JP2013522251A - パルボウイルスをｈｄａｃ阻害剤と併用して使用する癌治療 - Google Patents

Abstract

（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）を含む医薬組成物、ならびに、癌、例えば、脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌の治療のための前記組成物の使用が記載される。

Description

本発明は、（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）を含む医薬組成物、ならびに、癌、例えば、脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌の治療のための前記組成物の使用に関する。

子宮頸癌は、世界で２番目に多い女性の悪性腫瘍であり、毎年２７０，０００人を超える死亡と５００，０００の新規症例の原因である。ある種のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、いわゆる高リスク型（例えば１６および１８型）が、子宮頚部発癌の原因物質である。高リスクＨＰＶからの２つのウイルス癌遺伝子、Ｅ６およびＥ７は、細胞の悪性化を担い、それらの継続的発現は、通常遺伝毒性物質または可溶性のデスリガンドにより活性化される細胞死経路の不活性化に関連する。放射線療法、化学療法および外科手術による従来の治療は、ＨＰＶに関連する癌腫に対して大部分は効果のないままであり、新しい治療戦略が緊急に必要である。最近開始された予防ワクチンは、ワクチン接種を通して感染の効果的な予防を達成する見込みは得られるが、子宮頸癌発生率の低下となるまでには数十年を必要とするであろう。

膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、最も致死的な胃腸悪性腫瘍の１つである。ＰＤＡＣは、北米において癌関連死亡例の４番目に多い原因であり、ヨーロッパでは６位、英国では５位である。この疾患は、現在利用できる治療に高度耐性化している。外科的切除が長期の生存に最も可能性をもたらすが、少数の患者においてのみ実現可能であり、リスクがないわけではない。外科手術が選択肢でない進行した疾患では、特にゲムシタビンまたは５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）を用いる化学療法が作用し始めるが、効果はそれでも中程度であり、常に高い一般毒性を伴う。ゲムシタビンは、局所進行性または転移性膵癌の患者のための一次治療としてＦＤＡに認可された。この薬物は、代謝拮抗剤クラスの細胞周期依存性のデオキシ−シチジン類似体であり、ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ｈＥＮＴ）によって細胞へ輸送され、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によってその活性三リン酸塩形態へリン酸化される。ゲムシタビン治療の重要な懸念は、この化学療法薬に対する耐性の発現にある。この耐性は、薬物の取り込み／リン酸化の低下、ならびに／またはＡＢＣ輸送体ファミリーメンバーＭＤＲおよびＭＲＰ１／２による細胞からの放出の増強に起因し得、活性化したゲムシタビンの細胞内プールの枯渇をもたらす。ゲムシタビンとその他の治療計画の併用が、耐性変異株を絶滅させることにより制癌効果を向上させるため、または化学療法の用量およびその後に続いて起こる毒性の低下を可能にするために調査されている。

ラットパルボウイルスＨ−１ＰＶおよびそのマウス相同体マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）を含む、げっ歯類パルボウイルスグループのいくつかのメンバーが、その制癌能で高い注目を集めている。実際に、これらのウイルスは、ヒトに対して非病原性であり、固有の腫瘍溶解特性および腫瘍抑制（ｏｎｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）特性を有する。その上、ヒト集団がいまだにＨ−１ＰＶ感染に曝されていない（ｐｒｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）という事実は、ウイルスに基づく治療の有効性が低いことの一般的な理由である、既存の抗ウイルス免疫の問題が、Ｈ−１ＰＶの場合には存在しないことを示す。そのために、ウイルスは投与後に患者の免疫系により直ちに除去されず、治療の実効時間を増加させる。

パルボウイルスゲノムは、非構造（ＮＳ１およびＮＳ２）タンパク質およびキャプシッド（ＶＰ１およびＶＰ２）タンパク質の発現をそれぞれ調節する２つのプロモーター、Ｐ４およびＰ３８を含有する、約５１００塩基の一本鎖ＤＮＡからなる。げっ歯類パルボウイルスは、いくつかの細胞死経路を活性化することが示されている。特に、細胞種および成長条件にもよるが、Ｈ−１ＰＶは、アポトーシス、壊死またはカテプシンＢ依存性細胞死を誘導する能力がある。

