JP2013525477A - 高密度ポリアルキレングリコールでコーティングされた酸化鉄コア／金シェルナノ粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、コアとして磁性酸化鉄粒子、前記磁性酸化鉄粒子上に金シェル、そして前記金シェル上にポリ（アルキレングリコール）コーティングを含む複合粒子を提供するものであり、前記ポリ（アルキレングリコール）は前記金シェルへ０．０５〜１．０ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６１／３３２３４６号および同第６１／３３２８８８号（各々２０１０年５月７日および２０１０年５月１０日に出願）に基づく優先権を主張するものであり、いずれの仮出願も引用により本明細書に含まれるものとする。

技術分野
本発明は、高密度ポリ（アルキレングリコール）でコーティングされた酸化鉄コア／金シェルナノ粒子に関し、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤としてのその使用に関する。

膵臓癌は高侵襲性と化学療法や放射線療法に対する急性耐性とを特徴とする侵攻性の強い癌であり、それゆえ、検出・治療が最も困難な悪性病変の一つである［¹〜²］。診断が遅れ、有効な療法が存在しないために、患者の予後は不良のことが多い。この点は、疾患の初期に有用な診断ツールを実現することで改善が可能であると考えられる。

磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、軟組織の医用画像化のための強力かつ非侵襲性の技術である。ＭＲＩは、生体内における器官の組織形態や解剖学的な詳細を可視化するための非常に優れた解剖学的分解能とコントラストとをもらすため［³〜⁶］、分子イメージングの臨床での実現を可能にするものである。造影剤の開発は、癌の早期診断や細胞・分子レベルでの生物活性プロセスの検出のための磁気共鳴画像技術の進歩において中核をなしてきた。特に、酸化鉄ナノ粒子は、その低い毒性と、増感ＭＲＩで強いＴ₂およびＴ₂＊コントラストを生じる優れた磁気感受性とのため、生体内ＭＲＩへの応用に対する関心が益々高まっている。生体内での有用性を高め、腫瘍への利用を含むためには、酸化鉄ナノ粒子を高度に生体適合性の適切なサイズとしなければならず、かつ、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によって受動的に腫瘍へ蓄積するよう十分に長い血中循環時間を持つようにしなければならない［⁷〜⁹］。生体適合性ポリマーによる酸化鉄ナノ粒子の表面修飾は、細網内皮系（ＲＥＳ）による認識を回避または効果的に低減でき、粒子の循環特性を改善する。

ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、タンパク質治療剤の循環時間を引き延ばす生体適合性の非特異的タンパク質抵抗性材料として臨床上広く普及している［¹⁰〜¹¹］。ＰＥＧ系ブロックコポリマーやＰＥＧ化リポソームが、生理的環境における酸化鉄ナノ粒子の安定性や薬物動態を改善するために使用されている［¹²〜¹³］。多くの研究グループが、ＰＥＧでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子をＴ₂強調ＭＲ画像に用いて担腫瘍マウスの血管過多腫瘍部位におけるネガティブエンハンスメントを示している。

近年、金でコーティングされた超常磁性コア／シェルナノ粒子が生体医用への応用に対して少なからぬ関心を集めている［¹⁶〜¹⁹］。Ａｕおよび酸化鉄ナノ粒子は生体適合性であることが知られており、それぞれ光学的および磁気的な用途に広く用いられている。さらにまた、磁性ナノ粒子上の金コーティングは生物学的条件下で安定であってＡｕ−Ｓ結合によって容易に官能化させることができる。

中川らの文献には、金の層とその上のＰＥＧコーティングによって覆われた磁気を帯びた酸化鉄コアを有するＭＲＩ造影剤が報告されており、マウスの皮下に移植した線維肉腫のＭＲ画像において当該造影剤がネガティブエンハンスメントをもたらすことに成功したことが報告されている［²⁸］。

しかしながら、ＰＥＧでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を用いれば、標的化を可能にする生体分子と併用しなくても、膵臓腫瘍部位のＭＲ画像が強調されるという論文は存在しない。その理由は、これまでに開発されたＰＥＧでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子が血液区画で限られた循環特性しか持たず、そのサイズも膵臓腫瘍モデルへ侵入するほど小さくないためである。事実、ＴＧＦ−β阻害剤を腹腔内投与しなかった場合、ＰＥＧでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子（約１００ｎｍサイズ）は、血管過少と厚い線維化を特徴とするＢｘＰＣ３膵臓腫瘍の皮下モデルでは蓄積しなかった［¹⁵］。

これらの状況下では、血中循環特性が延長され、膵臓癌組織上にエンハンスメントをもたらすことのできるＭＲＩ造影剤の開発が待たれている。

本発明者らは既に、ネガティブ造影剤として流体力学的直径が約１００ｎｍであるＰＥＧでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を報告しており、皮下大腸腫瘍モデルのＭＲ画像化に成功している［¹⁴］。

また、本発明者らは、膵臓腫瘍モデルを受動的に標的とするためのナノ粒子系の上限サイズが約５０ｎｍであることを最近見出した（未発表データ）。従って、本発明者らは、酸化鉄系のナノ粒子系のサイズおよび表面特性を適切に制御することで、膵臓腫瘍の生体内検出に有効なＴ₂強調ＭＲＩ造影剤の開発が可能となるとの仮説を立てた。

本発明者らは上述の仮説を実証するため鋭意検討した結果、膵臓腫瘍モデルを画像化するＴ₂強調ＭＲＩ造影剤として用いるためのＰＥＧでコーティングされた酸化鉄コア／金シェルナノ粒子（ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ）系を開発した。

本発明者らによって開発された方法では、ナノ粒子の全体的なサイズを酸化鉄ナノ粒子をＡｕでコーティングすることにより制御したが、Ａｕはメトキシ−ＰＥＧ−チオール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ）との反応後、高次凝集体を形成することなく、強力なＡｕ−Ｓ結合によって高密度のＰＥＧコーティングを表面上に形成することが可能である。当該ナノ粒子を用いて得られた結果から、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは血中循環が長く、正常位の膵臓腫瘍と皮下大腸腫瘍モデルをＭＲ画像化することが明らかとなった。本知見から、酸化鉄コア／金シェルナノ粒子（ＡｕＩＯＮ）の流体力学的サイズと有効ＰＥＧ密度を正確に制御できる上述の方法は、膵臓癌を含む種々の腫瘍型のＭＲＩ造影剤の開発にとって有望な方法である可能性が示唆される。

