JP2013502584A - 早産リスク評価用バイオマーカーの同定及び定量 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2009年8月20日に出願された米国仮特許出願第61/253,503号明細書に対する優先権を主張する。この出願は、その全ての教示が本明細書によって全体として参照により援用される。
本発明に至った研究は、一部についてNational Institutes of Health、交付金番号第R21HD047319号及び同第U01HD050080号による資金提供を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本明細書に記載されるペプチドは、配列識別子番号(配列番号)によって参照される。配列番号は数値的には配列識別子<400>1、<400>2等に対応する。コンピュータ可読フォーマット(CFR)で書かれた配列表は、全体として参照により援用される。
Rf=(バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間)/(後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間)。
試験には160人の妊婦が関与し、妊娠24週又は28週で血液を採取し、妊娠の最後まで追跡調査した。これらの女性のうち80人は早産(PTB)のエビデンスなく合併症を伴わない妊娠を経た。これを対照群とした。女性のうち80人はPTB(妊娠37週未満)であった。これらの女性をPTB症例群とした。これらの160人の女性の血清を、本明細書に記載されるプロテオミクス技法を用いて試験した。この試験に関わった各群の統計データを表7に掲載する。
2容量のHPLC等級アセトニトリル(400μL)を200μLの血清に添加し、5秒間ボルテックスにかけ、室温で30分間静置した。次に(血清コレクション)からの試料を室温でIEC Micromax RF遠心分離機(Thermo Fisher Scientific、Waltham,MA)において12,000rpmで10分間遠心した。次に上清のアリコートを、300μLのHPLC等級の水が入った微量遠心管に移した。試料を短時間ボルテックスにかけて溶液を混合し、次にそれをLabconco CentriVap Concentrator(Labconco Corporation、Kansas City,MO)において約200μLまで凍結乾燥した。凍結乾燥前に添加するこの容量の水は、溶液からのアセトニトリルの完全な取り出しを促進する。アセトニトリルはタンパク質濃度の決定に用いられるアッセイと適合しないため、これは必須である。製造者の指示に従い実施されるBio−Radマイクロタイタープレートタンパク質アッセイを用いて上清タンパク質濃度を決定した。4μgのタンパク質を含むアリコートを新しい微量遠心管に移し、ほぼ乾固するまで凍結乾燥した。HPLC水で試料を20μLとし、次に20μLの88%ギ酸を使用して酸性化した。
キャピラリー液体クロマトグラフィー(cCL)を実施して試料を分画した。キャピラリーLCは、インハウスで組み立てられた1mm(16.2μL)のマイクロボア保護カラム(Upchurch Scientific、Oak Harbor,WA)と、15cm×250μm内径のキャピラリーカラムとを使用する。保護カラムはドライパックし、キャピラリーカラムはPOROS R1逆相媒体(Applied Biosystems、Framingham,MA)を使用してスラリーパックした。水相(98%HPLC等級H2O、2%アセトニトリル、01.%ギ酸)と有機相(2%HPLC H2O、98%アセトニトリル、0.1%ギ酸)とを使用して、カラム平衡化及びクロマトグラフ分離を実施した。分離は、95%水溶液での3分間のカラム平衡から開始し、次に2.75%/分の勾配で60%有機相まで増加させ、次に7%/分で95%有機相の濃度まで増加させて達成した。勾配は95%有機相で7分間保持して試料のうちより疎水性が高い成分を溶出させ、次に勾配を5分間で95%水相に戻し、その濃度に2分間保持してカラムを再度平衡化した。分離は全て、5μL/分の流量で実施した。クロマトグラフィーでは、Analyst QS(登録商標)(Applied Biosystems、Foster City,CA)により制御して、FAMOS(登録商標)オートサンプラー(Dionex Corporation、Sunnyvale,CA)と共にLC Packings Ultimate Capillary HPLCポンプシステムを使用した。
毎日試料ラン前に外部標準を使用してMS校正を実施した。必要に応じて、信号対雑音比が最適化され、且つ感度が最大化されるように設定を調整した。
試料は別々の日に実行にかけられ、及びカラムは溶出時間が異なり得るため、有効なクロマトグラム(有効なクロマトグラム約15分〜35分)の全体を通じて約2分おきに溶出する平均存在量の10個の内因性分子種を決定した。目的の溶出領域に対して2分間のウィンドウを設定することにより、ファイルサイズを管理し易いまま維持した。各溶出時間マーカーについての所望のm/z領域の溶出は、MSコンピュータのExtract Ion Chromatogram(XIC)機能を使用して可視化される。次に各標本ランについてアライメントピークの溶出時間の各々を決定し、次にSet Selection機能を用いることにより2分間ウィンドウの中心として使用した。これにより当該のウィンドウについて全てのランの位置が同じ中点にアライメントされる。次にShow Spectra機能を使用して、全ての質量スペクトルから単一の平均質量スペクトルを作成することができる。
