JP2013143917A - Preventive or therapeutic agent for fibrosis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、線維症治療剤に関する。具体的には、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１をコードする遺伝子を標的とするsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）及びそれを用いた医薬に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for fibrosis. Specifically, the present invention relates to small interfering RNA (siRNA) targeting a gene encoding Smad3 or MCP-1 and a drug using the same.
肺線維症とは、過剰なコラーゲンと他の細胞外マトリックスの蓄積により肺組織が線維化した症状をいう。肺線維症の中でも、特発性肺線維症は、中間生存期間平均３年で、５年生存率が２０〜４０％の予後不良の慢性難治性疾患である。肺線維症の治療としては、ステロイド剤や免疫抑制剤が用いられているが、予後を改善するような効果的な治療法は無いのが現状であり、新たな治療薬の開発が望まれている。 Pulmonary fibrosis refers to a condition in which lung tissue has become fibrotic due to accumulation of excess collagen and other extracellular matrix. Among pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis is a chronic intractable disease with a poor prognosis with an average intermediate survival period of 3 years and a 5-year survival rate of 20 to 40%. Steroids and immunosuppressants are used to treat pulmonary fibrosis, but there are currently no effective treatments that improve prognosis, and the development of new therapeutics is desired. Yes.
近年、多くの疾患が遺伝子を原因として発症することが明らかにされているが、肺線維症についても、多くの遺伝子の関与が報告されている（特許文献１−４，非特許文献１−６）。肺線維症に関与する主要な因子として、Ｓｍａｄ３（非特許文献１）、ＭＣＰ−１（特許文献３）、ＴＧＦ−β１（特許文献１−２，非特許文献２−６）等が報告されている。 In recent years, it has been clarified that many diseases develop due to genes, but many genes are also involved in pulmonary fibrosis (Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 6). ). As major factors involved in pulmonary fibrosis, Smad3 (Non-patent Document 1), MCP-1 (Patent Document 3), TGF-β1 (Patent Document 1-2, Non-patent Document 2-6) and the like have been reported. Yes.
一方、核酸、特にｓｉＲＮＡは、細胞に存在する特定の配列と同一あるいはほぼ同一な遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害する（ＲＮＡ干渉）。従って、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の発現阻害機能は、特定の遺伝子あるいは遺伝子群の異常な発現により惹起される疾患症状を軽減あるいは治療する上で有用である。肺線維症関連遺伝子についても、ｓｉＲＮＡを用いて当該遺伝子の発現抑制を試みた報告がなされている（特許文献１−４、非特許文献１−６）。 On the other hand, nucleic acids, particularly siRNA, cause degradation of mRNA of a gene that is identical or nearly identical to a specific sequence present in a cell, and inhibits expression of a target gene (RNA interference). Therefore, the target gene expression inhibition function by RNA interference is useful in reducing or treating a disease symptom caused by abnormal expression of a specific gene or gene group. Regarding pulmonary fibrosis-related genes, there have been reports of attempts to suppress expression of the genes using siRNA (Patent Documents 1-4 and Non-Patent Documents 1-6).
しかしながら、これまでに報告されている技術は、実験動物（マウスやラット）の疾患関連遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列の抑制効果を示したのみで、ヒト遺伝子に特異的な効果を十分に示したものではない。また、ｓｉＲＮＡの抑制効果についても、２００ｎＭ（非特許文献１），２０−５００ｎＭ（非特許文献５）における効果を示しているが、効率よく低濃度において肺線維症関連遺伝子の発現を抑制しうる核酸分子については示されていない。 However, the techniques reported so far have only shown the suppressive effect of siRNA sequences on disease-related genes in experimental animals (mouse and rat), but not sufficient effects specific to human genes. . Moreover, about the suppression effect of siRNA, although the effect in 200 nM (nonpatent literature 1) and 20-500 nM (nonpatent literature 5) is shown, it can suppress the expression of a pulmonary fibrosis related gene efficiently in low concentration. The nucleic acid molecule is not shown.
Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡについては、これまでに数十種のｓｉＲＮＡが報告されているが（特許文献１、５−７）、Ｓｍａｄ３の遺伝子の全長は６２５６塩基（GeneBank Accession No. NM_005902.3）、ＭＣＰ−１の遺伝子の全長は７５７塩基（GeneBank Accession No. NM_002982.2）であり、当該遺伝子の全長から約２０ｍｅｒ程度の配列を選び出す組み合わせは無数に存在することから、その中から当該遺伝子の発現をより効率的に抑制できるｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ分子を設計することは、容易なことではない。 Regarding siRNA targeting the Smad3 or MCP-1 gene, several tens of siRNAs have been reported so far (Patent Documents 1 and 5-7), but the total length of the Smad3 gene is 6256 bases (GeneBank Accession No. NM_005902.3), the full length of the gene of MCP-1 is 757 bases (GeneBank Accession No. NM_002982.2), and there are innumerable combinations for selecting a sequence of about 20 mer from the full length of the gene. It is not easy to design a dsRNA or siRNA molecule that can suppress the expression of the gene more efficiently.
本発明は、線維症を治療するために有効なｓｉＲＮＡ及びこれを用いた医薬を提供することに関する。 The present invention relates to providing an siRNA effective for treating fibrosis and a medicament using the same.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトＳｍａｄ３遺伝子またはヒトＭＣＰ−１遺伝子を標的とする特定のｓｉＲＮＡが、ヒト細胞においてＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現を効果的に抑制できることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that specific siRNA targeting the human Smad3 gene or the human MCP-1 gene has an effect on the expression of Smad3 or MCP-1 in human cells. It was found that it can be suppressed.
すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に係るものである。
１）配列番号１の塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに配列番号２の塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。
２）ｓｉＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｒ）から選ばれる上記１）のｓｉＲＮＡ。
（ａ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｃ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｄ）配列番号９に示されるセンス配列と配列番号１０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｅ）配列番号１１に示されるセンス配列と配列番号１２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｆ）配列番号１３に示されるセンス配列と配列番号１４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｇ）配列番号１５に示されるセンス配列と配列番号１６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｈ）配列番号１７に示されるセンス配列と配列番号１８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｉ）配列番号１９に示されるセンス配列と配列番号２０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｊ）配列番号２１に示されるセンス配列と配列番号２２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｋ）配列番号２３に示されるセンス配列と配列番号２４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｌ）配列番号２５に示されるセンス配列と配列番号２６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｍ）配列番号２７に示されるセンス配列と配列番号２８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｎ）配列番号２９に示されるセンス配列と配列番号３０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｏ）配列番号３１に示されるセンス配列と配列番号３２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｐ）配列番号３３に示されるセンス配列と配列番号３４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
３）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）又は２）のｓｉＲＮＡ。
４）前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）−３）のｓｉＲＮＡ。
５）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換され、且つアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）−４）のｓｉＲＮＡ。
６）アンチセンス鎖の５’末端がモノリン酸化された上記１）〜５）のｓｉＲＮＡ。
７）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物。
８）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有するＳｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子発現抑制剤。
９）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する線維症予防又は治療剤。
１０）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する肺線維症予防又は治療剤。
That is, the present invention relates to the following 1) to 10).