従って、本発明は以下のものを提供する：
［１］ コアとして磁性酸化鉄粒子、前記磁性酸化鉄粒子上に金シェル、そして前記金シェル上にポリ（アルキレングリコール）コーティングを含む複合粒子であって、前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．０５〜１．０ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、前記複合粒子。
［２］ 前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．１２５〜０．７ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、［１］に記載の複合粒子。
［３］ 前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．２〜０．４ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、［１］に記載の複合粒子。
［４］ 平均直径が６０ｎｍ以下である、［１］に記載の複合粒子。
［５］ 平均直径が１０〜５０ｎｍである、［１］に記載の複合粒子。
［６］ 平均直径が１５〜４０ｎｍである、［１］に記載の複合粒子。
［７］ 前記磁性酸化鉄が、Ｆｅ₃Ｏ₄、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃、ＭｎＦｅ₂Ｏ₃およびフェライトからなる群より選択される一つである、［１］に記載の複合粒子。
［８］ 前記ポリ（アルキレングリコール）が、ポリ（メチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）からなる群より選択される一つである、［１］に記載の複合粒子。
［９］ 前記ポリ（アルキレングリコール）分子が、チオール−金カップリングによって前記金分子に結合している、［１］に記載の複合粒子。
［１０］ 前記ポリ（アルキレングリコール）の平均分子サイズが５００〜５０００ダルトンの範囲である、［１］に記載の複合粒子。
［１１］ 脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌からなる群より選択される複数種の癌のネガティブエンハンスメントをもたらす、［１］に記載の複合粒子。
［１２］ 膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、脳腫瘍および卵巣癌からなる群より選択される複数種の癌を診断する方法に使用するための、［１］に記載の複合粒子。
［１３］ ［１］に記載の複合粒子を製造する方法であって：
金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程；および
ポリ（アルキレングリコール）コーティングを前記金シェル上へ０．０５〜１．０ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて適用する工程、
を含む、前記方法。
［１４］ 前記金シェルの前記磁性酸化鉄粒子上への適用を、前記磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、ＮａＢＨ₄、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択される還元剤とを含有する溶液中において前記金錯体を還元することにより行う、［１３］に記載の方法。
［１５］ 前記ポリ（アルキレングリコール）コーティングの前記金シェル上への適用を少なくとも１回繰り返す、［１３］に記載の方法。
［１６］ 前記ポリ（アルキレングリコール）分子が、チオール−金カップリングによって前記金分子に結合している、［１３］に記載の方法。
［１７］ ［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の複合粒子を含む、ＭＲＩ造影剤。
［１８］ 前記複合粒子が、ＮａＣｌ濃度０〜１．５Ｍの溶液中で６０ｎｍ以下の平均直径を維持する、［１７］に記載のＭＲＩ造影剤。
［１９］ 癌の診断方法であって：
［１７］に記載のＭＲＩ造影剤を被験体へ投与する工程；
ＭＲＩシステムを用いて前記被験体の磁気共鳴画像を取得する工程；および
前記磁気共鳴画像から腫瘍組織を検出する工程、
を含む、前記方法。
［２０］ 前記磁気共鳴画像がＴ₂強調ＭＲＩである、［１９］に記載の方法。

５０ｎｍ以下のサイズに制御され、高密度のＰＥＧブラシでコーティングされた本発明の複合粒子は、腫瘍を標的とする生体分子を結合させなくても、膵臓腫瘍を含む様々な腫瘍のＭＲＩ造影剤として使用できる。高いポリ（アルキレングリコール）密度に加えて比較的小さな流体力学的直径のため、本発明の複合粒子は循環が長くなっている。本発明の複合粒子はＥＰＲ効果によって膵臓モデルへ蓄積し、その結果膵臓における腫瘍のＭＲ画像のコントラストが増強される。

図１は合成手順の模式図を示し、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子上へＡｕシェルを形成した後、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨでコーティングして生体適合性のナノ粒子を形成する。 図２はγ−Ｆｅ₂Ｏ₃（Ａ）およびＡｕＩＯＮ（Ｂ）のＸ線回折パターンを示す。各ナノ粒子のブラッグ反射を示す。 図３は（Ｉ）γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子（クロロホルム中）、（ＩＩ）ＡｕＩＯＮ（クロロホルム中）、（ＩＩＩ）ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（水性媒体中）の紫外・可視スペクトルを示す。 図４は（Ａ）γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子、（Ｂ）ＡｕＩＯＮ（クロロホルム中）、（Ｃ）ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（水性媒体中）の透過型電子顕微鏡観察を示し、ＡｕＩＯＮ表面上のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨコーティングを示す。ナノ粒子は１％リンタングステン酸溶液で染色した。スケールバーはいずれのＴＥＭ画像も５０ｎｍである。 図５はＡｕＩＯＮ（クロロホルム中）（実線）とＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（水中）（点線）の粒度分布を示す。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮのＺ−平均サイズ分布は動的光散乱により測定した。 図６はＮａＣｌ濃度の上昇に伴う粒子径の変化を示す。 図７はＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの相対流体力学的直径の時間依存性を示す。Ｆｅ濃度は、３７℃の１０％ウシ胎仔血清を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液中で１ｍｍｏｌ／Ｌとした。 図８はCarr-Purcell-Meiboom-Gill（ＣＰＭＧ）パルス配列を２５℃、０．５９Ｔで用いた際のＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの緩和ｒ₂を示す。 図９はＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの生体内分布を示す。血液、腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓および筋肉におけるナノ粒子のレベルは、静脈内注射後の各時点における用量の百分率で示す。 図１０は癌の生体内ＭＲ画像化を示す。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（ａ）およびフェリデックス（登録商標）（ｂ）を静脈内注射した４時間後の皮下移植Ｃ２６マウス癌腫のＴ₂強調画像（腫瘍部位は赤色の点線で囲ってある）、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（ｃ）およびフェリデックス（登録商標）（ｄ）を静脈内注射した４時間後の正常位ＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓癌モデルのＴ₂強調画像（腫瘍部位は赤色の点線で囲ってある）を示す。いずれの画像も４．７Ｔの磁場強度で取得した。 図１１は、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮおよびフェリデックス（登録商標）をＣ２６皮下モデル（ａ）およびＭｉａＰａＣａ−２正常位モデル（ｂ）へ注射後のＴ₂強調画像における腫瘍部位での相対シグナル強度の時間依存性を示す。 図１２は、移植したＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓腫瘍細胞が肝臓へ転移したマウスにＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ（Ａ）およびフェリデックス（登録商標）（Ｂ）を静脈内注射した２時間後のＴ₂強調画像を示す（腫瘍部位は赤色の線で囲ってある）。いずれの画像も４．７Ｔの磁場強度で取得した。 図１３は、転移巣の組織学的切片をヘマトキシリン・エオジン染色したもの（ＡおよびＢ）と、銀染色したもの（Ｃ、褐色：Ａｕ）を示す。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの分布は投与後２４時間目に調べた。

以下、本発明をより詳細に記載する。以下の実施態様は本発明を記載するための例示であって、本発明はこれらの実施態様に限定されるわけではない。本発明は、その趣旨を逸脱しない限り、様々な態様で実施することができる。

複合粒子
本発明の複合粒子は、少なくとも３種類の材料、即ち、コアとしての磁性酸化鉄粒子、前記コアを包囲するシェルとしての金、そして前記金シェルを包囲する外側コーティング層としてのポリ（アルキレングリコール）を含む（図１参照）。

