JP2013517769A - 複数病原菌検出の方法 - Google Patents

Abstract

培養方法は、検出アッセイの１種以上の標的病原菌と競合する微生物とを有する試料を、酸素不足の条件下で増殖培地中で培養するステップを含む。増殖培地は非選択培地であってよい。酸素不足の条件は、競合する微生物が標的病原菌の増殖を抑制するのを防止するのに効果的である。この方法は、高多孔質濾過材料および多孔質球状濾過助剤を使用する大容量の微粒子試料のための試料調製方法と組み合わせて使用することができる。

Description

本開示は、競合する微生物を含む試料中におけるリステリア属の細菌の高感度の検出を可能にする方法に関する。本開示は、競合する微生物を含む試料中におけるリステリア属、サルモネラ属および大腸菌属の細菌を含む複数種の病原菌の高感度の検出を可能にする方法にも関する。さらに、本開示は、高多孔質濾過および多孔質球状濾過助剤を使用して、低コストおよび短い実時間での、大容量の微粒子試料中の複数種の病原菌の高感度の検出を可能にする方法にも関する。

本明細書では文書、行為または知識項目が言及され、または考察されるが、本明細書においてこの言及または考察は、当該文書、行為もしくは知識項目またはその任意の組合せが、優先日に公衆に利用可能であったこと、公然知られていたこと、一般的な通常の知識の一部であったこと、または別の方法で適用される法律の条項下で先行技術を構成すること、または本明細書が関与するいずれかの課題を解決する試みと関連があると知られていることを認めるものではない。

米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）による最近の概算によれば、食物媒介病原菌は、毎年、合衆国内だけでも疾病のうちの７６００万症例、３２５，０００件の入院、および５０００件の死亡の原因となっている。これらの食物が媒介する疾病の大発生は、人への有害な影響に加えて、医療費、生産性の損失、商品の回収、および輸出の停止による弊害のある経済的影響を及ぼす。そのような病原菌は少量でも食中毒または集団発生をも引き起こし得るため、米国農務省（ＵＳＤＡ）は特定の食物媒介病原菌に対してはゼロトレランス政策を推奨している。したがって、数グラムの食物試料中の１コロニー形成単位（ｃｆｕ）の病原菌を検出することができる高感度の病原菌検出技術の開発が必要である。

リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））Ｏ１５７：Ｈ７およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）などの食物媒介病原菌に対する多くの現在利用可能な検出技術および製品があるにもかかわらず、数グラムの食物試料において１ｃｆｕの病原菌を２４時間の枠内で検出することは依然として困難である。従来法では、病原菌は希釈および均質化により食物試料から抽出され、数百ミリリットルまたはそれよりも多い試料体積が得られる。そのような大容量の試料中の少数の病原菌を検出するためには、病原菌を、その濃度が適切な病原菌検出アッセイの検出閾値に達するまで培養する必要がある（前濃縮）。前濃縮に必要な時間は、倍加時間、病原菌の生存率、検出閾値、および均質化された食物試料の任意の増殖抑制効果に依存する。前濃縮は通常、少なくとも１２〜４８時間かかる。より選択的な増殖培地における二次濃縮は、対象の病原菌をより選択的に濃縮するのに有用であり得るが、さらになお長い時間がかかる。前濃縮のせいで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの高感度検出アッセイを使用しても、食物試料における低濃度の病原菌汚染の検出には１日〜２日はかかることがある。

Ｌ．モノサイトゲネスは主要な食物媒介病原菌の１つであり、食物媒介疾病の数回の大発生の原因であった。従来法では、食物試料中の少量のＬ．モノサイトゲネスを検出するためには、リステリア選択増殖培地を使用して、同一試料中の競合する微生物の増殖を抑制することによりＬ．モノサイトゲネスを選択的に濃縮する。Ｌ．モノサイトゲネスよりも高い開始濃度を有し増殖速度が速い競合する微生物は、培養物で優勢を占め、非選択増殖培地または弱い選択増殖培地ではＬ．モノサイトゲネスの連続増殖を抑制し得る（ジェイムソン効果）。競合する微生物が存在すると、Ｌ．モノサイトゲネスの濃度が検出閾値に到達することができる前に、さらに強い選択増殖培地における二次濃縮が必要になることがある。

選択増殖培地は、競合する微生物の増殖を抑制する抗生物質などの選択作用物質の組合せを含有していてもよい。選択増殖培地の選択性は、選択作用物質の濃度により制御され得る。選択作用物質を使用することに付随する不利な点の１つは、多くの選択作用物質が、特に比較的高濃度では、損傷を受けた病原菌の蘇生を妨げ健康な病原菌の増殖速度を低下させることである。もう１つの不利な点は、食物試料を複数種の病原菌について検査する必要がある場合、試料を等分し各アリコートを対象の種それぞれに特異的な選択増殖培地において培養することが必要になることである。

