone C, Erk2 clone N)のDNA断片を挿入することによりpCS2−RNF8−EGFPを作製した(RNF8断片の3’末端にSalIを付加し、ベクターのXhoIの連結させた)。制限酵素サイトを付加したEGFPのDNA断片はXhoI−EGFP−for(配列番号18: 5’−gccctcgaggtgagcaagggcgaggagctg−3’)及びXbaI−EGFP−rev(配列番号19: 5’ −gcctctagattacttgtacagctcgtccat−3’)のプライマーセット、制限酵素サイトを付加した各RNF8クローンのDNA断片はEcoRI−RNF8−for(配列番号16: 5’−gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc−3’)及びSalI−RNF8−rev(配列番号17: 5’−gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc−3’)のプライマーセットを使用するPCR反応(KOD Plus DNA polymerase:TOYOBO、変性:94℃,10秒、アニーリング:58℃, 30秒、伸長:68℃,60秒、サイクル:30回)により作製した。各PCR産物はQIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を用いて精製し、制限酵素処理した。制限酵素処理済みのDNA断片をアガロース電気泳動に供し、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。精製済みのベクターおよびインサートのDNA断片はTaKaRa Ligation kit Mighty Mix(TaKaRa)を用いて標準の方法でライゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌TG1 F−にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、QIAprep Spin MiniPrep kit(QIAGEN)を用いてプラスミドの回収を行った。
哺乳類培養細胞であるHEK293Tを10% FCS添加DMEM(Sigma)中で37℃、5%CO2供給下で培養した。Lipofectamin(Invitrogen)およびplus reagent(Invitrogen)を用いて標準の方法により、pCS2−RNF8−EGFP又はpCS2−RNF8−EGFP−NLSで細胞をトランスフェクトした。
24wellプレートを使用して、HEK293T細胞をpCS2−RNF8−EGFPでトランスフェクトし、24時間後に終濃度100nM PMAを加えて37℃で30分間インキュベートした。細胞のPMA処理後、直ちに培地を廃棄し、100μLのSDS−PAGE sample buffer(50 mM Tris−HCl pH6.8, 2% SDS, 5% β−メルカプトエタノール, 10%グリセロール, 少量のBromophenol Blue)を加えて細胞を溶解した。この細胞溶解液を煮沸した後、15μLをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。1次抗体に抗p90RSK(Cell Signaling Technology)、抗リン酸化Ser380 p90RSK(Cell Signaling Technology)、抗リン酸化Tre359/Ser363 p90RSK(Cell Signaling Technology)及び抗リン酸化Tre573 p90RSK(Cell Signaling Technology)を用い、いずれの抗体も希釈倍率は1:1000で使用した。また、2次抗体には1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(GE Healthcare)を用いた。検出は、ECL Advance(GE Healthcare)を用いて標準の方法で行った。
pCS2−RNF8−EGFP−NLSでトランスフェクションした24時間後、HEK293T細胞を4%PFAで室温、15分間のインキュベートにより固定した後、500μL PBSで3回洗浄した。これに500μL 0.2% Triton X−100/PBSを加えた後、室温で5分間インキュベートすることで膜透過処理を行い、500μL PBSで3回洗浄を行った。次に500μL 10%FCS/PBSを加え、室温で30分間ブロッキングを行った。Erk1/2を染色するために、1次抗体として抗ERK抗体(Cell Signaling)を10%FCS/PBSで1:50希釈した溶液を用いて室温で1時間、第一の反応を行い、500μL PBSで3回洗浄した。2次抗体としてAlexa555標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)を10%FCS/PBSで1:500希釈した溶液を用いて室温で1時間、第二の反応を行い、PBSで3回洗浄した。最後にHoechst33342を添加したPBSを加えて蛍光顕微鏡(OLYMPUS IX70)にてEGFP(RNF8)、ERKおよび核の三重染色像を観察した。
選択された抗原結合タンパク質の配列解析
リボソームディスプレイによるインビトロセレクション後の1stスクリーニングELISAの結果を表1に示す。
Erk2結合クローン(clone N)について、SPR(BIACORE)によって親和性を解析した結果、Kd=30nMの一般的な抗体と同等の親和性を持つ事が確認された(図6)。
精製したErk2結合クローン(Clone N)の抗原特異性を検討する目的で、哺乳動物細胞抽出液に組換えErk2タンパク質を加えて、Erk2結合クローンによる免疫沈降実験を行った(図7)。まず、SDS−PAGEの結果、Erk2結合クローンを加えた場合、Erk2タンパク質の分子量に相当する位置で1本のバンドが認められ、その他非特異的なバンドは検出されなかった。また、ウエスタンブロットの結果、検出されたバンドがErk2タンパク質である事が確認された。これらの結果より、細胞抽出液中でErk2結合クローンは厳密にErk2タンパク質を認識している事が確認された。
次に、精製したタンパク質による免疫沈降実験ではなく、Erk2結合クローンの遺伝子を細胞内に導入し、内在性Erk1およびErk2(Erk1/2)の免疫沈降を検討した(図8)。Erk2結合クローン遺伝子を導入した場合、内在性Erk1/2のバンドがはっきりと確認され、コントロールであるTrx結合クローン遺伝子を導入した細胞においてはバンドは確認されなかった。
図9に示したようにErk1およびErk2(Erk1/2)は、p90RSK、C−Myc、及びElk1をリン酸化するシグナル伝達因子である。この点を念頭に置き、Erk2結合クローンがErkと結合する事で、p90RSKとの相互作用を阻害(p90RSKのリン酸化阻害)できるかどうかを調べるために実験を行った(図10)。
