JP2013135648A - Method for producing beer-like drink - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｔ−フラクションを添加するビール様飲料およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a beer-like beverage to which T-fraction is added and a method for producing the same.
微生物の中には、ビール中で生育することができるものが存在し、それらはビール混濁菌と呼ばれる。ビール混濁菌は、濁らせたり、硫黄臭を発したりして、ビール品質を著しく低下させる場合がある。ビール混濁菌等の微生物増殖を抑制させるための一つの方策として、ホップが用いられることが知られている。 Some microorganisms can grow in beer and are called beer turbid bacteria. Beer turbid bacteria may become turbid or emit a sulfur odor, which may significantly reduce beer quality. It is known that hops are used as one measure for suppressing the growth of microorganisms such as beer turbid bacteria.
しかしながら、微生物に対して抗菌活性を有する既知のホップ成分であるα酸やα酸の酸化成分は、少なからず渋みを有しており、ビール等の飲料の香味特徴に影響する場合があった。そのため、そのような香味特徴を持たない無味、無臭の抗菌成分が望まれる。 However, α-acid and α-acid oxidation component, which are known hop components having antibacterial activity against microorganisms, have a little bit of astringency and may affect the flavor characteristics of beverages such as beer. Therefore, a tasteless and odorless antibacterial component that does not have such flavor characteristics is desired.
しかしながらこれまでに、ホップのイソα酸の分解成分（Ｔ−フラクション）に、香味特徴を持たない抗菌成分が含まれることについて全く知られていなかった（例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３参照）。 However, until now, it has not been known at all that an antibacterial component having no flavor characteristic is contained in the decomposition component (T-fraction) of hop iso-alpha acid (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, and (See Patent Document 3).
本発明は、抗菌成分が含まれるビール様飲料およびその製造方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the beer-like drink in which an antimicrobial component is contained, and its manufacturing method.
本発明者らは、特定量のイソα酸の分解成分（Ｔ−フラクション）が製造飲料に存在するようにビール様飲料を製造すると、製造飲料においてペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制されることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。 When the present inventors produce a beer-like beverage such that a specific amount of iso-alpha acid degradation component (T-fraction) is present in the produced beverage, the growth of Pectinata and / or Lactobacillus in the produced beverage Has been found to be suppressed. The present invention is based on this finding.
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ビール様飲料の製造方法であって、α酸の分解成分（Ｔ−フラクション）の添加工程を含んでなり、かつ製造飲料においてペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制された、製造方法。
（２）製造された飲料中のＴ−フラクションの量が、飲料を下記分析条件：
＜高速液体クロマトグラフィ分析用試料調製条件＞
（Ｔ−フラクションを添加した試料１０ｍｌに、１ｍｌの３Ｎ塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置し、この溶液は水溶層と、有機溶媒層(イソオクタン)との二層に分離し、有機溶媒層から１０ｍｌを採取し、採取した溶液を、窒素ガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化し、これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇと、エタノール溶液４４０ｍｌとの混合溶液を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とする）、
＜高速液体クロマトグラフィ分析条件＞
（・カラム：Ｃ１８カラム（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）
・移動相Ａの組成：蒸留水：リン酸＝１０００：０．０２(v/v)＋ＥＤＴＡ０．０２％(w/v)
・移動相Ｂの組成：アセトニトリル
・グラジエントプログラムは以下の通りである：
分析開始時においては、移動相Ａの割合を７０％、移動相Ｂの割合を３０％とし、リテンションタイムが１５分までに移動相Ａの割合が７０％から６０％、移動相Ｂの割合が３０％から４０％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが１５〜２２分の間は移動相Ａの割合を６０％、移動相Ｂの割合を４０％とし、リテンションタイムが２５分までに、移動相Ａの割合が６０％から４８％、移動相Ｂの割合が４０％から５２％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが２５〜４５分の間は移動相Ａの割合を４８％、移動相Ｂの割合を５２％とする、
・移動相流速：毎分１．８ｍｌ（流速一定）
・検出波長：２７０ｎｍ）、
により高速液体クロマトグラフィ分析に付した場合、βフェニルカルコンのピーク面積に対するＴ−フラクションのピーク面積の比（Ｔ−フラクション内標比）が０．１３以上となるようにＴ−フラクションを添加する、（１）に記載の方法。
（３）Ｔ−フラクションの添加工程が、熱処理した異性化ホップエキスを発酵前液の煮沸中に添加する工程を含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖を抑制する量のＴ−フラクションを含む、ビール様飲料。
（５）ビール様飲料にＴ−フラクションを添加することを特徴とする、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖抑制方法。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A method for producing a beer-like beverage, comprising a step of adding an α-acid decomposing component (T-fraction), and the growth of Pectinatus and / or Lactobacillus in the produced beverage is suppressed. Manufacturing method.
(2) The amount of T-fraction in the produced beverage is determined according to the following analysis conditions:
<Sample preparation conditions for high performance liquid chromatography analysis>
(After adding 1 ml of 3N hydrochloric acid to 10 ml of the sample to which T-fraction has been added, 20 ml of isooctane is added, and the mixture is shaken and allowed to stand. This solution consists of two layers: an aqueous layer and an organic solvent layer (isooctane). 10 ml from the organic solvent layer was collected, and the collected solution was completely dried and solidified under a nitrogen gas spray. Then, a mixed solution of 12 mg of internal standard substance β-phenylchalcone and 440 ml of ethanol solution was added to 1 ml. In addition, the dissolved sample is used as a sample for high performance liquid chromatography analysis)
<High performance liquid chromatography analysis conditions>
(Column: C18 column (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm)
-Composition of mobile phase A: distilled water: phosphoric acid = 1000: 0.02 (v / v) + EDTA 0.02% (w / v)
-Composition of mobile phase B: Acetonitrile-The gradient program is as follows:
At the start of the analysis, the ratio of mobile phase A is 70%, the ratio of mobile phase B is 30%, the ratio of mobile phase A is 70% to 60% and the ratio of mobile phase B is 15% by the retention time. Perform a continuous and linear gradient from 30% to 40%. During the retention time of 15 to 22 minutes, the ratio of mobile phase A is 60% and the ratio of mobile phase B is 40%. By 25 minutes, a continuous and linear gradient is performed so that the ratio of mobile phase A is 60% to 48% and the ratio of mobile phase B is 40% to 52%, and the retention time is 25 to 45 minutes. The ratio of mobile phase A is 48% and the ratio of mobile phase B is 52% during
-Mobile phase flow rate: 1.8 ml / min (constant flow rate)
・ Detection wavelength: 270 nm),
T-fraction is added so that the ratio of the peak area of T-fraction to the peak area of β-phenylchalcone (T-fraction internal standard ratio) is 0.13 or more when subjected to high performance liquid chromatography analysis by The method according to 1).
(3) The method according to (1) or (2), wherein the step of adding the T-fraction includes a step of adding the heat-treated isomerized hop extract during boiling of the pre-fermentation solution.
(4) A beer-like beverage containing an amount of T-fraction that inhibits the growth of Pectinata and / or Lactobacillus.
(5) A method for inhibiting the growth of Pectinatus and / or Lactobacillus, which comprises adding a T-fraction to a beer-like beverage.
本発明の製造方法は、抗菌成分が含まれるビール様飲料を提供できる点で有利である。 The production method of the present invention is advantageous in that a beer-like beverage containing an antibacterial component can be provided.