選択増殖培地の不利な点を考慮すると、選択増殖培地を使用せずに、食物試料中の複数の病原菌種を同時に検出することができるアッセイが望ましい。ジェイムソン効果のために、特に増殖速度が遅いリステリア種が対象であり競合する微生物が試料中に存在する場合は、非選択増殖培地においてアッセイの検出閾値まで複数の病原菌種を濃縮するのは困難である。

米国特許第５，１４５，７８６号、米国特許出願公開第２００８／００１４５７８号、およびＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８、７４、４８５３〜４８６６頁（これら文献はすべて参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）にそれぞれ開示されているユニバーサルプレエンリッチメントブロス（ＵＰＢ）、Ｎｏ．１７ならびにサルモネラ菌、大腸菌およびリステリア（ＳＥＬ）の増殖を促進するための濃縮ブロスなどのいくつかの増殖培地は、食物試料からのＬ．モノサイトゲネス、サルモネラ菌および大腸菌Ｏ１５７の同時増殖を支持するように開発された。ＵＰＢは、培養中の競合する微生物の増殖に起因する急速なｐＨ低下を防ぐために、高度に緩衝されており炭水化物が少ない。したがって、ＵＰＢは損傷した病原菌でも同時濃縮を支持することができる。Ｎｏ．１７はＵＰＢと類似の培地組成を有する。ＳＥＬは、リステリア選択増殖培地である緩衝されたリステリア濃縮ブロス（ＢＬＥＢ）を基に、サルモネラ菌および大腸菌Ｏ１５７の増殖を支持するために抗生物質の濃度を下げることにより開発された。これらの増殖培地は、食物試料からこれらの病原菌を首尾よく濃縮することが報告されているが、実際の食物検査におけるその適用はさらに評価されなければならない。カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｌ．モノサイトゲネス、サルモネラ菌および大腸菌Ｏ１５７の同時濃縮に関してはこれまで報告はない。なぜならば、カンピロバクター培養物の濃縮は微好気的環境で行われることが多く、Ｌ．モノサイトゲネス、サルモネラ菌、および大腸菌Ｏ１５７は通常、好気的環境において濃縮されるためである。

本明細書に記載されているのは、非選択増殖培地中の溶存酸素の濃度を制限することにより複数の病原菌種を同時に濃縮するための新規な方法である。

本発明の開示を促進するために従来の技術の特定の態様を考察してきたが、本出願人らは、これらの技術的態様の請求権を決して放棄することはなく、請求項に記載される発明は本明細書に考察される従来の技術的態様のうちの１つ以上を包含する、または含む可能性があることが企図されている。

［定義］
本明細書において具体的に定義されている場合を除き、技術用語および科学用語はすべて、関連技術の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。また、本明細書において特定されるすべての出版物、特許出願公開、および特許は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

本明細書で使用されるように、「酸素不足」は、周囲環境における酸素濃度よりも低い溶存酸素濃度を意味する。

本明細書で使用されるように、「選択作用物質」または「選択培地」は、培養物中で非標的微生物または競合する微生物の増殖を抑制するように作用する作用物質または１種以上の作用物質を含有する培地を意味する。

本発明は、上記の欠陥の問題のうちの１つ以上に随意に対処する。

したがって、本発明は、少なくとも１種の標的病原菌と競合する微生物とを含む試料を、酸素不足の条件下で増殖培地中で培養するステップを含むジェイムソン効果を防止するための培養方法などの方法を含んでもよい。

さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも１種の標的病原菌と、前記少なくとも１種の標的病原菌よりも高い開始濃度を有するおよび／または増殖速度がより速い競合する微生物とを含む試料を、酸素不足の条件下で非選択増殖培地中で培養するステップと、前記少なくとも１種の標的病原菌の存在および／または濃度を検出する検出アッセイを行うステップとを含むジェイムソン効果を防止するための培養方法を含む。

