JP2013173691A - 口腔用抗菌剤、口腔内の抗菌方法、及び口腔内疾患治療薬 - Google Patents

Abstract

【課題】生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性に優れる口腔用抗菌剤、該口腔用抗菌剤を用いた口腔内の抗菌方法及び口腔内疾患治療薬の提供。
【解決手段】本発明の口腔用抗菌剤は、デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる口腔用抗菌成分を含有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、口腔菌に対して抗菌作用を有する口腔用抗菌剤、該口腔用抗菌剤を用いた口腔内の抗菌方法及び口腔内疾患治療薬に関する。

人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌等の口腔機能が低下する。これらの中でも、唾液分泌が低下すると、歯周病、口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭等の口腔疾患が増大する。このような口腔疾患は、一個人のみならず高齢化社会を迎える日本全体にとって大きな問題である。

これまで、口腔ケア用品等に添加される抗菌成分又は殺菌成分としては、エタノール等の有機溶剤や抗生物質などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記有機溶剤を用いた口腔ケア用品は、体質的に受け入れられないという問題、乳幼児には使用できないという問題があり、前記抗生物質を用いた口腔ケア用品では、長期間使用により耐性菌が出現するという問題がある。

一方、動物、植物、昆虫、微生物等の様々な生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、多糖分解酵素や溶菌酵素などのタンパク質やアミノ酸が約１０個〜約５０個程度ならなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。これらの抗菌成分は、前記抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じさせにくいという特性を有することから、口腔用抗菌剤としての利用が期待されている。

生物由来の抗菌剤として、例えば、イネ由来の抗菌タンパク質であるオリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）のジンジパインを阻害することが知られているものの、その菌体に対して直接抗菌活性を示すものではない。

したがって、生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性に優れる口腔用抗菌剤、該口腔用抗菌剤を用いた口腔内の抗菌方法及び口腔内疾患治療薬の開発が強く求められているのが現状である。

特開２００７−８４４７１号公報

本発明は、前記従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性に優れる口腔用抗菌剤、該口腔用抗菌剤を用いた口腔内の抗菌方法及び口腔内疾患治療薬を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる口腔用抗菌成分により、口腔菌が抗菌されることを知見した。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる口腔用抗菌成分を含有することを特徴とする口腔用抗菌剤である。
＜２＞ α−１，４グリコシド結合切断酵素が、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼの少なくともいずれかである前記＜１＞に記載の口腔用抗菌剤である。
＜３＞ 口腔用抗菌成分が、α−１，６グリコシド結合を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の口腔用抗菌剤である。
＜４＞ 抗菌される口腔菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の口腔用抗菌剤である。
＜５＞ １ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌのデンプンと１０ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌのペプトンとを、１００℃〜１３０℃、１０分間〜２０分間、及び１気圧〜３気圧の条件で加熱乃至加圧してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を前記デンプン１ｇ／Ｌに対してタンパク質濃度で１．５μｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬ添加し、３０℃〜４０℃かつ２４時間〜７２時間の条件で反応させることにより得られる口腔用抗菌成分であって、
前記口腔用抗菌成分が、α−１，６グリコシド結合を有し、抗菌される口腔菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の口腔用抗菌剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の口腔用抗菌剤を用いて口腔菌を抗菌する工程を含むことを特徴とする口腔内の抗菌方法である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の口腔用抗菌剤を含有することを特徴とする口腔内疾患治療薬である。

本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性に優れる口腔用抗菌剤、該口腔用抗菌剤を用いた口腔内の抗菌方法及び口腔内疾患治療薬を提供することができる。

（口腔用抗菌剤）
本発明の口腔用抗菌剤は、口腔用抗菌成分を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。

＜口腔用抗菌成分＞
前記口腔用抗菌成分は、デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる成分である。また、前記口腔用抗菌成分は、α型に配位したデンプンにおいて、１位と６位の炭素間でできる結合、即ち、α−１，６グリコシド結合を有する成分である。

