JP2013111001A - デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的領域(A)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(I)と、標的配列(B)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(II)及び標的配列(C)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(III)から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、を含むデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
【選択図】なし
Description
PCEやTCEなどの汚染物質を浄化するために嫌気性バイオスティミュレーションを適用した場合、cis−1,2−DCE以降の分解が思うように進まず、より毒性の高い塩化ビニルモノマーが土壌中または地下水中に長期間蓄積する結果となっているケースが多々見受けられる。
デハロコッコイデス属細菌の汚染サイトにおける存在の有無を検出する方法として、デハロコッコイデス属細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、Real-time PCR法により定量分析を行うことが知られている(例えば、特許文献1参照)。
また、cis−1,2−DCE分解遺伝子として、デハロコッコイデス属 VS株の保有するvcrA遺伝子及びデハロコッコイデス属 BAV1株の保有するbvcA遺伝子がそれぞれ報告されている(例えば、非特許文献1参照)。
また、上記特許文献1及び非特許文献1に記載のプライマーは、Real-time PCR法用のプライマーであるため、LAMP法のプライマーセットとして用いることはできない。
<1> デハロコッコイデス属細菌における16S rRNA遺伝子をコードする配列番号1で示される塩基配列のうち315番目から1410番目の塩基配列に含まれる標的領域(A)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(I)と、
デハロコッコイデス属細菌におけるbvcA遺伝子をコードする配列番号2で示される塩基配列のうち508番目から1260番目の塩基配列に含まれる標的配列(B)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(II)及びvcrA遺伝子をコードする配列番号3で示される塩基配列のうち1260番目から1684番目の塩基配列に含まれる標的配列(C)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(III)から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、
を含むデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
<2> 前記標的配列(A)が配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表される塩基配列を含み、前記標的配列(B)が配列番号8、配列番号9、配列番号10及び配列番号11で表される塩基配列を含み、前記標的配列(C)が配列番号12、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で表される塩基配列を含む<1>に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
<3> 前記プライマーセット(I)が、配列番号16から配列番号19で表される塩基配列を含む<1>又は<2>に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
<4> 前記プライマーセット(II)が、配列番号20から配列番号23で表される塩基配列を含む<1>から<3>のいずれかに記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
<5> 前記プライマーセット(III)が、配列番号24から配列番号27で表される塩基配列を含む<1>から<4>のいずれかに記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
<6> <1>から<5>のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
<7> 前記検出が、濁度又は蛍光強度を測定することを含む<6>に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
<8> さらに、前記検出することにより得られた結果に基づいて、デハロコッコイデス属細菌を定量することを含む<6>又は<7>に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
<9> 浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、
該試料核酸から<6>から<8>のいずれかに記載の検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び
検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む浄化対象領域の浄化計画を設計する方法。
<10> (I)浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、cis−1,2−DCEの濃度を測定すること、
(II)<6>から<8>のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
(III)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