Q−Star(q−TOF)質量分析器をサポートするソフトウェアプログラムAnalyst(登録商標)により、16件の個別の液体クロマトグラフィーランを編集し、同様の溶出時間におけるそれらのラン内の質量スペクトルを比較することが可能である。上記に説明したとおり、20分間の期間の有効な溶出に対して10個の2分間ウィンドウを設定し、データファイルサイズを管理し易いまま維持した。同様に上記に説明したとおり、2分間ウィンドウをアライメントした。10個の2分間溶出間隔のうち、最初に分析すべき間隔を二番目の2分間ウィンドウとし、これは典型的にはより多くのペプチド種が存在したため選択した。ペプチドをその多価状態の特徴的な外観により同定した。この多価状態は、単一のピーク又は1質量/電荷単位だけ離れた複数のピークではなく、個々のピークが1質量/電荷単位未満しか離れていない、ガウス形状を有する十分に定義された一群のピークとして見える。PTBを起こした8人の対象群、及び対照(PTBなし)からの8人の対象群を色分けして重ね合わせた。次にデータを視覚的に調べ、1色が優位を占めるように見える分子種を記録した。使用したソフトウェアは16個の試料のみの視覚化に制限されていた。16より大きいサンプリングサイズについては、データセットの多重比較を行った。さらに考慮すべき化合物については、データセットの少なくとも3分の2で2つの群間に同じ外観上の違いを観測する必要があった。
時間アライメントに使用される基準ピークの質量及び典型的な溶出時間を表8に要約する。
時間アライメント後、PTB症例群及び対照群を各々色付けして複数の質量スペクトルを重ね合わせる最初のプロセスで、バイオマーカー候補を視覚的に同定した。主に1色のように見えるこれらのピークをさらに試験した。次に個々のスペクトルを、QqTOF質量分析器(Applied Biosystems)用のオペレーティングシステムであるAnalyst(登録商標)ソフトウェア(Applied Biosystems)を備えたコンピュータによるピーク高さの決定に供した。次にバイオマーカーの量を表にした。加えて、症例群と対照群との間で定量的に違いがなかった、同じ時間ウィンドウ内に生じた第2のピークもまた選択した。これは非生物学的ばらつきの低減を可能にする内因性標準に相当した。これは、候補ピークの量を内因性標準の量で除算することにより達成した。各標本についての比の大きさを記録し、PTB症例群と対照群とを比較するスチューデントt検定を用いて統計的有意差を求めた。
Rf=(バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間)/(後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間)
現在の血清プロテオミクス手法の特徴の一つは、あらゆる種に存在した、且つ症例群と対照群との間で差がなかった内因性分子の使用である。この内部標準に対してバイオマーカー存在量を正規化することにより、非生物学的変動が低下し、リスク予測におけるバイオマーカーの利用能力が向上した。正規化は、目的のピーク存在量の基準ピークによる数学的除算を含んだ。存在量は機械導出値であった。所与の分子の存在量は、所与の質量スペクトル中における質量分析器により計測される特定の質量のイオンの数、又は全溶出間隔に相当するいくつかの質量スペクトルで観測される特定の質量のイオンの合計数を表す。分子は、典型的にはクロマトグラフィーカラムから出るまでに1.0〜1.5分を要し、一方で質量スペクトルは当該の溶出間隔の間、1秒ごとに取得される。
上記に説明したとおり、バイオマーカーの予測力の一般的な一尺度は、その感度及び特異度であった。表13及び表14に示されるとおり第1のバイオマーカーの閾値を決定し、PTBを発症するリスクがある対象を特定した。各々についての閾値は、特異度(真陰性率)が80%以上となるように計算した。前述のとおり、これは20%以下の偽陽性率と同じである。これらの数学的に決定された閾値を用いると、表13及び表14に要約するとおり、4つの比から独立して以下の感度(真陽性)及び特異度(真陰性)の比率がもたらされた。
2つの質量分析器間に衝突セルを含むタンデムMSを用いて親ペプチドのフラグメンテーションを生じさせ、第2のMSステップで観測されるフラグメンテーションパターンから検索可能なデータベース(MASCOT)と比較してアミノ配列を決定した。ペプチドのうちの3つは同じ親タンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖4(ITIH4)に由来し、一方、最終的なペプチドは第2のタンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質(IHRP)から得られた。表15は第1のバイオマーカーのアミノ酸配列(それぞれ配列番号1〜3)を提供する。
コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型を含む6つのさらなるバイオマーカー(「第2のバイオマーカー」と定義される)、又はそれらの組み合わせを、第1のバイオマーカー(すなわち配列番号1〜3又はそれらの任意の組み合わせ)の組み合わせと共に分析した。
症例群と対照群との間で存在量に有意差がある第2のバイオマーカー(すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型)を表16に掲載する。上記に説明される方法により第2のバイオマーカーの存在量を決定した。
