JP2013525270A

JP2013525270A - １，４，７−トリアザシクロノナンのコンジュゲート、斯かるコンジュゲートの二核金属錯体、並びに１，４，７−トリアザシクロノナン及びコンジュゲートの双方の使用の方法

Info

Publication number: JP2013525270A
Application number: JP2013500088A
Authority: JP
Inventors: アール．バーケルマントーマス; マーティンリサンドラ; ジョーンズリアノン; ウォーカー，ザセカンドジョン
Original assignee: バイオ−ラッドラボラトリーズ，インコーポレイティド
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2013-06-20
Also published as: AU2011227637B2; EP2547666A4; WO2011115802A1; US20120058565A1; US9274103B2; CA2793179A1; US20140057293A1; EP2547666B1; AU2011227637A1; US9689840B2; CA2793179C; EP2547666A1; US20160223491A1; US8536162B2; CN102858756A

Abstract

１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンと様々なコンジュゲーティングメンバーを含むコンジュゲートは、リン酸エステルと結合する二核金属錯体の形成に用いられる。それらのコンジュゲートを形成した形態により、錯体は、クロマトグラフィーメディア、アフィニティー結合試薬、及び染料に組み込まれ、それは、アッセイ、分離、及び精製の広い範囲において有用な錯体を形成する。加えて、コンジュゲートを形成していない１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンの二核金属錯体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、又は染料置換により生物学的種のリン酸エステルの検出に有用である。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／３１４，４３１号、及び２０１０年７月２７日に出願された同第６１／３６８，１０６号の利益を主張する。斯かる仮特許出願の双方の内容は、参照により本明細書に援用される。

発明の背景
リン酸化及び脱リン酸化は、生理学的システムにおいて代謝的に重要な反応である。これらの反応は、特定のタンパク質のヒドロキシル基において、特定の他のタンパク質の窒素原子において、及びさらに多くのタンパク質のカルボキシル基において生じ、いずれの場合にも、インビボで、これらのタンパク質の活性及び機能に影響を与える。特定のリン酸化／脱リン酸化反応は、タンパク質キナーゼ及びホスファターゼにより仲介され、それらの発生は、これらの酵素の活性の指示を与える。リン酸化／脱リン酸化反応における異常は、細胞発癌、アレルギー性疾患、及びアルツハイマー病に関与する。タンパク質リン酸化は、シグナル伝達、アポトーシス、増殖、分化、及び代謝のための、全ての生細胞における必須のプロセスである。タンパク質のリン酸化状態の測定のための方法は、従って、疾患の分子的起源の探索、及び新規薬物の設計において、価値がある。

二つの金属イオンを含む特定の金属酵素は、脱リン酸化反応、特にリン酸ジエステルの加水分解を触媒することが知られている。これらの反応により生じる機構の研究は、二金属錯体を形成し、同一の触媒機能を果たす合成有機リガンドの使用を伴う。これらの合成リガンドの多くは、水への溶解性が低いことが分かっており、しかしながら、実験室研究におけるそれらの有用性は限られる。この障害を取り除くために、水溶性リガンドである１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンは、開発されている。このリガンドのＺｎ（ＩＩ）錯体、及びＲＮＡの加水分解におけるその使用の開示は、Iranzo, O., et al., “Cooperativity between Metal Ions in the Cleavage of diester phosphate and RNA by Dinuclear Zn(II) Catalysts,” Inorganic Chemistry 42(24), 7737-7746 (2003)、及び Iranzo, O., et al., “Physical and Kinetic Analysis of the Cooperative Role of Metal Ions in Catalysis of Phosphodiester Cleavage by a Dinuclear Zn(II) Complex,” J. Am. Chem. Soc. 125(7), 1988-1993 (2003)により公開されている。この分子、及びそれがリン酸エステルと形成する遷移状態の更なる研究は、Yang, M.-Y., et al., “Substrate specificity for catalysis of phosphodiester cleavage by a dinuclear Zn(II) complex,” Chem. Commun. 2003, 2832-2833、及び Yang, M.-Y., et al., “A transition state analog for phosphate diester cleavage catalyzed by a small enzyme-like metal ion complex,” Bioorganic Chemistry 35, 366-374 (2007)により報告されている。