さらなる任意の態様によれば、本発明は、以下の追加の態様および／またはステップ、すなわち、
・ 前記競合する微生物が、前記少なくとも１種の標的病原菌よりも増殖速度が速くおよび／または高い開始濃度を有する上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地が非選択増殖培地を含む上記方法（複数可）、
・ 前記競合する微生物が、前記標的病原菌よりも少なくとも１００倍高い開始濃度を有する上記方法（複数可）、
・ 前記標的病原菌が、リステリア属、サルモネラ属、大腸菌属、およびカンピロバクター属のうちの１種以上を含む上記方法（複数可）、
・ 前記少なくとも１種の標的病原菌を検出するおよび／または定量化するための検出アッセイを行うステップをさらに含む上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の５０％未満、場合により大気中の酸素濃度の２５％未満、大気中の酸素濃度の１０％未満、または大気中の酸素濃度の５％未満である上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の５０％未満、たとえば、６．６ｍｇ／Ｌ未満である上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の２５％未満、たとえば、３．３ｍｇ／Ｌ未満である上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の１０％未満、たとえば、１．３ｍｇ／Ｌ未満である上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地が、ブレインハートインフージョンブロス、ニュートリエントブロス、またはトリプチックソイブロスである上記方法（複数可）、
・ 前記標的病原菌を検出および／または定量化するために検出アッセイが使用され、前記検出アッセイが、寒天プレート、発色性寒天プレート、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、等温核酸増幅、核酸プローブ、バイオセンサー、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、またはルミネックスシステムを含む上記方法（複数可）、
・ 前記試料が少なくとも２種の標的病原菌を有する上記方法（複数可）、
・ 前記増殖培地が非選択培地である上記方法（複数可）、
・ 前記非選択培地が抗生物質を含まない上記方法（複数可）、
・ 前記酸素不足の条件が、前記試料を酸素が２０％未満の雰囲気下で培養するステップ、前記増殖培地に酸素枯渇剤を添加するステップ、前記試料を密封容器内で培養するステップ、静置培養するステップ、および／または前記増殖培地の表面に油の層を適用するステップによって確立される上記方法（複数可）、
・ 前記酸素枯渇剤が、オキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ）酵素、アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、システイン、および／またはクエン酸チタン（ＩＩＩ）である上記方法（複数可）、
・ 前記培養培地が、液体培地、半流動体培地、または固体培地である上記方法（複数可）、
・ 前記試料が、前記標的病原菌および前記競合する微生物を大容量の微粒子試料から回収するために使用される高多孔質濾過材料上に配置される上記方法（複数可）、ならびに／または
・ 前記少なくとも１種の標的病原菌がリステリア属の細菌である上記方法（複数可）
の１つ以上、または１つ以上の任意の組合せをさらに含み得る。

本発明は、上で考察された先行技術の問題点および欠陥のうちの１つ以上に対処してもよい。しかし、本発明は、他の問題点および欠陥に対処するのに有用であることが判明し得ること、または多くの技術領域において利益および利点を提供し得ることが企図されている。したがって、請求項に記載される発明は、必ずしも本明細書において考察される特定の問題点または欠陥のいずれかに対処することに限定されると解釈されるべきではない。

好気的（白丸）および酸素不足（黒丸）の培養条件下での単独培養におけるＬ．モノサイトゲネスの増殖速度を示す図である。 好気的（白丸）および酸素不足（黒丸）の培養条件下での混合培養におけるＬ．モノサイトゲネス（実線）および大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８（点線）の増殖速度を示す図である。 好気的（白丸）および酸素不足（黒丸）の培養条件下での混合培養におけるＬ．モノサイトゲネス（実線）および大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８（点線）の増殖速度を示す図である。 ３つの異なる酸素濃度下で２４時間培養された、Ｌ．モノサイトゲネスおよび大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を含有する３つの試料におけるＬ．モノサイトゲネスの検出アッセイ結果を示す図である。 別の３つの異なる酸素濃度下で２４時間培養された、Ｌ．モノサイトゲネスおよび大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を含有する３つの試料におけるＬ．モノサイトゲネスの検出アッセイ結果を示す図である。 好気的および酸素不足の培養条件下で２４時間培養された、Ｌ．モノサイトゲネスおよび大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を含有する均質化された（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｄ）牛ひき肉の試料におけるＬ．モノサイトゲネスの検出アッセイ結果を示す図である。 好気的および酸素不足の培養条件下で、異なる増殖培地において２４時間培養された、Ｌ．モノサイトゲネス、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、および大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を含有する試料におけるＬ．モノサイトゲネスの検出アッセイ結果を示す図である。 好気的および酸素不足の培養条件下で２４時間培養された、Ｌ．モノサイトゲネスおよび競合する微生物を含有する９つの試料におけるＬ．モノサイトゲネスの検出アッセイ結果の概要を示す図である。

記載されている実施形態は本発明の好ましい実施形態を表すが、本発明の趣旨を逸脱することなく当業者は変更を思い付くだろうことが理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、添付されている特許請求の範囲によってのみ決定されるべきである。