本発明の複合粒子は、非常に高密度のポリ（アルキレングリコール）コーティングを有し、前記ポリ（アルキレングリコール）は、前記金シェルへ０．０５〜１．０ｎｍ²金シェル表面／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している。好ましくは、ポリ（アルキレングリコール）は前記金シェルへ０．０７５〜０．９ｎｍ²、０．１〜０．８ｎｍ²、０．１２５〜０．７ｎｍ²、０．１５〜０．６ｎｍ²、０．１７５〜０．５ｎｍ²、０．２〜０．４ｎｍ²、０．２２５〜０．３ｎｍ²または０．２３〜０．２７ｎｍ²金シェル表面／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している。

この高密度ポリ（アルキレングリコール）コーティングを有することで、本発明の粒子は高い生体適合性と被験体の循環系において長期の循環能とを有する。

本発明の複合粒子の平均直径は６０ｎｍ以下であり、好ましい範囲は５〜５５ｎｍ、好ましくは１０〜５０ｎｍ、より好ましくは１５〜４０ｎｍ、さらに好ましくは１５〜３５ｎｍ、１５〜３０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、２０〜２７．５ｎｍまたは２０〜２５ｎｍである。

このような本発明の複合粒子は、先行技術のＭＲＩ造影剤の複合粒子（例えば、平均直径が２３４．０ｎｍである中川らの文献に記載のもの）に比べて驚くほどサイズが小さいため、本発明の複合粒子は処理の難しい腫瘍（例えば、膵臓癌）へも侵入することができる。

本発明の複合粒子の緩和ｒ²は１００×１０^-3〜２００×１０^-3Ｍ^-1・ｓ^-1、好ましくは１２５×１０^-3〜１７５×１０^-3Ｍ^-1・ｓ^-1、より好ましくは１４０×１０^-3〜１６０×１０^-3Ｍ^-1・ｓ^-1、そしてさらに好ましくは１４５×１０^-3〜１５５×１０^-3Ｍ^-1・ｓ^-1の範囲であり、ＭＲ画像に強いコントラストをもたらす。

さらに、本発明の複合粒子は、被験体へ投与した際に腫瘍に特異的な生体内分布を示す。複合粒子の生体内分布は、血中および組織中のＡｕ含量を誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて測定することで確認できる。

本発明の複合粒子は、塩を含有する溶液中で安定である。本発明の実施例に示すように、本発明の複合粒子は、０〜１．５ＭのＮａＣｌを含有するＮａＣｌ水溶液中でその粒子径、即ち、直径を維持する。さらに、本発明の複合粒子は生理的条件下で非常に安定であり、そのためＭＲ画像のエンハンスメントが長く続く。本発明の複合粒子はまた、広範囲のｐＨ、例えばｐＨ３〜１０で安定である。

本発明の複合粒子は基本的に、金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程と、ポリ（アルキレングリコール）コーティングを金シェル上へ適用する工程の２段階で製造可能である。磁性酸化鉄粒子は市販のものであってよく（例えば、フェリデックス（登録商標））、または、適当な鉄錯体から調製してもよい。磁性酸化鉄粒子の調製、金シェルの磁性酸化鉄粒子上への適用、ポリ（アルキレングリコール）コーティングの金シェル上への適用について詳細を以下に記載する。

磁性酸化鉄
本発明の複合粒子に使用する磁性酸化鉄は、磁気を帯びていて酸化鉄を含有している限り任意の材料であってよい。従って、磁性酸化鉄粒子は市販のものでもよい（例えば、フェリデックス（登録商標））。磁性酸化鉄の例としては、Ｆｅ₃Ｏ₄、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃、ＭｎＦｅ₂Ｏ₃およびフェライトが挙げられる。好ましくは磁性酸化鉄はγ−Ｆｅ₂Ｏ₃である。

本発明の複合粒子に使用する磁性酸化鉄粒子の平均直径は７．５〜１５ｎｍ、好ましくは８．０〜１４ｎｍ、より好ましくは８．５〜１３．５ｎｍ、さらに好ましくは９．０〜１１ｎｍである。

磁性酸化鉄粒子は、１種以上のキャッピング剤の存在下で鉄錯体、例えばＦｅ（ＣＯ）₅、ＦｅＣｌ₃およびＦｅＳＯ₄を熱分解することで調製可能である。

キャッピング剤の例としては、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、１，２−ヘキサデカンジオール、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、ドデシルアミンおよびドデカンチオールが挙げられる。キャッピング剤の好ましい例はオレイルアミンとオレイン酸であり、５：１（＝オレイルアミン：オレイン酸）の比率で用いるのが有利である。オレイン酸の存在は、均一な形状の磁性酸化鉄粒子（特に、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃粒子）を得るのに役立つ。

好ましくは好気条件下で鉄錯体の熱分解を行う。

磁性酸化鉄粒子の形成は、電子顕微鏡観察によって容易に確認できる。

金シェル
磁性酸化鉄粒子上の金シェルはＡｕ分子からなり、平均の厚さが０．５〜１．８ｎｍ、好ましくは０．７〜１．５ｎｍ、より好ましくは１．０〜１．４ｎｍ、さらに好ましくは１．２〜１．４ｎｍである。

金シェルの磁性酸化鉄粒子上への適用は、磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、還元剤とを含有する溶液中で金錯体を還元することにより行うことができる。

金錯体の例としては、ＨＡｕＣｌ₄およびＡｕ（Ｏ₂ＣＣＨ₃）₃が挙げられる。金錯体の好ましい例はＨＡｕＣｌ₄である。しかしながら、金錯体は、リガンドを提供することでＡｕ分子と錯体を形成し、かつ、適当な溶液中でＡｕ⁺イオンを生成できる限り、上記のものに限定されない。

あるいは、Ａｕ分子を金の塩形態（例えば、硝酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩）で提供することもできる。

還元剤の例はオレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、ＮａＢＨ₄、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択されるが、これらに限定されない。

溶液に使用する溶剤としては、水、含水アルコールまたはアルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール）、酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸）、有機溶剤（例えば、ベンゼン、フェノール、トルエン、クロロホルム、ジオクチルエーテル）が挙げられる。

上記で列挙した化合物は、１つ以上のハロゲン基で置換されていてもよい。溶剤の好ましい例は１，２−ジクロロベンゼンである。

磁性酸化鉄粒子上での金シェルの形成を促進するために、ガンマ線、電子線または超音波といった刺激を必要に応じて溶液へ与えてもよい。

このようにして調製した金シェルを有する磁性酸化鉄粒子は、過剰のリガンド、還元剤または溶剤を除去するために、適当な手段（例えば、分散−遠心分離）によって洗浄してもよい。

金シェルの形成は、Ｘ線回折測定によりＡｕ分子の面心立方（ｆｃｃ）格子構造からブラッグ回折ピークを検出することで確認できる。

あるいは、金シェルの形成は、電子顕微鏡観察により磁性酸化鉄粒子の厚さの増加を測定するか、または、紫外・可視分光法によって確認できる。

ポリ（アルキレングリコール）
本発明の複合粒子に使用するポリ（アルキレングリコール）は、複合粒子に親水性と生体適合性を与えるものである限り任意の材料であってよい。ポリ（アルキレングリコール）の例としては、低級（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキレングリコールのポリマー、例えば、ポリ（メチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様では、ポリ（アルキレングリコール）はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。