発明の概要
一部においては、本発明は、様々なコンジュゲーティングメンバーを含む、置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンのコンジュゲートに属し、それぞれのコンジュゲートは、上記の報告に開示される錯体と同様の様式で二金属錯体を形成することができる。本発明はまた、官能基化された、置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンに属し、その官能基は、コンジュゲーティングメンバーと反応性を有する。置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンは、便宜のために、「リガンド」と称され、コンジュゲートは、後述のように様々な更なる機能の一つを果たすコンジュゲーティングメンバーとコンジュゲートを形成するこれらのリガンドである。本発明は、更に、これらのコンジュゲートの二核金属錯体、及びリン酸ジエステルの加水分解以外におけるこれらの錯体の様々な使用に属する。これらの錯体の有用性は、二つの金属イオンのリン酸結合活性と共に、コンジュゲートの形成に用いられる特定のコンジュゲーティングメンバーに起因する。

本発明は、更に、リン酸エステルの正に帯電した二核金属錯体を形成する好適なマトリックスにおいてサンプルと斯かる錯体を混合することにより、リガンドの二核金属錯体、又はリガンドのコンジュゲートの二核金属錯体のいずれかを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型）質量分析により、サンプル中のリン酸エステルを検出するための方法に属する。質量分析スキャンが、サンプル及びマトリックスに対して実行される場合、錯体を形成していない成分と、サンプル中のリン酸エステルの正に帯電した二核金属錯体との識別は、錯体中のリガンドにより与えられる付加質量、及び錯体の帯電における変化のために、増加する。コンジュゲートを形成していないリガンドは、本発明のこの態様において、特に対象となる。

本発明のなお更なる態様は、リガンドの二核金属錯体、又はリガンドのコンジュゲートの二核金属錯体のいずれかを再び用いて、色素置換によりサンプル中のリン酸エステルを検出するための方法に属する。本発明のこの態様では、二核金属錯体は、二つの主要な特徴−（１）色素体化合物は、金属帯電リガンド（又はリガンドのコンジュゲート）とリン酸エステルが有するよりも低い親和性を有する、即ちリン酸エステルは、リガンドとより強く結合し、接触した場合に錯体中の色素体化合物を置き換える；及び（２）色素体化合物は、結合の場合に、未結合の場合と異なる吸収又は蛍光スペクトルを有する、を有する色素体化合物との錯体を更に形成する。この記述を満たす色素体染料の一つの例は、ピロカテコール・バイオレットである。リン酸エステルによる錯体からの色素体化合物の置換の結果として生じるスペクトル変化は、従って、サンプル中のリン酸エステルの存在の指標として機能する。本発明のこの態様ではまた、コンジュゲートを形成していないリガンドの使用も、特に対象となる。

発明の実施形態の詳細な説明
置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンであるリガンドは、一般式（Ｉ）：

により表される。

式（Ｉ）では、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、Ｈ又は低級アルキル基のいずれかである。表現「低級アルキル」とは、６個以下の炭素原子のアルキル基として定義される。Ｒ¹〜Ｒ⁶の好ましい基は、Ｈ、Ｃ₁〜Ｃ₃アルキルのいずれかである、又はＨ及びＣ₁〜Ｃ₃アルキルから選択される組み合わせであり、最も好ましくはＨである。本明細書において用語「置換された」とは、１又は２以上のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨ原子ではなくアルキル基であることを表す。