本発明の特定の態様に従えば、酸素不足の培養は、ジェイムソン効果、すなわち、培養物中の高い全微生物濃度はその中のあらゆる微生物の増殖を抑制するという現象を効果的に予防することができる。特に、酸素不足の培養は、抗生物質などのいかなる選択作用物質も使用せずに、競合する微生物が高い開始濃度を有する試料においてさえＬ．モノサイトゲネスの連続増殖を促進することができる。これとは対照的に、競合する微生物が高い開始濃度を有する試料におけるＬ．モノサイトゲネスの増殖は、ジェイムソン効果のために好気的培養では抑制され、Ｌ．モノサイトゲネスの培養後の濃度は、従来の検出アッセイの検出閾値に到達することができない。酸素不足条件および好気的条件は単独培養（すなわち、Ｌ．モノサイトゲネスのみで開始する培養）でのＬ．モノサイトゲネスの増殖速度にいかなる差も生じず、このことはいくつかの出版物により裏付けられているため、この結果は思いがけないものであった。さらに、本発明に従えば、酸素不足条件および好気的条件は、単独培養で損傷を受けたＬ．モノサイトゲネスの蘇生にそれほど影響を与えないことが観察された。

本発明の原則に従って実施される培養方法は、１種以上の標的病原菌と、該標的病原菌よりも高い開始濃度を有するおよび／または増殖速度が速い競合する微生物とを含有する試料を、酸素不足の条件下で非選択増殖培地中で培養するステップと、場合により、該標的病原菌を検出するステップとを含む。

増殖培地は、一般に、病原菌増殖のための炭素源、窒素源、アミノ酸、および様々な塩の１つ以上を含む。増殖培地は、Ｌ．モノサイトゲネス、サルモネラ菌種、および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７などの複数の病原菌の増殖ならびに熱、冷却、酸、アルカリ、冷蔵、凍結、圧力、および／または真空などの状態により損傷を受けた病原菌の急速蘇生を支持する非選択増殖培地であり得る。Ｌ．モノサイトゲネス、サルモネラ菌種、および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のための好ましい増殖培地には、ブレインハートインフージョンブロス、ニュートリエントブロス、およびトリプチックソイブロスが含まれる。または、増殖培地は、競合する微生物に対する抗生物質などの１つ以上の選択作用物質を含む選択増殖培地であり得る。しかし、選択作用物質の濃度が高い培地は、損傷を受けた病原菌の蘇生を妨げ、培養物中のすべての病原菌の増殖速度を下げることがある。増殖培地は、培養中の増殖培地のｐＨを維持するために、好ましくはｐＨ５〜９の１〜５００ｍＭのリン酸緩衝液、さらに好ましくはｐＨ５．５〜８．５の１０〜２００ｍＭのリン酸緩衝液を用いて緩衝することができる。

酸素不足の培養は、溶存酸素が制限されている増殖培地において本発明に従って行うことができる。増殖培地は、半流動体培地、固体培地、または好ましくは液体培地でもよい。酸素不足の条件は、培養中の増殖培地における溶存酸素濃度が大気中の酸素濃度未満であることを意味する。より具体的には、増殖培地中の溶存酸素濃度は、酸素不足の条件下にある。よって、酸素濃度は大気中の酸素濃度の５０％未満（たとえば、６．６ｍｇ／Ｌもしくはそれ未満）、あるいは２５％未満（たとえば、３．３ｍｇ／Ｌもしくはそれ未満）、または１０％未満（たとえば、１．３ｍｇ／Ｌもしくはそれ未満）でもよい。溶存酸素濃度は、Ｏａｋｔｏｎ ＤＯ３００シリーズメータなどの市販の溶存酸素センサーにより測定することができる。増殖培地の酸素濃度は、オキシラーゼ酵素（Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ．、ＯＨ）、アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、システインおよびクエン酸チタン（ＩＩＩ）などの酸素枯渇剤を増殖培地に添加することにより制御することができる。たとえば、０ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／ＬのＬ−システインを添加した５ｍＬのＢＨＩ培地の溶存酸素濃度は、それぞれ８．１ｍｇ／Ｌ、２．４ｍｇ／Ｌ、０．９２ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、および０．０１ｍｇ／Ｌ未満であった。別の例では、ブロス用のオキシラーゼまたは寒天用のオキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ．、ＯＨ）を２０μＬ／ｍＬまたは１００μＬ／ｍＬ添加した５ｍＬのＢＨＩブロスの溶存酸素濃度は、酸素センサーの検出範囲よりも低い、または０．０１ｍｇ／Ｌ未満であった。培養中の増殖培地の酸素濃度は、試料を密封容器内で培養すること、試料を酸素不足の雰囲気（たとえば、５０％未満の酸素）中で培養すること、酸素溶解を抑制する静置培養、および／または酸素溶解を抑制する油の層（たとえば、鉱油）を培養物と雰囲気との界面に適用することによって酸素の換気を制限するなどの方法により制御することも可能である。品質管理のために、培養中の増殖培地の溶存酸素濃度を直接的にまたは間接的にモニターすることも有用であり得る。容器内の培養物上の気体酸素濃度を測定することにより溶存酸素濃度の間接的測定を行うことができる。ＲｅｄＥｙｅ酸素センサーパッチ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ、ＦＬ）などの使い捨ての酸素センサーは、酸素不足の培養物の酸素濃度を非侵襲的な形でモニターするのに有用であり得る。