パルボウイルス複製および腫瘍崩壊は、悪性形質転換に付随する細胞変化によって刺激される。Ｈ−１ＰＶは、天然に、細胞培養と動物モデルの両方で、ヒト子宮頸癌由来の細胞株に対して抗悪性腫瘍活性を提示することを示すことができた。これらの結果は、癌腫に対するＨ−１ＰＶの治療可能性を明示する。しかし、パルボウイルスが、特定の例では、腫瘍を完全に根絶することができないか、その増殖を停止することができないことも述べるべきである。しばしば、耐性細胞が発生し、腫瘍再発の可能性をもたらす。さらに、ウイルスは腫瘍細胞において選択的に複製するが、正常細胞に侵入することもでき、治療に適したウイルスの量を減少させる。そのために、その腫瘍溶解活性を強化して、癌細胞を死滅させる際にパルボウイルスと協力して作用することのでき得るその他の物質を見出すことが大いに有利であろう。

要約すれば、残念ながら、ヒトにおいて試験した腫瘍溶解性ウイルスは、単剤療法プロトコールで使用された場合、単独で完全かつ永久的な腫瘍の根絶を誘導することに限られた成功を示した。腫瘍細胞の破片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、ウイルス治療を逃れ、腫瘍再発のリスクが増加する。パルボウイルスが増殖する腫瘍から単離されたという事実は、単独で、これらのウイルスもまた、必ずしも増殖を停止させるかまたは腫瘍性病変の完全な退縮を引き起こすのに十分なほど強力でないことを示す。そのために、さらなる有害な副作用なしに、癌細胞を効率的に死滅させる際にウイルスと作用することのでき得る薬物を見出すことが非常に望ましい。これらの薬剤は、（ｉ）その他の手段によってパルボウイルス耐性細胞を死滅させること、（ｉｉ）癌細胞をパルボウイルス細胞毒性に対してより高感受性にし、それによって効力を得るために必要なウイルス用量の低下を可能にすること、および／または（ｉｉｉ）薬物をより低い濃度で使用できるようにし、それにより安全性を向上させることによって治療の成果を改善することができ得る。

従って、本発明の目的は、改良されたパルボウイルスに基づく治療法のための手段を提供することである。

本発明によれば、これは、特許請求の範囲において定義される主題により実現される。本発明は、パルボウイルスとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）の併用治療により、治療効果が相乗的に改善され得るという出願人の知見に基づく。ＨＤＡＣＩｓは、構造上不均一な分子の群である。ＨＤＡＣＩｓ、すなわち酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）の致死未満量は、パルボウイルスの抗悪性腫瘍活性を、癌、例えば子宮頸癌由来のＨｅＬａ（ＨＰＶ−１８陽性）、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ（ＨＰＶ−１６陽性）および原発子宮頸癌細胞ならびに膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来のＡｓＰＣ−１およびＣａｐａｎ−１細胞株において相乗的な方法で強化することが見出された。ＨＤＡＣＩｓは、癌において発現停止している複数の遺伝子の転写を再活性化し、このようにしてそれらは癌細胞の増殖抑制、分化およびアポトーシスを誘導することができる。ＨＤＡＣＩで処理した子宮頸癌細胞ならびに膵管腺癌細胞は、Ｅ２Ｆ−標的遺伝子ｐ７３のアポトーシス促進性イソ型の強い誘導と相関するが、ｐ５３の再活性化に依存しないＥ２Ｆに媒介されるプロセスによってアポトーシスを受ける。さらに、パルボウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ−１）は、ＨＤＡＣＩｓによりアセチル化され、結果的にパルボウイルスの複製および細胞殺傷活性は高度に改善される。

よって、パルボウイルスは、癌、例えば前立腺腫瘍、肺腫瘍、腎腫瘍、肝腫瘍、リンパ腫、乳腺腫瘍、肝細胞腫または黒色腫および特に脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌を、ＨＤＣＡ阻害剤と併用して、好ましくは２段階プロトコールで治療するのに多大な治療可能性を有する。

要約すれば、パルボウイルスＨ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤は、癌、例えば子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ）および原発腫瘍細胞ならびに膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来細胞株（ＡｓＰＣ−１およびＣａｐａｎ−１）を死滅させる際に相乗的に作用することが実証され得る。これら２種類の薬剤間の協同作用は、致死未満量のＨＤＡＣ阻害剤を用いて起こり、それは正常な組織に対する望ましくない副作用のリスクを低下させる。併用療法は、Ｈ−１ＰＶ（およびその他の腫瘍溶解性パルボウイルス）を低い濃度で、その有効性に影響を及ぼすことなく使用することを可能にし得る。