コンジュゲートを形成していないとして本明細書で記述されるリガンドは、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶が同じ又は異なっており、それぞれがＨ又は低級アルキル基のいずれかであるものである。リガンドのコンジュゲートは、コンジュゲーティングメンバーを残りの構造につなぐ連結基を介して、コンジュゲーティングメンバーが、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶により示される任意の位置を占める式（Ｉ）のこれらの化合物である。コンジュゲーティングメンバーを表さない任意の斯かるＲ基は、上述のように、Ｈ又は低級アルキル基である。コンジュゲートについては、１又は２以上のＲ¹〜Ｒ⁶は、従って、−Ｌ−Ｒ⁷であり（Ｌは連結基を表し、Ｒ⁷はコンジュゲーティングメンバーである）、Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りの基（単数又は複数）は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、Ｈ又はＣ₁〜Ｃ₆アルキルのいずれかである。官能基化されたリガンドについては、１又は２以上のＲ¹〜Ｒ⁶は、−Ｌ’である（Ｌ’は、コンジュゲーティングメンバーとの反応性を有する、未反応の連結基を表す）。コンジュゲートとして、官能基化されたリガンドでは、Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りの基（単数又は複数）は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、それぞれＨ又はＣ₁〜Ｃ₆アルキルのいずれかである。好ましい官能基化されたリガンド又はコンジュゲートでは、Ｒ¹〜Ｒ⁶の一つのみがそれぞれ−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ⁷であり、さらに好ましいリガンド又はコンジュゲートでは、Ｒ⁵のみ、Ｒ⁶のみ、又はＲ²のみが−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ⁷である。−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ⁷により置き換えられないＲ¹〜Ｒ⁶基の中で、斯かる基は、好ましくはＨ、Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル、又はＨ及びＣ₁〜Ｃ₃アルキルから選択される組み合わせであり、Ｈが最も好ましい。コンジュゲーティングメンバーＲ⁷は、アクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、又は固体クロマトグラフィー支持体のいずれかである。連結基Ｌ’又はＬは、二つの結合部位を有する任意の従来のリンカーであり、その一つは、コンジュゲーティングメンバーＲ⁷と共有結合を形成し、他方は、式（Ｉ）の残り上の隣接する炭素原子と共有結合を形成する。連結基は、一般的に、使用可能な価数を満たすＨ原子に加えてＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される３〜３０原子を有し、環式の、非環式の、芳香族の、又は環式、非環式及び芳香族部分の組み合わせのいずれかである。連結基の例としては、アミンアルキル連結、アルケニル連結、アミド又はアミドを含む連結、エステル又はエステルを含む連結、及びエーテル又はエーテルを含む連結が挙げられる。Ｌ’について好ましい連結基は、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ₂、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ₂、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−ＣＯ₂Ｈ、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ₂、及び−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₁−Ｃ₄）−ＮＨ₂であり、−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ₂、−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ₂、及び−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ₂は特に好ましい。Ｌについて好ましい基は、（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−であり、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、及び−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−は特に好ましい。

Ｒ⁷はアクリルアミド基である場合、−Ｌ−Ｒ⁷は、好ましくは−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂、又は−（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂（式中、ｎは１〜６である）であり、
−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂、及び
−（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂
が最も好ましい。

特定にこの−Ｌ−Ｒ⁷がＲ⁵を置き換え、残りのＲが全てＨである場合、コンジュゲートは以下の式を有する。

コンジュゲーティングメンバーがアクリルアミドであるこの発明に従って、官能基化されたポリアクリルアミドゲルは、コンジュゲート及び二核金属錯体から形成され得る。これらのゲル中の官能基は、アクリルアミドを含むコンジュゲートの二金属錯体であり、得られたゲルは、タンパク質、ペプチド、又は核酸のリン酸モノエステルの、これらの種類の非リン酸化形態からとの電気泳動分離に用いられ得る。混合物中のタンパク質、ペプチド、又は核酸のリン酸モノエステルは、リン酸エステルとゲル上の二金属錯体官能基との相互作用のために、電気泳動の間、より遅く泳動される。混合物のリン酸化成分は、それにより、それらのリン酸化されていない同等物と区別され得る。官能基化されたゲルは、モノマー混合物中に二金属錯体を含むことにより形成され、それはまた、一般的に、官能基化されていないアクリルアミド、架橋剤、及び開始剤を含む。好適な架橋剤及び開始剤は、当該技術分野においてよく知られている。架橋剤の例としては、ビスアクリルアミド、及びエチレンジアクリレートが挙げられ、開始剤の例としては、リボフラビン、過硫酸アンモニウム、及びテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）が挙げられる。モノマーのポリマー化のための条件、及びモノマー混合物の様々な成分の濃度は、ポリアクリルアミドゲルの形成のための先行技術の手順に用いられるものと同様である。