(IV)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるcis−1,2−DCEの分解速度を算出すること、
(V)前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたcis−1,2−DCE分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること、及び
(VI)前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行することを含む浄化対象領域の浄化方法。
<11> 前記(I)の後に、<6>から<8>のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき、デハロコッコイデス属細菌によるcis−1,2−DCEの分解速度を予測すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び前記予測されたcis−1,2−DCE分解速度に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な予測施工期間を得ること、
前記予測施工期間を得た後に、前記(II)から前記(IV)を行うこと、
前記(II)から前記(IV)で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認すること、
前記(VI)を行うこと、
を含む<10>に記載の浄化対象領域の浄化方法。
<12> さらに、前記(VI)の後に、前記浄化対象領域のcis−1,2−DCEの濃度をモニタリングすること、及び
<6>から<8>のいずれかに記載の検出方法を用いて、前記浄化対象領域のデハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすることを含む<10>又は<11>に記載の浄化対象領域の浄化方法。
<13> <1>から<5>のいずれかに記載のプライマーセットを含むデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キット。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法は、前記デハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを用いてcis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を検出することを含む方法である。
本発明にかかる浄化対象領域の浄化計画を設計する方法は、浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、該試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む方法である。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、デハロコッコイデス属細菌を検出するためのプライマーセットを含むものである。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において、地下水とは、地中の土砂や岩石のすきまや割れ目などに存在する水の総称を意味する。
本明細書において、バイオスティミュレーションとは、土着微生物を活性化させて浄化する方法を意味し、例えば、汚染土壌や地下水に生息する、油分を分解する能力を有する微生物に、栄養剤となる化合物を与えて微生物を増殖、活性化させ、汚染物質である油分の分解を促進する方法などを含む。
本明細書において、バイオオーグメンテーションとは、外来微生物及び栄養剤となる化合物を導入して浄化する方法を意味し、例えば、外部で大量に増殖、活性化させた、油分を分解する能力を有する微生物を、栄養剤となる化合物と共に汚染土壌又は地下水に注入して浄化する方法などを含む。
本明細書において、細菌数とは、LAMP法により検出される標的領域のコピー数を意味する。
以下、本発明について説明する。
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット(以下、単に「検出用プライマーセット」ともいう。)は、デハロコッコイデス属細菌における16S rRNA遺伝子をコードする配列番号1で示される塩基配列のうち315番目から1410番目の塩基配列に含まれる標的領域(A)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(I)と、デハロコッコイデス属細菌におけるbvcA遺伝子をコードする配列番号2で示される塩基配列のうち508番目から1260番目の塩基配列に含まれる標的配列(B)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(II)及びvcrA遺伝子をコードする配列番号3で示される塩基配列のうち1260番目から1684番目の塩基配列に含まれる標的配列(C)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(III)から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットとを含む検出用プライマーセットである。
すなわち、前記標的領域(A)と、前記標的領域(B)及び前記標的領域(C)から選ばれる少なくとも一方の標的領域とを増幅させることにより、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在を適正に評価することが可能になると推測される。加えて、プライマーセット(I)と、前記プライマーセット(II)及び前記プライマーセット(III)から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットとを用いることにより、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、迅速、簡便且つ高感度で検出することが可能になると推測される。