Ｈ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤の子宮頸癌由来細胞株の相乗的死滅 ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８陽性細胞株）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６陽性）を、示されるＭＯＩでＨ−１ＰＶに感染させ、その後、ＨＤＡＣＩｓの存在下（黒色バー）または不在下（灰色バー）で増殖させた。試験したＨＤＡＣＩｓは、ＨｅＬａ細胞に関してＮａＢ（１ｍＭ）、ＴＳＡ（５０ｎＭ）およびＳＡＨＡ（５０ｎＭ）であり、ＳｉＨａ細胞に関してＮａＢ（２ｍＭ）、ＴＳＡ（１００ｎＭ）およびＳＡＨＡ（５００ｎＭ）であった。インキュベーション後、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより細胞溶解を評価した。バーの上の値（％で表示）は、得られる相互作用を示す。１つの代表的な実験の結果を示す。 Ｈ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤の子宮頸癌由来細胞の相乗的死滅 原発子宮頸癌細胞を、示されるＭＯＩでＨ−１ＰＶに感染させ、その後、ＨＤＡＣＩｓの存在下（黒色バー）または不在下（灰色バー）で増殖させた。試験したＨＤＡＣＩｓは、ＮａＢ（１ｍＭ）、ＴＳＡ（１００ｎＭ）およびＳＡＨＡ（２００ｎＭ）であった。インキュベーション後、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより細胞溶解を評価した。値（％）は、得られる相互作用を示す。１つの代表的な実験の結果を示す。 ＨＤＡＣ阻害剤によるＨ−１ＰＶ細胞毒性の増強 （Ａ）ｍｏｃｋ処理またはＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：１ｐｆｕ／細胞）感染ＨｅＬａ細胞のいずれかを、ＮａＢ（１ｍＭ）の存在下または不在下で増殖させた。４８時間後、フローサイトメトリーによるｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の分析のために細胞を回収した。ＮａＢとの併用治療（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、Ｈ−１ＰＶにより誘導されるｓｕｂ−Ｇ１細胞集団を増加させ、該化合物が癌細胞を死滅させる際にウイルスと相乗的に作用することを示す。

（Ｂ）各々三重反復で実施された３つの独立した実験の概要を示す。バーは、平均値＋／−相対標準偏差を表す。Ｐ＜０．０５、対応のあるスチューデントのｔ検定が示される（^＊＊＊）。
Ｈ−１ＰＶ／ＨＤＡＣ阻害剤の併用治療による、アポトーシスを受けている細胞の破片の増加 青色の線としてラベルされ、数字で示される、ｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の増加は、ＨＤＡＣ阻害剤がＨ−１ＰＶ細胞毒性を増強することを示す。 Ｈ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤による子宮頸癌由来細胞株の相乗的死滅。 子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ）および確立されていない子宮頸癌細胞培養（ＣｘＣａ）を、示されるＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）でＨ−１ＰＶに感染させ、ＶＰＡ（１ｍＭ）の存在下（灰色のバー）または不在下（白色のバー）で７２時間増殖させた。インキュベーション後、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより細胞溶解を評価した。各々の図表の右手側の斜線のバーは、単剤療法として癌細胞の９０〜１００％を死滅させることのできるＨ−１ＰＶの最小用量を示す。同様の細胞毒性は、それよりも低いウイルスＭＯＩで、Ｈ−１ＰＶと致死未満量のＶＰＡ（１ｍＭ）を組み合わせることにより得られ、両方の薬剤が癌細胞を死滅させる際に相乗的に協働することが示される。 Ｈ−１ＰＶ／ＶＰＡ併用治療によりもたらされるＨｅＬａ定着腫瘍の完全な退縮。 ５×１０^６ＨｅＬａ細胞を、５週齢の雌ヌードラットの右側腹に皮下注射した。５日後（腫瘍が２００〜４００ｍｍ^３の量に到達した時）、腫瘍を有する動物を４つの群に無作為化した（ｎ＝８）。群を、ＤＭＥＭ（対照）、ＶＰＡ（１００ｍｋ／ｋｇ）、Ｈ−１ＰＶ（総用量１．２５ １０９ｐｆｕ／動物、移植後５日、９日、１６日および２３日の４回の腫瘍内投与に分割）か、または両方の薬剤の組合せのいずれかで処理した。腫瘍容積を、示された日にデジタル式カリパスで測定し、次式に従って計算した：容積（ｃｍ^３）＝Ｌ×Ｗ×Ｈ（長さＬ、ｃｍ；幅Ｗ、ｃｍ、高さＨ、ｃｍ）。示したデータは、平均値を標準偏差バーとともに表す。 Ｈ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤によるＰＤＡＣ由来細胞の相乗的死滅。 ＡＰＣ−１およびＣａｐａｎ−１細胞を、９６ウェルプレート（２０００細胞／ウェル）に播種した。１６時間後、細胞を、示されるＭＯＩでＨ−１ＰＶに感染させ、ＶＰＡの存在下または不在下でさらに７２時間増殖させた。細胞溶解をＬＤＨアッセイにより測定した。