ビール様飲料の製造方法
本発明によれば、ビール様飲料の製造方法において、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖を抑制する量のＴ−フラクションを添加することによりビール様飲料中のペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖を抑制することが可能となる。すなわち、本発明によれば、ビール様飲料の製造方法であって、Ｔ−フラクションの添加工程を含んでなり、かつ、製造飲料においてペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制された製造方法が提供される。
Production method of beer-like beverage According to the present invention, in the production method of beer-like beverage, by adding an amount of T-fraction that suppresses the growth of Pectinatus and / or Lactobacillus, It becomes possible to inhibit the growth of Pectinata and / or Lactobacillus. That is, according to the present invention, it is a method for producing a beer-like beverage, comprising a step of adding a T-fraction, and the growth of Pectinatus and / or Lactobacillus is suppressed in the produced beverage. A manufacturing method is provided.
本発明において「ビール様飲料」とは、通常にビールを製造した場合、すなわち、酵母等による発酵に基づいてビールを製造した場合に得られるビール特有の味わい、香りを有する飲料をいい、例えば、ビール、発泡酒、リキュール等の発酵麦芽飲料や、完全無アルコール麦芽飲料等の非発酵麦芽飲料が挙げられる。また、ビール様飲料である限り、麦芽飲料に限定されるものではないが、ビール様飲料としては、好ましくは発酵麦芽飲料である。 In the present invention, “beer-like beverage” refers to a beverage having a taste and aroma peculiar to beer obtained when beer is usually produced, that is, when beer is produced based on fermentation by yeast or the like. Examples include fermented malt beverages such as beer, happoshu, and liqueurs, and non-fermented malt beverages such as completely alcohol-free malt beverages. Moreover, as long as it is a beer-like beverage, it is not limited to a malt beverage, but as a beer-like beverage, a fermented malt beverage is preferable.
本発明の製造方法では、製造飲料においてペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制されるようにＴ−フラクションを添加することができる。例えば、Ｔ−フラクションは、ホップを加えて、煮沸等することにより飲料中のＴ−フラクションの量を増加させて、Ｔ−フラクションを飲料中に含ませてもよい。ここで、Ｔ−フラクションとは、ホップに含まれるイソα酸の分解成分であり、具体的には図１の高速液体クロマトグラフィ分析チャート中に示されたリテンションタイム（保持時間：Ｒ．Ｔ．）が６〜１２分あるいはイソα酸のピークよりも早く検出されるピークの中で検出強度(mAU)（縦軸）が他のピークよりも高い２本のピークで、各々のリテンションタイムが内部標準物質βフェニルカルコンより３３分±０．６分、３０分±０．７分早く検出されるピーク面積の総和で表される成分を意味する。 In the production method of the present invention, T-fraction can be added so that the growth of Pectinata and / or Lactobacillus is suppressed in the produced beverage. For example, the T-fraction may be added to the beverage by increasing the amount of the T-fraction in the beverage by adding hops and boiling, etc. Here, the T-fraction is a decomposition component of iso-α acid contained in hops, and specifically, the retention time (retention time: RT) shown in the high performance liquid chromatography analysis chart of FIG. Among the peaks detected at 6 to 12 minutes or earlier than the iso-α acid peak, the detection intensity (mAU) (vertical axis) is higher than the other peaks, and each retention time is an internal standard. It means a component represented by the sum of peak areas detected 33 minutes ± 0.6 minutes and 30 minutes ± 0.7 minutes earlier than the substance β-phenylchalcone.
このＴ−フラクションの取得源は特に限定されるものではなく、市販のもの、合成して得られたもの、あるいは天然物から単離・精製されたものいずれを用いてもよい。Ｔ−フラクションは、例えば、イソα酸、イソα酸を含有するホップ、ホップエキス等の抽出物から調製することができる。また、Ｔ−フラクションの調製方法の好ましい態様によれば、異性化ホップエキス（例えば、スタイナー社製（米国））を蒸留水に０．５％溶解させた後に、溶解液を乳酸にて酸性のｐＨ１．０〜５．０（好ましくは、ｐＨ３．０）に調整し、該溶解液を５０〜１３５℃（好ましくは、１３５℃）、１〜１２０分（好ましくは、２０分）オートクレーブ等で熱処理した処理液をＴ−フラクション抽出液として、調製してもよい。なお、イソα酸は、ホップに含まれる成分であり、ホップから抽出して、精製してもよく、また合成してもよいが、市販されているものを用いてもよく、またホップ中のα酸の異性化によって生成してもよい。 The source for obtaining the T-fraction is not particularly limited, and any commercially available product, one obtained by synthesis, or one isolated and purified from a natural product may be used. T-fraction can be prepared from extracts such as hops and hop extracts containing iso-α acid and iso-α acid, for example. According to a preferred embodiment of the method for preparing the T-fraction, an isomerized hop extract (for example, Steiner (USA)) is dissolved in distilled water by 0.5%, and then the solution is acidified with lactic acid. The pH is adjusted to 1.0 to 5.0 (preferably, pH 3.0), and the solution is heat-treated in an autoclave or the like at 50 to 135 ° C. (preferably 135 ° C.) for 1 to 120 minutes (preferably 20 minutes). The treated liquid may be prepared as a T-fraction extract. In addition, iso alpha acid is a component contained in hops, and may be extracted from hops, purified, or synthesized, but commercially available ones may be used, You may produce | generate by the isomerization of alpha acid.
ここで、本発明によれば、イソα酸（イソフムロン化合物）は、イソフムロン、イソアドフムロン、イソコフムロン、イソポストフムロン、イソプレフムロン、テトラハイドロイソフムロン、テトラハイドロイソアドフムロン、テトラハイドロイソコフムロン、テトラハイドロイソプレフムロン、およびテトラハイドロイソポストフムロンを含む意味で用いられ、イソフムロン、イソアドフムロン、および／またはイソコフムロンが含有されていることが好ましい。 Here, according to the present invention, isoalpha acid (isohumulone compound) is isohumulone, isoadhumulone, isocohumulone, isoposthumulone, isoprehumulone, tetrahydroisohumulone, tetrahydroisoadhumulone, tetrahydroisocohumulone, tetrahydro It is used in the meaning including isoprehumulone and tetrahydroisoposthumulone, and preferably contains isohumulone, isoadhumulone, and / or isocohumulone.
本発明の製造方法におけるＴ−フラクションの添加時期は、製造飲料にペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制される程度の量のＴ−フラクションが含まれる限り、ビール様飲料の製造工程のいずれの時点で添加してもよい。 As long as the T-fraction is added in the production method of the present invention, the beer-like beverage is produced as long as the produced beverage contains an amount of T-fraction that prevents the growth of Pectinatus and / or Lactobacillus. It may be added at any point in the process.
本発明の製造方法におけるＴ−フラクションの添加態様は、製造飲料にペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制される程度の量のＴ−フラクションが含まれる限り特に限定されるものではなく、Ｔ−フラクションを発酵前液や発酵液にそのまま添加しても、Ｔ−フラクションの前駆物質であるイソα酸や、イソα酸を含有するホップを発酵前液に添加してもよい。すなわち、イソα酸やホップをビール様飲料の製造工程のいずれかの時点で添加し、イソα酸や、ホップに含まれるイソα酸の分解を引き起こし、結果的にビール様飲料中にＴ−フラクションが存在する状態としてもよい。 The addition mode of the T-fraction in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the produced beverage contains an amount of the T-fraction that suppresses the growth of Pectinata and / or Lactobacillus. Alternatively, the T-fraction may be added to the pre-fermentation solution or the fermentation solution as it is, or iso-α acid that is a precursor of the T-fraction or hops containing iso-α acid may be added to the pre-fermentation solution. That is, iso alpha acid and hops are added at any point in the production process of beer-like beverages, causing the degradation of iso alpha acid and iso alpha acids contained in hops. It is good also as a state in which a fraction exists.
