JP2013505740A - 高有効性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年9月29日に出願された米国仮特許出願第61/246,844号の優先権を主張するものであり、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
a)ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む酵母細胞を準備するステップ、ここで前記ポリペプチドはKARIのSLSL Cladeのメンバーであるステップと;
b)(a)の酵母細胞とアセト乳酸を接触させて、2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸が生成されるステップと
を含む。
a)ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を備える微生物細胞を準備するステップ、ここで前記ポリペプチドは、KARIのSLSL Cladeのメンバーであるステップと;
b)ステップ(a)の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと
を含む。
6−141、143−148、151−154、156−159、161−163、165、166、168、170−173、177−181、186−197、199−202、205、206、209、210、213−222、224−243は、PCRおよび配列決定プライマーである。
米国特許出願公開第20070092957号明細書に開示されたイソブタノール生成の生合成経路を、図1に示す。生合成経路のステップを最大限に利用して、イソブタノール生成を最大にすることは望ましい。図1の全経路の第2ステップは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)による、アセト乳酸のジヒドロキシイソ吉草酸への変換である。出願人らによって、イソブタノール生合成経路で使用されるとき、酵母および細菌において、イソブタノール生成の、以前に他のKARIを使用して得られたレベルを上回る増大を実現するKARIが確認された。
上記のKARIはいずれも、酵母または細菌細胞において発現して、アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換することができ、イソブタノール生合成経路におけるステップを実現する。宿主細胞とすることができる酵母細胞としては、サッカロミケス(Saccharomyces)、シゾサッカロミケス(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、カンジダ(Candida)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ヤロウイア(Yarrowia)、イサチェンキア(Issatchenkia)、およびピキア(Pichia)という属に属するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞とすることができる細菌細胞としては、エシェリキア(Escherichia)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、オエノコッカス(Oenococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、ザイモモナス(Zymomonas)、サルモネラ(Salmonella)、ペディオコッカス(Pediococcus)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、クレブシエラ(Klebsiella)、パエニバチルス(Paenibacillus)、アルスロバクター(Arthrobacter)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、およびブレビバクテリウム(Brevibacterium)という属に属するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ラクトコッカス(Lactococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、オエノコッカス(Oenococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、およびストレプトコッカス(Streptococcus)などの乳酸菌(LAB)である宿主細胞が特に有用である。
本明細書に記載されるKARIを含めて、イソブタノール生合成経路についてエンジニアリングされた酵母および細菌細胞は、追加の改変を加えてもよい。イソブタノール合成へのフラックスを増大させる改変など、宿主細胞を改良する何らかの改変を行うことができる。
本明細書に記載されたようにインビボで高有効性であるKARIを有する本細胞は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20070092957(A1)号明細書に開示され、図1に示されるものなどの生合成経路を使用して、イソブタノールを生成する。
− 例えば、EC番号2.2.1.69で知られるアセト乳酸合成酵素(ALS)によって触媒されるピルビン酸からアセト乳酸への変換(図1経路ステップa);
− 例えば、EC番号1.1.1.86で知られるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、別名ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)によって触媒されるアセト乳酸から2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換(図1経路ステップb);
− 例えば、EC番号4.2.1.9で知られるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、別名ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)によって触媒される2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換(図1経路ステップc);
− 例えば、EC番号4.1.1.72または4.1.1.1で知られる分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換(図1経路ステップd);および
− 例えば、EC番号1.1.1.265で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ(具体的には、EC 1.1.1.1または1.1.1.2)に分類されることもある分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換(図1経路ステップe)
を含む。
本明細書に開示する細菌および酵母細胞は、イソブタノール生成用の発酵培地で増殖させることができる。最大の生成には、生成宿主として使用される株が、増強されたイソブタノール耐性を有し、および高い炭化水素利用率を有することが好ましい。これらの特性は、突然変異誘発と選択、遺伝子工学によって付与されることもあり、または自然のものであることもある。
典型的には、適切な培地中、細菌細胞は、約25℃から約40℃の範囲の温度で増殖され、酵母細胞は、約20℃から約37℃の範囲の温度で増殖される。好適な増殖培地は、工業的に調製された一般的な培地であり、使用する特定の細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知であろう。