好ましくは、ポリ（アルキレングリコール）の平均分子サイズは５００〜５０００ダルトン、７５０〜４０００ダルトンまたは１０００〜３０００ダルトンの範囲である。

ポリ（アルキレングリコール）は１つ以上のＳＨ基を含有していてもよく、金シェルの表面へチオール−金カップリング反応によって結合させることができる。好ましくは、ポリ（アルキレングリコール）は１つのＳＨ基を一方の末端に含む。ポリ（アルキレングリコール）は、必要に応じて、アルコキシ基をもう一方の末端に含む。アルコキシ基の好ましい例としては、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ基、即ち、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基およびブトキシ基が挙げられる。一実施態様では、アルコキシ基はメトキシである。

このようにして得られたポリ（アルキレングリコール）でコーティングされた複合粒子は既に水溶性であるが、金シェル表面上のポリ（アルキレングリコール）の密度を増加させるために、コーティング工程を少なくとも１回繰り返してもよく、その結果、水性条件での複合粒子の安定性がさらに強化される。

ポリ（アルキレングリコール）のコーティング工程を繰り返す際の溶剤として低級アルコール（例えば、メタノール、エタノールまたはプロパノール）を用いることにより、本発明の複合粒子のサイズを十分に制御することができる。

一方、ポリ（アルキレングリコール）の１回目のコーティングには、任意の溶剤、例えば、有機溶剤（フェノールやクロロホルム等）または水性溶剤（水等）を使用してもよい。ポリ（アルキレングリコール）の１回目のコーティングに好ましい溶剤の例はクロロホルムである。

その結果、本発明の複合粒子は１粒子当たり平均で５００〜５０００個のポリ（アルキレングリコール）分子を有し、好ましくは１粒子当たり平均で１０００〜４０００、１５００〜３０００、２０００〜２７５０または２２５０〜２６００個のポリ（アルキレングリコール）分子を有する。１粒子当たりのポリ（アルキレングリコール）分子の数は、Ｎ₂雰囲気下での複合粒子の熱重量分析（ＴＧＡ）により算出できる。

ポリ（アルキレングリコール）コーティングの平均の厚さは３〜１０ｎｍ、好ましくは４〜８ｎｍ、より好ましくは５〜７ｎｍであると考えられる。

金シェル上でのポリ（アルキレングリコール）コーティングの形成は、リンタングステン酸染色を用いた電子顕微鏡観察によって確認できる。

複合粒子の適用
上述したように、本発明の複合粒子は、高密度のポリ（アルキレングリコール）コーティングを金シェル上に有する点を特徴とする。高密度のポリ（アルキレングリコール）コーティングのおかげで本発明の複合粒子は優れた生体適合性と長期の血中循環能を有し、そのためＭＲ画像のエンハンスメントが長く続く。

さらに、本発明の複合粒子は、被験体へ投与した際に腫瘍に特異的な生体内分布を示す。

さらに、本発明の複合粒子は粒子径が小さいため（５０ｎｍ未満）、従来の方法で使用されているＭＲＩ造影剤では処理の難しい腫瘍組織へ侵入でき、前記腫瘍組織の画像に明らかなエンハンスメントをもたらすことができる。

これらの特性を有するため、本発明の複合粒子はＭＲ画像造影剤として、特に被験体の腫瘍を診断するために有利に用いることができる。

本発明の複合粒子は、プロトン緩和を促進してより長いエコー時間でＭＲＩシグナルを減少させる磁性酸化鉄粒子をコアとして含むため、Ｔ₂強調ＭＲＩ造影剤として有利に用いることができる。

複合粒子を用いて診断される被験体としては、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ヒト以外の霊長類）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験モデル動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の複合粒子によって可視化される腫瘍の例としては、良性または悪性のいずれでもよい。悪性腫瘍の例としては、脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。これらの癌は原発性または転移性のいずれでもよい。一実施態様では、診断対象の癌は膵臓癌である。別の実施態様では、診断対象の癌は大腸癌である。

複合粒子は、経口または非経口経路のいずれで被験体へ投与してもよい。経口投与の場合には、本発明の複合粒子を錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤として製剤化すればよい。非経口投与の場合には、本発明の複合体を注射剤、坐剤、点眼剤、経肺投与用の製剤（例えば、ネブライザーを用いて投与するもの）、経鼻投与用の製剤、経皮投与用の製剤（例えば、クリーム剤や軟膏剤）として製剤化すればよい。

注射剤の形態では、本発明の複合粒子は、全身投与してもよく、あるいは、静脈内注射（輸液を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射または皮下注射などの局所投与で投与してもよい。本発明の複合粒子は、１種以上の薬学的に許容される添加剤（例えば、賦形剤、滑沢剤、分解剤、安定化剤、結合剤、矯味矯臭剤、希釈剤）と共に製剤化することもできる。

賦形剤の例としては、デンプン（例えば、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン）、ラクトース、結晶性セルロース、リン酸水素カルシウムが挙げられる。

滑沢剤の例としては、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバ蝋、パラフィンが挙げられる。

結合剤の例としては、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、そして賦形剤の例として挙げた化合物が挙げられる。

分解剤の例としては、賦形剤の例として挙げた化合物、化学変性デンプンまたはセルロース（例えば、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム）、ポリビニルピロリドンが挙げられる。

安定化剤の例としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、アルコール類（例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール）、フェノール類（例えば、フェノール、クレゾール）、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。

矯味矯臭剤の例としては、日常的に使用されている甘味剤、酸味剤および着香剤が挙げられる。

本発明の複合粒子の液体製剤を調製する際には、溶剤、例えば、エタノール、フェノール、クロロホルム、クロロクレゾール、精製水および蒸留水を使用できる。あるいは、本発明の複合粒子をリン酸生理食塩緩衝液またはトリス−ＨＣｌ緩衝液へ溶解してもよい。液体製剤には、界面活性剤および／または乳剤、例えば、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０およびラウロマクロゴールが含まれていてもよい。

上述の添加剤は、本発明の複合粒子の製剤に応じて、単独または組み合わせて使用することができる。

被験体へ投与される本発明の複合体の用量は、被験体の年齢、性別および状態、投与の経路や頻度、本発明の複合粒子の製剤の種類に応じて変わる。投与スケジュールは、内科医、外科医、獣医師、生体医用工学の研究者、そして特に放射線専門医といった当業者であれば適切に決めることができる。

本発明の複合粒子の有効用量は、被験体の体重１ｋｇ当たり１〜５００ｍｇの範囲、好ましくは被験体の体重１ｋｇ当たり１〜２０ｍｇの範囲であるが、これに限定されない。

本発明の複合粒子を被験体へ投与すると、ネガティブエンハンスメントによって（即ち、暗い画像として）腫瘍組織が可視化される。

本発明の複合粒子と共に、ＴＧＦ−β阻害剤等の追加の薬剤を必要に応じて被験体へ同時投与してもよい。追加の薬剤の同時投与は、本発明の複合粒子の投与前または投与後に行うことができる。追加の薬剤は、本発明の複合粒子を被験体へ投与しながら、同時投与してもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に記載するが、下記の実施例は発明の範囲を限定するものではない。