本発明において、「ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制された」とは、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌を植菌し、培養後に、Ｔ−フラクションを添加した場合に、Ｔ−フラクションを添加しない場合と比較して、菌の増殖が抑制されていた場合には、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制されたと評価する。例えば、実施例において、「Ｔ−フラクション未添加」の場合の生菌数と比較して、生菌数が下回ったか否かを指標として、「ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖が抑制された」か否かを評価することができる。 In the present invention, “the growth of Pectinata and / or Lactobacillus was suppressed” means inoculating Pectinata and / or Lactobacillus, and adding T-fraction after culturing In addition, it is evaluated that the growth of Pectinatus spp. And / or Lactobacillus spp. Was suppressed when the growth of the bacteria was suppressed as compared with the case where the T-fraction was not added. For example, in the Examples, using as an index whether or not the viable cell count was lower than the viable cell count in the case of “T-fraction not added”, the growth of “Pectinatus and / or Lactobacillus” It can be evaluated whether or not it is “suppressed”.
本発明の製造方法により製造される飲料が、例えば、発酵麦芽飲料である場合には、少なくとも水、麦芽、およびホップを含んでなる発酵前液を発酵させることにより製造することができる。すなわち、麦芽等の醸造原料から調製された麦汁（発酵前液）に発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、所望により発酵液を低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することにより、本発明による発酵麦芽飲料を製造することができる。ここで、発酵前液の調製に当たっては、後述のようにペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖がさらに抑制されるような量のＴ−フラクションが発酵飲料に含まれるようにホップを添加してもよい。 When the beverage produced by the production method of the present invention is, for example, a fermented malt beverage, it can be produced by fermenting a pre-fermentation solution comprising at least water, malt, and hops. That is, fermentation beer yeast is added to wort (pre-fermentation liquid) prepared from brewing raw materials such as malt, and the fermentation liquid is stored at a low temperature if desired, and then the yeast is removed by a filtration step. Thus, the fermented malt beverage according to the present invention can be produced. Here, in the preparation of the pre-fermentation solution, hops are added so that the fermented beverage contains an amount of T-fraction that can further suppress the growth of Pectinata and / or Lactobacillus as described below. May be.
上記製造手順において麦汁の作製は常法に従って行うことができる。例えば、醸造原料と水の混合物を糖化し、濾過して、麦汁を得、その麦汁を煮沸し、煮沸した麦汁を冷却することにより麦汁を調製することができる。ホップは、麦汁を煮沸する前、麦汁を煮沸した後、あるいは麦汁を煮沸中に添加することができる。 In the above production procedure, wort can be produced according to a conventional method. For example, wort can be prepared by saccharifying a mixture of brewing raw materials and water, filtering to obtain wort, boiling the wort, and cooling the boiled wort. Hops can be added before boiling the wort, after boiling the wort, or during the boiling of the wort.
本発明の製造方法が発酵麦芽飲料の製造方法である場合には、ホップ、麦芽以外に、米、とうもろこし、こうりゃん、馬鈴薯、でんぷん、糖類（例えば、液糖）等の酒税法で定める副原料や、タンパク質分解物や酵母エキス等の窒素源、香料、色素、起泡・泡持ち向上剤、水質調整剤、発酵助成剤等のその他の添加物を醸造原料として使用することができる。また、未発芽の麦類（例えば、未発芽大麦(エキス化したものを含む)、未発芽小麦(エキス化したものを含む)）を醸造原料として使用してもよい。得られた発酵麦芽飲料は、（ｉ）減圧若しくは常圧で蒸留してアルコールおよび低沸点成分を除去するか、あるいは（ii）逆浸透（ＲＯ）膜にてアルコールおよび低分子成分を除去することによって、非アルコール発酵麦芽飲料とすることもできる。 When the production method of the present invention is a method for producing a fermented malt beverage, in addition to hops and malt, auxiliary materials specified by liquor tax law such as rice, corn, corn, potato, starch, saccharides (eg, liquid sugar), etc. In addition, other sources such as nitrogen sources such as protein degradation products and yeast extract, fragrances, pigments, foaming / foaming improvers, water quality modifiers, fermentation aids, and the like can be used as brewing materials. Further, ungerminated barley (for example, ungerminated barley (including an extracted one), ungerminated wheat (including an extracted one)) may be used as a brewing raw material. The obtained fermented malt beverage should be (i) distilled under reduced pressure or atmospheric pressure to remove alcohol and low boiling components, or (ii) remove alcohol and low molecular components with a reverse osmosis (RO) membrane. Can also be used as a non-alcohol fermented malt beverage.
本発明の製造方法により製造される飲料が麦や麦芽を使用しないビール様発酵飲料である場合には、発酵麦芽飲料の製造手順に準じて、少なくとも水およびホップを含んでなる発酵前液を発酵させることにより製造することができる。発酵前液には、水、ホップの他に炭素源（例えば、液糖などの糖類）、窒素源（例えば、タンパク質分解物や酵母エキスなどのアミノ酸供給源）を添加することができ、必要に応じて、香料、色素、起泡・泡持ち向上剤、水質調整剤、発酵助成剤等のその他の添加物等を添加することができる。得られたビール様発酵飲料は、（ｉ）減圧若しくは常圧で蒸留してアルコールおよび低沸点成分を除去するか、あるいは（ii）逆浸透（ＲＯ）膜にてアルコールおよび低分子成分を除去することによって、非アルコール・ビール様発酵飲料とすることもできる。ここで、発酵前液の調製に当たっては、後述のようにペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖がさらに抑制されるような量のＴ−フラクションが発酵飲料に含まれるようにホップを添加してもよい。 When the beverage produced by the production method of the present invention is a beer-like fermented beverage that does not use wheat or malt, ferment a pre-fermentation solution comprising at least water and hops according to the production procedure of the fermented malt beverage. Can be manufactured. In addition to water and hops, carbon sources (for example, sugars such as liquid sugar) and nitrogen sources (for example, amino acid sources such as protein degradation products and yeast extract) can be added to the pre-fermentation solution. Accordingly, other additives such as fragrances, pigments, foaming / foaming improvers, water quality modifiers, fermentation aids, and the like can be added. The resulting beer-like fermented beverage is either (i) distilled at reduced pressure or atmospheric pressure to remove alcohol and low boiling components, or (ii) removed alcohol and low molecular components with a reverse osmosis (RO) membrane. Depending on the situation, a non-alcohol beer-like fermented beverage can be obtained. Here, in the preparation of the pre-fermentation solution, hops are added so that the fermented beverage contains an amount of T-fraction that can further suppress the growth of Pectinata and / or Lactobacillus as described below. May be.