この発明の実施において使用のための式（Ｉ）のリガンドの二核金属錯体は、式（ＩＩ）：

を有するものである。

式（ＩＩ）では、Ｒ¹〜Ｒ⁶は、上記に定義された通りであり、Ｍは、二価の金属である。二価の金属の好ましい群は、Ｃａ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、及びＣｕ（全て二価の形態）である。特に好ましい二価の金属は、Ｚｎ（ＩＩ）及びＭｎ（ＩＩ）である。

本発明の様々な方法において使用される場合、式（ＩＩ）の二核金属錯体は、式（ＩＩＩ）のリン酸結合錯体：

を形成する。

式（ＩＩＩ）では、Ｘは、ペプチド、タンパク質、核酸の残基、又はこの発明の錯体が本明細書で述べられる任意の様々な目的に適用される一般的な任意の種類である。

Ｒ⁷が蛍光染料である場合、染料は、生物学的種の標識に用いられるために知られている任意の様々な蛍光染料でもよい。例としては、

フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、

ローダミン誘導体、例えばテトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、ローダミン１０１（ＴｅｘａｓＲｅｄ）、及びローダミン１１０、

４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、及びそれらの誘導体、

ピレン及びピレン誘導体、例えば８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸、

ピリジルオキサゾール誘導体、

ダポキシル誘導体、

ウンベリフェロン、

１−アニリノ−８−ナフタリンスルホン酸、

３，６−ジスルホネート−４−アミノ−ナフタルイミド、

トリ−、ペンタ−、及びヘプタメチンシアニン染料、並びに

発光性遷移金属錯体、例えばトリス（２，２’−ビピリジンン）ルテニウム（ＩＩ）又はＩｒ（ＩＩＩ）のシクロメタル化された錯体が挙げられる。

Ｒ⁷がテトラメチルローダミンである場合、例えば、−Ｌ−Ｒ⁷は、好ましくは、

［式中、アスタリスクは、１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンと結合する部位を表す。］
である。このリンカー及び染料が、Ｒ⁵と置き換わり、Ｒ¹〜Ｒ⁴が全てＨである場合、得られるコンジュゲートは、式

を有する。

蛍光染料を含むコンジュゲートから形成されるこの発明に従って、二核金属錯体は、例えば、生体液のサンプル中、及び一般的なアッセイメディア中のリン酸エステル、例えばリンタンパク質を同定及び定量するためのゲル又はブロットの染色のために、用いられ得る。

Ｒ⁷がアフィニティー型結合メンバーである場合、斯かる結合メンバーの例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、及び抗体フラグメントが挙げられる。Ｒ⁷がビオチンである場合、−Ｌ−Ｒ⁷は、好ましくは、

［式中、アスタリスクは、１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンとの結合の部位を表す。］
である。この官能基が、Ｒ⁵と置き換わり、Ｒ¹〜Ｒ⁴が全てＨである場合、得られるコンジュゲートは、式