生合成されたイソブタノールは、ABE発酵について当技術分野において公知である方法を使用して発酵培地から単離することができる(例えば、Durre、Appl. Microbiol. Biotechnol.、49巻:639〜648頁(1998年)、Grootら、Process. Biochem.、27巻:61〜75頁(1992年)、およびそれらの引用文献を参照のこと)。例えば、固体は、発酵培地から遠心、濾過、デカンテーションなどによって除去することができる。次いで、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸留、または浸透気化などの方法を使用して発酵培地から単離することができる。
Krieg and G. Briggs Phillips編), American Society for Microbiology, Washington,DC. (1994年))、またはThomas D. Brock、Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology、第2版、Sinauer Associates, Inc.、Sunderland,MA (1989年)に記載のように見ることができる。別段の指定のない限り、細菌細胞の増殖および維持に使用される試薬、制限酵素、および材料はすべて、Aldrich Chemicals (Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems (Sparks,MD)、Life Technologies (Rockville,MD)、またはSigma Chemical Company (St. Louis,MO)から入手した。微生物株は、別段の注記のない限りAmerican Type Culture Collection (ATCC)、(Manassas,VA)から入手した。下記の実施例で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを表3に示す。オリゴヌクレオチドプライマーはすべて、Sigma−Genosys(Woodlands, TX)、Integrated DNA Technologies(Coralsville,IA)、またはInvitrogen Corp(Carlsbad,CA)によって合成された。
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)PN0512を、下記の手順で形質転換した:1%グリシン(Sigma−Aldrich、St. Louis,MO)を含有する ラクトバチルス(Lactobacilli)MRS培地(Accumedia、Neogen Corporation、Lansing、MI)5mlに、PN0512細胞を播種し、30℃で一晩増殖させた。1%グリシン含MRS培地100mlに、一晩培養物を0.1のOD600まで播種し、30℃で0.7のOD600まで増殖させた。細胞を、3700xgで8分間、4℃で収穫し、1mMの冷MgCl2(Sigma−Aldrich、St. Louis,MO)100mlで洗浄し、3700xgで8分間、4℃で遠心し、冷30%PEG−1000(Sigma−Aldrich、St. Louis,MO)100mlで洗浄し、3700xgで20分間、4℃で再び遠心し、次いで1mlの冷30%PEG−1000に再懸濁した。60μlの細胞を、ギャップ1mmの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約100ngのプラスミドDNAと混合し、BioRad Gene Pulser(Hercules,CA)で1.7kV、25μF、および400Ωにおいて電気穿孔した。500mMスクロース(Sigma−Aldrich、St. Louis,MO)および100mMのMgCl2を含有するMRS培地1mlに、細胞を再懸濁し、30℃で2時間インキュベートし、1または2μg/mlのエリスロマイシンを含有するMRS培地(Sigma−Aldrich、St. Louis,MO)に蒔き、次いでPack−Anaeroサシェ(三菱ガス化学株式会社、日本、東京)が入っている嫌気性ボックスに入れ、30℃でインキュベートした。
発酵副生物組成物の分析は当業者に周知である。例えば、1つの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)方法は、Shodex SH−1011カラムをShodex SH−Gガードカラム(両方とも、Waters Corporation、(Milford,MA)から入手可能)と共に利用し、屈折率(RI)で検出した。クロマトグラフ分離は、0.01M H2SO4を移動相として、流量0.5mL/分およびカラム温度50 ℃で使用して実現される。イソブタノール保持時間は約47.6分である。
ilvD組込み型ベクターおよびPN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl+組込み株の構築
この実施例は、DHADの発現のため、L.プランタルム(L.plantarum)株PN0512ΔldhDΔldhL1の染色体へのラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)ilvD遺伝子の組込みを説明する。L.プランタルム(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1の構築は、米国仮特許出願第61/100786号明細書の実施例1に記載された。この株は、主要な乳酸デヒドロゲナーゼをコードする2つの遺伝子:ldhDおよびldhL1について欠失している。この二重欠失体は、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)PN0512(ATCC株 #PTA−7727)において作製された。
ldhD遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットは、EcoRI部位を含むTop D F1(配列番号:111)とTop D R1(配列番号:112)のプライマーを有する上流フランキング領域であるPN0512ゲノムDNAから増幅させることによって作製した。ldhDのコード配列の一部分を含む下流の相同性領域を、Bot D F2(配列番号:113)とXhoI部位を含むBot D R2(配列番号:114)のプライマーで増幅させた。2つの相同性領域を、以下の通りPCR SOEにより合わせた。0.9kbpの上流および下流PCR生成物をゲル精製した。PCR生成物を、PCR反応において等量で混合し、プライマーTop D F1およびBot D R2で再増幅させた。1.8kbpの最終PCR生成物をゲル精製し、TOPOをpCR4BluntII−TOPO(Invitrogen)にクローニングして、ベクターpCRBluntII::ldhDを作製した。ldhD遺伝子の内部欠失を保有している組込み型ベクターを作製するために、pFP996をEcoRIおよびXhoIで消化し、5311−bpの断片をゲル精製した。ベクターpCRBluntII::ldhDをEcoRIおよびXhoIで消化し、1.8kbpの断片をゲル精製した。T4 DNAリガーゼを使用して、ldhDノックアウトカセットとベクターを連結させ、ベクターpFP996::ldhD koを得た。