本発明の好ましい態様によれば、Ｔ−フラクションの添加工程が、加熱処理（好ましくは、オートクレーブによる処理）した異性化ホップエキスを発酵前液の煮沸中（好ましくは、煮沸開始時）に添加する工程を含む方法である。Ｔ−フラクションの添加工程がこのような工程を含むことにより、飲料中のＴ−フラクションの量を増加させることができ、その結果として、ペクチネイタス属菌の増殖をさらに抑制することが可能となる。さらに好ましい態様によれば、異性化ホップエキス（例えば、スタイナー社製（米国））を蒸留水に０．５％溶解させた後に、溶解液を乳酸にてｐＨ１．０〜５．０（好ましくは、ｐＨ３．０）に調整し、該溶解液を５０〜１３５℃（好ましくは、１３５℃）、１〜１２０分（好ましくは、２０分）加熱処理（好ましくは、オートクレーブによる処理）したものである。 According to the preferable aspect of this invention, the addition process of T-fraction adds the isomerization hop extract heat-processed (preferably processing by an autoclave) during boiling of the pre-fermentation liquid (preferably at the time of boiling start). It is a method including a process. When the step of adding the T-fraction includes such a step, the amount of the T-fraction in the beverage can be increased, and as a result, it is possible to further suppress the growth of the genus Pectinatus. According to a more preferred embodiment, after isomerized hop extract (for example, Steiner (USA)) is dissolved in distilled water by 0.5%, the solution is dissolved in lactic acid at pH 1.0 to 5.0 (preferably , PH 3.0), and the solution is heat-treated (preferably treated with an autoclave) at 50 to 135 ° C. (preferably 135 ° C.) for 1 to 120 minutes (preferably 20 minutes). .
本発明の好ましい態様によれば、ビール様飲料はビール様発酵アルコール飲料である。発酵アルコール飲料は、一般的にパストライゼーション処理などの滅菌工程がないため、本発明の方法が特に有用である。ここで、発酵アルコール飲料とは酵母により発酵して得られた飲料を意味し、アルコールは発酵により得られても良いし、さらにアルコールを添加して作成しても良い。ビール様発酵アルコール飲料としては、例えば、ビール、発泡酒、雑酒、リキュール類、スピリッツ類、および低アルコール麦芽発酵飲料が挙げられる。 According to a preferred embodiment of the present invention, the beer-like beverage is a beer-like fermented alcoholic beverage. Since fermented alcoholic beverages generally do not have a sterilization process such as a pasturization process, the method of the present invention is particularly useful. Here, the fermented alcoholic beverage means a beverage obtained by fermentation with yeast, and the alcohol may be obtained by fermentation, or may be prepared by adding alcohol. Examples of beer-like fermented alcoholic beverages include beer, sparkling wine, miscellaneous sake, liqueurs, spirits, and low alcohol malt fermented beverages.
本発明の方法により増殖が抑制されるペクチネイタス属菌は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、好ましくはペクチネイタス・フリシンジェンシスまたはペクチネイタス・セレビシフィラスであり、より好ましくはペクチネイタス・フリシンジェンシスである。本発明の製造方法により製造された飲料はこれらの菌の増殖を抑制することができる。 The Pectinatus spp. Whose growth is suppressed by the method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited. Sith. The beverage produced by the production method of the present invention can suppress the growth of these bacteria.
本発明の方法により増殖が抑制されるラクトバチルス属菌は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、好ましくはラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・リンドネリであり、より好ましくはラクトバチルス・ブレビスである。本発明の製造方法により製造された飲料はこれらの菌の増殖を抑制することができる。 The Lactobacillus genus whose growth is suppressed by the method of the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is preferably Lactobacillus brevis or Lactobacillus lindonelli, more preferably Lactobacillus brevis. is there. The beverage produced by the production method of the present invention can suppress the growth of these bacteria.
本発明の方法により製造されるビール様飲料中のＴ−フラクションの含有量は、公知のいずれの方法により測定してもよいが、好ましくは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析により測定することができる。 The content of T-fraction in the beer-like beverage produced by the method of the present invention may be measured by any known method, but preferably can be measured by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis.
ビール様飲料中のＴ−フラクションの含有量を測定するための高速液体クロマトグラフィの分析条件としては、例えば、以下の条件を用いて行うことができるが、高速液体クロマトグラフィに使用されるカラムは逆相カラムであれば特に限定されないが、Ｃ１８カラム（好ましくは、粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍの形態のものが好ましい）が好ましい。Ｃ１８カラムとしては、例えば、Ａｌｌｔｉｍａ ８８０５２（オルテック社製）（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）などが挙げられる。
＜高速液体クロマトグラフィ分析用試料調製条件＞
Ｔ−フラクションを添加した試料１０ｍｌに、１ｍｌの３Ｎ塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置する。この溶液は水溶層と、有機溶媒層(イソオクタン)との二層に分離し、有機溶媒層から１０ｍｌを採取する。採取した溶液を、窒素ガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化する。これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇと、エタノール溶液４４０ｍｌとの混合溶液を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とする。
＜高速液体クロマトグラフィ分析条件＞
・カラム：Ｃ１８カラム（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）
・移動相Ａの組成：蒸留水：リン酸＝１０００：０．０２(v/v)＋ＥＤＴＡ０．０２％(w/v)
・移動相Ｂの組成：アセトニトリル
・グラジエントプログラムは以下の通りである：
分析開始時においては、移動相Ａの割合を７０％、移動相Ｂの割合を３０％とし、リテンションタイムが１５分までに移動相Ａの割合が７０％から６０％、移動相Ｂの割合が３０％から４０％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが１５〜２２分の間は移動相Ａの割合を６０％、移動相Ｂの割合を４０％とし、リテンションタイムが２５分までに、移動相Ａの割合が６０％から４８％、移動相Ｂの割合が４０％から５２％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが２５〜４５分の間は移動相Ａの割合を４８％、移動相Ｂの割合を５２％とする。
・移動相流速：毎分１．８ｍｌ（流速一定）
・検出波長：２７０ｎｍ
As analysis conditions of high performance liquid chromatography for measuring the content of T-fraction in beer-like beverages, for example, the following conditions can be used. The column is not particularly limited, but is preferably a C18 column (preferably having a particle size of 5 μm × inner diameter of 4.6 mm × column length of 150 mm). Examples of the C18 column include Alltima 88052 (manufactured by Oltech) (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm).
<Sample preparation conditions for high performance liquid chromatography analysis>
1 ml of 3N hydrochloric acid is added to 10 ml of the sample to which the T-fraction has been added, 20 ml of isooctane is added, and the mixture is shaken and allowed to stand. This solution is separated into two layers, an aqueous layer and an organic solvent layer (isooctane), and 10 ml is collected from the organic solvent layer. The collected solution is completely dried and solidified under a nitrogen gas spray. To this, 1 ml of a mixed solution of 12 mg of internal standard substance β-phenylchalcone and 440 ml of ethanol solution is added, and the dissolved one is used as a sample for high performance liquid chromatography analysis.
<High performance liquid chromatography analysis conditions>
Column: C18 column (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm)
-Composition of mobile phase A: distilled water: phosphoric acid = 1000: 0.02 (v / v) + EDTA 0.02% (w / v)
-Composition of mobile phase B: Acetonitrile-The gradient program is as follows:
At the start of the analysis, the ratio of mobile phase A is 70%, the ratio of mobile phase B is 30%, the ratio of mobile phase A is 70% to 60% and the ratio of mobile phase B is 15% by the retention time. Perform a continuous and linear gradient from 30% to 40%. During the retention time of 15 to 22 minutes, the ratio of mobile phase A is 60% and the ratio of mobile phase B is 40%. By 25 minutes, a continuous and linear gradient is performed so that the ratio of mobile phase A is 60% to 48% and the ratio of mobile phase B is 40% to 52%, and the retention time is 25 to 45 minutes. The ratio of mobile phase A is 48% and the ratio of mobile phase B is 52%.