１．材料および方法
材料
ペンタカルボニル鉄（Ｆｅ（ＣＯ）₅）およびテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸水素四水和物（ＨＡｕＣｌ₄）は関東化学株式会社（東京、日本）から購入した。１，２−ジクロロベンゼン（ＯＤＣＢ）はシグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。オレイルアミン、オレイン酸、エタノール、メタノールおよびクロロホルムは和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入した。メトキシ−ＰＥＧ−チオール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ；Ｍｗ＝２，０００）は日油株式会社（東京、日本）から購入した。

酸化鉄コア／金シェルナノ粒子（ＡｕＩＯＮ）の合成
典型的な合成では、４ｍｍｏｌのＦｅ（ＣＯ）₅（０．５３ｍｌ）を３ｍｌの（脱酸素化されていない）ＯＤＣＢに溶解し、次いで１５ｍｌのＯＤＣＢと、８ｍｍｏｌのオレイルアミン（２．６３ｍｌ）と、１．６ｍｍｏｌのオレイン酸（０．５ｍｌ）とを含有する温かい溶液中へ速やかに注入した。得られた混合物をゆっくりと１８０℃まで好気条件下で加熱した。溶液の最初のオレンジ色はプロセス中に徐々に黒へと変わった。９時間後、得られた黒い溶液を室温まで冷却し、エタノールを添加してナノ粒子を沈殿させた。得られた黒い凝集塊を８，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより単離し、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ペレットをＯＤＣＢ中へ再分散させた。

Ａｕシェルをγ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子の表面上に調製するため、最初にＨＡｕＣｌ₄（２．５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＯＤＣＢ中に含む溶液を１ｍｍｏｌのオレイルアミンの存在下に調製し、次いでこの溶液を数分間撹拌してＨＡｕＣｌ₄をＯＤＣＢ中に完全に溶解させた。次に、この溶液を、５０ｍｇのγ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子と２ｍｍｏｌのオレイルアミンとを１０ｍｌのＯＤＣＢ中に含む溶液へゆっくりと添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、次いで１４０℃で２時間撹拌した。溶液の色が黒から薄いピンク色へと変わった。混合物を室温へ冷却し、８，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、得られた少量の沈殿物を廃棄した。エタノールを残りの溶液へ添加し、次いで遠心分離を１４，０００ｒｐｍにて１５分間行った。ナノ粒子を分散−遠心分離を数回繰り返して洗浄し、過剰のオレイルアミンをナノ粒子の表面から除去した。最終的に、ナノ粒子を１０ｍｌのクロロホルム中に分散させた。

ＡｕＩＯＮ上へのＰＥＧコーティング
周知のチオール−金化学を用いてＰＥＧをナノ粒子の表面へ結合させた。ＡｕＩＯＮをクロロホルムへ分散させた溶液へ、１００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨを添加し、混合物を２４時間室温で振盪撹拌し、次いで真空下でクロロホルムを除去した。ＰＥＧでコーティングされたＡｕＩＯＮは水性媒体中に可溶化することができた。しかしながら、１５０ｍＭのＮａＣｌをナノ粒子溶液へ添加した１２時間後には、ナノ粒子の一部に塩による凝塊形成が観察された。表面上のＰＥＧ密度を上げるため、ナノ粒子に２回目のＰＥＧ化プロセスを行った。ＰＥＧでコーティングされたＡｕＩＯＮを真空乾燥したもの（クロロホルム蒸発後）をメタノール中に分散させ、５０ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨを添加した。溶液を２４時間振盪混合した。一晩透析（分画分子量１０，０００）してメタノールを水と交換した。ナノ粒子は水性媒体中に容易に分散し、数ヶ月経っても沈殿物は観察されなかった。未結合のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨは限外濾過（ＭＷＣＯ ２０００００；ポリスルホン膜、東洋濾紙株式会社、東京、日本）により除去した。

ＰＥＧ化されたγ−Ｆｅ ₂ Ｏ ₃ コア／Ａｕシェルナノ粒子（ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ）の物理化学的特性決定
紫外・可視スペクトルは、石英キュベットを用いて紫外−可視−近赤外分光計（Ｖ−５７０、日本分光株式会社、八王子、東京、日本）にて記録した。ナノ粒子の形態およびサイズ分布は、透過型電子顕微鏡観察（Ｈ−７０００、日立製作所、東京、日本）により加速電圧１００ｋＶにて記録した。ＴＥＭサンプルは、異なる溶剤中のナノ粒子を１滴（１０μｌ）炭素コーティングされた４００メッシュＣｕグリッド上へ載せ、空気中で乾燥させることにより調製した。Ｘ線回折パターンは、ＭＡＣ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍ１８ＸＨＦ回折計を用い、２９３ＫにてＣｕ−Ｋα照射（λ＝１．５４０５６Å）を行い記録した。ＡｕＩＯＮ中のＡｕおよびＦｅの含量は、イオン結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、４５００、ヒューレット・パッカード社、パロアルト、カリフォルニア州、米国）により求めた。動的光散乱およびζ電位の測定は、２５℃にてマルバーン４７００システム上でＤＴＳ５００１セルを備えたゼータサイザーナノＺＳ機器を用いて行った。ポリマーのＡｕＩＯＮへの吸着量は、熱重量分析（ＴＧＡ）（ＥＸＳＴＡＲ６２００ ＴＧ／ＤＴＡ、セイコーインスツル社、千葉、日本）によって、窒素雰囲気下、加熱速度１０℃／分にて２５〜６００℃の温度範囲において測定した。ナノ粒子水溶液のプロトン緩和ｒ₂は、Carr-Purcell-Meiboom-Gill（ＣＰＭＧ）配列により２５℃で２５ＭＨｚのパルスＮＭＲ（ＪＮＭ ＭＵ２５Ａ、日本電子株式会社、昭島、日本）を用いて評価した。

癌細胞株および動物
動物実験プロトコルは全て、東京大学動物実験委員会の方針に従って行った。マウス大腸腺癌由来のＣ２６細胞株は、松村医師（国立がん研究センター東病院（柏、日本））より提供を受けた。ＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓腺癌細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国培養細胞系統保存機関；マナッサス、ヴァージニア州）より入手した。Ｃ２６およびＭｉａＰａＣａ−２細胞は、細口フラスコ中で、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ₂中にて培養した。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５〜６週齢）は、日本チャールス・リバー株式会社（東京、日本）より入手した。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（メス）の皮下にＣ２６細胞（１×１０⁶細胞、５０μＬ体積）を接種した。異種移植片は接種後１２日目に使用した。正常位の膵臓腫瘍は、ＭｉａＰａＣａ−２細胞（１×１０⁷細胞、５０μＬ体積）をヌードマウスの膵臓へ正常位で接種することにより作製し、増殖期に到達するまで２〜３週間生育した。肝転移腫瘍モデルは、ＭｉａＰａＣａ−２癌細胞（１×１０⁷細胞、５０μＬ体積）を腸間膜静脈へ注射することにより開発した。腫瘍を３週間生育し、適切な転移形成を肉眼で検出した。磁気共鳴画像法には、２０ｍｍ³を超える転移節を有するマウスを選択した。