ダブルΔldhL1ΔldhD欠失株を作製するために、PN0512ΔldhD株において、ldhL1遺伝子の欠失を行った。ldhL1遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットを、PN0512ゲノムDNAから増幅させた。ldhL1左ホモロジーアームは、BglII制限部位を含むプライマーoBP31(配列番号:118)およびXhoI制限部位を含むプライマーoBP32(配列番号:119)を使用して増幅させた。ldhL1右ホモロジーアームは、XhoI制限部位を含むプライマーoBP33(配列番号:120)およびXmaI制限部位を含むプライマーoBP34(配列番号:121)を使用して増幅させた。ldhL1左ホモロジーアームを、BglII/XhoI部位にクローニングし、ldhL1右ホモロジーアームを、pFP996の誘導体であるpFP996pyrFΔermのXhoI/XmaI部位にクローニングした。pFP996pyrFΔermは、pFP996におけるエリスロマイシンコード領域の代わりに、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)PN0512由来のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするpyrF配列(配列番号:122)を含む。第2の相同クロスオーバーを単離するために、プラスミド由来のpyrF遺伝子は、ΔpyrF株における化学物質5−フルオロオロチン酸と一緒に有効的な対抗選択方法として使用することができる。XmaI消化の後に、ldhL1ホモロジーアームを含むXmaI断片を単離し、pFP996のXmaI制限部位にクローニングし、900bpの左相同性領域および1200bpの右相同性領域が得られ、ベクターpFP996−ldhL1−アームが作製された。
sufオペロンプロモーター組込み型ベクターおよびPN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl+suf::P5P4+組込み株の構築
この実施例は、L.プランタルム(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl+の染色体への2つのプロモーターの組込みを説明する。プロモーターをsufオペロンの上流に組み込んだ。sufオペロンの遺伝子産物は、Fe−Sクラスターアセンブリを担うものである。プロモーター組込みによって、内因性Fe−Sクラスターマシナリーの発現が増大した株になる。
Tn5−トランスポゾンベクター(pTN6)の構築およびPgroE−kivD(o)−sadB(o)カセットの組込みのためのその使用
Tn5は、大腸菌(E.coli)において特徴が十分に明らかにされている細菌トランスポゾンである(Johnson & Reznikoff、Nature、(1983年)304巻:280〜282頁)。乳酸菌(LAB)のTn5によって媒介される転移系が、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第61/246717号明細書に記載された。この実施例では、LABの染色体へのランダム遺伝子組込みの送達系としてのTn5−トランスポゾンベクターの使用が、開発された。開発されたTn5−トランスポゾンベクター(pTN6)(配列番号:149)は、大腸菌(E.coli)−L.プランタルム(L.plantarum)シャトルベクターである。プラスミドpTN6は、トランスポザーゼ遺伝子(tnp)、トランスポザーゼ認識ヌクレオチド 配列Tn5IE(19塩基対内側端部)およびTn5OE(19塩基対外側端部)、2つの抗生物質耐性マーカー;一方は、クロラムフェニコール耐性のもの、他方は、エリスロマイシン耐性のもの、大腸菌(E.coli)のP15A複製開始点、温度感受性であるL.プランタルム(L.plantarum)のpE194複製開始点(HorinouchiおよびWeisblum、J. Bacteriol.、(1982年)、150巻:804〜814頁)、ならびに2つのloxPヌクレオチド配列(34塩基対)を含む。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、Creリコンビナーゼによるその後の切除のためのloxP部位によってフランキングされている。BamHI、NotI、ScaI、およびSpeIのための制限部位を含む複数のクローニング部位(MSC)は、loxP部位とTn5OE部位の間に位置する。クロラムフェニコール耐性遺伝子、2つのloxP部位、およびMCSは、Tn5IEとTn5OEによってフランキングされている。
pDM5−PldhL1−ilvC(L.ラクティス(L.lactis))ベクターの構築
本実施例の目的は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)NCDO2118(NCIMB 702118)[Godonら、J. Bacteriol.、(1992年)174巻:6580〜6589頁]由来のケトール酸レダクトイソメラーゼのilvCコード領域(配列番号:67)のpDM5ベクターへのクローニングを説明することである。
pDM5−PldhL1−ilvC(P.フルオレッセンス(P.fluorescens)5)ベクターの構築
本実施例の目的は、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)PF5由来のケトール酸レダクトイソメラーゼのilvCコード領域の発現ベクターへのクローニングを説明することである。
pDM5−PldhL1−ilvC(S.ミュータンス(S.mutans))、pDM5−PldhL1−ilvC(S.サーモフィルス(S.thermophilus))、およびpDM5−PldhL1−ilvC(L.メセンテロイデス(L.mesenteroides))ベクターの構築
本実施例の目的は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ用のストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159 ilvCコード領域(コード配列番号:27;タンパク質配列番号:28)、ケトール酸レダクトイソメラーゼ用のストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)LMD−9 ilvCコード領域((コード配列番号:55;タンパク質配列番号:56)、およびケトール酸レダクトイソメラーゼ用のロイコノストック・メセンテロイデス亜種メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)ATCC8293 ilvCコード領域(コード配列番号:39;タンパク質配列番号:40)の発現ベクターへのクローニングを説明することである。
ベクターpDM5−PldhL1−ilvC(L.ラクティス(L.lactis))、pDM5−PldhL1−ilvC(S.ミュータンス(S.mutans))、pDM5−PldhL1−ilvC(S.サーモフィルス(S.thermophilus))、pDM5−PldhL1−ilvC(L.メセンテロイデス(L.mesenteroides))、またはpDM5−PldhL1−ilvC(P.フルオレッセンス(P.fluorescens)Pf5)を含むPN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4+glgB::Tn5−PgroE−kivD(o)−sadB(o)を使用したイソブタノールの生成
本実施例の目的は、ベクターpDM5−PldhL1−ilvC(P.フルオレッセンス(P.fluorescens)Pf5)を含むPN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4+ glgB::Tn5−PgroE−kivD(o)−sadB(o)に比べて、ベクターpDM5−PldhL1−ilvC(L.ラクティス(L.lactis))、pDM5−PldhL1−ilvC(S.ミュータンス(S.mutans))、pDM5−PldhL1−ilvC(S.サーモフィルス(S.thermophilus))、またはpDM5−PldhL1−ilvC(L.メセンテロイデス(L.mesenteroides))を含むPN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4+ glgB::Tn5−PgroE−kivD(o)−sadB(o)において、イソブタノールの生成が増大していることを説明することである。