−組成物−
前記組成物は、前記デンプンと前記ペプトンとを加熱してなる組成物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

−−デンプン−−
前記デンプンとしては、グルコース分子がグリコシド結合により重合した高分子化合物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、口腔用抗菌成分を効率よく製造できる点で、溶性デンプンが好ましい。また、前記デンプンには、分子量が比較的小さいアミロース、及び分子量が比較的大きいアミロペクチンが共存している。

前記アミロースは、前記アミロペクチンと共に前記デンプンの成分をなす多糖類の一種であり、前記デンプン中に約２０％〜２５％含有される。前記アミロースは、下記一般式（１−１）で表され、Ｄ−グルコースがα−１，４グリコシド結合で直鎖状に重合した高分子化合物であり、１分子中に還元性末端基、非還元性末端基を各１個ずつ有する。
ただし、前記一般式（１−１）中、ｎは、繰返し単位数を示す。

前記アミロペクチンは、前記アミロースと共に前記デンプンの成分をなす多糖類の一種であり、前記デンプン中に約７５％〜８０％含有される。前記アミロペクチンは、下記一般式（１−２）で表される部分構造を有し、Ｄ−グルコースがα−１，４グリコシド結合で直鎖をなす所々から、α−１，６グリコシド結合の枝分かれをした分岐状の高分子化合物である。前記アミロペクチン中に含まれるα−１，６グリコシド結合の結合数は全体の約４％である。

前記デンプンとしては、特に制限はなく、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。前記市販品としては、例えば、可溶性デンプン（和光純薬工業社製）などが挙げられる。

−−ペプトン−−
前記ペプトンは、タンパク質のアルカリ、酸、酵素等による部分加水分解物であり、誘導タンパク質の一種であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大豆ペプトン、プロテオーゼペプトン、トリプチケースペプトン、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトンなどが挙げられる。

前記ペプトンとしては、特に制限はなく、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。前記市販品としては、例えば、トリプチケースペプトン（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）などが挙げられる。

−−加熱条件−−
前記加熱条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、口腔用抗菌成分を効率よく製造できる点で、前記デンプンと前記ペプトンとを含む組成物を１００℃〜１３０℃で、１０分間〜２０分間、１気圧〜３気圧の条件で加熱することが好ましく、前記デンプンと前記ペプトンとを含む組成物を１２１℃、１５分間、２気圧の条件で加熱することがより好ましい。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素−
前記α−１，４グリコシド結合切断酵素としては、α−１，４グリコシド結合を切断する酵素であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３）などが挙げられる。

前記α−アミラーゼ（別名：１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドラーゼ、グリコゲナーゼ）は、デンプンやグリコーゲン中に有するα−１，４グリコシド結合を不規則に切断し、多糖乃至オリゴ糖を生成する酵素である。
前記β−アミラーゼ（別名：１，４−α−Ｄ−グルカングルカノマルトヒドラーゼ、グリコゲナーゼ、サッカロゲンアミラーゼ）は、デンプンやグリコーゲン中に有するα−１，４グリコシド結合を切断して麦芽糖（還元性二糖）を生成する酵素である。
前記α−グルコシダーゼ（名称：グルカン１，４−α−グルコシダーゼ；別名：１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドラーゼ、エキソ１，４−α−グルコシダーゼ、γ−アミラーゼ、リソソーマルα−グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ）は、糖鎖の非還元末端のα−１，４グリコシド結合を切断してブドウ糖（単糖）を生成する酵素である。

前記α−１，４グリコシド結合切断酵素の分離源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物、植物、微生物などが挙げられる。
前記動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、豚などが挙げられ、具体的な分離源としては、ヒトの唾液、ヒトの膵臓、豚の膵臓などが挙げられる。
前記植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネなどが挙げられ、具体的な分離源としては、日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の精白米（砕米）の抽出液、日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の米糠の抽出液などが挙げられる。
前記微生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、糸状菌、細菌などが挙げられ、具体的な分離源としては、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の培養上清、バチルス・サブティリス（枯草菌）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養上清、アスペルギルス・オリザエ（ニホンコウジカビ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の培養上清、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の培養上清などが挙げられる。