-Mobile phase flow rate: 1.8 ml / min (constant flow rate)
・ Detection wavelength: 270 nm
本発明では、Ｔ−フラクションについて、上記高速液体クロマトグラフィ条件により分析を実施し、リテンションタイムが６〜１２分あるいはイソα酸のピークよりも早く検出されるピーク中で検出強度(mAU)（縦軸）が他のピークよりも高い２本のピークで、各々のリテンションタイムが内部標準物質βフェニルカルコンより３３分±０．６分、３０分±０．７分早く検出されるピーク面積の総和を、内部標準物質のピーク面積で除したピーク面積比（Ｔ−フラクション内標比）に基づいて、Ｔ−フラクションを添加することができる。Ｔ−フラクション内標比は、以下の式により表される：
Ｔ−フラクション内標比＝（Ｔ−フラクションのピーク面積）／（内部標準物質のピーク面積）・・・（Ｉ）
In the present invention, the T-fraction is analyzed under the above-mentioned high performance liquid chromatography conditions, and the detection intensity (mAU) (vertical axis) in the peak in which the retention time is detected from 6 to 12 minutes or earlier than the iso-α acid peak. ) Are two peaks that are higher than the other peaks, and the total peak area detected for each retention time is 33 minutes ± 0.6 minutes and 30 minutes ± 0.7 minutes earlier than the internal standard β-chalcone The T-fraction can be added based on the peak area ratio (T-fraction internal standard ratio) divided by the peak area of the internal standard substance. The T-fraction internal ratio is represented by the following formula:
T-fraction internal standard ratio = (T-fraction peak area) / (peak area of internal standard substance) (I)
高速液体クロマトグラフィ分析の際に用いられる内部標準物質は、特に限定されないが、Ｔ−フラクションともに、βフェニルカルコンを用いることが好ましい。高速液体クロマトグラフィ分析用試料は、例えば、以下のように調製することができる。
＜高速液体クロマトグラフィ分析用試料調製条件＞
Ｔ−フラクションを添加した試料１０ｍｌに、１ｍｌの３Ｎ塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置する。この溶液は水溶層と、有機溶媒層(イソオクタン)との二層に分離し、有機溶媒層から１０ｍｌを採取する。採取した溶液を、窒素ガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化する。これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇと、エタノール４４０ｍｌとの混合溶液を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とする。
Although the internal standard substance used in the high performance liquid chromatography analysis is not particularly limited, it is preferable to use β-phenylchalcone for both T-fractions. The sample for high performance liquid chromatography analysis can be prepared as follows, for example.
<Sample preparation conditions for high performance liquid chromatography analysis>
1 ml of 3N hydrochloric acid is added to 10 ml of the sample to which the T-fraction has been added, 20 ml of isooctane is added, and the mixture is shaken and allowed to stand. This solution is separated into two layers, an aqueous layer and an organic solvent layer (isooctane), and 10 ml is collected from the organic solvent layer. The collected solution is completely dried and solidified under a nitrogen gas spray. 1 ml of a mixed solution of 12 mg of internal standard substance β-phenylchalcone and 440 ml of ethanol is added thereto, and the resulting solution is used as a sample for high performance liquid chromatography analysis.
本発明の好ましい態様によれば、製造された飲料中のＴ−フラクションの量が、飲料を上記高速液体クロマトグラフィ分析条件により上記高速液体クロマトグラフィ分析を実施した場合、Ｔ−フラクション内標比が０．１３以上となるようにＴ−フラクションを添加することができる。Ｔ−フラクション内標比を上記の範囲とすることにより、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖を抑制することができる。 According to a preferred aspect of the present invention, the amount of T-fraction in the produced beverage is such that when the beverage is subjected to the high performance liquid chromatography analysis under the high performance liquid chromatography analysis conditions, the T-fraction internal standard is 0. T-fraction can be added so that it becomes 13 or more. By setting the T-fraction internal standard ratio within the above range, growth of Pectinatus and / or Lactobacillus can be suppressed.
ビール様飲料
本発明の好ましい態様によれば、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖を抑制する量のＴ−フラクションを含むビール様飲料が提供される。
Beer-like beverage According to a preferred embodiment of the present invention, a beer-like beverage comprising an amount of T-fraction that inhibits the growth of Pectinata and / or Lactobacillus is provided.
本発明のより好ましい態様によれば、ビール様飲料はビール様発酵アルコール飲料である。また、本発明の別の好ましい態様によれば、ペクチネイタス属菌はペクチネイタス・フリシンジェンシスまたはペクチネイタス・セレビシフィラスであり、さらに好ましい態様によれば、ペクチネイタス・フリシンジェンシスである。本発明のビール様飲料によれば、これらの菌の増殖を顕著に抑制することができる。 According to a more preferred embodiment of the present invention, the beer-like beverage is a beer-like fermented alcoholic beverage. Moreover, according to another preferable aspect of the present invention, the genus Pectinatus is Pectinatus fricensiensis or Pectinatus cerevisiae, and according to a more preferable aspect, it is Pectinatus fricensiensis. According to the beer-like beverage of the present invention, the growth of these bacteria can be remarkably suppressed.
本発明の別のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属菌はラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・リンドネリであり、さらに好ましい態様によれば、ラクトバチルス・ブレビスである。本発明のビール様飲料によれば、これらの菌の増殖を顕著に抑制することができる。 According to another more preferred aspect of the present invention, the Lactobacillus spp. Is Lactobacillus brevis or Lactobacillus lindonelli, and according to a further preferred aspect, is Lactobacillus brevis. According to the beer-like beverage of the present invention, the growth of these bacteria can be remarkably suppressed.
本発明の好ましい態様によれば、ビール様飲料にＴ−フラクションを添加することを特徴とする、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖抑制方法が提供される。 According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a method for inhibiting the growth of Pectinata and / or Lactobacillus, which comprises adding a T-fraction to a beer-like beverage.
本発明の別の好ましい態様によれば、ビール様発酵アルコール飲料にＴ−フラクションを添加することを特徴とする、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖抑制方法が提供される。 According to another preferred aspect of the present invention, there is provided a method for inhibiting the growth of Pectinata and / or Lactobacillus, which comprises adding a T-fraction to a beer-like fermented alcoholic beverage.
本発明の別の好ましい態様によれば、製造された飲料中のＴ−フラクションの量が、上記高速液体クロマトグラフィ分析条件により高速液体クロマトグラフィ分析に付した場合、Ｔ−フラクション内標比が０．１３以上となる量である、ペクチネイタス属菌および／またはラクトバチルス属菌の増殖抑制方法が提供される。 According to another preferred embodiment of the present invention, when the amount of T-fraction in the produced beverage is subjected to high performance liquid chromatography analysis under the above high performance liquid chromatography analysis conditions, the T-fraction internal ratio is 0.13. There is provided a method for inhibiting the growth of Pectinata and / or Lactobacillus, which is the above amount.