酵母におけるイソブタノール生成のための様々なKARI酵素の発現
ベクター構築
2つのプラスミドの系を使用して、酵母におけるイソブタノール経路をエンジニアリングした。ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)およびアセト乳酸合成酵素(ALS)の発現用の第1のプラスミドを、pYZ090(配列番号:198)と称した。pYZ090は、酵母CUP1プロモーター(nt位2〜449)から発現されたバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)(nt位457〜2172)由来のalsS遺伝子のコード領域と、その後に続くALS発現用のCYC1ターミネーター(nt位2181〜2430)を有するキメラ遺伝子、および酵母ILV5プロモーター(2433〜3626)から発現されたラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)(nt位3634〜4656)由来のilvC遺伝子のコード領域と、その後に続くKARI発現用のILV5 ターミネーター(nt位4682〜5304)を有するキメラ遺伝子が含まれるように構築された。このベクターにおけるL.ラクティス(L.lactis)KARIコード領域は、LLKARI−PmeI(配列番号:199)およびLLKARI−SfiI 配列番号:200)のプライマーセット、ならびにpLH475−IlvC(Ll)を鋳型として使用して、PCRにより得られたDNA断片であった。pLH475−IlvC(Ll)を構築するために、実施例4に上述したことであるが、IlvC(Lactis)−FおよびIlvC(Lactis)−R(配列番号:201および202)のプライマーセットを用いて、鋳型としてpDM5−PldhL1−ilvC(L.ラクティス(L.lactis))を使用して、ilvC−Llコード領域を増幅させた。PCR生成物をAvrIIおよびSfiIで消化し、pLH475をベースとしたベクターの対応する部位にクローニングし、コンストラクトpLH475−IlvC(Ll)(配列番号:203)、別名pLH475−IlvC(L.ラクティス(L.lactis))を作製した。
fluorescens)ilvCコード領域(ilvC(Pf−5)と置換されている点以外、pYZ090と同じである。IlvC(Pf−5)コード領域は、pILVCy−PmeII(配列番号:205)およびpilvCy−SfiI(配列番号:206)のプライマーセットを用いて、pLH532を鋳型DNAとして使用してで増幅させた。pLH532(配列番号:207)は、pHR81ベクター(ATCC #87541)であり、ILV5コード領域(nt位8118〜9167)がFBAプロモーター(nt位7454〜8110)とCYC1ターミネーター(nt位9176〜9425)との間に位置し、P.フルオレッセンス(P. fluorescence)Pf−5(nt位10192〜11208)由来のIlvCコード領域が、ILV5プロモーター(nt位11200〜12390)とILV5ターミネーター(nt位9434〜10191)の間に位置する。この遺伝子は、配列番号:207の配列pLH532の逆補体である。Pf−5コード領域は、出芽酵母(S.cerevisiae)における発現に最適化されたコドンであった。
2009年9月29日出願の米国仮特許出願第61/246,709号明細書に記載されている遺伝子型BY4700 pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4を有するNYLA84株を、イソブタノール生成に使用した。この株は、出芽酵母(S.cerevisiae)の内因性PDC1、PDC5、およびPDC6遺伝子の挿入−不活性化によって構築した。PDC1、PDC5、およびPDC6遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの主要な3つのアイソザイムをコードする。
pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t−URA3r組込みカセットは、pRS425::GPM−sadB(上述)由来のGPM−sadB−ADHtセグメント(配列番号:156)をpUC19−URA3r由来のURA3r遺伝子に結合させることによって作製した。pUC19−URA3r(配列番号:212)は、インビボでの相同組換えおよびURA3マーカーの除去が可能になるように75bpの相同性反復配列によってフランキングされているpRS426(ATCC #77107)由来のURA3マーカーを含む。2つのDNAセグメントは、SOE PCR(Hortonら、(1989年)Gene 77巻:61〜68頁によって記載されている)により、鋳型としてpRS425::GPM−sadBおよびpUC19−URA3rプラスミドDNAを使用
して、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs Inc.、Beverly,MA;カタログ番号F−540S)、ならびにプライマー114117−11Aから114117−11D(配列番号:213、214、215、および216)、および114117−13Aと114117−13B(配列番号:217および218)を用いて結合させた。
pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t−URA3r組込みカセットは、SOE PCR(Hortonら、(1989年)、Gene、77巻:61〜68頁によって記載されている)により、鋳型としてpLH468およびpUC19−URA3rプラスミドDNAを使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs Inc.、Beverly、MA;カタログ番号F−540S)およびプライマー114117−27Aから114117−27D(配列番号:224、225、226および227)を用いて、pLH468(上述)由来のilvD−FBA1tセグメント(配列番号:223)をpUC19−URA3r由来のURA3r遺伝子に結合させることによって作製した。
内因性HIS3コード領域を欠失するために、his3::URA3r2カセットをURA3r2鋳型DNA(配列番号:231)からPCR増幅させた。URA3r2は、インビボでの相同組換えおよびURA3マーカーの除去が可能になるように500bpの相同性反復配列によってフランキングされているpRS426(ATCC #77107)由来のURA3マーカーを含む。Phusion DNAポリメラーゼおよびプライマー114117−45Aおよび114117−45B(配列番号:232および233)を使用して、PCRを行い、約2.3kbのPCR生成物が生成された。各プライマーのHIS3部分は、HIS3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来するものであった。したがって、URA3r2マーカーの組込みによって、HIS3コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作(Methods in Yeast Genetics、2005年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY、201〜202頁)を使用して、PCR産物をNYLA67に形質転換し、得られた形質転換体を、ウラシルを含まず、2%グルコースを補充した合成完全培地上で30℃において選択した。ヒスチジンを含まず、2%グルコースを補充した合成完全培地上で、形質転換体を30℃でレプリカ平板法にかけることによって正確な組込みが検証されるように、形質転換体をスクリーニングした。URA3rマーカーは、標準プロトコルに従って、2%グルコースおよび5−FOAを補充した合成完全培地上に30℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを5−FOAプレートからSD−URA培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって確認した。NYLA73と呼ばれる得られた同定された株は、遺伝子型:BY4700 pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t Δhis3を有するものである。
Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマーPDC5::KanMXFおよびPDC5::KanMXR(配列番号:234および235)を使用して、pdc5::kanMX4カセットを、株YLR134W染色体DNA(ATCC No. 4034091)からPCR増幅させ、約2.2kbのPCR生成物が生成された。各プライマーのPDC5部分は、PDC5プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来するものであった。したがって、kanMX4マーカーの組込みによって、PDC5コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作(Methods in Yeast Genetics、2005年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY、201〜202頁)を使用して、PCR産物をNYLA73に形質転換し、得られた形質転換体を、1%エタノールおよびジェネテシン(200μg/ml)を補充したYP培地上で30℃において選択した。形質転換体は、プライマーPDC5koforおよびN175(配列番号:236および237)を使用して、PCRによりスクリーニングして、PDC座における正確な組込みおよびPDC5コード領域の置換を検証した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型:BY4700 pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t Δhis3 pdc5::kanMX4を有する。株は、NYLA74と名付けた。
Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマー384および385(配列番号:238および239)を使用して、hxk2::URA3rカセットを、URA3r2鋳型(上述)からPCR増幅させ、約2.3kbのPCR生成物が生成された。各プライマーのHXK2部分は、HXK2プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来するものであった。したがって、URA3r2マーカーの組込みによって、HXK2コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作(Methods in Yeast Genetics、2005年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY、201〜202頁)を使用して、PCR産物をNYLA73に形質転換し、得られた形質転換体を、ウラシルを含まず、2%グルコースを補充した合成完全培地上で30℃において選択した。形質転換体は、プライマーN869およびN871(配列番号:240および241)を使用して、PCRによりスクリーニングして、HXK2座における正確な組込みおよびHXK2コード領域の置換を検証した。URA3r2マーカーは、標準プロトコルに従って、2%グルコースおよび5−FOAを補充した合成完全培地上に30℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを5−FOAプレートからSD −URA培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって、またプライマーN946およびN947(配列番号:242および243)を使用して、PCRによって、正確なマーカー除去を検証することによって確認した。NYLA83と呼ばれる得られた同定された株は、遺伝子型:BY4700 pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t Δhis3 Δhxk2を有するものである。
pdc5::kanMX4カセットは、上述のようにPCR増幅させた。上述のように、PCR断片をNYLA83に形質転換し、形質転換体を選択し、スクリーニングした。NYLA84と呼ばれる同定された正確な形質転換体は、遺伝子型:BY4700 pdc6::PGPM1−sadB−ADH1t pdc1::PPDC1−ilvD−FBA1t Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4を有する。
LiAc/PEG法を使用して、プラスミドpYZ067をpYZ090、pYZ091またはpYZ058に沿って、酵母株NYLA84に形質転換し、形質転換体を、2%グルコースおよび0.1%エタノール(SEG)を補充した(ヒスチジンおよびウラシルを含まない)酵母ドロップアウト培地画は言っている酵母寒天培養プレート上で選択した。30℃で5〜6日後、炭素源として0.1%エタノールおよび2%グルコースを含有する同様の寒天板(SEGプレート)に、個々のコロニーをパッチし、30℃で2〜3日間培養し、下記の振盪フラスコ試験を行った。
Claims (18)
- ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む酵母細胞であって、該リペプチドが、KARIのSLSLクレードのメンバーである、上記酵母細胞。
- SLSLクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、請求項1に記載の酵母細胞。
- ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、および245からなる群から選択される配列と少なくとも約80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の酵母細胞。
- 細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキア(Pichia)からなる群から選択される属の酵母のメンバーである、請求項1に記載の酵母細胞。
- ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であって、該ポリペプチドが、KARIのSLSLクレードのメンバーである、上記微生物細胞。
- SLSLクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、請求項5に記載の微生物細胞。
- ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性をコードするポリペプチドが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、および245からなる群から選択される配列と少なくとも約80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の微生物細胞。