前記α−１，４グリコシド結合切断酵素としては、特に制限はなく、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記α−１，４グリコシド結合切断酵素の合成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）公知の遺伝子工学的手法により前記α−１，４グリコシド結合切断酵素をコードする遺伝子を単離又は合成して組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより合成する方法、（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写乃至翻訳系によって合成する方法などが挙げられる。
前記α−１，４グリコシド結合切断酵素の市販品としては、例えば、α−アミラーゼ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来（シグマアルドリッチ社製）、β−アミラーゼ，大麦由来（和光純薬工業株式会社製）、α−グルコシダーゼ，イネ由来（シグマアルドリッチ社製）などが挙げられる。

前記α−１，４グリコシド結合切断酵素の前記デンプンに対する添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、口腔用抗菌成分を効率よく製造できる点で、前記デンプン５ｇ／Ｌに対して、タンパク質濃度として１０μｇ／ｍＬ以上添加することが好ましい。

−口腔用抗菌成分を調製する方法−
前記口腔用抗菌成分を調製する方法としては、前記デンプンと前記ペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより調製する方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、生理食塩水、その他の水溶性溶媒、賦形剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、吸収促進剤、滑沢剤、矯味剤、保存料、日持向上剤、酸化防止剤、甘味料、着色剤、乳化剤、増粘ゲル化剤、品質改良剤、調味料、酸味料、強化剤、香料、界面活性剤、保湿剤、シリコーン類、高級アルコール、低級アルコール、動植物由来抽出エキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、防腐剤などが挙げられる。

＜抗菌作用＞
前記口腔用抗菌剤が抗菌作用を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗菌試験等の公知試験方法を用いて確認する方法などが挙げられる。

前記口腔用抗菌剤の抗菌される対象としては、口腔内で生息できる菌であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，歯周病原因菌）；フゾバクテリウム・ヌクレアーツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ，歯周病原因菌）；エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ，歯周病関連細菌）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ，口腔カンジダ症原因菌）などが好ましい。これらの中でも、本発明の口腔用抗菌剤により効果的に抗菌することができる点で、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，歯周病原因菌）が好ましい。

＜使用形態＞
前記口腔用抗菌剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記に記載の投与方法、投与対象、剤形などが挙げられる。

−投与方法−
前記口腔用抗菌剤の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与などが挙げられる。
前記口腔用抗菌剤の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記口腔用抗菌剤の個体への投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食前に予防的に投与してもよく、食後に治療的に投与してもよい。

−投与対象−
前記口腔用抗菌剤の投与対象となる動物種としては、口腔菌に感染する可能性のある動物種であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、トリ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどが挙げられる。

−剤形−
前記口腔用抗菌剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、内服液剤、シロップ剤、ゲル剤、軟膏剤、スプレー剤などが挙げられる。

＜用途＞
本発明の口腔用抗菌剤は、生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性に優れるため、後述する口腔内の抗菌方法、口腔内疾患治療薬として用いることができるだけでなく、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料、食品添加剤、飼料添加剤等として用いることができる。

（口腔内の抗菌方法）
本発明の口腔内の抗菌方法は、上述した本発明の口腔用抗菌剤を用いて口腔菌を抗菌する工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
前記抗菌する工程としては、上述した本発明の口腔用抗菌剤を用いて口腔菌を抗菌する工程であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記口腔用抗菌剤を口に含み、口腔菌を抗菌する工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯及び口腔表面をブラッシングする工程、口の中を水等ですすぐ工程などが挙げられる。