また、標的領域(A)は、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表1に示される配列表の配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
相同性が認められるとは、例えば配列番号16、配列番号17、配列番号18及び配列番号19で表される各塩基配列からなる4種のプライマーのぞれぞれと同等程度の作用を示せばよい。好ましくは配列番号16、配列番号17、配列番号18及び配列番号19で表される各塩基配列からなる4種のプライマーとそれぞれ、80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性、さらに好ましくは95%以上の相同性を有する4種のプライマーで構成されるプライマーセットが挙げられる。80%以上の相同性を示すことにより、前記標的領域(A)を迅速、簡便且つ高感度で増幅することができる等の利点がある。
ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19mM〜約40mM、好ましくは約19mM〜約20mMで、温度が約50℃〜約70℃、好ましくは約60℃〜約65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合がもっとも好ましい。
塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては1塩基又は2塩基以上が挙げられ、プライマーセットに含まれる各プライマーそれぞれの全体の長さによって異なるが、例えば1塩基〜10塩基、好ましくは1塩基〜5塩基が挙げられる。
また、標的領域(B)は、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表3に示される配列表の配列番号8、配列番号9、配列番号10及び配列番号11で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
なお、プライマーセット(II)は、前記4種のプライマーの他に、標的領域(B)にハイブリダイズするものの、前記4種のプライマーとは異なる塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
なお、相同性の程度等については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
なお、ハイブリダイゼーションやストリンジェントの条件については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
なお、挿入、欠失又は置換等の範囲については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
また、標的領域(C)は、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在をより適正に評価するという観点より、下記表6に示される配列表の配列番号12、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で表される塩基配列を含んでいることが好ましい。
なお、相同性の程度等については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
なお、ハイブリダイゼーションやストリンジェントの条件については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
なお、挿入、欠失又は置換等の範囲については、前記プライマーセット(I)についての説明を引用するものとする。
cis−1,2−DCE分解に関連する遺伝子をコードする塩基配列を増幅可能な、前記プライマーセット(II)又は前記プライマーセット(III)を含むことにより、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を高感度で検出することが可能になると推測される。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法(以下、単に「検出方法」ともいう。)は、前記検出用プライマーセットを用いて、LAMP法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法である。
本発明にかかるデハロコッコイデス属細菌の検出方法は、前記検出用プライマーセットを用いて、LAMP法による試料核酸の増幅をすることにより、デハロコッコイデス属細菌を検出するものである。当該検出方法により、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を高い感度で、迅速且つ簡便に検出することができる。
採取の方法は、特に限定されない。例えば、土壌から試料を採取する場合にはロータリーボーリング、打撃貫入式ボーリング、ハンドオーガを利用する方法を用いることができる。地下水から試料を採取する場合には後述する井戸からエアーリフトポンプ、水中ポンプ、ピストンポンプ、ベーラーなどを利用する方法を用いることができる。土壌又は地下水から採取するという観点からは分析試料の二次汚染を防止する方法により採取するという観点より、ボーリング時にはケーシングやセメンチングを実施することが好ましい。
LAMP法により試料核酸を増幅させる場合の温度としては、例えば約60℃〜約65℃が挙げられ、62℃〜64℃であることが好ましい。
反応時間としては、例えば0.5時間〜1.5時間が挙げられ、1時間〜1.4時間がより好ましい。
使用する試薬の濃度は、反応容量、反応時間などに合わせて適宜調製することが可能である。
正確な濁度又は蛍光強度の測定を行うという観点からは、前記プライマーセット及び前記ポリメラーゼを除く、核酸増幅に必要な全ての試薬が混合されたReaction Mix.(RM)(栄研化学社製)を用いることが好ましい。