- 細胞が細菌細胞または酵母細胞である、請求項5に記載の宿主微生物細胞。
- 宿主細胞が、エシェリキア、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、エンテロコッカス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、ザイモモナス、サルモネラ、ペディオコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される属の細菌細胞である、請求項8に記載の宿主微生物細胞。
- 宿主細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキアからなる群から選択される属の酵母細胞である、請求項8に記載の宿主微生物細胞。
- アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法であって、
a)ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む酵母細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドはKARIのSLSLクレードのメンバーである、該ステップと;
b)(a)の酵母細胞とアセト乳酸を接触させるステップであって、ここで2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸が生産される、該ステップと;を含む、上記方法。 - SLSLクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、請求項11に記載の方法。
- イソブタノールを生産する方法であって、
a)ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を含む微生物細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドは、KARIのSLSLクレードのメンバーである、該ステップと;
b)ステップ(a)の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと;
を含む、上記方法。 - SLSLクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、請求項13に記載の方法。
- ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、および245からなる群から選択される配列と少なくとも約80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の方法。
- 酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも1つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号:198、203、204、208、または211からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも約80%同一性を有するコード領域を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
- 酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも1つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号:198、203、204、208、または211からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも約80%の同一性を有するキメラ遺伝子を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
- 配列番号:198、203、204、208、または211の配列を有するプラスミド。
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US9790521B2 (en) | 2011-03-24 | 2017-10-17 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Host cells and methods for production of isobutanol |
AU2012249389A1 (en) | 2011-04-29 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids using genes encoding polypeptides having thiolase, HMG-CoA synthase and HMG-CoA reductase enzymatic activities |
BR112013032319A2 (pt) | 2011-06-17 | 2016-12-20 | Butamax Advanced Biofuels Llc | métodos da geração de coprodutos de destilação, coprodutos de destilação, método para atenuar o impacto de contaminantes de fermentação, método para a redução da contaminação por micotoxinas, método para a redução da variabilidade do teor de lipídeos, método para aumento do teor de triglicerídeos, método de produção de um coproduto de destilação para o combustível e método de produção de um coproduto destilação para o biodiesel |
WO2013016717A2 (en) | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Keto-isovalerate decarboxylase enzymes and methods of use thereof |
AU2012347687A1 (en) | 2011-12-09 | 2014-05-29 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Process to remove product alcohols from fermentation broth by multistep flash evaporation |
CA2861613A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentative production of alcohols |
AU2013235391A1 (en) | 2012-03-23 | 2014-09-04 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Acetate supplemention of medium for butanologens |
NZ701099A (en) | 2012-05-11 | 2017-04-28 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Ketol-acid reductoisomerase enzymes and methods of use |