1) Base Nos. 647 to 667, Nos. 1816 to 1836, Nos. 2359 to 2387, Nos. 3670 to 3690, Nos. 5486 to 5506, and No. 2 of SEQ ID No. 1 The target sequence is 17 to 21 bases selected from the group consisting of bases 377 to 410, 473 to 493, 533 to 560 and 599 to 631, and the total length is 30 nucleotides or less. An siRNA.
2) The siRNA of 1) above, wherein the siRNA is selected from the following (a) to (r).
(A) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 4
(B) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 6
(C) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 8
(D) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 10
(E) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 12
(F) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 14
(G) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 15 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 16
(H) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 18
(I) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 19 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 20
(J) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 21 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 22
(K) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 23 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 24
(L) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 26
(M) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 28
(N) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 29 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 30
(O) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 31 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 32
(P) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 34
3) The siRNA of the above 1) or 2), wherein continuous 1 to 10 nucleotides excluding overhanging nucleotides from the 3 ′ end of the sense strand of the siRNA are converted to DNA.
4) The siRNA of 1) to 3) above, wherein 1 to 10 nucleotides continuous from the 5 ′ end of the antisense strand of the siRNA are converted to DNA.
5) 1 to 10 consecutive nucleotides excluding overhanging nucleotides from the 3 ′ end of the siRNA sense strand are converted to DNA, and 1 to 10 continuous from the 5 ′ end of the antisense strand SiRNA of said 1) -4) by which the nucleotide was converted into DNA.
6) The siRNA of the above 1) to 5), wherein the 5 ′ end of the antisense strand is monophosphorylated.
7) A pharmaceutical composition comprising the siRNA of any one of 1) to 6) above.
8) A Smad3 gene or MCP-1 gene expression inhibitor containing the siRNA of any one of 1) to 6) as an active ingredient.
9) A fibrosis preventive or therapeutic agent comprising the siRNA of any one of 1) to 6) above as an active ingredient.
10) A preventive or therapeutic agent for pulmonary fibrosis containing the siRNA of any one of 1) to 6) as an active ingredient.
本発明のｓｉＲＮＡは、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現を低濃度で効率よく抑制又は阻害することができるので、線維症の予防又は治療のための医薬として有用である。 Since the siRNA of the present invention can efficiently suppress or inhibit the expression of Smad3 or MCP-1 at a low concentration, it is useful as a medicament for the prevention or treatment of fibrosis.
本発明のｓｉＲＮＡが標的とする配列は、配列番号１の塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに配列番号２の塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基であるが、ここで、各群から選ばれる連続する１７〜２１塩基としては、好ましくは１９〜２１塩基であり、より好ましくは２１塩基である。
配列番号１で示される塩基配列は、Ｓｍａｄ３のｍＲＮＡの塩基配列であり、当該配列情報はＧｅｎＢａｎｋに、GeneBank Accession No. NM_005902.3として、配列番号２で示される塩基配列は、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡの塩基配列であり、当該配列情報はＧｅｎＢａｎｋに、GeneBank Accession No. NM_002982.2として、登録されている。
The sequences targeted by the siRNA of the present invention are the bases of base numbers 647 to 667, bases 1816 to 1836, bases 2359 to 2387, bases 3670 to 3690, and bases 5486 to 5506 of SEQ ID NO: 1. A base, and bases 377 to 410 of SEQ ID NO: 2, bases 473 to 493, bases 533 to 560, and bases 17 to 21 selected from the group consisting of bases 599 to 631 However, as continuous 17-21 bases chosen from each group here, Preferably it is 19-21 bases, More preferably, it is 21 bases.
The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of Smad3 mRNA, the sequence information is GenBank, GeneBank Accession No. NM_005902.3, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is MCP-1 mRNA. The sequence information is registered in GenBank as GeneBank Accession No. NM_002982.2.
本発明のｓｉＲＮＡは、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１のｍＲＮＡの上記標的配列に相補的な配列であるアンチセンス鎖と当該アンチセンス鎖に相補的な配列であるセンス鎖がハイブリダイズしてなるものであり、当該Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１のｍＲＮＡを切断する活性（ＲＮＡ干渉作用）を有し、当該ｍＲＮＡの翻訳を阻止する能力、すなわち当該Ｓｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子の発現を阻害する能力を有する。 The siRNA of the present invention is obtained by hybridizing an antisense strand which is a sequence complementary to the target sequence of Smad3 or MCP-1 mRNA and a sense strand which is a sequence complementary to the antisense strand. And has the activity of cleaving the mRNA of the Smad3 or MCP-1 (RNA interference action), and has the ability to block translation of the mRNA, that is, the ability to inhibit the expression of the Smad3 gene or MCP-1 gene.
本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド長は、センス鎖、アンチセンス鎖が同一のヌクレオチド長であっても異なっていてもよく、その全長は３０ヌクレオチド以下であり、好ましくは２５ヌクレオチド以下、より好ましくは２３ヌクレオチド以下、或いは２１ヌクレオチドである。
また、センス鎖及びアンチセンス鎖の両端は、平滑末端でもよいし、それぞれの鎖の３’側がオーバーハング（突出末端）であっても良い。ここで、「平滑末端」とは、２本鎖ＲＮＡの末端部分において、センス鎖の末端領域とそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域が、１本鎖部分を形成することなく対合している構造を意味する。また、「オーバーハング」は、ダングリングエンドとも称され、２本鎖ＲＮＡの末端部分のセンス鎖の末端領域又はそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域において、対合する塩基が存在しないために２本鎖を形成できず、１本鎖部分（突出末端）が存在している構造を意味する。
突出末端部分の塩基数は１〜１０ヌクレオチドであり、好ましくは１〜４ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１〜２ヌクレオチドである。尚、突出末端の長さは二つの鎖の間で無関係であり、互いに異なる長さであっても良い。突出末端部分のヌクレオチドはＲＮＡでも、ＤＮＡでもよく、標的であるＳｍａｄ３のｍＲＮＡまたはＭＣＰ−１のｍＲＮＡに相補的な塩基が好ましいが、上記ＲＮＡ干渉能を保持する限り相補的でない塩基であってもよい。
The nucleotide length of the siRNA of the present invention may be the same or different in the sense strand and the antisense strand, and the total length is 30 nucleotides or less, preferably 25 nucleotides or less, more preferably 23 nucleotides. Or alternatively 21 nucleotides.