を有する。

Ｒ⁶がアフィニティー結合メンバーであるこの発明に従って、二核金属錯体は、固体支持体と結合した、さもなければ固体支持体上に固定化されたリンタンパク質、及び他のリン酸エステルの検出に有用である。アフィニティー結合対を形成する第二のアフィニティー結合メンバーと特異性的に結合するアフィニティー結合メンバーの能力は、錯体がリン酸エステルと結合する前又は後に、結合対を介してレポーター基と錯体との結合を可能にする。これは、アフィニティー結合メンバーとコンジュゲートを形成し得る任意の種類のレポーター基による検出を可能にする。アフィニティー結合対は、よく知られており；例としては、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、及び任意の様々な抗体又は抗体フラグメントと抗原が挙げられる。レポーター基の例としては、放射性標識、化学発光標識、及び酵素が挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。アフィニティー結合メンバーを含む二核金属錯体の使用を説明するために、固体支持体、例えばその上にリン酸エステルが捕捉されるブロッティング膜は、錯体と最初に接触する。例えば、錯体上のコンジュゲーティングメンバーがビオチンである場合、支持体は、ストレプトアビジン−酵素コンジュゲートと接触する。続いて、支持体は酵素基質とインキュベーションされ、変化、ほとんどの場合、酵素により媒介される基質における変色は検出される。接触及びインキュベーションのための最適条件は、当業者に容易に理解される。

Ｒ⁷が固体クロマトグラフィー支持体である場合、用語「固体」は、半固体（例えばゲル）、可撓性固体（例えば膜及びフィルム）、並びに硬い固体（例えば非圧縮性のビーズ、顆粒、及びカラムの形成に用いられるもの又はチューブ壁）を含むものとして本明細書で用いられる。斯かる固体の例としては、ポリアクリルアミド、架橋されたシリコンポリマー、シリカゲル、アガロース、ポリビニルアルコール、セルロース、及びニトロセルロースが挙げられる。この発明の二核金属錯体を含むクロマトグラフィー支持体は、精製又は濃縮の目的のために、液体、例えば生体液、アッセイメディア、又はリン酸化化合物を含む任意の液体から、リン酸化化合物（リン酸エステル）を抽出するために用いられ得る。

この発明に従って、コンジュゲートは、１又は２以上の保護された二級アミン基、又は好適な保護基を含む１，４，７−トリアザシクロノナン誘導体で開始する従来の方法により、又は１，４，７−トリアザシクロノナン三環式オルトアミドの形成により、調製され得る。適切な官能基は、選択的に、１又は２以上の未保護のＲ¹〜Ｒ⁴位置に置かれ得る。適切な官能基はまた、三つの炭素鎖を含む各大員環からの一つの環窒素を連結することにより、二つの１，４，７−トリアザシクロノナン基と結合する適切な合成中間体の選択により、Ｒ⁵位置に置かれ得る。官能基の選択は、連結基の選択、及び連結基が結合する様式により変更され得、斯かる結合は、当該技術分野において知られている連結反応の任意の広い範囲で達成可能である。官能基の顕著な例は、コンジュゲーティングメンバーに結合しているアミン官能基と反応し得るカルボン酸又はカルボン酸のエステル、活性カルボン酸エステル又は酸塩化物と反応し得るアミン基であり、双方ともにアミド結合の形成をもたらす。カルボン酸で官能基化されたリガンドと、アミンを含むコンジュゲーションパートナーとの反応は、当該技術分野で知られているように、直接的に、又は活性化酸、例えば酸塩化物、酸無水物、又はスクシンイミジルエステルの存在下で、容易に達成される。アミン官能基化されたリガンドと、活性化エステル又は酸塩化物を含むコンジュゲーションパートナーとの反応は、当該技術分野で知られているように、容易に達成される。

官能基化されたリガンドの調製は、メチルエステルが、Ｒ⁵を占め、他の全てのＲ基がＨであるリガンドにより説明される。斯かる調製の例としては、１，４，７−トリアザシクロノナンで開始され、ジメチルホルムアミドジメチルアセタールと反応し、１，４，７−トリアザシクロノナン三環式オルトアミドを形成し、それはその後メチル３，５−ジブロモレブリネートと反応し、メチル３，５−ビス（４−ホルミル−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−４−オキソペンタノアートを形成するものが挙げられる。後者は、その後水素化ホウ素ナトリウムと反応し、メチル３，５−ビス（４−ホルミル−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−４−ヒドロキシペンタノアートを形成し、それはその後、塩酸と反応し、メチル４−ヒドロキシ−３，５−ジ（１，４，７−トリアゾナン−１−イル）ペンタノアートを生成する。この一連の反応は、いかに示される：