US20140024064A1 (en) | 2012-07-23 | 2014-01-23 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of fermentative alcohols |
BR112015003701A2 (pt) | 2012-08-22 | 2017-12-12 | Butamax Advanced Biofuels Llc | células hospedeiras recombinantes, método para aprimoramento, processo para a produção de um álcool, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão e composição |
EP2895612A1 (en) | 2012-09-12 | 2015-07-22 | Butamax Advanced Biofuels LLC | Processes and systems for the production of fermentation products |
WO2014047421A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Production of renewable hydrocarbon compositions |
JP6407869B2 (ja) * | 2012-09-26 | 2018-10-17 | ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー | ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド |
CA2884876A1 (en) | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Production of fermentation products |
US9273330B2 (en) | 2012-10-03 | 2016-03-01 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Butanol tolerance in microorganisms |
BR112015008077A2 (pt) | 2012-10-11 | 2017-12-05 | Butamax Advanced Biofuels Llc | métodos para a produção de um produto de fermentação |
WO2014106107A2 (en) | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Dhad variants for butanol production |
WO2014105840A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentative production of alcohols |
WO2014159309A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-02 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of alcohols |
HUE045200T2 (hu) | 2013-03-14 | 2019-12-30 | Du Pont | Glicerin-3-foszfát dehidrogenáz butanol elõállítására |
US10006033B2 (en) * | 2013-03-14 | 2018-06-26 | The Regents Of The University Of California | Recombinant microorganisms having a methanol elongation cycle (MEC) |
WO2014151645A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Process for maximizing biomass growth and butanol yield by feedback control |
US9156760B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-13 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for production of butanol using extractive fermentation |
WO2014144210A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism |
US9580705B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-28 | Butamax Advanced Biofuels Llc | DHAD variants and methods of screening |
WO2014144643A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for producing butanol using extractive fermentation |
WO2015002913A1 (en) | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Partial adaptation for butanol production |
US10280438B2 (en) | 2014-08-11 | 2019-05-07 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for the production of yeast |
US11680280B2 (en) | 2018-01-09 | 2023-06-20 | Lygos, Inc. | Recombinant host cells and methods for the production of isobutyric acid |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008020A1 (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-14 | Biotechnology And Biological Sciences Research Council | Nucleic acid coding for an alpha-acetolactate synthase from lactococcus and its applications |
JP2005501912A (ja) * | 2001-09-10 | 2005-01-20 | バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー | 真菌病罹病性作物を処置するためのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の使用 |
WO2008130995A2 (en) * | 2007-04-18 | 2008-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes |
JP2009513136A (ja) * | 2005-10-26 | 2009-04-02 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 四炭素アルコールの発酵性生産 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101160409B (zh) | 2005-04-12 | 2013-04-24 | 纳幕尔杜邦公司 | 获得可发酵糖的生物质处理方法 |
US8945899B2 (en) | 2007-12-20 | 2015-02-03 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Ketol-acid reductoisomerase using NADH |
ES2553726T3 (es) | 2007-12-20 | 2015-12-11 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Cetol-ácido reductoisomerasa que utiliza NADH |
US8372612B2 (en) * | 2007-12-21 | 2013-02-12 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Production of four carbon alcohols using improved strain |
US8518678B2 (en) * | 2007-12-21 | 2013-08-27 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production |
US8017375B2 (en) * | 2007-12-23 | 2011-09-13 | Gevo, Inc. | Yeast organism producing isobutanol at a high yield |
US8188250B2 (en) | 2008-04-28 | 2012-05-29 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans |
BRPI0909989A2 (pt) | 2008-06-05 | 2021-06-22 | Butamax Advanced Biofuels Llc | célula de levedura recombinante e método para a produção de um produto |
EP2342330A1 (en) | 2008-09-29 | 2011-07-13 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Enhanced iron-sulfur cluster formation for increased dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria |
CN102186983A (zh) | 2008-09-29 | 2011-09-14 | 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 | 酵母中提高的异源Fe-S酶活性 |
KR101659101B1 (ko) | 2008-09-29 | 2016-09-22 | 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 | 박테리아 [2Fe-2S] 다이하이드록시산 탈수효소의 동정 및 용도 |
WO2010037105A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Butamax™ Advanced Biofuels LLC | Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria |
CA2735948A1 (en) | 2008-09-29 | 2011-04-01 | Butamaxtm Advanced Biofuels Llc | Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria |
BRPI0914521A2 (pt) | 2008-10-27 | 2016-07-26 | Butamax Advanced Biofuels Llc | célula hospedeira microbiana recombinante, método de aumento da produção de isobutanol e método de produção de isobutanol |
US8465964B2 (en) | 2008-11-13 | 2013-06-18 | Butamax (TM) Advanced Biofules LLC | Increased production of isobutanol in yeast with reduced mitochondrial amino acid biosynthesis |
ES2773130T3 (es) | 2014-06-18 | 2020-07-09 | Fotona D O O | Cabeza de tratamiento láser y sistema láser |
-
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2012
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2016
- 2016-07-14 US US15/209,841 patent/US20160319307A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008020A1 (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-14 | Biotechnology And Biological Sciences Research Council | Nucleic acid coding for an alpha-acetolactate synthase from lactococcus and its applications |
JP2005501912A (ja) * | 2001-09-10 | 2005-01-20 | バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー | 真菌病罹病性作物を処置するためのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の使用 |
JP2009513136A (ja) * | 2005-10-26 | 2009-04-02 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 四炭素アルコールの発酵性生産 |
WO2008130995A2 (en) * | 2007-04-18 | 2008-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6015000218; Godon J. et al.: Journal of Bacteriology Vol.174, No.20, 1992, pp.6580-6589 * |
JPN6015000221; Siezen R.J. et al.: Applied and Environmental Microbiology Vol.74, No.2, 2008, pp.424-436 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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