本発明は、（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ＨＤＣＡ阻害剤を、好ましくは別々の実体として、例えば別々の容器中に含有する医薬組成物を提供する。

好ましくは、前記医薬組成物中に、パルボウイルスおよびＨＤＣＡ阻害剤は、有効量で存在し、製薬上許容される担体と組み合わされている。「製薬上許容される」は、有効成分の生物活性の有効性を妨げない、かつ、それを投与する患者に対して毒性のないあらゆる担体を包含することを意味する。適した製薬担体の例は、当技術分野で周知であり、それには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳濁液、例えば油／水乳濁液など、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。かかる担体は、従来法により処方されてよく、有効量で被験体に投与され得る。

用語「パルボウイルス」は、本明細書において、その野生型または修飾された自己複製能をもつ誘導体、ならびに関連するウイルスあるいは、かかるウイルスまたは誘導体に基づくベクターを含む。適したパルボウイルス、誘導体など、ならびに前記パルボウイルスを活発に産生するために使用される細胞および治療に有用な細胞は、過度の実験労力なしに、本明細書中の開示に基づいて当分野の技術の範囲内で容易に決定できる。

「有効量」とは、疾患の経過および重篤度に影響を及ぼし、かかる病態の減少または緩解をもたらすために十分な有効成分の量をさす。これらの疾患または障害を治療および／または予防するために有用な「有効量」は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４６（（１９７５）参照）。

さらなる製薬上適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス剤、治療薬を含有する移植エレメント、または任意のその他の適したビヒクル、送達または分配手段または材料（類）を挙げることができる。

化合物の投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により達成することができる。投与経路は、当然、治療の種類および医薬組成物中に含まれる化合物の種類に依存する。好ましい投与経路は、静脈内投与である。パルボウイルスおよびＨＤＡＣＩの投与計画は、当分野の技術の範囲内で、主治医により、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与する特定のパルボウイルス、ＨＤＡＣＩなど、投与の時間および経路、腫瘍の種類および特徴、患者の全体的健康、ならびに患者が受けているその他の薬物治療を含む、患者データ、所見およびその他の臨床要因に基づいて容易に決定できる。

本発明に従うＨＤＡＣＩｓと併用したパルボウイルスが、血液脳関門を通過する能力をもつ感染性ウイルス粒子を含む場合、治療は、ウイルス、例えばＨ１ウイルスの静脈注射によって実施するか、少なくとも開始することができる。好ましい投与経路は、腫瘍内投与である。

長期の静脈治療は、ウイルスに対する中和抗体の形成の結果として非効率的となることに影響を受けやすいため、初期投与計画の静脈内ウイルス投与の後に様々な投与方法を採用してもよく、またはそのような異なる投与技法、例えば、頭蓋内または腫瘍内ウイルス投与を、パルボウイルス治療の全過程を通じて代わりに用いてもよい。

別の具体的な投与技法として、パルボウイルス（ウイルス、ベクターおよび／または細胞薬剤）を、患者に移植された放出源から患者に投与することができる。例として、例えば、シリコーンまたはその他の生体適合性材料のカテーテルを、腫瘍除去の間に、または別個の手順により患者に導入した小型の皮下リザーバ（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバ）に接続して、さらなる外科的介入を行わずにパルボウイルス組成物を様々な回数で局所的に注入することができる。パルボウイルスまたは由来ベクターはまた、定位手術法によるかまたはニューロナビゲーションターゲッティング技法により腫瘍に注入することもできる。

パルボウイルスの投与は、埋め込まれたカテーテルを通じて低流速で、適したポンプ系、例えば、蠕動式輸液ポンプまたは対流増加送達（ＣＥＤ）ポンプを用いて、ウイルス粒子またはウイルス粒子を含有する流体の持続注入により実施することもできる。