前記検出用プライマーセットを用いてLAMP法により増幅させた増幅産物の有無を確認することは、例えば単に増幅産物の有無を検出することだけではなく、該増幅産物の量を測定すること等を含んでいてもよい。
前記増幅産物の有無を確認するための方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、濁度を測定する方法、蛍光目視検出方法、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーターを用いる方法、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかける方法などによって確認することができる。
濁度を測定することは、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の存在を、土壌汚染対策を実施している敷地あるいはサイト内等の仮設された施設等においても簡便に測定することができるとともに、迅速且つ高感度に検出することもできるという点で好ましい。
このようなデハロコッコイデス属細菌の定量は、前記検出用プライマーセットを用いて得られた前記増幅産物の量の測定結果に基づいて行うものであるため、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の量を正確に把握することができる。
前記デハロコッコイデス属細菌の定量は、例えば、増幅産物の量を単に測定するものであってもよく、該増幅産物から具体的なcis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出するものであってもよい。
前記増幅産物の量を測定する方法としては、特に制限されず公知の方法を用いることができる。例えば、一例として、前記検出することにより得られた結果に基づいて、検量線を作成して定量する方法、内部標準を用いる方法、段階希釈試料を用いたMPN(最確値)法等の公知の方法が挙げられる。
ここで、検量線を作成して定量する方法の場合、前記試料核酸について、LAMP法で検出する対象領域を含む領域をPCR法により増幅させ、増幅産物量を測定した試料を適宜希釈し、例えば一反応あたり1×102、1×103、1×104、1×105、1×106コピーずつ添加した系を調製してLAMP法を行うことにより、定量のための検量線が作成できる。ただし、検量線の作成方法は、これに制限されるものではなく、公知の方法を用いることができる。
前記デハロコッコイデス属細菌の検出方法は、各種試料中におけるデハロコッコイデス属細菌の検出、浄化対象領域の浄化計画を設計する方法などの様々な方法に使用することができる。デハロコッコイデス属細菌の検出方法を用いて浄化対象領域の浄化計画を設計する方法について、以下に説明する。
浄化対象領域の浄化計画を設計する方法としては、浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、該試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む。
本発明の浄化対象領域の浄化計画を設計する方法は、前記プライマーセットを用いた前記検出方法を、土壌又は地下水の浄化期間の算出に適用するものである。前記検出方法を適用することにより、浄化対象領域に存在するcis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌を、高い感度で、迅速且つ簡便に検出できる。これにより、前記デハロコッコイデス属細菌によって土壌又は地下水の浄化を行う期間をより正確に算出することができるため、成功確度の高い浄化対象領域の浄化計画を、迅速に立てることが可能になる。
浄化計画とは、前記汚染物質による土壌汚染や水質汚濁の発生が確認された場所である浄化対象領域において、土壌汚染や水質汚濁を浄化するために立案された計画を意味する。具体的には、井戸配置の計画や地下水の揚水処理装置の設計等が挙げられる。また、前記浄化計画には、浄化対象領域の土壌汚染や水質汚濁に関する基本事項、施工数量、浄化品質、施工期間、薬剤量、薬剤注入条件、注入およびモニタリングに関する工程管理、資機材、施工費用、安全管理、周辺環境管理を含む計画等が包含される。
揮発性有機塩素化合物(VOC)等の汚染物質の使用による土壌汚染や水質汚濁の発生の確認は、例えば、土壌汚染対策法に基づく表層ガス調査等により行うことができる。
検出対象となる試料を採取する方法や、該試料中から試料核酸を調製する方法については、前記検出方法においての説明を引用するものとする。
また、前記試料核酸から前記検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出することについても、前記検出方法においての説明を引用するものとする。
ここで前記浄化薬剤としては、後述するバイオスティミュレーション用薬剤が挙げられる。
前記井戸としては公知のものを使用することができる。また、その設置方法などについては公知の方法を適用することができる。例えば、特開2011-099212号公報に記載されたものを適用することができる。
前記浄化に必要な施工期間を算出する方法としては、公知の方法を使用することができる。例えば、浄化に必要な施工期間は、上記で算出した前記浄化期間に加え、準備工事又は浄化実施後のモニタリングに必要な期間等を加味することにより算出することが可能である。
前記浄化のための目標期間としては、土壌汚染対策法に定められている汚染物質の暴露リスクの遮断についての緊急性から求められる期間、浄化対象領域における土地の形質変更を伴う土地利用計画又は形質変更の実施予定時期を考慮して許容される期間などが挙げられる。
前記具体的な浄化のための方法の設計としては、例えば、前記浄化のための目標期間の方が、前記浄化のための目標期間に比べて短い場合には、前記具体的な浄化のための方法として、バイオスティミュレーションを施工する。一方、前記浄化期間の方が、前記浄化のための目標期間に比べて長い場合には、前記具体的な浄化のための方法として、バイオスティミュレーション以外の方法(例えば、汚染部分の掘削除去など)を施工する。