（口腔内疾患治療薬）
本発明の口腔内疾患治療薬は、上述した本発明の口腔用抗菌剤を含み、更に必要に応じて薬学的に許容される担体及び添加剤を含む。
前記口腔用抗菌剤の前記口腔内疾患治療薬における配合割合としては、所望の抗菌作用が得られるのに十分な量であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記薬学的に許容される担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記口腔内疾患治療薬は、歯原性疾患（歯周病、多発性齲蝕症）、口腔乾燥症、食餌（食物残渣）、舌苔等の口腔内疾患の治療薬として好適に使用することができる。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ〔３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ〕，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ.Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ〔Ｅｄ．〕，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、該方法を修飾、改変等した方法を用いて、実験を実施することができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明がない場合、該方法を用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載及び前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。

（抗菌試験）
試験例１〜６では、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対して抗菌作用を有する物質の検討結果を示す。

（試験例１）
試験例１では、変法ＧＡＭ培地（デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に該当）に、表１に示す各種酵素を添加したものを用いて、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の抗菌活性を試験した。

−抗菌対象−
抗菌対象であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７の菌体復元から濁度測定までの手順を示す。まず、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ細胞懸濁液（８０μＬ）を、変法ＧＡＭ培地（Ｎ_２：ＣＯ_２（体積比）＝９：１）に播種した後、３７℃のインキュベーターに入れて２４時間培養した。その後、新たな培地に植え継ぎ、更に１２時間培養したものを段階希釈してＯＤ_６５０＝５．０×１０^−５の菌液を調製した。これを抗菌対象とした。

−抗菌試験の条件−
抗菌試験は、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定することにより行った。まず、培地（１．３３倍濃度に調製したもの）３００μＬ、酵素１００μＬ、及び抗菌対象の菌液１００μＬを混合した。この混合液を９６穴プレート（９６ Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに１００μＬずつ分注して［抗菌作用試験用培養プレート］とした。そして、嫌気ジャー（三菱ガス化学社製）に、［抗菌作用試験用培養プレート］、脱酸素剤（三菱ガス化学社製）、及び嫌気指示薬（三菱ガス化学社製）を入れて３７℃で４８時間〜７２時間、嫌気培養した。
なお、コントロールには、上記酵素を滅菌水に変更したものを用い、ブランクには、上記酵素を滅菌水に変更し、上記菌液を培地（１倍濃度に調製したもの）に変更したものを用いた。また、上記酵素は、予め、ろ過フィルター（ＤＩＳＭＩＣ（登録商標）−２５ｃｓ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ（０．２０μｍ品）、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて前処理を行ったものを使用した。

−抗菌活性の評価方法−
嫌気培養後の［抗菌作用試験用培養プレート］の各ウェルに１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（Ｋｉｋｋｏｍａｎ社製）を添加し、１０分間攪拌することで生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させてサンプルとした。次に、予め９６穴培養プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に対して上記サンプルを５０μＬずつ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー１４２０（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＡＲＶＯＴＭＭＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として測定した。また、抗菌活性は、抗菌成分を含まないコントロールのＲＬＵを指標とした相対値（％）で表した。１サンプルにつき２回測定を行い、測定は、各菌の対数増殖期初期において行った。なお、ＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・Ｇｌｏ^ＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。以上により、微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定した。結果を表１に示す。

−結果−
試験例１より、変法ＧＡＭ培地にα−１，４グリコシド結合切断酵素を添加すると、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が顕著に阻害されることがわかった（表１参照）。一方、変法ＧＡＭ培地にα−１，６グリコシド結合切断酵素を添加した場合には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が阻害されなかった（表１参照）。
したがって、抗菌活性を示す成分は、変法ＧＡＭ培地中に含まれる成分をα−１，４グリコシド結合切断酵素により部分的に切断された成分であって、α−１，６グリコシド結合を有する成分であることが示唆された。

（試験例２）
試験例２では、試験例１において示唆された変法ＧＡＭ培地中に含まれるどの成分が、抗菌活性に起因するのかを検討した。表２に示す各種培地とα−１，４グリコシド結合切断酵素（α−アミラーゼ）とを併用して、抗菌活性の有無を試験した。