パルボウイルス組成物のさらに別の投与方法は、パルボウイルスを所望の癌組織に分配するよう構築および配置された埋め込み物品からの投与方法である。例えば、パルボウイルス、例えば、パルボウイルスＨ１を含浸させたウエハを用いることができ、該ウエハは外科的腫瘍切除の終わりに切除腔の端部に取り付けられる。複数のウエハをそのような治療的介入に用いることができる。パルボウイルス、例えば、パルボウイルスＨ１、またはＨ１ベクターを活発に産生する細胞を、腫瘍切除後に腫瘍または腫瘍腔に注入することができる。

本発明に従う併用療法は、癌、例えば前立腺腫瘍、肺腫瘍、腎腫瘍、肝腫瘍、リンパ腫、乳腺腫瘍、肝細胞腫または黒色腫、特に脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌の治療に有用であり、前記疾患の予後を著しく改善することができる。パルボウイルスＨ１感染は、腫瘍細胞の死滅をもたらすが、正常細胞に害を与えるものでなく、そのような感染は、有害な神経学的作用またはその他の副作用なく、腫瘍特異的治療を達成するために、例えば、適したパルボウイルス、例えば、パルボウイルスＨ１、または関連ウイルスまたはかかるウイルスに基づくベクターの大脳内使用により行うことができる。

また、本発明は、癌の治療のための（ａ）医薬組成物（類）の調製のための、（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ＨＤＡＣＩの使用に関し、この際、好ましくは、（ａ）および（ｂ）は、順次に（または別々に）投与される。

本発明の１つの好ましい実施形態では、薬剤の併用は、神経膠腫、髄芽細胞腫および髄膜腫などの脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌の治療において利用される。好ましい神経膠腫は、悪性ヒト神経膠芽腫である。

本発明のもう一つの好ましい実施形態では、組成物のパルボウイルスには、パルボウイルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）または関連パルボウイルス、例えば、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）またはラットウイルス（ＲＶ）が含まれる。

本発明に従う薬剤の併用により治療可能な患者としては、ヒトならびに非ヒト動物が挙げられる。後者の例としては、それに限定されないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、およびネコなどの動物が挙げられる。

本発明の目的に有用なＨＤＡＣＩｓには、腫瘍増殖の阻害に効果的なすべてのＨＤＡＣＩｓが含まれる。ＨＤＡＣＩの投与は、非経口および腸経路による全身投与を含む、多様な方法（上記参照）で達成することができる。好ましくは、パルボウイルスおよびＨＤＡＣＩは、別々の化合物として投与する。ＨＤＡＣＩおよびパルボウイルスの好ましい投与間隔は、−３０日（パルボウイルスでの治療の前のＨＤＡＣＩの投与）からパルボウイルスでの治療後６０日である。２つの薬剤の同時処置も可能である。

併用療法に適したＨＤＣＡＩｓの特定の例としては、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）またはバルプロ酸（ＶＰＡ）が挙げられる。

下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

材料および方法
（Ａ）ＨＤＡＣ阻害剤
酪酸ナトリウム（ＮａＢ）およびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミュンヘン、ドイツ国）より購入し、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびバルプロ酸（ＶＰＡ）は、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，レラハ、ドイツ国）より購入した。

（Ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ（ＬＤＨ）
パルボウイルス細胞毒性は、Ｐｒｏｍｅｇａ（マンハイム、ドイツ国）製のＣｙｔｏＴｏｘ９６キットを用いて培地中の乳酸デヒドロゲナーゼの放出を評価することにより測定した。感染前日、５０μｌの培地中の９６ウェルプレートに、ウェル当たり２０００個の細胞を播種した。２４時間後、細胞を、１条件当たり７反復で、５０μｌのＨ−１ＰＶを含有する血清フリー培地に感染させるか、またはＨＤＡＣ阻害剤で処理した。測定当日、７のうちの３つのウェルを、溶解バッファーで３０分間インキュベートして、１００％溶解の条件下での最大ＬＤＨ放出を見積もった。その後、プレートを遠心し、５０μｌの上清を基質ミックス（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘ）と混合した。ＬＤＨ酵素は、培地中で放出された酵素の量を示す比色反応を触媒する。３０分後、反応を停止させ、ＥｌｉｓａリーダーＭｕｌｔｉＳｃａｎを４９２ｎｍで用いて分析した。