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described based on the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
植菌試験用Ｔ−フラクション抽出液の調製
異性化ホップエキス（スタイナー社製（米国））を蒸留水に０．５％溶解させた後に、溶解液を乳酸によりｐＨ３．０に調整した。該溶解液を１３５℃で、２０分間オートクレーブ処理した処理液をＴ−フラクション抽出液とした。
Preparation of T-fraction extract for inoculation test After isomerized hop extract (manufactured by Steiner (USA)) was dissolved in distilled water by 0.5%, the solution was adjusted to pH 3.0 with lactic acid. A treatment liquid obtained by autoclaving the solution at 135 ° C. for 20 minutes was used as a T-fraction extract.
Ｔ−フラクション抽出液添加による植菌試験（ペクチネイタス・フリシンジェンシス）
市販品のビールに上記Ｔ−フラクション抽出液を添加し、ビール混濁菌であるペクチネイタス・フリシンジェンシス（入手先：ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）））の増殖抑制効果を得る成分値の範囲を探索した。抽出液の各添加水準は、下記に示した表１の通りであった。
Inoculation test with addition of T-fraction extract (Pectinatus fricingensis)
Addition of the above T-fraction extract to commercial beer to suppress the growth of Pectinitas frisengensis (source: Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)) A range of component values for obtaining an effect was searched. Each addition level of the extract was as shown in Table 1 below.
さらに、１．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌレベルでペクチネイタス・フリシンジェンシスを植菌し、１４日間３０℃で培養後、生菌数を確認した。試験の結果を表１に示す。 Further, Pectinatus frisengensis was inoculated at a level of 1.0 × 10 4 CFU / ml, and the number of viable cells was confirmed after culturing at 30 ° C. for 14 days. The test results are shown in Table 1.
Ｔ−フラクション抽出液添加による植菌試験（ラクトバチルス・ブレビス）
市販品のビールに上記Ｔ−フラクション抽出液を添加し、ビール混濁菌であるラクトバチルス・ブレビス（入手先：ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ））の増殖抑制効果を確認した。抽出液の各添加水準は、下記に示した表２の通りであった。
Inoculation test by adding T-fraction extract (Lactobacillus brevis)
Addition of the above T-fraction extract to commercially available beer and confirm the growth inhibitory effect of Lactobacillus brevis (source: Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)) Each addition level of the extract was as shown in Table 2 below.
さらに、１．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌレベルでラクトバチルス・ブレビスを植菌し、１４日間３０℃で培養後、生菌数を確認した。試験の結果を表２に示す。 Furthermore, Lactobacillus brevis was inoculated at a level of 1.0 × 10 4 CFU / ml and cultured at 30 ° C. for 14 days, and the viable cell count was confirmed. The test results are shown in Table 2.
高速液体クロマトグラフィ分析のための試料の調製
Ｔ−フラクションを添加した各試料１０ｍｌに、１ｍｌの３Ｎ塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置した。この溶液は、水溶層と、有機溶媒層(イソオクタン)との二層に分離し、有機溶媒層から１０ｍｌを採取した。採取した溶液を、窒素ガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化させた。これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇと、エタノール４４０ｍｌとの混合溶液を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とした。
Preparation of Sample for High Performance Liquid Chromatography Analysis After adding 1 ml of 3N hydrochloric acid to 10 ml of each sample to which T-fraction was added, 20 ml of isooctane was added, and the mixture was shaken and allowed to stand. This solution was separated into two layers, an aqueous layer and an organic solvent layer (isooctane), and 10 ml was collected from the organic solvent layer. The collected solution was completely dried and solidified under a nitrogen gas spray. To this was added 1 ml of a mixed solution of 12 mg of internal standard substance β-phenylchalcone and 440 ml of ethanol, and the resulting solution was used as a sample for high performance liquid chromatography analysis.
高速液体クロマトグラフィ分析によるＴ−フラクション内標比の算出
高速液体クロマトグラフィの分析条件は、以下の通りである。
＜高速液体クロマトグラフィ分析条件＞
・カラム：Ａｌｌｔｉｍａ８８０５２（オルテック社製）（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）
・サンプル注入量１０μｌ
・移動相Ａの組成：蒸留水：リン酸＝１０００：０．０２(v/v)＋ＥＤＴＡ０．０２％(w/v)
・移動相Ｂの組成：アセトニトリル
・グラジエントプログラムは以下の通りである（表３参照）：
分析開始時においては、移動相Ａの割合を７０％、移動相Ｂの割合を３０％とし、リテンションタイムが１５分までに移動相Ａの割合が７０％から６０％、移動相Ｂの割合が３０％から４０％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが１５〜２２分の間は移動相Ａの割合を６０％、移動相Ｂの割合を４０％とし、リテンションタイムが２５分までに、移動相Ａの割合が６０％から４８％、移動相Ｂの割合が４０％から５２％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが２５〜４５分の間は移動相Ａの割合を４８％、移動相Ｂの割合を５２％とした。
・移動相流速：毎分１．８ｍｌ（流速一定）
・検出波長：２７０ｎｍ
Calculation of T-fraction internal standard ratio by high performance liquid chromatography analysis The analysis conditions of high performance liquid chromatography are as follows.
<High performance liquid chromatography analysis conditions>
Column: Alltima88052 (manufactured by Oltech) (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm)
・ Sample injection volume 10μl
-Composition of mobile phase A: distilled water: phosphoric acid = 1000: 0.02 (v / v) + EDTA 0.02% (w / v)
-Composition of mobile phase B: Acetonitrile-The gradient program is as follows (see Table 3):
At the start of the analysis, the ratio of mobile phase A is 70%, the ratio of mobile phase B is 30%, the ratio of mobile phase A is 70% to 60% and the ratio of mobile phase B is 15% by the retention time. Perform a continuous and linear gradient from 30% to 40%. During the retention time of 15 to 22 minutes, the ratio of mobile phase A is 60% and the ratio of mobile phase B is 40%. By 25 minutes, a continuous and linear gradient is performed so that the ratio of mobile phase A is 60% to 48% and the ratio of mobile phase B is 40% to 52%, and the retention time is 25 to 45 minutes. The ratio of mobile phase A was 48% and the ratio of mobile phase B was 52%.
-Mobile phase flow rate: 1.8 ml / min (constant flow rate)
・ Detection wavelength: 270 nm
高速液体クロマトグラフィ用カラム（Ａｌｌｔｉｍａ ８８０５２（オルテック社製）（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）を用いて、蒸留水：リン酸＝１０００：０．０２(v/v)＋ＥＤＴＡ０．０２％(w/v)で作成した移動相Ａ、アセトニトリルトリルの移動相Ｂを、上記表３のグラジエントプログラムのとおり、高速液体クロマトグラフィ分析を行った場合において、リテンションタイムが６〜１２分あるいはイソα酸のピークよりも早く検出されるピークの中で検出強度(mAU)（縦軸）が他のピークよりも高い２本のピークで、各々のリテンションタイムが内部標準物質βフェニルカルコンより３３分±０．６分、３０分±０．７分早く検出されるピーク面積を総和し、「Ｔ−フラクション」と表記し、内部標準物質βフェニルカルコンのピーク面積の総和を「内部標準物質（βフェニルカルコン）」と表記した（図１参照）。 Using a column for high performance liquid chromatography (Alltima 88052 (manufactured by Oltech) (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm), distilled water: phosphoric acid = 1000: 0.02 (v / v) + EDTA 0.02 When the mobile phase A and the mobile phase B of acetonitrile tolyl prepared in% (w / v) were subjected to high performance liquid chromatography analysis according to the gradient program of Table 3, the retention time was 6 to 12 minutes or isoα Among the peaks detected earlier than the acid peak, two peaks whose detection intensity (mAU) (vertical axis) is higher than the other peaks, and each retention time is 33 minutes ± from the internal standard substance β-phenylchalcone. The peak areas detected early at 0.6 minutes, 30 minutes ± 0.7 minutes are summed up, expressed as “T-fraction”, and the internal standard substance β-phenylcalco The sum of the peak areas was expressed as “internal standard (β-phenylchalcone)” (see FIG. 1).
