JP2013135637A - 末梢神経細胞とケラチノサイトの共培養系及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、末梢神経細胞、ケラチノサイト、及び、両細胞を別々に培養するための複数のチャンバーを備えた細胞培養容器、を含む、末梢神経細胞を播種するチャンバーとケラチノサイトを播種するチャンバーとが、末梢神経細胞から伸展する軸索が通過できる程度の内径を有する複数の流路で接続されている、キット及びその使用方法、を提供する。
【選択図】図2
Description
[1]末梢神経細胞、ケラチノサイト、及び、両細胞を別々に培養するための複数のチャンバーを備えた細胞培養容器、を含み、末梢神経細胞を播種するチャンバーとケラチノサイトを播種するチャンバーとが、末梢神経細胞から伸展する軸索が通過できる程度の内径を有する複数の流路で接続されている、キット。
[2]前記流路の内径が約10μmである、[1]のキット。
[3]軸索伸展を定量する方法であって、
1)[1]又は[2]のキット内の各チャンバーに、末梢神経細胞及びケラチノサイトを播種する工程、
2)当該キットをインキュベートする工程、及び
3)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程、
を含んで成る方法。
[4]前記末梢神経細胞がチャンバーの体積1μL当たり1,500個以上となるよう播種される、[3]の方法。
[5]軸索伸展阻害剤をスクリーニングする方法であって、
1)[1]又は[2]のキット内の各チャンバーに、末梢神経細胞及びケラチノサイトを播種する工程、
2)ケラチノサイトを含むチャンバー内に候補薬剤を添加する工程、
3)当該キットをインキュベートする工程、及び
4)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程、
を含んで成り、コントロールと比較して前記量が有意に減少した場合に当該候補薬剤が軸索伸展阻害剤として評価される、方法。
[6]前記末梢神経細胞がチャンバーの体積1μL当たり1,500個以上となるよう播種される、[5]の方法。
[7]前記軸索伸展阻害剤が鎮痒剤である、[5]又は[6]の方法。
第一の観点において、本発明は、末梢神経細胞、ケラチノサイト、及び、両細胞を別々に培養するための複数のチャンバーを備えた細胞培養容器、を含むキット、を提供する。当該末梢神経細胞は特に限定されないが、後根神経節(DRG)由来のものはケラチノサイトとの相互作用を観察するのに好ましい。当該ケラチノサイトも特に限定されず、皮膚部由来のケラチノサイト、例えば、包皮由来のケラチノサイトを使用することができる。本発明のキットは種々の用途に使用可能であるが、一例として、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部に由来するケラチノサイトを用いた場合、神経細胞との共培において軸索伸展促進効果を検討することもできる。
第二の観点において、本発明は、上記キットを用いて軸索伸展を定量する方法、を提供する。当該定量方法は、以下の工程を含んで成る:
1)末梢神経細胞及びケラチノサイトを当該キット内の各チャンバーに播種する工程、
2)当該キットをインキュベートする工程、及び
3)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程。
流路を超えて伸展した末梢神経細胞のピクセル数/解析エリアのピクセル数×100
解析はケラチノサイト側のチャンバー全てについて実施する必要はなく、任意の一視野当たりにおける軸索伸展量を測定してもよい。
1)末梢神経細胞及びケラチノサイトを当該キット内の各チャンバーに播種する工程、
2)ケラチノサイトを含むチャンバー内に候補薬剤を添加する工程、
3)当該キットをインキュベートする工程、及び
4)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程。
細胞培養容器としてAXIS(登録商標)(Millipore社製)を準備し、その取扱説明書に従いAXIS(登録商標)の各チャンバーを、ポリ-D-リジン、ラミニン、ヒトII型コラーゲン、ポリ-L-オルニチンの混合液でコーティングした。翌日、当該コーティングを洗浄し、新生児由来ケラチノサイト(ヒト新生児由来表皮ケラチノサイト(クラボウ社製: をチャンバー1μl当たり1,000個播種した。
セマフォリン3Aは、表皮内の神経細胞密度を減少させるタンパク質である(非特許文献1)。既知の軸索伸展阻害剤であるセマフォリン3Aを用い、以下の方法で軸索伸展量を測定した。
Claims (7)
- 末梢神経細胞、ケラチノサイト、及び、両細胞を別々に培養するための複数のチャンバーを備えた細胞培養容器、を含み、末梢神経細胞を播種するチャンバーとケラチノサイトを播種するチャンバーとが、末梢神経細胞から伸展する軸索が通過できる程度の内径を有する複数の流路で接続されている、キット。
- 前記流路の内径が約10μmである、請求項1に記載のキット。
- 軸索伸展を定量する方法であって、
1)請求項1又は2に記載のキット内の各チャンバーに、末梢神経細胞及びケラチノサイトを播種する工程、
2)当該キットをインキュベートする工程、及び
3)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程、
を含んで成る方法。 - 前記末梢神経細胞がチャンバーの体積1μL当たり1,500個以上となるよう播種される、請求項3に記載の方法。
- 軸索伸展阻害剤をスクリーニングする方法であって、
1)請求項1又は2に記載のキット内の各チャンバーに、末梢神経細胞及びケラチノサイトを播種する工程、
2)ケラチノサイトを含むチャンバー内に候補薬剤を添加する工程、
3)当該キットをインキュベートする工程、及び
4)末梢神経細胞から伸展する軸索が、ケラチノサイトが播種されたチャンバー内へ侵入する量を測定する工程、
を含んで成り、コントロールと比較して前記量が有意に減少した場合に当該候補薬剤が軸索伸展阻害剤として評価される、方法。 - 前記末梢神経細胞がチャンバーの体積1μL当たり1,500個以上となるよう播種される、請求項5に記載の方法。
- 前記軸索伸展阻害剤が鎮痒剤である、請求項5又は6に記載の方法。
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