Erk2に結合するクローンに核移行シグナル(NLS)を導入し、これらを細胞内で発現させて、内在性Erkの局在化を観察した(図11)。まず、EGFPを観察した。すべての結合クローンの核内への局在が認められた。次に、抗Erk抗体によって内在性Erkを観察した。Erk2結合クローンを導入したすべての細胞で内在Erkの核内への移行が認められ、コントロールであるTrx結合分子を導入した細胞においては、内在性Erkの核内移行は認められなかった。
配列番号3 オリゴヌクレオチド
配列番号4 オリゴヌクレオチド
nは任意の塩基を表す。
sはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号5 オリゴヌクレオチド
nは任意の塩基を表す。
sはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号6 オリゴヌクレオチド
nは任意の塩基を表す。
sはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号7 オリゴヌクレオチド
配列番号10 オリゴヌクレオチド
配列番号11 オリゴヌクレオチド
配列番号12 オリゴヌクレオチド
配列番号13 オリゴヌクレオチド
配列番号14 オリゴヌクレオチド
配列番号15 オリゴヌクレオチド
配列番号16 オリゴヌクレオチド
配列番号17 オリゴヌクレオチド
配列番号18 オリゴヌクレオチド
配列番号19 オリゴヌクレオチド
配列番号20 オリゴヌクレオチド
配列番号21 タンパク質
配列番号22 タンパク質
配列番号23 タンパク質
配列番号24 タンパク質
配列番号25 タンパク質
配列番号26 タンパク質
配列番号27 タンパク質
配列番号28 タンパク質
配列番号29 タンパク質
配列番号30 タンパク質
配列番号31 タンパク質
配列番号32 タンパク質
配列番号33 タンパク質
配列番号34 タンパク質
配列番号35 タンパク質
配列番号36 タンパク質
配列番号37 タンパク質
配列番号38 タンパク質
配列番号39 タンパク質
配列番号40 タンパク質
配列番号41 タンパク質
配列番号42 タンパク質
Claims (14)
- E3ユビキチンライゲースRNF8−FHAドメインのループをランダム化したランダムループ化ポリペプチドを得る工程と、
前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程と、を含む、人工抗体を製造する方法。 - 前記E3ユビキチンライゲースRNF8−FHAドメインのループは、下記の(a’)から(d’)に記載のループのうち、いずれか1つ又は2つ以上のループである、請求項1に記載の方法。
(a’)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41−46番目のアミノ酸残基からなるループ
(b’)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の49−62番目のアミノ酸残基からなるループ
(c’)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の78−83番目のアミノ酸残基からなるループ
(d’)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の108−118番目のアミノ酸残基からなるループ - 前記E3ユビキチンライゲースRNF8−FHAドメインのループは、下記の(a)から(d)に記載のループのうち、いずれか1つ又は2つ以上のループである、請求項1に記載の方法。
(a)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41−43番目のアミノ酸残基からなるループ
(b)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の53−60番目のアミノ酸残基からなるループ
(c)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の80−82番目のアミノ酸残基からなるループ
(d)配列番号1で示されるRNF8タンパク質の109−114番目のアミノ酸残基からなるループ - 前記ランダムループ化ポリペプチドは、前記E3ユビキチンライゲースRNF8−FHAドメインのループにランダム配列が導入されたポリペプチドであり、前記ランダム配列のアミノ酸残基数は3−12残基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程が、試験管内選択法である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により得られる人工抗体。
- イントラボディである、請求項1に記載の方法により得られる人工抗体。
- 請求項1に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体。
- 請求項1に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体であって、前記抗原タンパク質が、Erk2またはTrxである複合体。
- 請求項6に記載の人工抗体であって、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、(a)41−43番目のアミノ酸残基、(b)53−60番目のアミノ酸残基、(c)80−82番目のアミノ酸残基、及び(d)109−114番目のアミノ酸残基以外の部分に1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。
- 配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列からなる人工抗体、或いは、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、(a)41−43番目のアミノ酸残基、(b)53−60番目のアミノ酸残基、(c)80−82番目のアミノ酸残基、及び(d)109−114番目のアミノ酸残基以外の部分に1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。
- イントラボディである、請求項11に記載の人工抗体。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、(a)41−43番目のアミノ酸残基、(b)53−60番目のアミノ酸残基、(c)80−82番目のアミノ酸残基、及び(d)109−114番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、(a)41−46番目のアミノ酸残基、(b)49−62番目のアミノ酸残基、(c)78−83番目のアミノ酸残基、及び(d)108−118番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。
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