前記バイオスティミュレーション用薬剤としては、易生分解性の有機性物質および栄養塩類であれば特に限定されないが、例えばポリ乳酸エステル、酵母抽出物質、高級脂肪酸エステルなどの有機物および硝酸アンモニウム、尿素、リン酸一水素カリウムなどの栄養塩類が挙げられる。
前記薬剤移流解析とは、特に限定はされないが、例えば調査から得られた浄化対象領域の地盤条件に基づいて移流拡散解析を行うことにより、前記薬剤の浸透速度、浸透範囲、滞留時間及び濃度などを解析するもの等が挙げられる。
バイオスティミュレーション以外の方法の施工としては、バイオオーギュメンテーションや、特開2011−167646号公報に記載のような酸化剤を用いて浄化する方法などが挙げられる。
バイオオーギュメンテーションの施工は、特開2009-213427号公報等に記載の方法に従い実施することができる。
浄化対象領域の浄化方法としては、(I)浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、cis−1,2−DCEの濃度を測定すること(cis−1,2−DCE濃度測定工程)、(II)前記検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること(細菌の検出工程)、(III)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること(細菌数算出工程)、(IV)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるcis−1,2−DCEの分解速度を算出すること(分解速度算出工程)、(V)前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたcis−1,2−DCE分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること(施工期間算出工程)、及び(VI)前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行すること(浄化工程)を含む。
より好ましい態様における(I)cis−1,2−DCE濃度測定工程、(II)細菌の検出工程、(III)細菌数の算出工程、(IV)分解速度算出工程及び(VI)浄化工程については、前記と同義である。また、より好ましい態様における前記細菌の検出工程及び前記細菌数の算出工程は、前記(II)細菌の検出工程及び(III)細菌数算出工程においての説明を引用するものとする。
前記施工期間予測工程は、浄化対象領域におけるcis−1,2−DCEの濃度、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び予測されたcis−1,2−DCE分解速度に基づき施工期間を予測するものである。具体的には、浄化対象領域におけるcis−1,2−DCEの濃度を、算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数から予測されたcis−1,2−DCE分解速度で除することにより施工期間を予測することができる。デハロコッコイデス属細菌による予測されたcis−1,2−DCE分解速度については、過去に報告されている分解速度(例えば、He, J. et al., Applied and Environmental Microbiology,(2003) vol.69,996−1003等)を用いることができる。
前記cis−1,2−DCE濃度モニタリング工程及び前記細菌数モニタリング工程を行う場合には、前記浄化のための工法を実行後、1ヶ月〜3ヶ月ごとに行うことがより好ましい。
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、上述したデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを含む。
本発明のデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットは、cis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセットを含むものである。そのためデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キットを用いることにより、高感度で、迅速且つ簡便にcis−1,2−DCE分解能を有するデハロコッコイデス属細菌の検出を行うことができるなどの利点がある。
試薬としては、前記プライマーセットの他に、ポリメラーゼ、バッファー、dNTPs、MgSO4等が挙げられる。
なお、ポリメラーゼやバッファーについては、前述した検出方法においての説明を引用するものとする。
なお、「別個に収容」とは、プライマーセット及びその他の試薬が、必要に応じて相互に非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。4種のプライマーが別個に収容される場合も同様である。
試料核酸を含む溶液(サンプル溶液)を、以下の方法により調製した。地下水試料を0.20μmポリカーボネイト製フィルターにて吸引ろ過し、微生物がトラップされたフィルターを、ビーズチューブに加えてビーズ破砕を行った。その後、DNA抽出キットExtrap Soil DNA Kit Plus ver.2(日鉄環境エンジニアリング社製)を用いてDNAを抽出し、サンプル溶液とした。
反応チューブを、Loopamp濁度測定装置RT−160C(栄研化学社製)にセットし、63℃、80分反応させた後、ポリメラーゼを失活させるためにさらに80℃、5分反応させた。
実施例1において表9に記載のプライマーセットを、表10、表11及び表12に記載のプライマーセットに変更した以外は、実施例1と同様にして、表10、表11及び表12に記載のプライマーセットの評価を行った。