Further, both ends of the sense strand and the antisense strand may be blunt ends, or the 3 ′ side of each strand may be an overhang (protruding end). Here, “blunt end” means that the end region of the sense strand and the end region of the antisense strand that is paired with the end region of the double-stranded RNA are paired without forming a single-stranded portion. Means a structure. In addition, “overhang” is also called a dangling end, because there is no pairing base in the terminal region of the sense strand in the terminal part of the double-stranded RNA or the terminal region of the antisense strand. It means a structure in which a double strand cannot be formed and a single strand portion (protruding end) exists.
The number of bases of the protruding terminal portion is 1 to 10 nucleotides, preferably 1 to 4 nucleotides, and more preferably 1 to 2 nucleotides. Note that the length of the protruding end is irrelevant between the two chains, and may be different from each other. The nucleotide at the protruding terminal portion may be RNA or DNA, and a base complementary to the target Smad3 mRNA or MCP-1 mRNA is preferable, but may be a base that is not complementary as long as the RNA interference ability is maintained. Good.
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡである他、１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡであってもよい。すなわち、本発明のｓｉＲＮＡには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡ、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。さらには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。 The siRNA of the present invention is not only one double-stranded RNA composed of two separate strands, but may also be a double-stranded RNA formed by one strand taking a stem-loop structure. That is, the siRNA of the present invention includes RNA having a loop composed of 2 to 4 nucleotides at the 5 ′ end of the sense strand and the 3 ′ end of the antisense strand, the 3 ′ end of the sense strand and the 5 ′ end of the antisense strand. RNA having a loop consisting of 2 to 4 nucleotides is also included. Furthermore, RNA in which loops of 2 to 4 nucleotides are formed at both ends of the 5 'end of the sense strand and the 3' end of the antisense strand and the 3 'end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand are also included.
本発明のｓｉＲＮＡと標的配列は、同一であることが望ましいが、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる範囲において、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。具体的には、本発明のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、１又は数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、本発明のｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１又は数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したものであってＲＮＡ干渉を誘導できるもの、或いは標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、且つＲＮＡ干渉を誘導できるものが包含される。
尚、この場合のハイブリダイズ条件は、本発明のｓｉＲＮＡを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｉＲＮＡを試薬としてｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃〜70℃で12〜160時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。これらの条件については、当業者に周知であり、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1989)に記載されている。
また、配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))等によって計算すればよく、例えば、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ver.5.1.1；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
The siRNA of the present invention and the target sequence are desirably the same, but may be substantially the same, that is, a homologous sequence as long as the RNA interference can be induced. Specifically, as long as the antisense strand sequence of the siRNA of the present invention and the target sequence hybridize, there may be one or several (eg, 2, 3, 4) mismatches. That is, the siRNA of the present invention has one or several bases substituted, added or deleted to the target sequence and can induce RNA interference, or 85% or more, preferably 90%, with the target sequence. % Or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and those capable of inducing RNA interference are included.
The hybridization conditions in this case are in-vivo conditions when the siRNA of the present invention is administered in vivo and used as a pharmaceutical, and moderate when the siRNA of the present invention is used as a reagent in vitro. Stringent conditions or highly stringent conditions such as 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, hybridization conditions at 50-70 ° C. for 12-160 hours. Is mentioned. These conditions are well known to those skilled in the art and are described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1989).
The sequence identity may be calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)) or the like. For example, genetic information processing software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; It is calculated by performing analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using a software development) homology analysis (Search homology) program.
また、本発明のｓｉＲＮＡには、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、センス鎖又はアンチセンス鎖の何れか一方のヌクレオチドを全てＤＮＡに変換したもの（ハイブリッド型）や、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したもの（キメラ型）が包含される。
ここで、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡへの変換とは、ＡＭＰをｄＡＭＰへ、ＧＭＰをｄＧＭＰへ、ＣＭＰをｄＣＭＰへ、ＵＭＰをｄＴＭＰへ変換することを意味する。
ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが好ましい。キメラ型としては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の３’末端側及びアンチセンス鎖の５’末端側のヌクレオチドを共にＤＮＡに変換したもの、センス鎖の３’末端側又はアンチセンス鎖の５’末端側の何れかのヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチドまでの任意長とするのが好ましく、例えば末端から１〜１３ヌクレオチド、好ましくは１〜１０ヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安定性、安全性等の点から、好適なキメラ型ｓｉＲＮＡとしては、例えばヌクレオチド長がそれぞれ１９〜２１であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’末端側から１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが挙げられる（後記〔表２〕参照）。また、この場合、センス鎖（オーバーハングヌクレオチドを除く）とアンチセンス鎖のＤＮＡ変換数は同一であるのがより好ましい。
In addition, the siRNA of the present invention may be one in which any nucleotide of either the sense strand or the antisense strand is converted to DNA (hybrid type), the sense strand and / or the antisense strand as long as the above-described RNA interference can be induced. In which some nucleotides are converted to DNA (chimeric type).
Here, conversion of RNA nucleotides into DNA means conversion of AMP to dAMP, GMP to dGMP, CMP to dCMP, and UMP to dTMP.
The hybrid type is preferably one in which the nucleotide of the sense strand is converted to DNA. Examples of the chimeric type include those obtained by converting some nucleotides on the downstream side (3 ′ end side of the sense strand, 5 ′ end side of the antisense strand) into DNA. Specifically, the nucleotides on the 3 ′ end side of the sense strand and the 5 ′ end side of the antisense strand are both converted to DNA, either the 3 ′ end side of the sense strand or the 5 ′ end side of the antisense strand And those obtained by converting nucleotides into DNA. The nucleotide length to be converted is preferably an arbitrary length up to a nucleotide corresponding to ½ of the RNA molecule, for example, 1 to 13 nucleotides, preferably 1 to 10 nucleotides from the end. In terms of RNA interference effect, stability of RNA molecule, safety, etc., suitable chimeric siRNAs have, for example, nucleotide lengths of 19 to 21, respectively, and overhanging nucleotides are removed from the 3 ′ end side of the sense strand. 1 to 10, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6 nucleotides and 1 to 10, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6 nucleotides from the 5 ′ end of the antisense strand, Examples include those continuously converted into DNA (see Table 2 below). In this case, the number of DNA conversions of the sense strand (excluding overhanging nucleotides) and the antisense strand is more preferably the same.