生体内分布の検討
Ｃ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（メス、６週齢、ｎ＝５、日本チャールス・リバー株式会社）の腹部へ移植して担腫瘍マウスを作製した。腫瘍体積が１００ｍｍ³に達したら、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮを０．８ｍｇＡｕ／ｋｇの用量にて静脈内注射した。ナノ粒子を注射後、腫瘍および主要な器官（腎臓、肝臓、筋肉、脾臓）を０．２５、０．５、１、２、４、８および２４時間目に採取した。血液は下大静脈より採取し、ヘパリンを添加して遠心分離し、血漿を得た。血漿および全ての器官を王水中で分解し、蒸発させ、１Ｍ塩酸溶液中に再溶解してＩＣＰ−ＭＳ測定用サンプルを調製した。血漿および組織中のＡｕ濃度について曲線下面積（ＡＵＣ）を２４時間まで台形法則に基づいて算出した。

生体内ＭＲＩ
４．７Ｔスキャナー（ＩＮＯＶＡ２００、バリアン社、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いて腫瘍のＭＲ画像化を行った。生きているマウスのＴ₂強調ＭＲ画像の場合には、以下のパラメータを採用した：点分解能＝２３４×２３４μｍ、切片の厚さ＝２．０ｍｍ、ＴＥ＝６０ｍｓ、ＴＲ＝３０００ｍｓ、取得回数＝５。磁性ナノ粒子（ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮおよびフェリデックス（登録商標）、Ｆｅとして４５０μｇ）を担腫瘍マウスへ静脈内投与した後、腫瘍領域のＴ₂強調ＭＲ画像を異なる時点（例えば、注射前、注射後約５分、注射後４時間まで１５分おき）で撮影した。

組織学
切除したサンプルを一晩４％パラホルムアルデヒド中で固定し、次いでパラフィン包埋してヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色用に調製した。脱蝋して貼り付けた切片へ、鏡検用銀増感キット（キルケガード・ペリー・ラボラトリーズ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州、米国）を用いて切片の銀染色を行った。サンプルをオリンパス（東京、日本）ＡＸ８０顕微鏡を用いて観察した。

２．結果および考察
酸化鉄コア／金シェルナノ粒子（ＡｕＩＯＮ）の合成
図１に、本検討におけるＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの調製についての模式図を示す。ナノ粒子の合成は、有機溶剤中高温にて２工程連続で行い、その結果、サイズ、結晶性および磁気特性が制御された高度に単分散のナノ粒子が形成された。まず、平均直径が１０．５±１．６ｎｍのほぼ単分散のγ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子を合成するが、キャッピング剤であるオレイルアミンおよびオレイン酸（５：１）の存在下、好気条件下にて、既報の方法［²⁰］を若干改変してＦｅ（ＣＯ）₅を熱分解することにより合成した。形状の異なるγ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子が形成するのを避けるため、少量のオレイン酸を反応混合物へ添加した。γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子の結晶構造を、図２に示すように、Ｘ線回折測定により確認した。次の工程では、オレイルアミンが還元剤かつ安定化剤として機能する有機溶剤中で１４０℃にてＨＡｕＣｌ₄をオレイルアミンで還元することにより、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子の表面上へＡｕをコーティングした［¹⁸］。このようにして合成したオレイルアミンでコーティグされたＡｕＩＯＮは、さらなる修飾を行うための有機溶剤中に分散可能であった。

γ−Ｆｅ₂Ｏ₃表面上でのＡｕシェルの形成は、異なる媒体中におけるナノ粒子の紫外・可視分光法により確認した。図３に示すように、ＡｕＩＯＮは長鎖アルキルリガンドで保護されているため、ＡｕＩＯＮは有機媒体中では特徴的なプラズモン共鳴は何ら示さなかった。しかしながら、ＡｕＩＯＮを水性媒体中へ移した場合には、５１５ｎｍに吸収を有するプラズモン共鳴バンドが現れ、おそらく水中では比誘電率が変化するためと思われる。γ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子上でのＡｕシェルの形成は、図２に示すように、Ｘ線回折測定でも確認した。ＡｕＩＯＮのＸ線回折スペクトルからは、Ａｕのｆｃｃ格子構造からのブラッグ回折ピークの出現が明らかに見て取れる。デバイ−シェラーの式を用い、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃表面上のＡｕの厚さを１．３ｎｍと算出した。ＴＥＭによる検討（図４（Ａ、Ｂ））からは、Ａｕシェルをγ−Ｆｅ₂Ｏ₃ナノ粒子上へ沈着後に平均粒子径が１．５±０．６ｎｍ増加したことが明らかであり、これはＸ線回折ピークから算出されたＡｕの厚さと同程度である。

クロロホルム中でＰＥＧ修飾を行った後真空下で蒸発させるサイクルを１回行ったところ、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは水性媒体中に容易に溶解した。しかしながら、ナノ粒子を１２時間１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中でインキュベートした場合には凝塊形成が生じたことから、ナノ粒子表面上のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨのコーティングが不完全であることが示唆された（データ未掲載）。従って、ナノ粒子を２回ＰＥＧコーティングし、高密度のＰＥＧコーティングを達成した。透析によって水性媒体中へ移した後も、塩によるＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの凝塊形成は観察されなかったことから、ＡｕＩＯＮの表面周囲に明らかに高密度のＰＥＧ層が形成されたことが示唆された。０．０３％ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中で保存したＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは、顕著な凝集を示すことなく数ヶ月安定であった。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨで表面修飾した後水へ移したＰＥＧ−ＡｕＩＯＮのＴＥＭ画像（図４（Ｃ））からは、明らかな凝塊形成は認められなかった。さらにまた、１％リンタングステン酸でネガティブ染色したところ、ＡｕＩＯＮコアの周囲にＰＥＧコーティングが観察された。最終的に、ＰＥＧ層の厚さはＴＥＭより６．５±１．２ｎｍと求められた。

ＰＥＧでコーティングされた酸化鉄コア／金シェルナノ粒子（ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ）の合成と特性決定
ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは、図５の点線に示すように、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝生理食塩水中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定により測定したところ、４２ｎｍのＺ−平均流体力学的直径を示した。その結果、生理的環境下ではＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは凝集しないことが判明し、一方で、クロロホルム中に分散させたＡｕＩＯＮ（図５の実線、Ｚ−平均サイズが１３ｎｍ、ＰＤＩ０．０７１）と比較して流体力学的直径が２９ｎｍ増加したことが観察された。この増加は、酸化鉄コアを包囲するＰＥＧシェルの寄与と考えられる。ＤＬＳによる検討から求めたＰＥＧ層の厚さは、ＴＥＭによる検討（図４）で観察された厚さと比べて高い値である。これらの結果から、水中では一部のＡｕＩＯＮが凝集している可能性が判明した。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの水中でのζ電位は０．４９±０．１２ｍＶとニュートラルであり、ナノ粒子表面がＰＥＧ層によって完全に表面処理されていることが明らかとなった。１２．９ｎｍのＡｕＩＯＮの表面上に存在するＰＥＧ分子（分子量＝２ｋＤａ）の数は、Ｎ₂雰囲気下でのサンプルのＴＧＡ分析より約２５００と算出された。この表面被覆率は、ＰＥＧ１分子当たり０．２５ｎｍ²の占有面積に相当し、Ａｕナノ粒子表面上に結合したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨについて従来報告されている値（２．４２ｎｍ²）［²¹〜²²］よりも有意に低い。