−抗菌対象−
試験例１と同様に調製した抗菌対象（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を使用した。

−抗菌試験の条件−
試験例１において使用した酵素及び培地を表２に示すもの変更したこと以外は、試験例１と同様の方法により抗菌試験を行った。

−抗菌活性の評価方法−
試験例１と同様の評価方法により抗菌活性を評価した。結果を表２に示す。

−結果−
試験例２より、変法ＧＡＭ培地及びＴＳＢＳ培地にα−アミラーゼを添加すると、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が顕著に阻害されることがわかった（表２参照）。一方、ＴＳＢ培地にα−アミラーゼを添加した場合には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が阻害されなかった（表２参照）。抗菌活性が確認されたＴＳＢＳ培地（溶性デンプン有）と、抗菌活性が確認されなかったＴＳＢ培地（溶性デンプン無）との違いは、溶性デンプン添加の有無のみである。
したがって、抗菌作用を示す成分は、培地中に含まれる溶性デンプンをα−１，４グリコシド結合切断酵素により部分的に切断して得られた成分（溶性デンプンの分解物）であることが示唆された。

（試験例３）
試験例３では、試験例２において溶性デンプンの分解物が抗菌作用を有することが示唆されたため、溶性デンプンの分解物として想定された成分（表３参照）を用いて、該分解物のみで抗菌作用を有するか否か試験した。

−抗菌対象−
試験例１と同様に調製した抗菌対象（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を使用した。

−抗菌試験の条件−
試験例１において使用した酵素（１００μＬ）を表３に示す溶性デンプンの分解物（１００μＬ）に変更し、更に試験例１では変法ＧＡＭ培地（３００μＬ）のみで試験していた点を、試験例３では変法ＧＡＭ培地（３００μＬ）及びＴＳＢ培地（３００μＬ）の両方で試験した点に変更したこと以外は、試験例１と同様の方法により抗菌試験を行った。

−抗菌活性の評価方法−
試験例１と同様の評価方法により抗菌活性を評価した。結果を表３に示す。

−結果−
試験例３より、溶性デンプンの分解物として想定されたグルコース、マルトース、及びマルトトリオースの抗菌活性について試験したが、いずれもＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖を阻害しないことがわかった（表３参照）。また、溶性デンプン分解物やその加工品として市販されている３種類のデキストリン、４種類のデキストラン、プルラン、及びイソマルトオリゴ糖の抗菌活性を確認したが、いずれもＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖を阻害しないことがわかった（表３参照）。
したがって、溶性デンプンの分解物やその加工品のみでは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖を阻害できないことが示唆された。

（試験例４）
試験例４では、試験例３より、溶性デンプンの単なる分解物のみでは抗菌作用を有さないことがわかったため、溶性デンプンを酵素処理（α−アミラーゼで３７℃、２４時間糖化処理）して得られた分解物（糖化液）を用いて、その抗菌活性を試験した。

−抗菌対象−
試験例１と同様に調製した抗菌対象（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を使用した。

−抗菌試験の条件−
試験例１において使用した酵素（１００μＬ）を、溶性デンプンを酵素処理して得られた分解物（１００μＬ）に変更し、更に試験例１で使用した変法ＧＡＭ培地（３００μＬ）をＴＳＢ培地（３００μＬ）に変更したこと以外は、試験例１と同様の方法により抗菌試験を行った。

−抗菌活性の評価方法−
試験例１と同様の評価方法により抗菌活性を評価した。結果を表４に示す。

−結果−
試験例４より、溶性デンプンを酵素処理して得られた分解物の抗菌活性を確認したが、いずれもＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖を阻害しないことがわかった（表４参照）。
したがって、溶性デンプンを酵素処理して得られた分解物のみでは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖を阻害できないことが示唆された。