分子上の他の位置においてメチルエステル基を置き、更なる置換基と共に官能基化されたリガンドを得るための手順のバリエーションは、有機化学合成分野における当業者に明らかである。一つの例は下記に示され、それは、アミン基を置き、二つのＮ原子においてブトキシカルボニル基で保護された１，４，７−トリアザシクロノナンで開始し、１，３−ジブロモ−２−プロパノールと反応し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル７−（３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７−トリアゾナン−１，４−ジカルボキシレートを形成する（ステップ１）。独立して、未保護の１，４，７−トリアザシクロノナンは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタールと反応し、対応する三環式構造を形成し、それはその後、ｔｅｒｔ−ブチル（２−ブロモエチル）カルボマートと反応し、加水分解され、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−ホルミル−１，４，７−トリアザノン−１−イル）−３−）１，４，７−トリアゾナン−１−イル）エチルカルボマートを得る。二つの生成物は、その後反応し、１−（４−（２−アミノエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−３−（１，４，７−トリアゾナン−２−イル）プロパン−２−オールを形成し、続いて脱保護される（ステップ３）。

更なる例は、下記に示され、Ｎ−（３−ブチニル）フタルアミドのＮ−（３−オキソブチル）フタルアミドへの水和で開始する。これに続き、臭素、その後ウィッティヒ試薬、その後ペルオキシ酢酸、その後二つのＮ原子において保護されている１，４，７−トリアザシクロノナンと反応し、続いて脱保護され、２−（１，４，７−トラゾナン−１−イル）メチル）−４−１−（１，４，７−トリアゾナン−１−イル）ブタン−２−オールを形成する。

本発明に使用のためのリガンド又はコンジュゲートのいずれかの錯体形成は、リガンドで、コンジュゲーションの前の官能基化されたリガンドで、又はコンジュゲート自身上で行なわれ得る。いずれにしても、錯体形成は、金属の適切な塩、例えばＺｎ（ＮＯ₃）₂（Ｚｎ錯体は形成される）と、適切なモル比において、リガンドの臭化水素酸又は塩酸塩と結合し、ｐＨを６．５〜７．０に調整することにより、達成され得る。

本明細書に添付の特許請求の範囲において、用語「一つの（ａ）」又は「一つの（ａｎ）」は、「１又は２以上」を意味することを意図する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びそれらのバリエーション、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ステップ又は要素の列挙に先立つ場合、更なるステップ又は要素の付加が任意であり、排除されないことを意味することを意図する。全ての特許、特許出願、及びこの明細書において引用される他の公開されている参照材料は、これによりそれらの全体において参照により本明細書に援用される。本明細書で引用される任意の参照材料又は一般的な任意の先行技術と、この明細書の明示的な教示との間の任意の矛盾は、この明細書の教示を尊重して解決されることを意図する。これは、語又は語句の当該技術分野で理解されている定義と、同一の語又は語句の明細書で明示的に提供される定義との間の任意の矛盾を含む。

Claims

以下の式を有する化合物

［式中、
１又は２以上のＲ¹〜Ｒ⁶が−Ｌ’であり、Ｌ’がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるコンジュゲーティングメンバーと反応性を有する連結基であり、前記化合物と前記コンジュゲーティングメンバーとのコンジュゲートを形成し；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される］。
Ｌ’が−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ₂、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ₂、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−ＣＯ₂Ｈ、−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ₂、及び−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₁〜Ｃ₄）−ＮＨ₂からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
Ｌ’が−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ₂、−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ₂、及び−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ₂からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
以下の式を有する化合物

［式中、
１又は２以上のＲ¹〜Ｒ⁶が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｌが連結基であり、Ｒ⁷がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される］。
Ｒ⁵が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁵が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ²が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
Ｒ²が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁶が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁶が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｌが、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
Ｌが、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、及び−Ｃ₂Ｈ₅−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁷がアクリルアミド基である、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁵が−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁵が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁶が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵がＨである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁷が蛍光染料である、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁷がビオチンである、請求項４に記載の化合物。
Ｒ⁷が固体クロマトグラフィー支持体である、請求項４に記載の化合物。
以下の式を有する化合物