本明細書に記載される方法には著しい利点がある。この方法は、標的病原菌よりも高い開始濃度を有するおよび／または増殖速度が速い競合する微生物（たとえば、大腸菌、サルモネラ菌、または食物試料中に頻繁に存在する他の微生物）の存在下で、試料中の複数種の標的病原菌（たとえば、リステリア属（たとえば、Ｌ．モノサイトゲネス）、サルモネラ属、大腸菌属、および／またはカンピロバクター属における種）の同時培養を可能にする。従来の好気的培養物中のそのような競合する微生物は、ジェイムソン効果のために標的病原菌の増殖を抑制する。これとは対照的に、本発明の方法における酸素不足の条件は、競合する微生物が存在するにもかかわらず標的病原菌の増殖を促進し、ジェイムソン効果を防止する。

標的病原菌が検出アッセイの検出閾値レベルに到達すると、本明細書に記載される通りに行われる培養物中の標的病原菌を検出するために検出アッセイを使用することができる。複数種の標的病原菌を別々にまたは同時に検出することができる。検出アッセイは、ゲノムＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはタンパク質などの標的病原菌の特徴的細胞成分を抽出し検出することを含み得る。特徴的細胞成分は、標準的な分子生物学的手法または市販品を使用することにより抽出され、寒天プレート、発色性寒天プレート、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、他の任意の等温核酸増幅、核酸プローブ、および／またはバイオセンサーなどの従来の手法により検出することができる。複数種の標的病原菌を別々に検出するためには、培養物または抽出された特徴的細胞成分は、アリコートに分割されることができ、そのアリコートの各々が標的病原菌の種に特異的な検出アッセイにより試験される。複数種の標的病原菌を同時に検出するためには、培養物または抽出された特徴的細胞成分を、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、およびルミネックスシステムなどの従来のマルチプレックス病原菌検出アッセイにより試験することができる。

本発明の方法は、同一出願人によるＰＣＴ出願の国際公開第２００９０１８５４４号に開示される高多孔質濾過材料および多孔質球状濾過助剤を使用する大容量の微粒子試料のための試料調製方法と組み合わせて使用することができ、この特許文献は参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。具体的には、食物ホモジネートおよび環境試料などの大容量の微粒子試料は、試料中の病原菌を固定化することができる高多孔質濾過材料により濾過することができる。濾過材料は、上記のように溶存酸素濃度が制限された増殖培地において（すなわち、酸素不足の培養条件下で）培養することができる。増殖培地の最適な体積は、濾過材料のサイズに依存する。最大病原菌濃度を得るためには、固定化された病原菌の増殖を支持するのに十分な最少量の増殖培地を使用するのが好ましい。たとえば、径が４７ｍｍの濾過材料では５ｍＬ未満または径が７０ｍｍの濾過材料では１０ｍＬ未満が好ましい。培養の終了時には、標的病原菌を増殖培地から回収することができる。標的病原菌の回収率を最大にするためには、濾過材料からの標的病原菌抽出および／または標的病原菌の増殖を促進するように、培養前、培養中、または培養後に、濾過材料を引き裂き、寸断し、砕きまたは切断して小断片にすることができる。増殖培地中の標的病原菌は、上文に記載されるアッセイを使用して検出することができる。

競合する微生物（大腸菌）の非存在下および存在下、好気的および酸素不足の条件において、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖速度をそれぞれ調べた。

［Ｌ．モノサイトゲネスの単独培養］
６．１ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂを播種された２つの５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス試料は、それぞれ好気的および酸素不足の条件下、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上で培養された。好気的条件は、培養中に空気を換気させることにより確立され、酸素不足の条件は空気の換気を妨げることにより確立された。Ｌ．モノサイトゲネスの増殖曲線を構築するために、Ｌ．モノサイトゲネスは、２４時間までのいくつかの培養時点でプレート計数法により検出された。図１Ａに示されるように、好気的条件（白丸）および酸素不足の条件（黒丸）下で培養された試料間のＬ．モノサイトゲネスの増殖速度に有意差は観察されなかった。