溶液中のＮａＣｌ濃度の上昇に対するＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの分散安定性を、ＤＬＳを用いて評価した。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの流体力学的直径は、１．５ＭのＮａＣｌ濃度までは著しい変化は見られなかった（図６）。生理的条件下におけるＰＥＧ化ナノ粒子の安定性を調べるため、ＰＥＧ化ナノ粒子を１０％ウシ胎仔血清を含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中でｐＨ７．４、３７℃にて１２時間インキュベートし、次いで流体力学的直径を測定した（図７）。１２時間の間に流体力学的体積に変化は見られず、優れた粒子安定性が判明した。ナノ粒子は３〜１０のｐＨ範囲でも安定であった。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮをＴ₂ＭＲＩ造影剤として用いる可能性について調べるため、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの緩和ｒ₂を評価したところ、その値は１４９．３２ｍＭ^-1ｓ^-1（図８）と求められ、市販のＴ₂造影剤であるフェリデックス（登録商標）（デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子）と同程度であった。

ＡｕＩＯＮ上のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨコーティングは２段階で行い、確実にナノ粒子表面上に高密度のＰＥＧ層が形成するようにした。ＰＥＧの吸着を繰り返し行うプロセスが金表面上のＰＥＧ表面密度の増加に有意に寄与することは、既に報告されている［²³］。ＡｕＩＯＮのＡｕ表面上にＰＥＧコーティングを繰り返すこのプロセスを本検討に採用した。異なる溶剤（最初はクロロホルム、次いでメタノール）中でＰＥＧをＡｕＩＯＮへ繰り返し添加することにより、非常に高密度のＰＥＧ層がナノ粒子表面上に形成された。ＰＥＧコーティングの２回目のサイクルにメタノールを溶剤として用いる点は、ＰＥＧ化ナノ粒子の粒子径と分散度を制御する上でも非常に重要であることが判明した。ＡｕＩＯＮの２回目のＰＥＧコーティングを水中で行うと、流体力学的直径が大きく［６６．４±１２．２ｎｍ］、多分散度指数も高い低品質の粒子が得られた。一方、２回目のＰＥＧコーティングをメタノール中で行った後ナノ粒子を透析によって水性媒体中へ移すと、ナノ粒子系の流体力学的サイズ（約４０ｎｍ）を狭いサイズ分布で適切に制御できた。

ＰＥＧ化されたＦｅ ₂ Ｏ ₃ コア／Ａｕシェルナノ粒子の生体内分布
図９は、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮを静脈内投与した後の血漿中の金濃度を経時的に示したものである。血漿中の金濃度の測定からは、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮが静脈内投与後に安定して血漿区画中を循環し、２４時間経っても注射した用量の８％が観察されることが明らかである。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの血中循環が長くなったことに伴って、３７℃の生理的条件でのＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの安定性も当然高くなった（図７）。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの固形腫瘍および正常組織（肝臓、腎臓、脾臓および筋肉）中への蓄積も図９に示す。注目すべきことに、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは時間と共に固形腫瘍へ連続的に蓄積する一方、正常組織への蓄積はある程度制限されていた。

固形腫瘍への選択性を評価するため、注射後２４時間におけるＡｕ濃度−時間曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）と、腫瘍対正常組織のＡＵＣ比とを求めた（表１）。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは脾臓、腎臓および腎臓については１．０を超えるＡＵＣ_tumor／ＡＵＣ_organ比を示し、腫瘍に対する選択性が判明した（脾臓、腎臓および筋肉に対するＡＵＣ_tumor／ＡＵＣ_organの測定値はそれぞれ２．８４、１．２１および６７．２７）。これらのＡＵＣ_tumor／ＡＵＣ_organ比は、ステルス性の薬物担体［²⁴］の場合に観察される値と同程度である。しかしながら、ＡＵＣ_tumor／ＡＵＣ_liver比は０．９５であり、腫瘍への選択性は認められないことが分かる。ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの肝臓における生体内分布には、血液中を循環しているＰＥＧ−ＡｕＩＯＮが一部含まれていた。肝臓は、体内の血液量の約５分の１を有する。これらのＡＵＣ_tumor／ＡＵＣ_organ比は、ステルス性の薬物担体［²⁴］（生体適合性ポリマーで修飾された無機ナノ粒子としては当該文献中では依然として稀である）の場合に観察される値と同程度である。これらの結果から、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは明らかに、肝臓や脾臓といった器官に存在するＲＥＳへの取り込みが少ないことが示唆される。

生体内での腫瘍の画像化
動的生体内ＭＲＩに対するＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの効力について検討するため、腫瘍組織の画像化を行い、市販のＭＲＩ造影剤であるフェリデックス（登録商標）（デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子）と比較した。まず、マウス大腸腺癌（Ｃ２６）細胞を皮下に接種されたヌードマウスに生体内ＭＲＩを行った（図１０（ａ、ｂ））。Ｔ₂強調腫瘍部位におけるネガティブエンハンスメントはＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの注射の５分後から徐々に増加し、６６％の最大ネガティブエンハンスメントが注射後４時間で観察された（図１０（ａ）および図１１（ａ）、表２）。これに対し、フェリデックス（登録商標）は、４時間経っても腫瘍にネガティブエンハンスメントは見られなかったが（図１０（ｂ）および図１１（ａ）、表２）、これはおそらくＲＥＳでの非特異的な蓄積が高かったためと考えられる。

次に、膵臓癌の正常位モデルにおけるＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ系の効力を、ヒト膵臓癌由来のＭｉａＰａＣａ−２細胞株を用いて試験した。腫瘍領域のＴ₂強調ＭＲ画像を経時的に図１０（ｃ、ｄ）に示す。ナノ粒子の投与後わずか５分で顕著なネガティブエンハンスメント（約２５％）が観察され、投与後４時間経っても持続していたことから（図１０（ｃ）および図１１（ｂ）、表３）、腫瘍へ効率的にナノ粒子が蓄積することが実証された。対照実験では、同一の腫瘍モデルにおける経時的なＭＲ画像化に対するフェリデックス（登録商標）の効果を検討した。図１０（ｄ）および表３に示すように、フェリデックス（登録商標）は、投与後４時間経っても腫瘍のネガティブエンハンスメントは見られず、腫瘍への粒子の蓄積が乏しいことが判った。