TCE、cis−1,2−DCEにより汚染された地下水が存在するサイトにおいて、汚染された深度の帯水層に設置した複数の井戸より栄養薬剤(EDC、エコサイクル社製)を注入し、嫌気性バイオスティミュレーションによる浄化を行った。
サイトに設置した10箇所の観測井戸(観測井戸A〜観測井戸J)より採水器を用いて地下水試料(地下水A〜地下水J)を採取した。地下水試料を0.20μmポリカーボネイト製フィルターにて吸引ろ過し、微生物のトラップされたフィルターをビーズチューブに加えてビーズ破砕を行い、DNA抽出キットExtrap Soil DNA Kit Plus ver.2(日鉄環境エンジニアリング社製)を用いてDNAを抽出して試料核酸とした。
次に、上記表8に記載のマスターミックス23.0μLを、Loopamp反応チューブに注入した。ここで、プライマーとしては上記表9に記載のプライマーセットを用いた。該反応チューブに、上記で調製したサンプル溶液を2μL添加し、全量を25μLにした。反応チューブを、Loopamp濁度測定装置RT−160C(栄研化学社製)にセットし、63℃、80分反応させた後、ポリメラーゼを失活させるためにさらに80℃、5分反応させた。各反応チューブの濁度の増幅曲線から地下水試料中のデハロコッコイデス属細菌の細菌数を定量した。
PCE、TCE、cis−1,2−DCEにより汚染された地下水が存在するサイトの一部区画において、汚染された深度の帯水層(PCE=0.01mg/L以下、TCE=0.01mg/L以下、cis−1,2−DCE=0.05mg/L、デハロコッコイデス属細菌の細菌数1.0×101copies/ml以下)に設置した井戸より栄養薬剤(EDC、エコサイクル社製)を注入する嫌気性バイオスティミュレーションを実施し、一定期間ごとにVOC類、デハロコッコイデス属細菌の細菌数の計測を行った。試料核酸の調製、LAMP法によるデハロコッコイデス属細菌の細菌数の定量は実施例1に準じて行った。
以上の結果を用いることにより、本サイトにおいて最も高濃度の地点(PCE=0.02mg/L、TCE=0.04mg/L、cis−1,2−DCE=0.08mg/L)でcis−1,2−DCEの脱塩素化に必要な浄化期間は薬剤浸透後53日間と算出された。
本サイトでは、cis−1,2−DCEの分解速度とあわせ、薬剤注入後にデハロコッコイデス属細菌の細菌数がcis−1,2−DCEの完全脱塩素化が進む目安となる1×105copies/ml以上まで増加していたことから、嫌気バイオスティミュレーションによる地下水浄化が適用可能であると判断した。
Claims (13)
- デハロコッコイデス属細菌における16S rRNA遺伝子をコードする配列番号1で示される塩基配列のうち315番目から1410番目の塩基配列に含まれる標的領域(A)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(I)と、
デハロコッコイデス属細菌におけるbvcA遺伝子をコードする配列番号2で示される塩基配列のうち508番目から1260番目の塩基配列に含まれる標的配列(B)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(II)及びvcrA遺伝子をコードする配列番号3で示される塩基配列のうち1260番目から1684番目の塩基配列に含まれる標的配列(C)をLAMP法により増幅させるプライマーセット(III)から選ばれる少なくとも一方のプライマーセットと、
を含むデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。 - 前記標的配列(A)が配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表される塩基配列を含み、前記標的配列(B)が配列番号8、配列番号9、配列番号10及び配列番号11で表される塩基配列を含み、前記標的配列(C)が配列番号12、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で表される塩基配列を含む請求項1に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
- 前記プライマーセット(I)が、配列番号16から配列番号19で表される塩基配列を含む請求項1又は請求項2に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
- 前記プライマーセット(II)が、配列番号20から配列番号23で表される塩基配列を含む請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
- 前記プライマーセット(III)が、配列番号28から配列番号31で表される塩基配列を含む請求項1から請求項4のいずれか一項に記載のデハロコッコイデス属細菌検出用プライマーセット。
- 請求項1から請求項5のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により試料核酸を増幅して、デハロコッコイデス属細菌を検出することを含むデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
- 前記検出が、濁度又は蛍光強度を測定することを含む請求項6に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
- さらに、前記検出することにより得られた結果に基づいて、デハロコッコイデス属細菌を定量することを含む請求項6又は請求項7に記載のデハロコッコイデス属細菌の検出方法。
- 浄化対象領域からの試料核酸を準備すること、
該試料核酸から請求項6から請求項8のいずれか一項に記載の検出方法を用いてデハロコッコイデス属細菌を検出すること、及び
検出結果に基づき土壌又は地下水の浄化期間を算出することを含む浄化対象領域の浄化計画を設計する方法。 - (I)浄化対象領域から得られた評価用試料を用いて、cis−1,2−DCEの濃度を測定すること、