［Ｌ．モノサイトゲネスと競合する微生物との同時培養］
６．１ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂと、８．３×１０^４ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８とが播種された２つの５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス試料は、単独培養で行われた通りに、それぞれ好気的および酸素不足の条件下、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上で培養された。Ｌ．モノサイトゲネス（実線）および大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８（点線）の増殖曲線を構築するために、Ｌ．モノサイトゲネスおよび大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８は、２４時間までのいくつかの培養時点でプレート計数法により検出された。図１Ｂに示されるように、好気的条件下で培養された試料（白丸）と比べて酸素不足の条件下で培養された試料（黒丸）においてＬ．モノサイトゲネスの増殖は著しく促進された。

［Ｌ．モノサイトゲネスと競合する微生物との同時培養］
６．８ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネスと、６．４×１０^４ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８とが播種された２つの５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス試料は、上記の単独培養で行われた通りに、それぞれ好気的および他の酸素不足の条件下、３７℃で培養された。好気的条件は、回転インキュベーション（２５０ｒｐｍ）を通じて空気を換気させることにより作り出され、酸素不足の条件は、静置インキュベーションを通じて空気の換気を妨げることにより作り出された。Ｌ．モノサイトゲネス（実線）および大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８（点線）の増殖曲線を得るために（図１Ｃ）、Ｌ．モノサイトゲネスおよび大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８は、２４時間までのいくつかのインキュベーション時点でプレート計数法により検出された。好気的インキュベーション（白丸）と比べると、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は酸素不足のインキュベーション（黒丸）により著しく促進された。

［競合する微生物と同時培養のＬ．モノサイトゲネスの増殖に対する増殖培地中の溶存酸素濃度の効果］
第一組の実験では、１ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂと、１×１０^５ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８とが播種された３つの５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス試料が、それぞれ（上から下への）空気換気、空気換気なし、および空気換気なしと１００μＬ／ｍＬの寒天用のオキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ、ＯＨ）により確立された異なる溶存酸素濃度で、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において培養された。溶存酸素濃度は、空気換気について８．７ｍｇ／Ｌ、空気換気なしについて８．１ｍｇ／Ｌ、空気換気なしと１００μＬ／ｍＬの寒天用のオキシラーゼについて０．０１ｍｇ／Ｌ未満と推定された。２４時間培養後、Ｌ．モノサイトゲネスは、プレート計数法により検出され定量化された。図２に示されるように、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は、溶存酸素濃度を下げることにより著しく促進された。

第二組の実験では、６．０ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂと、７．０×１０^４ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８とが播種された３つの５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス試料が、それぞれ（上から下への）空気換気なし、空気換気なしと０．５ｇ／ＬのＬ−システイン、および空気換気なしと２．０ｇ／ＬのＬ−システインにより確立された異なる溶存酸素濃度で、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において培養された。溶存酸素濃度は、空気換気なしについて８．１ｍｇ／Ｌ、空気換気なしと０．５ｇ／ＬのＬ−システインについて０．９２ｍｇ／Ｌ、および空気換気なしと２．０ｇ／ＬのＬ−システインについて０．０１ｍｇ／Ｌ未満と推定された。２４時間培養後、Ｌ．モノサイトゲネスは、プレート計数法により検出され定量化された。図３に示されるように、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は、溶存酸素濃度を下げることにより著しく促進された。

［１０％牛ひき肉ホモジネートにおけるＬ．モノサイトゲネスと競合する微生物との同時培養］
５ｍＬの１０％牛ひき肉ホモジネートの２つの試料は、ブレインハートインフージョンブロス中で消化することにより調製され、７．３ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂおよび７．９×１０^４ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を播種された。試料は好気的および酸素不足の条件下、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において培養された。好気的条件は空気を換気させることにより確立された。酸素不足の条件は、空気の換気を妨げ、培養物にブロス用の２０μＬ／ｍＬのオキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ、ＯＨ）を添加することにより確立された。溶存酸素濃度は、好気的条件について８．７ｍｇ／Ｌ、酸素不足の条件について０．０１ｍｇ／Ｌ未満と推定された。２４時間培養後、Ｌ．モノサイトゲネスは、プレート計数法により検出され定量化された。図４に示されるように、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は、酸素不足の条件下で培養された試料において著しく促進された。

５ｍＬのトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）の２つの試料、５ｍＬのニュートリエントブロス（ＮＢ）の２つの試料、およびブレインハートインフージョンブロス（ＢＨＩ）中で消化することにより調製された５ｍＬの１０％デリ・ミート（ｄｅｌｉ ｍｅａｔ）ホモジネートの２つの試料であって、それぞれが７．４ｃｆｕ／ｍＬのＬ．モノサイトゲネス４ｂ、１．０ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、および７．８×１０^４ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を播種された試料におけるＬ．モノサイトゲネスと、競合する微生物との同時培養が調べられた。試料は、好気的および酸素不足の条件下、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において培養された。好気的条件は空気を換気させることにより確立された。酸素不足の条件は、空気の換気を妨げ、ブロス用の１００μＬ／ｍＬのオキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ、ＯＨ）を添加することにより確立された。溶存酸素濃度は、好気的条件について８．７ｍｇ／Ｌ、酸素不足の条件について０．０１ｍｇ／Ｌ未満と推定された。２４時間培養後、Ｌ．モノサイトゲネスは、発色性寒天プレートにより検出された。図５に示されるように、Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は、酸素不足の条件下で培養された試料において著しく促進された。

［１０^４ｃｆｕ／ｍＬ超の競合する微生物の組合せとの同時培養における１０ｃｆｕ／ｍＬ未満のＬ．モノサイトゲネスの増殖の向上が調べられた］
５ｍＬのブレインハートインフージョンブロス、またはブレインハートインフージョンブロス中で消化することにより調製された１０％食物ホモジネートは、Ｌ．モノサイトゲネス４ｂ、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、または大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８を播種された。試料は、好気的および酸素不足の条件下、３７℃、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において培養された。好気的条件は空気を換気させることにより確立された。酸素不足の条件は、空気の換気を妨げ、２０μＬ／ｍＬまたは１００μＬ／ｍＬのブロス用のオキシラーゼまたは寒天用のオキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ、ＯＨ）を添加することにより確立された。溶存酸素濃度は、好気的条件について８．７ｍｇ／Ｌ、酸素不足の条件について０．０１ｍｇ／Ｌ未満と推定された。２４時間培養後、Ｌ．モノサイトゲネス４ｂ、Ｌ．イノキュア、Ｓ．チフィムリウム、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、または大腸菌Ｏ１：Ｋ１：Ｈ８は、プレート計数法により検出され定量化された。Ｌ．モノサイトゲネスの増殖は、酸素不足の培養により著しく促進され、Ｓ．チフィムリウムおよび大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７などの他の食物病原菌も同時に検出された（図６）。

本明細書において使用される成分の量、構成要素、反応条件等を表すいかなる数字も、あらゆる場合に用語「約（ａｂｏｕｔ）」に修飾されていると理解されるべきである。記載されている数値の範囲およびパラメータ、本明細書に提示される事項の広い範囲は近似値であるが、記載されている数値はできる限り正確に示されている。しかし、いかなる数値も本質的に、それぞれの測定法に見出される標準偏差から明らかなように、いくらかの誤差または不正確さを含む可能性がある。本明細書に列挙される特質はどれも、用語「意味する（ｍｅａｎｓ）」が明確に使用されていなければ、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２，¶６を想起するものと解釈されるべきではない。

本発明はその好ましい実施形態と関連して説明されてきたが、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、具体的に記載されていない付加、欠失、変更および置換を行い得ることは当業者により認識されるであろう。

Claims (42)