また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基及び／又はリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であっても良い。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。
また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾が挙げられる。
リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。
Moreover, the nucleotide (ribonucleotide, deoxyribonucleotide) of the siRNA of the present invention may be a nucleotide analog in which sugar, base and / or phosphate are chemically modified as long as it can induce RNA interference. Examples of nucleotide analogs with modified bases include 5-position-modified uridine or cytidine (for example, 5-propynyluridine, 5-propynylcytidine, 5-methylcytidine, 5-methyluridine, 5- (2-amino) propyl Uridine, 5-halocytidine, 5-halouridine, 5-methyloxyuridine, etc .; 8-position modified adenosine or guanosine (eg, 8-bromognosin, etc.); deazanucleotide (eg, 7-deaza-adenosine, etc.); O- and N -Alkylated nucleotides (for example, N6-methyladenosine etc.) etc. are mentioned.
Examples of nucleotide analogues modified with sugar include, for example, 2′-OH of ribonucleotide is H, OR, R, halogen atom, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , or CN (where , R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group, or an alkynyl group) and the like, and a 5 ′ terminal phosphorylation modification in which the 5 ′ terminal is monophosphorylated.
Examples of nucleotide analogs modified with phosphate include those in which the phosphoester group that binds adjacent ribonucleotides is replaced with a phosphothioate group.
また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ヌクレオチド類似体とは別に、センス鎖の５’末端側又は３’末端側から１〜６番目のヌクレオチド（５’末端、３’末端、又は末端以外の内部の塩基、糖）の少なくとも１つに特定の置換基又は機能性分子が直接又はリンカーを介して結合していてもよく、センス鎖の５’末端側から１〜６番目、好ましくは１〜４番目のヌクレオチドの少なくとも１つに当該置換基又は機能性分子が結合しているのが好ましい。
ここで、置換基としては、一例として、アミノ基；メルカプト基；ニトロ基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のモノ若しくはジアルキルアミノ基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキルチオ基；炭素数２〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のポリエチレンオキサイド基；炭素数３〜３９（好ましくは３〜２１、更に好ましくは３〜１２）のポリプロピレンオキサイド基等を挙げることができる。これらの置換基を結合させることによって、ＲＮＡ干渉効果を顕著に増強させることが可能になる。
In addition, the siRNA of the present invention, apart from the nucleotide analogue, contains the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end side or 3 ′ end side of the sense strand (5 ′ end, 3 ′ end, or an internal portion other than the end). A specific substituent or a functional molecule may be bound directly or via a linker to at least one of the base and sugar), which is 1st to 6th, preferably 1st to 4th from the 5 ′ end side of the sense strand It is preferable that the substituent or the functional molecule is bound to at least one of the nucleotides.
Here, as an example of the substituent, an amino group; a mercapto group; a nitro group; an alkyl group having 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12); 1 to 40 carbon atoms (preferably Is an aminoalkyl group having 2 to 20, more preferably 4 to 12); a thioalkyl group having 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12); 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 2). 20, more preferably 4-12) alkoxyl group; 1-40 carbon atoms (preferably 2-20, more preferably 4-12) aminoalkoxyl groups; 1-40 carbon atoms (preferably 2-20, more Preferably 4 to 12) a thioalkoxyl group; a mono- or dialkylamino group having 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12 carbon atoms); 1 to 40 carbon atoms (preferably -20, more preferably 4-12) alkylthio group; C2-C40 (preferably 2-20, more preferably 4-12) polyethylene oxide group; C3-39 (preferably 3-21, More preferably, the polypropylene oxide group of 3-12) etc. can be mentioned. By binding these substituents, the RNA interference effect can be remarkably enhanced.
機能性分子としては、糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｔＲＮＡを含む）、アプタマー、修飾ヌクレオチド、低分子有機・無機材料、コレステロール、デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。機能性分子を付加することにより、優れたＲＮＡ干渉効果と当該機能性分子に基づく有用効果を兼ね備えさせることができる。 Examples of functional molecules include sugars, proteins, peptides, amino acids, DNA, RNA (including tRNA), aptamers, modified nucleotides, low molecular organic / inorganic materials, cholesterol, dendrimers, lipids, polymer materials, and the like. By adding a functional molecule, it is possible to combine an excellent RNA interference effect and a useful effect based on the functional molecule.
上記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。 Examples of the sugar include monosaccharides such as glucose, galactose, glucosamine, and galactosamine, and oligosaccharides or polysaccharides in which these are arbitrarily combined.
上記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、インポーチンbタンパク質、アビジン、抗体等を挙げることができる。 As said protein, the protein which exists in the living body, the protein which has a pharmacological action, the protein which has a molecule recognition effect etc. can be used, Importin b protein, avidin, an antibody etc. can be mentioned as an example of this protein.
上記ＤＮＡとしては、具体的には、塩基長が５〜５０のＤＮＡ、好ましくは塩基長が５〜２５のＤＮＡが例示される。 Specific examples of the DNA include DNA having a base length of 5 to 50, preferably DNA having a base length of 5 to 25.
上記ペプチドとしては、例えば、オクタアルギニンペプチド Ｒ８、核局在化シグナルペプチド配列（ＨＩＶ−１ ＴａｔやＳＶ４０Ｔ抗原等）、核外移行性シグナルペプチド（ＨＩＶ−１ ＲｅｖやＭＡＰＫＫ等）、細胞膜融合ペプチド等が挙げられる。上記修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型ＤＮＡ／ＲＮＡ等のリン酸骨格を修飾したもの；２’−０Ｍｅ修飾ＲＮＡ、２’−Ｆ修飾ＲＮＡ等の２’修飾ヌクレオチド；ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチドなどが挙げられる（国際公開第２００８／１４０１２６号パンフレット、国際公開第２００９／１２３１８５号パンフレット参照）。 Examples of the peptide include octaarginine peptide R8, nuclear localization signal peptide sequences (such as HIV-1 Tat and SV40T antigen), nuclear export signal peptides (such as HIV-1 Rev and MAPKK), and cell membrane fusion peptides. Is mentioned. Examples of the modified nucleotide include those obtained by modifying a phosphate skeleton such as phosphorothioate-type or boranophosphate-type DNA / RNA; 2′-modified nucleotides such as 2′-0Me-modified RNA and 2′-F-modified RNA; LNA (Locked Nucleic Acid) and ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids) and other modified nucleotides that are cross-linked sugar molecules; PNA (peptide nucleic acid), morpholino nucleotides and other basic skeletons Examples include different modified nucleotides (see WO 2008/140126 pamphlet and WO 2009/123185 pamphlet).
上記低分子有機・無機材料としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質；ビオチン；量子ドット；金微粒子等が挙げられる。上記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。上記脂質としては、例えば、リノール酸、ＤＯＰＥ（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）等の他、国際公開第２００９／１２３１８５号パンフレットに記載の２つの疎水基を有する２本鎖脂質が挙げられる。上記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げられる。 Examples of the low-molecular organic / inorganic material include fluorescent substances such as Cy3 and Cy5; biotin; quantum dots; and gold fine particles. As said dendrimer, a polyamide amine dendrimer etc. are mentioned, for example. Examples of the lipid include a double chain having two hydrophobic groups described in International Publication No. 2009/123185, in addition to linoleic acid, DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) and the like. Lipids. Examples of the polymer material include polyethylene glycol and polyethyleneimine.