直前に考察したとおり、第1のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子(CRF)、腫瘍壊死因子α受容体1型(TNFar)、トロンビン−抗トロンビンIII複合体(TAT)、フェリチン(FER)及びラクトフェリチン(lactoferritin)(LACTO)を含む5つのさらなるタンパク質(すなわち、第2のバイオマーカー)と組み合わせることで、89.8%の感度及び81.0%の特異度を有するバイオマーカーのパネルを提供することができる。ロジスティック回帰モデルを用いて、種々のマーカーのこれらの様々な組み合わせを検討した。モデルから、患者についての予測確率が示された。従って、マーカーの組み合わせのカットオフ値は予測確率に基づく。各分析では、≧80%の特異度をもたらす確率を使用した。
以下のELISAアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。目的のペプチド(抗原)に対して免疫学的特異性を有する第1の抗体を96ウェルマイクロタイタープレートの表面上に吸着させる。既知の段階的濃度の目的とするペプチドの25マイクロリットルの血清又は標準を個々にウェルに添加する。血清を第1の抗体と30分間インキュベートする。ウェル表面にコーティングされた第1の抗体が抗原を結合して固定化する。同様にその抗原に対して免疫学的特異性を有する第2の抗体を含む200マイクロリットルの第2の溶液を各ウェルに添加する。第2の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は化学発光前駆体などのマーカーで標識されている。ウェルを30分間インキュベートして第2の抗体を抗原−第1の抗体複合体と結合させることで、それ自体がウェル表面に結合している抗体−抗原−抗体「サンドイッチ」が形成される。次にウェルを慎重且つ完全に洗浄し、結合していない第2の抗体を全て取り除く。次に、第2の抗体標識に特異的な基質を含む溶液を添加する。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、結合した第2の抗体の量に対応してウェル内で色の変化が起こる。化学発光マーカーの場合、基質は非化学発光分子種から光を放つ化学発光生成物に変換される。この生成物から放たれる光はウェル内に存在する抗原の量に比例し、特定の波長で放たれる光を計測してその強度を記録する特殊な分光計「プレートリーダー」により計測される。
以下のELISAアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。このアッセイはELISAアッセイIと同様であり、但し第2の抗体はビオチン分子で標識される。抗体−抗原−抗体の形成後にウェルを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するストレプトアビジンを含む溶液をウェルに添加してビオチン分子と反応させる。この特定のアッセイでは、未着色の基質が着色された生成物に変換される。その特定の波長の吸光度として計測される色の強度が、ウェル内に存在する抗原の量に比例する。その吸光度を、既知の段階的濃度の抗原の一連の校正用標準の吸光度対濃度のプロットと比較することにより、未知試料の濃度を推定することができる。
Claims (26)
- 妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
(a)前記対象からの生体試料中に存在する第1のバイオマーカーと第2のバイオマーカーとの組み合わせを検出するステップであって、前記第1のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号1、配列番号2、配列番号3、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体1型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
(b)前記生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの量を定量するステップと、
を含む、方法。 - ステップ(b)が、前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの存在量を計測するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの存在量を、早産を起こさなかった対象から得られた対照生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 早産リスクの増加を特定するステップが、対照生体試料中の前記少なくとも1つのペプチドの対照濃度と比べて前記生体試料中の前記少なくとも1つのペプチドの存在量が有意に低いことを決定するステップを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの存在量を、前記対象からの前記生体試料中の基準分子の対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号1、配列番号2、又は配列番号3を有する少なくとも2つのペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号1、配列番号2、又は配列番号3を有する少なくとも3つのペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型からなる群から選択される少なくとも2つのタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