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶のうちの一つが−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｌが連結基であり、Ｒ⁷がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］。
ＭがＣａ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、及びＣｕからなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
ＭがＺｎ及びＭｎからなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁵が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁵が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ²が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ²が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁶が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁶が−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁵がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｌが、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル）−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
Ｌが、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、及び−Ｃ₂Ｈ₅−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁷がアクリルアミド基である、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁵が−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁵が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁶がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ²が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁶がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁶が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵がＨである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁷が蛍光染料である、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁷がビオチンである、請求項２１に記載の化合物。
Ｒ⁷が固体クロマトグラフィー支持体である、請求項２１に記載の化合物。
リン酸化種の電気泳動に使用のための分離メディアの調製のための方法であって、アクリルアミド、架橋剤、開始剤、及び以下の式を有する化合物

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶のうちの一つが−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｌは連結基であり、Ｒ⁷はアクリルアミド基である；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
を含むモノマー混合物をポリマー化することを含む、方法。
固体支持体上に固定化された、又はゲル中のリン酸化された化合物を蛍光染料で染色する方法であって、前記固体支持体又はゲルと、以下の式を有する化合物

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶のうちの一つが−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｌは連結基であり、Ｒ⁷は蛍光染料である；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
とを接触させることを含む、方法。
固体支持体上に固定化された、又はゲル中のリン酸化された化合物を検出するための方法であって、
（Ａ）前記固体支持体又はゲルと、以下の式を有する化合物

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶のうちの一つが−Ｌ−Ｒ⁷であり、Ｌは連結基であり、Ｒ⁷は第一の結合メンバーである；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
とを接触させ、
（Ｂ）（Ａ）に続いて、前記固体支持体又はゲルと、（ｉ）アフィニティー型結合を介して接触する場合、前記第一の結合メンバーと結合する第二の結合メンバーと（ｉｉ）レポーター基とのコンジュゲートとを接触させること
を含む、方法。
溶液からのリン酸化種の抽出のための方法であって、固体支持体とコンジュゲートを形成した以下の化合物

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶のうちの一つが−Ｌ−^*であり、Ｌは連結基であり、^*は前記固体支持体との結合部位であり；
Ｒ¹〜Ｒ⁶の残りが、独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
を含む抽出媒体に前記溶液を通過させることを含む、方法。
サンプル中のリン酸エステルを検出する方法であって、
（Ａ）前記サンプルと以下の式の化合物：

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、
Ｍが二価金属である］
の混合物を形成し、前記サンプル中に存在する任意の斯かるリン酸エステルと前記化合物の錯体を形成し、
（Ｂ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析により、前記混合物をスキャンし、前記錯体を検出し、及びそれにより、前記サンプル中の前記リン酸エステルをリン酸エステル以外の前記サンプル中の種と区別すること、
を含む、方法。
染料置換によりサンプル中のリン酸エステルを検出する方法であって、
（Ａ）前記サンプルと、金属帯電リガンドと色素体化合物の錯体との混合物を形成し、
ここで前記金属帯電リガンドは、以下の式：

［式中、
Ｒ¹〜Ｒ⁶が独立してＨ及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、
Ｍが二価金属である］
を有し、前記色素体化合物は、前記金属帯電リガンドと第一の程度で結合親和性を有し、リン酸エステルは、前記金属帯電リガンドと第二の程度で結合親和性を有し、前記第一の程度は、前記第二の程度より低く、前記色素体化合物は、前記金属帯電リガンドと結合する場合に第一の発光スペクトル、結合していない場合に第二の発光スペクトルを有し、前記第一及び第二の発光スペクトルは互いと区別可能である、
（Ｂ）前記サンプル中の前記リン酸エステルの存在又は不存在の指標として前記混合物の発光スペクトルを検出すること
を含む、方法。