（Ｃ）ｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の測定
ウイルス感染細胞または薬物処理細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で培養皿から収集し、ファルコンチューブに回収した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を２６０μｌのＰＢＳに再懸濁し、ボルテックス下で滴下した７００μｌの冷１００％エタノールで固定し、４℃で一晩貯蔵した。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼおよび１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ溶液に細胞ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液を濾過し、ＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。最小限の２０，０００イベントを獲得した後、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析した。

パルボウイルスＨ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤は、子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ）および原発腫瘍細胞を死滅させる際に相乗的に作用する。

致死未満量のＨＤＡＣＩｓ、すなわち酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、子宮頸癌由来ＨｅＬａ（ＨＰＶ−１８陽性）、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ（ＨＰＶ−１６陽性）および原発子宮頸癌細胞においてＰＶ細胞毒性を相乗的に増加させることが見出された。

図１は、試験した３種類のＨＤＡＣＩｓと組み合わせた様々なＨ−１ＰＶ感染多重度（ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞）を用いる、ＨｅＬａおよびＳｉＨａ細胞でのＬＤＨアッセイから得た結果を示す。同様の結果は、ＣａＳｋｉ細胞（データは示さず）および原発子宮頸癌細胞（ＣｘＣａ）（図２）においても得られ、約８０％の細胞死をもたらす最大９４％の相乗作用が、ＳＡＨＡ（２００ｎＭ）とＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ＝１００ｐｆｕ／細胞）を組み合わせることによって実現された。上述の癌細胞を死滅させる際の相乗作用は、パルボウイルスを別のＨＤＡＣＩ、すなわちＶＰＡと併用しても観察された（データは示さず）。

癌細胞を死滅させる際のＨ−１ＰＶとＨＤＡＣＩｓとの間の相乗作用を、ＨｅＬａおよびＣｘＣａにおいてフローサイトメトリーにより確認し、２Ｎ未満のＤＮＡ量を含有する細胞の画分（ｓｕｂ−Ｇ１細胞集団）を、アポトーシスを受けている細胞の共通する特徴である、ＤＮＡ断片化のマーカーとして分析した。図３は、ＨｅＬａ細胞で得られた結果を示す。Ｈ−１ＰＶ感染は、アポトーシスｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の増加に関連し、それはＮａＢの添加によりさらに増強される（１８％から３２％）。

図４は、原発子宮頸癌細胞で得られた結果を示す。Ｈ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤は、アポトーシスの増加（２６から３７％）により実証されるように、ＣｘＣａ細胞を死滅させる際に相乗的に作用する。Ｈ−１ＰＶ／ＨＤＡＣＩｓの併用が子宮頸癌由来細胞を死滅させる際に最大の相乗作用をもたらす条件を、表１に要約する。

パルボウイルスＨ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤は、インビトロ（ａ）およびインビボ（ｂ）で子宮頸癌由来細胞株および原発腫瘍細胞を死滅させる際に相乗的に作用する。

（ａ）インビトロ相乗作用。

致死未満量のＨＤＡＣＩｓ、すなわちバルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＨＰＶ−１８陽性）、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ（ＨＰＶ−１６により形質転換）および低継代子宮頸癌細胞培養においてＨ−１ＰＶ細胞毒性を相乗的に増強することが見出された。

図５は、１ｍＭ ＶＰＡと併用した、様々な感染多重度（ＭＯＩ、細胞あたりのプラーク形成単位［ｐｆｕ］で表す）のＨ−１ＰＶを用いる、ＬＤＨアッセイ（細胞溶解の指標として、培地中の乳酸デヒドロゲナーゼの放出を測定）から得た結果を示す。単独で適用した場合、ＶＰＡは、使用した濃度での細胞増殖にあまり効果がなかったが、パルボウイルスは、ＭＯＩ依存的な様式ですべての子宮頸癌細胞培養を死滅させた。致死未満量のＶＰＡは、パルボウイルス誘導性の細胞殺傷を相乗的に後押しし、５０〜１００％まで増加させた。これらの結果の確認は、アポトーシスｓｕｂ−Ｇ１細胞集団のフローサイトメトリーによる測定（データは示さず）により得た。同様の結果は、Ｈ−１ＰＶをＮａＢ、ＴＳＡまたはＳａＨａと組み合わせることによっても得られた（表２）。