（試験例５）
試験例５では、試験例４より、溶性デンプンを酵素処理して得られた分解物のみでは抗菌作用を有さないことがわかったため、「加熱した」溶性デンプンを酵素処理して得られた分解物（糖化液）を用いて、その抗菌活性を試験した。

−抗菌対象−
試験例１と同様に調製した抗菌対象（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を使用した。

−抗菌試験の条件−
試験例１において使用した酵素及び培地を、表５に示す酵素及び培地に変更したこと以外は、試験例１と同様の方法により抗菌試験を行った。

−抗菌活性の評価方法−
試験例１と同様の評価方法により抗菌活性を評価した。結果を表５に示す。

−結果−
試験例５より、培地Ａ〜Ｂ及び培地Ｅを用いると、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が阻害されることがわかった（表５参照）。一方、培地Ｃ〜Ｄを用いた場合には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が阻害されなかった（表５参照）。培地Ａ〜Ｂ及びＥに共通している点は、溶性デンプンとペプトンとを共存させて加熱させた成分が含まれている点にあるが、培地Ｃ〜Ｄには、溶性デンプンとペプトンとを共存させて加熱させた成分が含まれていない。
以上の試験例１〜５の結果から、抗菌成分は、溶性デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる成分であって、α−１，６グリコシド結合を含む成分であることが示唆された。

（試験例６）
試験例６では、変法ＧＡＭ培地（デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に該当）に、植物、微生物、動物等から分離されたα−１，４グリコシド結合切断酵素を添加したものを用いて、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の抗菌活性を試験した。

−抗菌対象（菌液）の調製−
抗菌対象であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体復元から濁度測定までの手順を示す。まず、表６に示すように、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ細胞懸濁液（８０μＬ）を、変法ＧＡＭ培地（Ｎ_２：ＣＯ_２（体積比）＝９：１）に播種した後、３７℃のインキュベーターに入れて２４時間培養した。その後、新たな培地に植え継ぎ、更に１２時間培養したものを段階希釈してＯＤ_６５０＝５．０×１０^−５の菌液を調製した。これを抗菌対象とした。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素（１）の調製−
α−１，４グリコシド結合切断酵素（１）として、日本晴の精白米から精製したＡｍｙＩ−Ｉと同様のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼ（ＡｍｙＩ−Ｉ，３５．２ｎＭ品）を使用した。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素（２）の調製−
α−１，４グリコシド結合切断酵素（２）として、日本晴の発芽米から精製したα−アミラーゼを使用した。まず、２．５質量％の次亜塩素酸中で３０分間振とうすることにより殺菌消毒した日本晴の種籾を、暗所３０℃で４日間〜５日間インキュベートし、５ｃｍ程度にまで発芽させた。この発芽米１００ｇ（湿重量）を２７０ｍＬの２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］＝［２０ｍＭのＣＨ_３ＣＯＯＮａ−３Ｈ_２Ｏ］及び［１．２ｍＭのＣａＣｌ_２−Ｈ_２Ｏ，０．６ｍＭのＮａＣｌ］を加えてフードプロセッサーで粉砕して、濾液を得た。この濾液に対して７０質量％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩攪拌することによりタンパク質を析出乃至沈殿させた。該析出乃至沈殿物を２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］１０ｍＬで再溶解させ、７０℃、１５分間の熱処理と１０分間の遠心分離を行い、その上清を［粗タンパク質抽出液Ｂ］とした。なお、以降のクロマトグラフィー操作は、全て０℃〜４℃で行い、透析膜として、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ：１，０００（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製）を使用した。