肝転移モデルを用いた生体内ＭＲＩ
フェリデックス（登録商標）と比較したＰＥＧ−ＡｕＩＯＮ系の効力を、ＭｉａＰａＣａ−２細胞株を用いた肝臓への転移巣を示すモデルで試験した。腫瘍領域のＴ₂強調ＭＲ画像を経時的に図１２（Ａ、Ｂ）に示す。ナノ粒子の投与後わずか５分で顕著なネガティブエンハンスメント（約２５％）が観察され、投与後４時間経っても持続していたことから（図１２Ａ）、腫瘍へ効率的にナノ粒子が蓄積することが実証された。一方、フェリデックス（登録商標）は、投与後４時間経っても腫瘍のネガティブエンハンスメントは見られず、腫瘍への粒子の蓄積が乏しいことが判った。

肝臓内の転移巣でのＰＥＧ−ＡｕＩＯＮの蓄積をさらに検証するため、肝臓内の転移巣のＨＥ染色と銀染色を行って金（褐色に染まる）を検出した。図１３（ＡおよびＢ）には、肝臓内の転移巣のＨＥ染色を示した。図１３（Ｃ）に示すように、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮを投与した場合、肝臓内の転移巣が金に対してポジティブ染色されたことが明らかである（図１３（Ｂ）に示したＨＥ染色と同一の切片）。金の存在はＭＲＩの結果と一致した。血管周囲に金が観察された。

３．結論
本検討では、５０ｎｍ以下のサイズに制御され、高密度のＰＥＧブラシでコーティングされたＡｕＩＯＮが、腫瘍を標的とする生体分子を結合させなくても、膵臓腫瘍を含む様々な腫瘍のＭＲＩ造影剤として使用できることが実証された。高いＰＥＧ密度に加えて比較的小さな流体力学的直径のため、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮは循環が長くなった。ＭＲ画像からは、ＰＥＧ−ＡｕＩＯＮがＥＰＲ効果によって膵臓モデルへ蓄積することが明らかとなった。これらの結果から、ナノ粒子の構造および表面特性を適切に制御することで、細胞を標的とするリガンドを結合させなくても、処理の難しい腫瘍（例えば、膵臓癌）を診断するのに有効なＭＲＩ造影剤を開発することが可能であると考えられる。磁性ナノ粒子上にＡｕシェルが存在することで、バイオマーカーを標的としたイメージング用に各種生体分子での表面修飾が可能となるだけでなく、Ｘ線断層撮影［²⁵〜²⁶］（ＣＴ）や表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）［²⁷］といった各種技術による別の検出様式も提供される。ナノ粒子の医学研究の最終目標は、生物学的事象（例えば、癌転移）を検出・治療するための、そして生物学的事象を細胞・分子レベルでリアルタイムに可視化するための、高性能ナノ粒子系を開発することであり、担腫瘍患者の予後をより良好にすることに繋がる。

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[20] J.W. Cheon, N.J. Kang, S.M. Lee, J.H. Lee, J.H. Yoon, S.J. Oh, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1950.
[21] S. Takae, Y. Akiyama, H. Otsuka, T. Nakamura, Y. Nagasaki, K. Kataoka, Biomacromolecules 2005, 6, 818.
[22] W.P. Wuelfing, S.M. Gross, D.T. Miles, R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12696.
[23] K. Uchida, H. Otsuka, M. Kaneko, K. Kataoka, Y. Nagasaki, Anal. Chem. 2005, 77, 1075.
[24] H. Cabral, N. Nishiyama, K. Kataoka, J. Control. Release 2007, 121, 146.
[25] Q.Y. Cai, S.H. Kim, K.S. Choi, S.Y. Kim, S.J. Byun, K.W. Kim, S.H. Park, S.K. Juhng, K.H. Yoon, Investigative Radiology 2007, 42, 797.
[26] D. Kim, S. Park, J.H. Lee, Y.Y. Jeong, S. Jon, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 7661.
[27] X. Qian, X.H. Peng, D.O. Ansari, Q. Yin-Goen, G.Z. Chen, D.M. Shin, L. Yang, A.N. Young, M.D. Wang, S.M. Nie, Nat. Biotechnol. 2008, 26, 83.
[28] 特開２００８−２６６２１４号公報

Claims (20)

1. コアとして磁性酸化鉄粒子、前記磁性酸化鉄粒子上に金シェル、そして前記金シェル上にポリ（アルキレングリコール）コーティングを含む複合粒子であって、前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．０５〜１．０ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、前記複合粒子。
2. 前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．１２５〜０．７ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、請求項１に記載の複合粒子。
3. 前記ポリ（アルキレングリコール）が前記金シェルへ０．２〜０．４ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて結合している、請求項１に記載の複合粒子。
4. 平均直径が６０ｎｍ以下である、請求項１に記載の複合粒子。
5. 平均直径が１０〜５０ｎｍである、請求項１に記載の複合粒子。
6. 平均直径が１５〜４０ｎｍである、請求項１に記載の複合粒子。
7. 前記磁性酸化鉄が、Ｆｅ₃Ｏ₄、γ−Ｆｅ₂Ｏ₃、ＭｎＦｅ₂Ｏ₃およびフェライトからなる群より選択される一つである、請求項１に記載の複合粒子。
8. 前記ポリ（アルキレングリコール）が、ポリ（メチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）からなる群より選択される一つである、請求項１に記載の複合粒子。
9. 前記ポリ（アルキレングリコール）分子が、チオール−金カップリングによって前記金分子に結合している、請求項１に記載の複合粒子。
10. 前記ポリ（アルキレングリコール）の平均分子サイズが５００〜５０００ダルトンの範囲である、請求項１に記載の複合粒子。
11. 脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌からなる群より選択される複数種の癌のネガティブエンハンスメントをもたらす、請求項１に記載の複合粒子。
12. 膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、脳腫瘍および卵巣癌からなる群より選択される複数種の癌を診断する方法に使用するための、請求項１に記載の複合粒子。
13. 請求項１に記載の複合粒子を製造する方法であって：
    金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程；および
    ポリ（アルキレングリコール）コーティングを前記金シェル上へ０．０５〜１．０ｎｍ²／ポリ（アルキレングリコール）分子の密度にて適用する工程、
    を含む、前記方法。
14. 前記金シェルの前記磁性酸化鉄粒子上への適用を、前記磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、ＮａＢＨ₄、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択される還元剤とを含有する溶液中において前記金錯体を還元することにより行う、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポリ（アルキレングリコール）コーティングの前記金シェル上への適用を少なくとも１回繰り返す、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ポリ（アルキレングリコール）分子が、チオール−金カップリングによって前記金分子に結合している、請求項１３に記載の方法。
17. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合粒子を含む、ＭＲＩ造影剤。
18. 前記複合粒子が、ＮａＣｌ濃度０〜１．５Ｍの溶液中で６０ｎｍ以下の平均直径を維持する、請求項１７に記載のＭＲＩ造影剤。
19. 癌の診断方法であって：
    請求項１７に記載のＭＲＩ造影剤を被験体へ投与する工程；
    ＭＲＩシステムを用いて前記被験体の磁気共鳴画像を取得する工程；および
    前記磁気共鳴画像から腫瘍組織を検出する工程、
    を含む、前記方法。
20. 前記磁気共鳴画像がＴ₂強調ＭＲＩである、請求項１９に記載の方法。