ここで、機能性分子を有する基としては、機能性分子の残基そのものであってもよく、また、機能性分子の残基に二官能性リンカーの一方の官能基が結合した基であってもよい。つまり、前者の場合、機能性分子が、上記センス鎖ＲＮＡの所定の部位に直接結合しており、後者の場合、機能性分子が二官能性リンカーを介して上記センス鎖ＲＮＡの所定の部位に結合している。ここで、二官能性リンカーとしては、官能基を２つ含むリンカーであれば特に制限されないが、例えば、N-スクシニミジル＝3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)−１−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノペンチル)-イミノジアセテックアシッド等を使用できる。
上記センス鎖ＲＮＡにおける、置換基若しくは機能性分子又はこれらを連結するリンカーの結合部位については、特に限定されるものではないが、これらがセンス鎖ＲＮＡの所定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していることが好ましい。
Here, the group having a functional molecule may be a residue of the functional molecule itself, or a group in which one functional group of the bifunctional linker is bonded to the residue of the functional molecule. Also good. That is, in the former case, the functional molecule is directly bonded to a predetermined site of the sense strand RNA, and in the latter case, the functional molecule is attached to a predetermined site of the sense strand RNA via a bifunctional linker. Are connected. Here, the bifunctional linker is not particularly limited as long as it includes two functional groups. For example, N-succinimidyl = 3- (2-pyridyldithio) propinate, N-4-maleimidobutyric acid, S- (2-pyridyldithio) cysteamine, iodoacetoxysuccinimide, N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide, N- [5- (3′-maleimidopropylamide) -1-carboxypentyl] iminodiacetic acid, N -(5-aminopentyl) -iminodiacetic acid etc. can be used.
Although there is no particular limitation on the binding site of the substituent or functional molecule or the linker linking these in the sense strand RNA, these constitute the hydroxyl group of the phosphate portion of the predetermined nucleotide of the sense strand RNA. It is preferable that the hydrogen atom is bonded to a hydrogen atom.
本発明のｓｉＲＮＡは、具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｑ）に示すセンス配列とアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子が例示できる。 Specific examples of the siRNA of the present invention include double-stranded RNA molecules formed from a sense sequence and an antisense sequence shown in the following (a) to (q).
また、キメラ型としては、センス鎖の３’末端側から１〜８のヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’末端側から１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが好適に挙げられ、例えば上記の（ｃ）の場合を用いて例示すれば以下のとおりである。 In addition, as the chimera type, a DNA in which any number of nucleotides 1 to 8 from the 3 ′ end side of the sense strand and 1 to 6 nucleotides from the 5 ′ end side of the antisense strand are continuously converted to DNA is preferable. For example, the case of (c) above is exemplified as follows.
本発明のｓｉＲＮＡの製造方法は、特に限定されないが、公知の製造方法、例えば、in vitroで化学的に合成すること、又はプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系により合成することができる。
化学的合成は、ｓｉＲＮＡ構成要素である核酸分子を含むアミダイド樹脂を原料として、核酸合成装置により合成することが可能である。
転写系による合成は、ヘアピン型ＲＮＡをトリミングする試験管内転写法により２本鎖ＲＮＡを合成することが可能である。
The method for producing the siRNA of the present invention is not particularly limited, but can be synthesized by a known production method, for example, in vitro chemical synthesis, or by a transcription system using a promoter and RNA polymerase.
Chemical synthesis can be performed by a nucleic acid synthesizer using amidite resin containing nucleic acid molecules as siRNA constituents as raw materials.
In the synthesis by the transcription system, double-stranded RNA can be synthesized by an in vitro transcription method in which hairpin RNA is trimmed.
斯くして得られる本発明のｓｉＲＮＡは、後記実施例に示すように、ヒト肺胞上皮由来細胞においてＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現をｍＲＮＡレベルで効果的に抑制することができる。
従って、本発明のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能な発現ベクターは、Ｓｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子発現抑制のための医薬、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の過剰発現に起因する疾患、例えば線維症および/または肺がんの予防・治療のための医薬、すなわち線維症および/または肺がんの予防又は治療剤として有用である。
ここで、肺の線維化を来たす疾患としては、間質性肺炎、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD: Chronic obstructive pulmonary disease）、急性呼吸促迫症候群 (ARDS: Acute respiratory distress syndrome）、炎症性肺疾患、肺感染症、放射性肺臓炎、薬剤性間質性肺炎、膠原病に伴う間質性肺炎など多岐にわたるが、原因が特定できない間質性肺炎である特発性間質性肺炎(IIPs)のうち特発性肺線維症 (IPF) が特に好ましい。特発性間質性肺炎（IIPs）には臨床病理学的疾患として、特発性肺線維症（IPF）、非特異的間質性肺炎 (NSIP)、特発性器質化肺炎 (COP/BOOP)、急性間質性肺炎 (AIP)、剥離性間質性肺炎 (DIP)、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患 (RB-ILD)、リンパ球性間質性肺炎 (LIP)等が包含される。
The siRNA of the present invention thus obtained can effectively suppress the expression of Smad3 or MCP-1 at the mRNA level in human alveolar epithelium-derived cells, as shown in Examples below.
Therefore, the siRNA of the present invention and the expression vector capable of expressing the siRNA in the administration subject are drugs for suppressing Smad3 gene or MCP-1 gene expression, diseases caused by overexpression of Smad3 or MCP-1, such as fiber It is useful as a medicament for the prevention and / or treatment of diseases and / or lung cancer, that is, as a preventive or therapeutic agent for fibrosis and / or lung cancer.
Diseases that cause lung fibrosis include interstitial pneumonia, cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), Idiopathic interstitial pneumonia, which is an interstitial pneumonia that cannot be identified for a variety of reasons, including inflammatory lung disease, pulmonary infection, radioactive pneumonitis, drug-induced interstitial pneumonia, and interstitial pneumonia associated with collagen disease Among the IIPs), idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is particularly preferred. For idiopathic interstitial pneumonia (IIPs), the clinicopathological disorders include idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), nonspecific interstitial pneumonia (NSIP), idiopathic organized pneumonia (COP / BOOP), acute Includes interstitial pneumonia (AIP), exfoliative interstitial pneumonia (DIP), interstitial lung disease associated with respiratory bronchiolitis (RB-ILD), lymphocytic interstitial pneumonia (LIP), etc. .