（ｂ）インビボ相乗作用
Ｈ−１ＰＶ／ＨＤＡＣＩｓ相乗作用をインビボで検証するために、ＨｅＬａ異種移植ヌードラットモデルを使用した。Ｈ−１ＰＶ単独は、高いウイルス用量を投与した場合に（２．５×１０^９ｐｆｕ／動物、１週間間隔で４回の腫瘍内投与に分割）、確立された腫瘍の完全な退縮を実現することができた（データは示さず）。それよりも低いウイルス用量の１．２５×１０^９（ｐｆｕ／動物、上記と同様に分割）では、腫瘍増殖は鈍化し、退縮は起こらなかった、これは、治療効果を得るためには、臨界用量のウイルスが必要であることを示す。１００ｍｇ／ｋｇの濃度で、ＶＰＡは、腫瘍増殖を損なうことができず、これはｍｏｃｋ処理対照に匹敵した（ラットは腫瘍が最大許容サイズの５ｃｍ^３に達した時に犠牲にした）。対照的に、動物にそれよりも低い量のウイルスを注入しＶＰＡと併用処置した（ｃｏ−ｔｒｅａｔｅｄ）場合には、腫瘍増殖は著しく低下し、最終的に１〜３．２ｃｍ^３のサイズで停止した。最も顕著なことに、すべての併用処置した動物において、この安定化の後に急速な退縮が続き、結果として既存の腫瘍の完全な消失がもたらされた（図６）。処置動物のいずれにおいても、体重減少またはその他の有害な副作用は記録されなかった。これらの結果は、子宮頸癌の治療のためにＨ−１ＰＶとＨＤＡＣＩｓを併用するという考えをさらに強化する。

パルボウイルスＨ−１ＰＶおよびＨＤＡＣ阻害剤は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来細胞株（ＡＰＣ−１およびＣａｐａｎ−１）を死滅させる際に相乗的に作用する。

インビトロ相乗作用。

致死未満量のＨＤＡＣＩｓ、すなわちバルプロ酸（ＶＰＡ）は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来ＡＰ−１およびＣａｐａｎ−１細胞株においてＰＶ細胞毒性を相乗的に増加させることが見出された。

図７は、ＰＶ細胞毒性に対して非常に抵抗性であることが記載されている（Ｄｅｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）ＡＰ−１およびＣａｐａｎ−１細胞株での、ＬＤＨアッセイから得た結果を示す。細胞を９６ウェルプレートに播種し、次に様々な濃度のＨ−１ＰＶをＨＤＡＣＩバルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下または不在下で感染させた。７２時間後、ＬＤＨアッセイによって細胞溶解を測定した。図７に示されるように、実験に使用した濃度での、ＶＰＡによる単独処置は、両方の細胞株の増殖に効果がなかった。以前の結果に一致して、Ｈ−１ＰＶは、高い多重度で感染した後でさえ、これらの培養に対して限られた細胞毒性しか示さなかった。Ｈ−１ＰＶの細胞障害活性は、ＶＰＡにより著しく増強された。これらの結果により、様々な腫瘍実体の治療のためにＨＤＡＣＩｓとＨ−１ＰＶを併用することがさらに支持される。

Claims (14)

1. （ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）を含有する医薬組成物。
2. （ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）ＨＤＣＡＩを別々の実体として含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記パルボウイルスが、Ｈ−１（Ｈ−１ＰＶ）または関連するげっ歯類パルボウイルスである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記関連するげっ歯類パルボウイルスが、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）またはラットウイルス（ＲＶ）である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記ＨＤＡＣＩが、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）またはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 癌の治療のための（ａ）医薬組成物（類）の調製のための、請求項１〜５のいずれか一項に定義されるパルボウイルスおよびＨＤＡＣＩの使用。
7. （ａ）前記パルボウイルスおよび（ｂ）前記ＨＤＡＣＩが、順次投与される、請求項６に記載の使用。
8. 前記パルボウイルス（ａ）が、前記ＨＤＡＣＩ（ｂ）よりも前に投与される、請求項７に記載の使用。
9. 前記癌が、脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記脳腫瘍が、神経膠腫、髄芽細胞腫または髄膜腫である、請求項９に記載の使用。
11. 前記神経膠腫が、悪性ヒト神経膠芽腫である、請求項１０に記載の使用。
12. 前記パルボウイルスが、腫瘍内投与により投与される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 癌の治療のための方法で使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 前記癌が、脳腫瘍、子宮頸癌、または膵癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
    

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