Ｔ−フラクション内標比は、上記式（Ｉ）に基づき算出した。 The T-fraction internal standard ratio was calculated based on the above formula (I).
試験醸造品でのＴ−フラクション増量の検証
２００Ｌスケールの試醸設備にて、まずは通常のビール製法にしたがって、糖化工程を行った。麦汁濾過工程を経て、麦汁煮沸開始時、Ｔ−フラクション抽出液を通常のホップと同時に煮沸釜へ添加し、７０分間煮沸した。添加したＴフラクション溶液は、異性化ホップエキス（スタイナー社製（米国））を蒸留水に０．５％溶解させた後に、ｐＨを乳酸により３．０に調整し、該溶解液を１３５℃で、２０分間オートクレーブ処理して調製し、その処理液をＴ−フラクション抽出液として上記の添加に用いた。麦汁煮沸終了後、仕込麦汁糖度１２度に調整した仕込麦汁（仕込時の麦芽使用比率４９％、副原料（液糖、大麦）使用比率５１％）を調製した。この仕込麦汁を冷却し、冷麦汁サンプルを得た。その後、冷麦汁に酵母を添加し、主発酵７日、後発酵１５日を経て、濾過を行った発泡酒を、試験醸造品とした。
その結果、煮沸中にＴ−フラクション抽出液を添加することで、上記試験醸造品において、ペクチネイタス・フリシンジェンシスおよびラクトバチルス・ブレビスの増殖抑制可能な範囲までＴ−フラクションを増量できることが明らかとなった（表４参照）。なお、表４中、試験区ＡはＴ−フラクション抽出液を添加したもの、試験区ＢはＴ−フラクション抽出液を添加していないものを表す。
Verification of T-fraction increase in test brewed products First, a saccharification step was performed in a 200 L scale brewing facility according to a normal beer manufacturing method. Through the wort filtration process, at the start of wort boiling, the T-fraction extract was added to the boiling pot simultaneously with the normal hop, and boiled for 70 minutes. The added T fraction solution was prepared by dissolving 0.5% of isomerized hop extract (manufactured by Steiner (USA)) in distilled water, adjusting the pH to 3.0 with lactic acid, and dissolving the solution at 135 ° C. The mixture was autoclaved for 20 minutes, and the treated solution was used as the T-fraction extract for the above addition. After the wort boiling was completed, a prepared wort adjusted to 12 degrees of the charged wort sugar (a malt usage ratio of 49% and a secondary raw material (liquid sugar, barley) usage ratio of 51%) was prepared. The charged wort was cooled to obtain a cold wort sample. Then, yeast was added to cold wort, and the Happoshu that was filtered after 7 days of main fermentation and 15 days of post-fermentation was used as a test brewed product.
As a result, it is clear that by adding the T-fraction extract during boiling, the T-fraction can be increased to the extent that the growth of Pectinatus frisengensis and Lactobacillus brevis can be suppressed in the test brewed product. (See Table 4). In Table 4, test group A represents a sample to which a T-fraction extract was added, and test group B represents a sample to which no T-fraction extract was added.
Ｔ−フラクションを増量させた試験醸造品の香味確認
上記Ｔ−フラクションを増量させた試験醸造品について、官能評価を行なった。また、抗菌活性を有する既知のホップ成分であるα酸およびα酸の酸化成分を増量させた試験醸造品についても官能評価を行なった。α酸およびα酸の酸化成分を増量させた試験醸造品の作成方法は、それぞれ下記に記載した方法に準じた。
Flavor confirmation of test brewed product with increased T-fraction The test brewed product with increased T-fraction was subjected to sensory evaluation. Moreover, sensory evaluation was performed also about the test brewing product which increased the alpha acid which is a known hop component which has antimicrobial activity, and the oxidation component of alpha acid. The methods for preparing test brewed products with increased amounts of α-acid and oxidation component of α-acid were in accordance with the methods described below.
α酸は、ペレットホップ（ＨＰＥ Ｔｙｐｅ９０）を、８０％エタノールに２４時間、４℃で浸漬させ、抽出した。浸漬後、６０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、その上清をα酸抽出液とした。このα酸抽出液を市販品ビールに加え、上記と同様に植菌試験を行った。結果は下記表６に表す。また、下記に示す高速液体クロマトグラフィ分析条件により、α酸の内標比（内部標準物質：βフェニルカルコン）を求めた。
＜α酸の高速液体クロマトグラフィ分析のための試料の調製＞
α酸抽出液を添加した各試料１０ｍｌに、１ｍｌの３N塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置した。この溶液は、試料から成る水溶層とイソクタンから成る有機溶媒層の２層に分離し、イソオクタン有機溶媒層から１０ｍｌを採取した。採取した後、窒素がガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化させた。これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇを加えたリン酸メタノール溶液（リン酸：メタノール＝４０ｍｌ：４００ｍｌ）を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とした。
＜高速液体クロマトグラフィ分析によるα酸内標比の算出＞
高速液体クロマトグラフィの分析条件は、以下の通りである。
<高速液体クロマトグラフィ分析条件>
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｃ１８ ４．０×２５０ｍｍ
サンプル注入量：５０μｌ
移動相Ｃの組成：蒸留水２７．０％・メタノール７２．０％・リン酸１．０％
移動相Ｄの組成：メタノール９９．０％・リン酸１．０％
移動相流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．（流速一定）
検出波長：２７０ｎｍ
<Preparation of Sample for High Performance Liquid Chromatography Analysis of α Acid>
1 ml of 3N hydrochloric acid was added to 10 ml of each sample to which the α acid extract was added, 20 ml of isooctane was added, and the mixture was shaken and allowed to stand. This solution was separated into two layers, a water-soluble layer consisting of a sample and an organic solvent layer consisting of isoctane, and 10 ml was taken from the isooctane organic solvent layer. After collection, nitrogen was completely dried and solidified under gas spray. 1 ml of a phosphoric acid methanol solution (phosphoric acid: methanol = 40 ml: 400 ml) to which 12 mg of the internal standard substance β-phenylchalcone was added was dissolved and used as a sample for high performance liquid chromatography analysis.
<Calculation of α acid internal standard ratio by high performance liquid chromatography analysis>
The analysis conditions of high performance liquid chromatography are as follows.
<High-performance liquid chromatography analysis conditions>
Column: Nucleosil 100-5C18 4.0 × 250 mm
Sample injection volume: 50 μl
Composition of mobile phase C: 27.0% distilled water, 72.0% methanol, 1.0% phosphoric acid
Composition of mobile phase D: methanol 99.0%, phosphoric acid 1.0%
Mobile phase flow rate: 1 ml / min. (Constant flow rate)
Detection wavelength: 270 nm
高速液体クロマトグラフィ用カラム；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｃ１８ ４.０×２５０ｍｍを用いて、蒸留水２７％、メタノール７２％、および、リン酸１％からなる移動相Ｃを、１ｍｌ／分の一定流速で２７０ｎｍの検出波長の高速液体クロマトグラフィによる測定をした場合において、α酸ピークのリテンションタイム（ＲＴ）は６．５〜１０．０分であり、その間の面積の総和を求め、その面積と内部標準物質βフェニルカルコンのピーク面積との比により求めた。α酸ピークのＲＴは±０．５分の差は許容される。 High-performance liquid chromatography column; Nucleosil 100-5C18 4.0 × 250 mm was used to transfer mobile phase C consisting of 27% distilled water, 72% methanol, and 1% phosphoric acid at 270 nm at a constant flow rate of 1 ml / min. When the detection wavelength was measured by high performance liquid chromatography, the retention time (RT) of the α acid peak was 6.5 to 10.0 minutes, and the total area between them was obtained. It calculated | required by ratio with the peak area of a chalcone. The α acid peak RT is allowed to differ by ± 0.5 minutes.