1. 少なくとも１種の標的病原菌と競合する微生物とを含む試料を、酸素不足の条件下で増殖培地中で培養するステップを含むジェイムソン効果を防止するための培養方法。
2. 前記競合する微生物が、前記少なくとも１種の標的病原菌よりも増殖速度が速いおよび／またはより高い開始濃度を有する請求項１に記載の方法。
3. 前記増殖培地が非選択増殖培地を含む請求項１に記載の方法。
4. 前記競合する微生物が、前記標的病原菌よりも少なくとも１００倍高い開始濃度を有する請求項１に記載の方法。
5. 前記標的病原菌が、リステリア属、サルモネラ属、大腸菌属、およびカンピロバクター属のうちの１種以上を含む請求項１に記載の方法。
6. 前記少なくとも１種の標的病原菌を検出および／または定量化するための検出アッセイを行うステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
7. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が６．６ｍｇ／Ｌ未満である請求項１に記載の方法。
8. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が３．３ｍｇ／Ｌ未満である請求項１に記載の方法。
9. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が１．３ｍｇ／Ｌ未満である請求項１に記載の方法。
10. 前記増殖培地が、ブレインハートインフージョンブロス、ニュートリエントブロスまたはトリプチックソイブロスである、請求項１に記載の方法。
11. 前記標的病原菌を検出および／または定量化するために検出アッセイが使用され、前記検出アッセイが、寒天プレート、発色性寒天プレート、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、等温核酸増幅、核酸プローブ、バイオセンサー、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、またはルミネックスシステムを含む請求項１に記載の方法。
12. 前記試料が少なくとも２種の標的病原菌を有する請求項１に記載の方法。
13. 前記非選択培地が抗生物質を含まない請求項３に記載の方法。
14. 前記酸素不足の条件が、酸素不足の雰囲気下で前記試料を培養するステップ、前記増殖培地に酸素枯渇剤を添加するステップ、前記試料を密封容器内で培養するステップ、静置培養するステップ、および／または前記増殖培地の表面に油の層を適用するステップによって確立される請求項１に記載の方法。
15. 前記酸素枯渇剤が、オキシラーゼ酵素、アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、システイン、および／またはクエン酸チタン（ＩＩＩ）である請求項１４に記載の方法。
16. 前記培養培地が、液体培地、半流動培地、または固体培地である請求項１に記載の方法。
17. 前記試料が、前記標的病原菌および前記競合する微生物を大容量の微粒子試料から回収するために使用される高多孔質濾過材料上に配置される請求項１に記載の方法。
18. 前記少なくとも１種の標的病原菌がリステリア属の細菌である請求項１に記載の方法。
19. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の５０％未満である請求項１に記載の方法。
20. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の２５％未満である請求項１９に記載の方法。
21. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の１０％未満である請求項２０に記載の方法。
22. 少なくとも１種の標的病原菌と、前記少なくとも１種の標的病原菌よりも高い開始濃度を有するおよび／または増殖速度がより速い競合する微生物とを含む試料を、酸素不足の条件下で増殖培地中で培養するステップと、前記少なくとも１種の標的病原菌の存在および／または濃度を検出する検出アッセイを行うステップとを含むジェイムソン効果を防止するための培養方法。
23. 前記競合する微生物が、前記少なくとも１種の標的病原菌よりも増殖速度が高いおよび／またはより高い開始濃度を有する請求項２２に記載の方法。
24. 前記増殖培地が非選択増殖培地を含む請求項２２に記載の方法。
25. 前記競合する微生物が、前記標的病原菌よりも少なくとも１００倍高い開始濃度を有する請求項２２に記載の方法。
26. 前記標的病原菌が、リステリア属、サルモネラ属、大腸菌属、およびカンピロバクター属のうちの１種以上を含む請求項２２に記載の方法。
27. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、６．６ｍｇ／Ｌ未満である請求項２２に記載の方法。
28. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、３．３ｍｇ／Ｌ未満である請求項２２に記載の方法。
29. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、１．３ｍｇ／Ｌ未満である請求項２２に記載の方法。
30. 前記増殖培地が、ブレインハートインフージョンブロス、ニュートリエントブロス、またはトリプチックソイブロスである請求項２２に記載の方法。
31. 前記検出アッセイが、寒天プレート、発色性寒天プレート、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、等温核酸増幅、核酸プローブ、バイオセンサー、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、またはルミネックスシステムを含む請求項２２に記載の方法。
32. 前記試料が少なくとも２種の標的病原菌を有する請求項２２に記載の方法。
33. 前記増殖培地が非選択培地である請求項２２に記載の方法。
34. 前記非選択培地が抗生物質を含まない請求項３３に記載の方法。
35. 前記酸素不足の条件が、酸素不足の雰囲気下で前記試料を培養するステップ、前記増殖培地に酸素枯渇剤を添加するステップ、前記試料を密封容器内で培養するステップ、静置培養するステップ、および／または前記増殖培地の表面に油の層を適用するステップによって確立される請求項２２に記載の方法。
36. 前記酸素枯渇剤が、オキシラーゼ酵素、アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、システイン、および／またはクエン酸チタン（ＩＩＩ）である請求項３５に記載の方法。
37. 前記培養培地が、液体培地、半流動体培地、または固体培地である請求項２２に記載の方法。
38. 前記試料が、前記標的病原菌および前記競合する微生物を大容量の微粒子試料から回収するために使用される高多孔質濾過材料上に配置される請求項２２に記載の方法。
39. 前記少なくとも１種の標的病原菌がリステリア属の細菌である請求項２２に記載の方法。
40. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の５０％未満である請求項２２に記載の方法。
41. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の２５％未満である請求項４０に記載の方法。
42. 前記増殖培地の溶存酸素濃度が、大気中の酸素濃度の１０％未満である請求項４１に記載の方法。