型からなる群から選択される少なくとも3つのタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型からなる群から選択される少なくとも4つのタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体1型である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のバイオマーカーが配列番号1である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出ステップ(a)がプロテオミクス技法を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出ステップ(a)が、(1)抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記生体試料を抗体と接触させるステップであって、前記抗体が、前記第1のバイオマーカー又は前記第2のバイオマーカーのいずれかに対して免疫学的特異性を有する、ステップと;(2)前記抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中の前記第1又は前記第2のバイオマーカーを検出するステップとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体が担体分子にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体が固体支持体にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体−抗原複合体の形成後、前記固体支持体上の前記抗体に結合していない前記生体試料の任意の成分が除去される、請求項17に記載の方法。
- 前記生体試料が、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が血清である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が血液である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
(a)前記対象から生体試料を採取するステップと、
(b)前記生体試料を第1の抗体と第2の抗体とに接触させるステップであって、前記試料を前記第1の抗体と前記第2の抗体とに接触させると、前記第1の抗体が第1のバイオマーカーに結合して第1の抗体−抗原複合体を形成し、及び前記第2の抗体が第2のバイオマーカーに結合して第2の抗体−抗原複合体を形成し;前記第1のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号1、配列番号2、配列番号3、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第2のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体1型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
(c)前記第1の抗体−抗原複合体及び前記第2の抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中のその前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの量を定量するステップと、
(d)前記生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの量を、早産を起こさなかった対象における同じバイオマーカーの量と比較するステップであって、それにより前記早産リスクを評価するステップと、
を含む、方法。 - 前記第1の抗体及び前記第2の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項22に記載の方法。
- 妊娠中の対象における早産リスクを評価するためのキットであって、
(a)少なくとも第1の抗体及び第2の抗体であって、前記第1の抗体が、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3を含むアミノ酸配列を有する第1のバイオマーカーに選択的に結合して第1の抗体−抗原複合体を形成する能力を有し、及び前記第2の抗体が、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体1型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第2のバイオマーカーに選択的に結合して第2の抗体−抗原複合体を形成する能力を有する、第1の抗体及び第2の抗体と、
(b)前記第1の抗体−抗原複合体及び前記第2の抗体−抗原複合体の形成をアッセイするため前記第1の抗体及び前記第2の抗体と機能上関連付けられる指標と、
を含む、キット。 - 前記生体試料中の前記第1のバイオマーカー及び前記第2のバイオマーカーの量を定量するように構成される指標をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記第1の抗体及び前記第2の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項24に記載のキット。
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