α酸の酸化成分は、大気存在下で２５℃２週間後熟させたペレットホップ（ＣＳＡ）を、水に２４時間、４℃で浸漬させ、抽出した。浸漬後、６０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、その上清をα酸の酸化成分抽出液とした。このα酸酸化成分抽出液を市販品ビールに加え、上記と同様に植菌試験を行った。結果は下記表６に表す。また、上記α酸と同様の高速液体クロマトグラフィ分析条件により、α酸の酸化成分の内標比（内部標準物質：βフェニルカルコン）を求めた。α酸酸化成分はイソα酸ピーク以前に検出される全てのピークの面積を総和し、その面積と内部標準物質βフェニルカルコンのピーク面積との比により求めた。 The oxidation component of α-acid was extracted by immersing pellet hops (CSA) that had been ripened after 2 weeks at 25 ° C. in the presence of air in water at 4 ° C. for 24 hours. After the immersion, the mixture was centrifuged at 6000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was used as an oxidizing component extract of α acid. This α-acid oxidation component extract was added to commercial beer, and an inoculation test was performed in the same manner as described above. The results are shown in Table 6 below. Moreover, the internal standard ratio (internal standard substance: β phenyl chalcone) of the oxidation component of α acid was determined under the same high performance liquid chromatography analysis conditions as those of the α acid. The α acid oxidation component was obtained by summing up the areas of all peaks detected before the iso α acid peak and the ratio of the area to the peak area of the internal standard substance β-phenylchalcone.
下記官能評価の結果、α酸およびα酸の酸化成分は、ペクチネイタス・フリシンジェンシスの増殖抑制効果が表れるまで増量すると、渋みを若干感じるが、Ｔ−フラクションは、ペクチネイタス・フリシンジェンシスの増殖抑制効果が表れるまで増量しても、異臭味はなく、香味に対して影響しなかった（表６参照）。 As a result of the following sensory evaluation, the α-acid and the oxidizing component of the α-acid are slightly astringent when the amount is increased until the growth inhibitory effect of pectinitas frisengensis appears, but the T-fraction is Even if the amount was increased until the growth inhibitory effect appeared, there was no off-flavor, and the flavor was not affected (see Table 6).
市販品の分析結果
市販品のＴ−フラクションの内標比を上記の高速液体クロマトグラフィ条件と同様の条件で測定し、Ｔ−フラクションの内標比を算出した。その結果を下記表７に示した。測定した市販品の中には、Ｔ−フラクションの内標比が０．１３以上のものは存在しなかった。
Claims (5)
＜高速液体クロマトグラフィ分析用試料調製条件＞
（Ｔ−フラクションを添加した試料１０ｍｌに、１ｍｌの３Ｎ塩酸を加えた後、２０ｍｌのイソオクタンを加え、振とう、静置し、この溶液は水溶層と、有機溶媒層(イソオクタン)との二層に分離し、有機溶媒層から１０ｍｌを採取し、採取した溶液を、窒素ガス噴霧下で完全に乾燥させ固体化し、これに内部標準物質βフェニルカルコン１２ｍｇと、エタノール溶液４４０ｍｌとの混合溶液を１ｍｌ加え、溶解したものを高速液体クロマトグラフィ分析用試料とする）、
＜高速液体クロマトグラフィ分析条件＞
（・カラム：Ｃ１８カラム（粒径５μｍ×内径４.６ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ）
・移動相Ａの組成：蒸留水：リン酸＝１０００：０．０２(v/v)＋ＥＤＴＡ０．０２％(w/v)
・移動相Ｂの組成：アセトニトリル
・グラジエントプログラムは以下の通りである：
分析開始時においては、移動相Ａの割合を７０％、移動相Ｂの割合を３０％とし、リテンションタイムが１５分までに移動相Ａの割合が７０％から６０％、移動相Ｂの割合が３０％から４０％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが１５〜２２分の間は移動相Ａの割合を６０％、移動相Ｂの割合を４０％とし、リテンションタイムが２５分までに、移動相Ａの割合が６０％から４８％、移動相Ｂの割合が４０％から５２％となるように、連続かつ直線的なグラジエントを行い、リテンションタイムが２５〜４５分の間は移動相Ａの割合を４８％、移動相Ｂの割合を５２％とする、
・移動相流速：毎分１．８ｍｌ（流速一定）
・検出波長：２７０ｎｍ）、
により高速液体クロマトグラフィ分析に付した場合、βフェニルカルコンのピーク面積に対するＴ−フラクションのピーク面積の比（Ｔ−フラクション内標比）が０．１３以上となるようにＴ−フラクションを添加する、請求項１に記載の方法。 The amount of T-fraction in the produced beverage is determined according to the following analysis conditions:
<Sample preparation conditions for high performance liquid chromatography analysis>
(After adding 1 ml of 3N hydrochloric acid to 10 ml of the sample to which T-fraction has been added, 20 ml of isooctane is added, and the mixture is shaken and allowed to stand. This solution consists of two layers: an aqueous layer and an organic solvent layer (isooctane). 10 ml from the organic solvent layer was collected, and the collected solution was completely dried and solidified under a nitrogen gas spray. Then, a mixed solution of 12 mg of internal standard substance β-phenylchalcone and 440 ml of ethanol solution was added to 1 ml. In addition, the dissolved sample is used as a sample for high performance liquid chromatography analysis)
<High performance liquid chromatography analysis conditions>
(Column: C18 column (particle size 5 μm × inner diameter 4.6 mm × column length 150 mm)
-Composition of mobile phase A: distilled water: phosphoric acid = 1000: 0.02 (v / v) + EDTA 0.02% (w / v)
-Composition of mobile phase B: Acetonitrile-The gradient program is as follows:
At the start of the analysis, the ratio of mobile phase A is 70%, the ratio of mobile phase B is 30%, the ratio of mobile phase A is 70% to 60% and the ratio of mobile phase B is 15% by the retention time. Perform a continuous and linear gradient from 30% to 40%. During the retention time of 15 to 22 minutes, the ratio of mobile phase A is 60% and the ratio of mobile phase B is 40%. By 25 minutes, a continuous and linear gradient is performed so that the ratio of mobile phase A is 60% to 48% and the ratio of mobile phase B is 40% to 52%, and the retention time is 25 to 45 minutes. The ratio of mobile phase A is 48% and the ratio of mobile phase B is 52% during
-Mobile phase flow rate: 1.8 ml / min (constant flow rate)
・ Detection wavelength: 270 nm),
The T-fraction is added so that the ratio of the peak area of the T-fraction to the peak area of β-phenylchalcone (T-fraction internal standard ratio) is 0.13 or more when subjected to high performance liquid chromatography analysis by Item 2. The method according to Item 1.
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