本発明のｓｉＲＮＡを医薬として使用する場合、そのままでも使用することができるが、高度分岐環状シクロデキストリン又はシクロアミロースと複合体を形成させてもよい。ここで、高度分岐環状デキストリンとは、枝作り酵素をアミロペクチンに作用させて生産されるものであり、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度５０〜５０００のグルカンをいう。ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である。高度分岐環状デキストリンの好適な形態として、上記グルカンの内分岐環状構造部分の重合度が１０〜１００であるもの、上記グルカンの外分岐構造部分の重合度が４０以上であるもの、上記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が平均で１０から２０であるものが例示される。また、高度分岐環状シクロデキストリンは市販されており、本発明では市販品を使用することもできる。
シクロアミロースは、グルコースがα１，４結合により結合した環状α−１，４−グルカンであり、へリックス構造の内側に立体的で奥行きのある空洞部分を有している。本発明に使用されるシクロアミロースにおけるグルコースの重合度としては、特に制限されるものではないが、例えば１０〜５００、好ましくは１０〜１００、更に好ましくは２２〜５０が例示される。シクロアミロースは、アミロマルターゼ等の酵素を利用して、グルコースから調製することができる。また、シクロアミロースは市販されており、本発明では市販品を使用することもできる（国際公開第２００９／６１００３号パンフレット参照）。
When the siRNA of the present invention is used as a medicine, it can be used as it is, but it may be complexed with a highly branched cyclic cyclodextrin or cycloamylose. Here, the highly branched cyclic dextrin is produced by allowing a branching enzyme to act on amylopectin and refers to a glucan having a polymerization degree of 50 to 5000 having an inner branched cyclic structure portion and an outer branched structure portion. Here, the inner branched cyclic structure portion is a cyclic structure portion formed by an α-1,4-glucoside bond and an α-1,6-glucoside bond, and the outer branched structure portion is the inner branched cyclic structure. A non-cyclic structure portion bonded to the portion. Preferred forms of highly branched cyclic dextrins are those in which the degree of polymerization of the inner branched cyclic structure portion of the glucan is 10 to 100, those in which the degree of polymerization of the outer branched structure portion of the glucan is 40 or more, and the outer branch structure Examples are those in which the degree of polymerization of each unit chain in the portion is 10 to 20 on average. Further, highly branched cyclic cyclodextrins are commercially available, and commercially available products can also be used in the present invention.
Cycloamylose is a cyclic α-1,4-glucan in which glucose is bound by α1,4 bonds, and has a three-dimensional and deep hollow portion inside the helix structure. Although it does not restrict | limit especially as a polymerization degree of glucose in the cycloamylose used for this invention, For example, 10-500, Preferably it is 10-100, More preferably, 22-50 are illustrated. Cycloamylose can be prepared from glucose using an enzyme such as amylomaltase. Moreover, cycloamylose is marketed and can use a commercial item in this invention (refer international publication 2009/61003 pamphlet).
本発明のｓｉＲＮＡは、１以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて常法により、医薬組成物として製剤化することができる。当該医薬組成物は、経肺投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、注射等の何れの投与形態の組成物であってもよく、投与は全身性又は局所的のいずれでもよい。その剤形は、その投与経路に応じて、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、坐剤、エアロゾル、スプレーなど、使用に適したいかなるものでもよい。 The siRNA of the present invention can be formulated as a pharmaceutical composition by a conventional method using one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients. The pharmaceutical composition may be a composition in any dosage form such as pulmonary administration, nasal administration, oral administration, rectal administration, injection, etc., and administration may be systemic or local. Depending on the route of administration, the dosage form can be any solution, suspension, emulsion, tablet, pill, pellet, capsule, powder, sustained release formulation, suppository, aerosol, spray, etc. But you can.
例えば、経鼻投与では、有効成分を、適当な溶媒（生理食塩水、アルコールなど）に溶解し、その溶液を鼻に注入又は点鼻することによって送達することができる。あるいは、経肺投与又は経鼻投与では、有効成分を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレーを噴出させる形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送達されるように弁を設けることにより決定することができる。更に粉末吸入剤としての投与も可能である。 For example, for nasal administration, the active ingredient can be delivered by dissolving in a suitable solvent (saline, alcohol, etc.) and injecting or nasally injecting the solution into the nose. Alternatively, for pulmonary or nasal administration, the active ingredient may be packaged in a pressurized pack with a suitable propellant such as dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide, or other suitable gas. Alternatively, it can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray ejected from a nebulizer. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount. Furthermore, administration as a powder inhaler is also possible.
注射の場合、有効成分は、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に溶剤として処方することができ、好ましくはハンクス液やリンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することができる。この溶剤は、懸濁剤や安定剤、及び／又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有してよい。あるいは有効成分は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの適切な賦形剤と共に再構成するために、粉末形態にすることができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。 In the case of injection, the active ingredient can be formulated as a solvent for parenteral administration (ie, intravenous or intramuscular administration), for example by bolus injection or continuous infusion, preferably Hanks's solution, Ringer's solution, physiological saline, etc. Can be formulated as a physiologically compatible buffer. The solvent may contain prescribing agents such as suspending and stabilizing agents and / or dispersing agents. Alternatively, the active ingredient can be in powder form for reconstitution with a suitable excipient, eg, sterile, pyrogen-free water, before use. Injectable preparations may be provided in unit dosage form, eg, in ampoules or multi-dose containers, with the addition of a preservative.
経口投与する場合には、本発明の治療剤は、例えば錠剤、顆粒、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、水性又は油性懸濁液、又はエリキシルの形態であり得る。錠剤又は丸薬形態の場合は、胃腸管内での分散及び吸収を遅延させ、それにより長時間持続した作用をもたらすために、組成物をコーティングすることができる。 When administered orally, the therapeutic agents of the invention can be in the form of, for example, a tablet, granule, powder, emulsion, capsule, syrup, aqueous or oily suspension, or elixir. In the case of tablet or pill form, the composition can be coated to delay dispersion and absorption in the gastrointestinal tract and thereby provide a sustained action over time.
薬学的に許容される担体又は賦形剤としては、限定されるものではないが、液体（例えば水、油、生理食塩水、デキストロース水溶液、エタノールなど）、固体（例えばアカシアガム、ゼラチン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、タルク、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、ケラチン、コロイド状シリカ、乾燥脱脂乳、グリセロールなど）が挙げられる。また、本発明の治療剤は、通常の医薬組成物に配合される補助剤、防腐剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、乳化剤、及びｐＨ緩衝剤などのうち適当なものを含有してもよい。 Pharmaceutically acceptable carriers or excipients include, but are not limited to, liquids (eg, water, oil, saline, aqueous dextrose, ethanol, etc.), solids (eg, acacia gum, gelatin, starch, Glucose, lactose, sucrose, talc, sodium stearate, glycerol monostearate, keratin, colloidal silica, dried skim milk, glycerol, etc.). Further, the therapeutic agent of the present invention includes adjuvants, preservatives, stabilizers, thickeners, lubricants, colorants, wetting agents, emulsifiers, pH buffering agents and the like that are blended in ordinary pharmaceutical compositions. You may contain a suitable thing.