アフィニティークロマトグラフィーを用いて［粗タンパク質抽出液Ｂ］から［タンパク質溶出液Ｂ１］を得た。まず、２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］で平衡化したβ−シクロデキストリンをカップリングさせたＥｐｏｘｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラム（１．０ｃｍ×２．０ｃｍ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を［粗タンパク質抽出液Ｂ］に供して、０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］で洗浄した後、７ｍＭのβ−シクロデキストリンを含む２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］1０ｍＬを用いて吸着タンパク質を溶出した（流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、分取量：０．５ｍＬ）。得られた吸着タンパク質をフラクションコレクター（ＳＦ−２１２０、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）により分画した。そして得られたタンパク質溶出液（ＡｍｙＩ−１を含む溶出液）中のβ−シクロデキストリンを除くため、１Ｍのグルコースを含む２０ｍＭ［ＢｕｆｆｅｒＢ］１Ｌで３時間〜４時間透析した後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１Ｌで一晩透析して［タンパク質抽出液Ｂ１］を得た。

強イオン交換クロマトグラフィーを用いて［タンパク質溶出液Ｂ１］から［タンパク質溶出液Ｂ２］を得た。このクロマトグラフィー操作は、タンパク質精製システム（ＡＫＴＡ ＰＵＲＩＦＩＥＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用した。まず、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した強イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ Ｑカラム，０．５ｃｍ×５ｃｍ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に［タンパク質溶出液Ｂ１］を供して、同バッファーで洗浄した後、０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌを用いて濃度勾配により吸着タンパク質を溶出した（流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、溶出量：２０ｍＬ、分取量：０．５ｍＬ）。得られたタンパク質溶出液を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析して脱塩を行い［タンパク質溶出液Ｂ２］とした。このα−アミラーゼを含む［タンパク質溶出液Ｂ２］をα−１，４グリコシド結合切断酵素（２）として使用した。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素（３）の調製−
α−１，４グリコシド結合切断酵素（３）として、微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼ（溶液品）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析して１０μＭ溶液に調製したものを使用した。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素（４）の調製−
α−１，４グリコシド結合切断酵素（４）として、豚の脾臓（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来のα−アミラーゼ（溶液品）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析して１０μＭ溶液に調製したものを使用した。

−α−１，４グリコシド結合切断酵素（５）の調製−
α−１，４グリコシド結合切断酵素（５）として、ヒトの唾液（Ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａ）由来のα−アミラーゼ（溶液品）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析して１０μＭ溶液に調製したものを使用した。

−抗菌試験の条件−
試験例１において使用した酵素及び培地を、表６に示す酵素及び培地に変更したこと以外は、試験例１と同様の方法により抗菌試験を行った。

−抗菌活性の評価方法−
試験例１と同様の評価方法により抗菌活性を評価した。結果を表６に示す。

−結果−
試験例６より、変法ＧＡＭ培地（デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に該当）に、α−１，４グリコシド切断酵素を添加したものを用いて培養すると、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖が阻害されることがわかった。また、抗菌成分は、溶性デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる成分であって、α−１，６グリコシド結合を含む成分であることが示唆された。

本発明の口腔用抗菌剤は、生物由来の口腔用抗菌剤であって、口腔菌の菌体に対して強い抗菌作用を有し、かつ、長期間摂取しても安全性が高いため、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料、口腔内の抗菌方法、口腔内疾患治療薬として、好適に使用することができる。

Claims (6)

1. デンプンとペプトンとを加熱してなる組成物に対して、α−１，４グリコシド結合切断酵素を添加することにより得られる口腔用抗菌成分を含有することを特徴とする口腔用抗菌剤。
2. α−１，４グリコシド結合切断酵素が、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼの少なくともいずれかである請求項１に記載の口腔用抗菌剤。
3. 口腔用抗菌成分が、α−１，６グリコシド結合を有する請求項１から２のいずれかに記載の口腔用抗菌剤。
4. 抗菌される口腔菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である請求項１から３のいずれかに記載の口腔用抗菌剤。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の口腔用抗菌剤を用いて口腔菌を抗菌する工程を含むことを特徴とする口腔内の抗菌方法。
6. 請求項１から４のいずれかに記載の口腔用抗菌剤を含有することを特徴とする口腔内疾患治療薬。