(II)請求項6から請求項8のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
(III)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
(IV)前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌によるcis−1,2−DCEの分解速度を算出すること、
(V)前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数と前記算出されたcis−1,2−DCE分解速度とに基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を算出すること、及び
(VI)前記浄化に必要な施工期間に基づき、浄化のための工法を選択し実行することを含む浄化対象領域の浄化方法。 - 前記(I)の後に、請求項6から請求項8のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記評価用試料中のデハロコッコイデス属細菌を検出すること、
前記検出方法により検出された前記デハロコッコイデス属細菌の細菌数を算出すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数に基づき、デハロコッコイデス属細菌によるcis−1,2−DCEの分解速度を予測すること、
前記算出されたデハロコッコイデス属細菌の細菌数及び前記予測されたcis−1,2−DCE分解速度に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な予測施工期間を得ること、
前記予測施工期間を得た後に、前記(II)から前記(IV)を行うこと、
前記(II)から前記(IV)で得られた結果に基づき、前記デハロコッコイデス属細菌による前記浄化対象領域の浄化に必要な施工期間を確認すること、
前記(VI)を行うこと、
を含む請求項10に記載の浄化対象領域の浄化方法。 - さらに、前記(VI)の後に、前記浄化対象領域のcis−1,2−DCEの濃度をモニタリングすること、及び
請求項6から請求項8のいずれか一項に記載の検出方法を用いて、前記浄化対象領域のデハロコッコイデス属細菌の細菌数をモニタリングすることを含む請求項10又は請求項11に記載の浄化対象領域の浄化方法。 - 請求項1から請求項5のいずれか一項に記載のプライマーセットを含むデハロコッコイデス属細菌検出用試薬キット。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016208254A1 (ja) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | 大成建設株式会社 | 1,4-ジオキサン分解菌検出用プライマーセットと、1,4-ジオキサン分解菌の検出・定量方法 |
JP2021036845A (ja) * | 2019-09-05 | 2021-03-11 | 株式会社アサノ大成基礎エンジニアリング | 地下水中の微生物の分析方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005265680A (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Aquas Corp | 浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法 |
-
2011
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005265680A (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Aquas Corp | 浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN6015037470; Applied and Environmental Microbiology Vol.69,No.2, 200302, p.996-1003 * |
JPN6015037473; 愛知県農業総合試験場研究報告 41号, 2009, p.1-6 * |
JPN6015037476; ウイルス 第54巻、第1号, 200406, p.107-112 * |
JPN6015037477; 崎原盛 他: 地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会講演集 第14巻, 2008, p.464-467 * |
JPN6015037480; 四本瑞世 他: 大林組技術研究所報 No.73, 2009, p.1-6 * |
JPN6015037481; 産総研TODAY Vol.7,No.9, 200709, p.14 * |
JPN6015037484; Database DDBJ/EMBL/GenBank [online]: 'Accession No. AF004928' <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF004928> 07-APR-2000 uploaded * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016208254A1 (ja) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | 大成建設株式会社 | 1,4-ジオキサン分解菌検出用プライマーセットと、1,4-ジオキサン分解菌の検出・定量方法 |
JP2021036845A (ja) * | 2019-09-05 | 2021-03-11 | 株式会社アサノ大成基礎エンジニアリング | 地下水中の微生物の分析方法 |
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