本発明の医薬組成物には、本発明のｓｉＲＮＡを、０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.001 to 50% by mass, preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.1 to 1% by mass of the siRNA of the present invention.
本発明の医薬組成物の投与量は、有効量を適用すれば特に制限されないが、例えば、体重１ｋｇあたり、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇであり、更に好ましくは０．００２〜１ｍｇである。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as an effective amount is applied. For example, it is preferably 0.0001 to 100 mg, more preferably 0.002 to 1 mg per kg body weight.
本発明の医薬組成物においては、本発明のｓｉＲＮＡに換えて、投与対象内で当該ｓｉＲＮＡを発現可能な発現ベクターを用いることも可能である。
この場合の発現ベクターは、例えば、本発明のｓｉＲＮＡをコードすることができるＤＮＡを、適当な遺伝子治療用ベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等に挿入することにより構築することができる。
In the pharmaceutical composition of the present invention, instead of the siRNA of the present invention, an expression vector capable of expressing the siRNA within the administration subject can also be used.
In this case, for example, an DNA that can encode the siRNA of the present invention is inserted into an appropriate gene therapy vector such as an adenovirus vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, or a lentivirus vector. Can be built.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ ｓｉＲＮＡの作製
下記表３に示されるＳｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子を設計し、各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成法によって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
Example 1 Production of siRNA siRNA molecules targeting the Smad3 gene or MCP-1 gene shown in Table 3 below are designed, and each siRNA oligonucleotide is synthesized by a chemical synthesis method, purified by an HPLC purification method, and used. did.
実施例２ Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現抑制効果の評価（in vitro）
（１）細胞
ヒト肺胞上皮由来のＡ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いた。
Example 2 Evaluation of Smad3 or MCP-1 Expression Inhibitory Effect (In Vitro)
(1) Cells A549 cells derived from human alveolar epithelium (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were used.
（２）培養条件
１×１０5個の細胞を１０％牛胎児血清含有のＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's Medium, 100 unit/mLペニシリン, 100 μg/mLストレプトマイシン含有）を１２ウェルプレートに播種する。３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養後、４０％コンフルエントとなったＡ５４９細胞の培地を無血清培地に交換した。
(2) Culture conditions 1 × 10 5 cells are seeded in a 12-well plate in D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum (containing Dulbecco's modified Eagle's Medium, 100 unit / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin) . After overnight culture at 37 ° C. and 5% CO 2 , the medium of A549 cells that became 40% confluent was replaced with a serum-free medium.
（３）前処理・ｓｉＲＮＡ添加量
ｓｉＲＮＡとして、上記表３に示すオリゴヌクレオチドを用い、細胞が４０％コンフルエントとなった時点で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ (インビトロジェン社)を用いて上記細胞への導入を行った。
具体的には、各ウェルあたり２．０μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を９８μＬ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン）に添加し、５分間室温でインキュベーションした（Ａ溶液）。
０．２μＭ ｓｉＲＮＡ溶液０．６２５μＬを９９．３７５μＬ ＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した（Ｂ溶液）。Ａ及びＢ溶液を混和し、室温で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１２−ウェルプレート各ウェルにＡＢ混液を添加した。ｓｉＲＮＡ最終濃度が、０．１ｎＭとなるように添加した。
(3) Pretreatment and siRNA addition amount As the siRNA, the oligonucleotides shown in Table 3 were used, and when the cells became 40% confluent, they were introduced into the cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Specifically, 2.0 μL Lipofectamine 2000 per well was added to 98 μL OPTI-MEM (Invitrogen) and incubated at room temperature for 5 minutes (solution A).
0.625 μL of 0.2 μM siRNA solution was added to 99.375 μL OPTI-MEM (B solution). The A and B solutions were mixed and incubated for 20 minutes at room temperature. After incubation, AB mixture was added to each well of the 12-well plate. The final siRNA concentration was 0.1 nM.
（４）後処理
（ｉ）サイトカイン処理
ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混液を添加６時間後、培地を０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）及びサイトカイン（１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α）含有Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、１２時間培養した。培養後上清をサンプリングした。
(4) Post-treatment (i) Cytokine treatment Six hours after addition of siRNA and Lipofectamine mixed solution, the medium contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and cytokine (1 ng / mL IL-1β and 1 ng / mL TNF-α). The medium was replaced with D-MEM medium and cultured for 12 hours. After culture, the supernatant was sampled.
（ｉｉ）細胞中全ＲＮＡ抽出
細胞中全ＲＮＡ抽出には、自動核酸抽出装置ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０（富士フイルム株式会社）とＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０の専用キットであるＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｋｉｔＳ（富士フイルム株式会社）を用いた。細胞を１．０ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、細胞溶解液０．５ｍＬを添加し、細胞中に含まれる全ＲＮＡの抽出を行った。０．５ｍＬ溶解液（ＬＲＣ、メルカプトエタノール添加済み）を添加した１２ウェルプレートをシーソー型振盪機で５分間撹拌した。ピペッティングにより液を５−６往復させてよく混ぜ、液をエッペンドルフチューブへ移した。エタノールを４２０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで１５秒間撹拌後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０で処理を行なった。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０での処理中、ＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。抽出した全ＲＮＡサンプルは、次処理を行うまで−８０(Ｃ冷蔵庫にて保管した。
(Ii) Extraction of total RNA in cells For extraction of total RNA in cells, an automatic nucleic acid extraction apparatus, QuickGene-810 (Fuji Film Co., Ltd.) and QuickGene RNA structured cell kitS (Fuji Film Co., Ltd.), which is a dedicated kit for QuickGene-810, are used. Using. The cells were washed with 1.0 mL PBS, 0.5 mL of cell lysate was added, and total RNA contained in the cells was extracted. A 12-well plate to which 0.5 mL of lysate (LRC, mercaptoethanol added) was added was stirred for 5 minutes on a seesaw type shaker. The solution was mixed well by pipetting up and down 5-6 times, and the solution was transferred to an Eppendorf tube. 420 μL of ethanol was added, stirred for 15 seconds with a vortex mixer, and then treated with QuickGene-810. During the treatment with QuickGene-810, DNase (RQ1 RNase-free DNase, Promega) was added. The extracted total RNA sample was stored in a −80 (C refrigerator until the next treatment.
（iii）全ＲＮＡのｃＤＮＡ化
培養細胞から抽出された全ＲＮＡサンプル中のＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を、２６０ ｎｍにおける吸光度の測定値から計算した（対照：ＴＥバッファー）。この値をもとに、各サンプルにおいてＲＮＡ量が０．１μｇに相当する溶液量を９６ウェルプレートに入れた。これに蒸留水を加えて全量１２μＬとし、さらにQuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるgDNA Wipeout Buffer ２μＬを加え、ボルテックス混和後、４２(Ｃで２分間インキュベートし、その後４(Ｃに冷却した。これにQuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるQuantiscript Reverse Transcriptase １μＬ、Quantiscript RT Buffer ４μＬ、及びRT Primer Mix １μＬを加え、混和し、４２(Ｃで１５分間インキュベートした。続いてQuantiscript Reverse Transcriptaseを失活させるため９５(Ｃで３分間加熱した後、４(Ｃに冷却した。
この調製液（ｃＤＮＡ調製原液）をＴＥバッファーで５倍希釈し、標的遺伝子（Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１）をターゲットとしたＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。
また、ｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで５０倍希釈し、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを選定しＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。なお、コントロールサンプル（ｓｉＲＮＡ非投与）のｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１、１０、１００、及び１０００倍希釈し、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１をターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。同様にコントロールサンプルｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１０、１００、１０００、及び１００００倍希釈し、ＧＡＰＤＨをターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。
(Iii) Conversion of total RNA to cDNA The RNA concentration (μg / mL) in the total RNA sample extracted from the cultured cells was calculated from the measured absorbance at 260 nm (control: TE buffer). Based on this value, the amount of solution corresponding to 0.1 μg of RNA in each sample was placed in a 96-well plate. Distilled water was added thereto to make a total volume of 12 μL, and further 2 μL of gDNA Wipeout Buffer contained in QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN) was added. After vortex mixing, the mixture was incubated at 42 (C for 2 minutes and then cooled to 4 (C. To this was added 1 μL of Quantiscript Reverse Transcriptase contained in QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN), 4 μL of Quantiscript RT Buffer, and 1 μL of RT Primer Mix, mixed, and incubated for 42 minutes at 42 (C. Subsequently, Quantiscript Reverse Transcriptase was inactivated. 95 (C for 3 minutes and then 4 (C cooled.
This preparation solution (cDNA preparation stock solution) was diluted 5-fold with TE buffer to obtain a cDNA solution for PCR targeting the target gene (Smad3 or MCP-1).
Moreover, the cDNA preparation stock solution was diluted 50 times with TE buffer, and GAPDH was selected as an internal standard gene to obtain a PCR cDNA solution. In addition, the cDNA preparation stock solution of a control sample (siRNA non-administration) was diluted 1, 10, 100, and 1000 times with TE buffer to obtain a sample for a PCR calibration curve targeting Smad3 or MCP-1. Similarly, the control sample cDNA preparation stock solution was diluted 10, 100, 1000, and 10000 times with TE buffer to obtain a sample for a PCR calibration curve targeting GAPDH.
（５）Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現量の測定方法
Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１に由来するｃＤＮＡ産物２．５μＬを鋳型として、１２．５μＬ QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN)と、ヒト由来Ｓｍａｄ３遺伝子、ヒト由来ＭＣＰ−１遺伝子又はヒト由来ＧＡＰＤＨ遺伝子の２．５ μＬ QuntiTect Primer Assay (QIAGEN)を用いて、滅菌蒸留水にて最終容量２５μＬとしたＰＣＲ反応溶液を調製した。調製した溶液は、Applied Biosystems 7500 (Life Technologies Japan)にて、９５(Ｃで５分間加熱した後、１）９５℃，１０秒、２）６０℃，３５秒のサイクルを４０回繰り返した後に、９５℃から６０℃に徐冷し、熱解離測定を行った。ＰＣＲ増幅過程に由来するＣｔ（Threshold Cycle）値を基に、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値による各標的遺伝子の増幅割合を補正し、標的遺伝子のｍＲＮＡ抑制効果を評価した。結果を図１および図２に示す。
ｓｉＲＮＡ番号が、ｃ，ｅおよびｍのものは、０．１ｎＭの濃度においても４０％以上のＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現抑制効率を有していることがわかった。特に、ｓｉＲＮＡ番号が、ｃおよびｅのｓｉＲＮＡは、０．１ｎＭにおいても６０％以上の抑制効率を示した。
(5) Method for measuring expression level of Smad3 or MCP-1 Using 2.5 μL of cDNA product derived from Smad3 or MCP-1 as a template, 12.5 μL QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), human-derived Smad3 gene, A PCR reaction solution having a final volume of 25 μL with sterile distilled water was prepared using 2.5 μL QuntiTect Primer Assay (QIAGEN) of human-derived MCP-1 gene or human-derived GAPDH gene. The prepared solution was subjected to 95 cycles (1) 95 ° C., 10 seconds, 2) 60 ° C., 35 seconds, 40 times on Applied Biosystems 7500 (Life Technologies Japan), The sample was gradually cooled from 95 ° C. to 60 ° C., and thermal dissociation was measured. Based on the Ct (Threshold Cycle) value derived from the PCR amplification process, the amplification rate of each target gene by the Ct value of the GAPDH gene was corrected, and the mRNA suppression effect of the target gene was evaluated. The results are shown in FIG. 1 and FIG.
It was found that siRNA numbers c, e, and m have an Smad3 or MCP-1 expression suppression efficiency of 40% or more even at a concentration of 0.1 nM. In particular, siRNAs with siRNA numbers c and e showed a suppression efficiency of 60% or more even at 0.1 nM.
Claims (10)
（ａ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｃ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｄ）配列番号９に示されるセンス配列と配列番号１０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｅ）配列番号１１に示されるセンス配列と配列番号１２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｆ）配列番号１３に示されるセンス配列と配列番号１４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｇ）配列番号１５に示されるセンス配列と配列番号１６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｈ）配列番号１７に示されるセンス配列と配列番号１８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｉ）配列番号１９に示されるセンス配列と配列番号２０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｊ）配列番号２１に示されるセンス配列と配列番号２２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｋ）配列番号２３に示されるセンス配列と配列番号２４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｌ）配列番号２５に示されるセンス配列と配列番号２６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｍ）配列番号２７に示されるセンス配列と配列番号２８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｎ）配列番号２９に示されるセンス配列と配列番号３０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｏ）配列番号３１に示されるセンス配列と配列番号３２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｐ）配列番号３３に示されるセンス配列と配列番号３４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ The siRNA according to claim 1, wherein the siRNA is selected from the following (a) to (r).
(A) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 4
(B) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 6
(C) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 8
(D) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 10
(E) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 12
(F) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 14
(G) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 15 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 16
(H) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 18
(I) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 19 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 20
(J) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 21 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 22
(K) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 23 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 24
(L) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 26
(M) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 28
(N) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 29 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 30
(O) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 31 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 32
(P) siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 34
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