JP2013100357A - Multilateral agent for improving skin barrier function - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分のスクリーニングに有用な皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法に関する。また、当該スクリーニング法により見出した皮膚バリア機能改善剤に関する。 The present invention relates to a screening method for a skin barrier function improving material useful for screening an active ingredient of a skin external preparation such as cosmetics. Moreover, it is related with the skin barrier function improving agent discovered by the said screening method.
皮膚におけるバリア機能は、生体にとっての異物の生体内への侵入を防ぐ意味で重要な機能の一つとなっている。かかるバリア機能の不全は肌荒れ、炎症などの原因ともなり、その保全策は化粧料分野においては一大課題となっている。この様な皮膚バリア機能の因子としては、角層細胞の形状や接合状態に起因する角層のバリア機能、表皮・真皮の含水量などの皮膚保湿性などが挙げられ、単純なものではなく、多くの因子が絡み合っていることが既に知られている。これらの因子で近年特に注目されているのは、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション蛋白であり、かかるタイトジャンクション蛋白を介した細胞接合の不全に皮膚バリア機能の低下が起因すると言う説である（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）。このタイトジャンクションの機能に注目した化粧料素材のスクリーニング法も前記の特許文献に開示されている。この方法では、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分を、数値として評価できるが、タイトジャンクションの不全に対してどの様にスクリーニング素材が働いているかを視覚的に捉えることは困難であり、この様な視覚的に皮膚バリア機能改善を捉えられる鑑別法が望まれていた。
The barrier function in the skin is one of the important functions in terms of preventing foreign bodies from entering the living body. Such insufficiency of the barrier function causes rough skin, inflammation, and the like, and its conservation measures are a major issue in the cosmetics field. Such skin barrier function factors include the stratum corneum barrier function due to the shape and bonding state of the stratum corneum cells, skin moisture retention such as the water content of the epidermis and dermis, and is not simple, It is already known that many factors are intertwined. Of particular interest in these factors in recent years is the tight junction protein present in the epidermal granule layer, and the theory that the skin barrier function is reduced due to the failure of cell junction via the tight junction protein ( For example, see
タイトジャンクション以外に、皮膚バリア機能については、セラミドの量、分布状況及びその種類が皮膚バリア機能に対して重要な因子となっていることも知られている（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照）。又、セラミドの生体内分布を調べるための標識セラミドも既に知られており（例えば、特許文献６を参照）、市販品も存する。しかしながら、検体が及ぼす、セラミドの分布状況と、タイトジャンクションの傷害からの回復改善効果とを比較可能な条件下で同時に検討した例は存しない。この為、皮膚バリア機能の低下とその改善に関しては、その要因が多面的であることを認めつつも、一因子のみで語られることが少なくなかった。 In addition to tight junctions, it is also known that for the skin barrier function, the amount, distribution state and type of ceramide are important factors for the skin barrier function (for example, Patent Document 3 and Patent Document 4). , See Patent Document 5). In addition, labeled ceramides for examining the biodistribution of ceramides are already known (see, for example, Patent Document 6), and there are commercially available products. However, there is no example in which the distribution of ceramide exerted by the specimen and the effect of improving recovery from tight junction injury were examined simultaneously under comparable conditions. For this reason, regarding the decrease and improvement of the skin barrier function, it is often said that only one factor is spoken while recognizing that the factors are multifaceted.
本発明は、この様な状況下為されたものであり、因子の多い皮膚バリア機能の低下において、多角的視点に立って、その改善効果を鑑別できる皮膚バリア機能向上素材のスクリーニング法を提供することを課題とする。 The present invention has been made under such circumstances, and provides a screening method for a skin barrier function-enhancing material capable of distinguishing the improvement effect from various viewpoints in the reduction of skin barrier function with many factors. This is the issue.
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、因子の多い皮膚バリア機能の低下において、多
角的視点に立って、その改善効果を鑑別できる皮膚バリア機能向上素材のスクリーニング法を求めて鋭意研究を重ねた結果、皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することにより、セラミド分布への影響を知り、ほぼ同じ実験被験体である、皮膚又は培養皮膚三次元モデルについて、そのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有するか否かを鑑別することにより、タイトジャンクションへの作用も鑑別でき、これらを総合することにより、多角的な皮膚バリア機能への検体の作用が鑑別できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、
上記培養した皮膚又は培養皮膚三次元モデルを検体で処理し、
皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察し、
セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された検体であると鑑別された、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、皮膚バリア機能改善剤。
In view of such a situation, the present inventors have eagerly studied for a screening method for a skin barrier function improving material that can distinguish the improvement effect from various viewpoints in the reduction of skin barrier function with many factors. As a result, the skin or cultured skin three-dimensional model is cultured with the labeled ceramide, and then the presence of the labeled ceramide in the skin or cultured skin three-dimensional model is observed, thereby affecting the ceramide distribution. Whether the skin or cultured skin three-dimensional model, which is the same experimental subject, has a recovery effect from injury of the tight junction against the tight junction injury skin model obtained by treating the tight junction with injury. By identifying whether or not, the effect on tight junctions can also be identified, and these can be combined. The found that the effect of the analyte to multilateral skin barrier function can distinguish, and completed the invention. That is, the present invention is as follows.
(1) Culturing a skin or cultured skin three-dimensional model with labeled ceramide,
Treat the cultured skin or cultured skin three-dimensional model with a specimen,
Observe the presence of labeled ceramide in the skin or cultured skin 3D model,
A skin barrier function-improving agent comprising ε, γ-glutamyllysine and / or palmaria extract, which has been identified as a specimen in which ceramide transport in tissue is accelerated compared to a condition in which no specimen is present.
本発明によれば、因子の多い皮膚バリア機能の低下において、多角的視点に立って、その改善効果を鑑別できる皮膚バリア機能向上素材のスクリーニング法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, in the fall of the skin barrier function with many factors, the screening method of the skin barrier function improvement material which can distinguish the improvement effect from a multilateral viewpoint can be provided.
＜１＞本発明のセラミドの組織内輸送の鑑別法
本発明のセラミドの組織内輸送の鑑別法は、皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識の存在状況を観察することを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好
適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚又は培養皮膚三次元モ
デルは、標識されたセラミドを含む培地中で１〜１０時間、好ましくは３〜５時間培養し、標識されたセラミドを細胞内に取り込ませる。PBS(リン酸緩衝生理食塩水）や液体培地で洗浄した後、新鮮な培地に交換して培養を続ける。６〜２４時間後、好ましくは１２〜１８時間後に培地を回収し、その蛍光強度を計測したり、組織を切片に加工して、蛍光顕微鏡下観察して取り込まれたセラミドの量を蛍光として捉え、定量するとともにその存在位置を鑑別する。回収した培地中のセラミド量が多かったり、培養皮膚三次元モデルにおける、表皮細胞間の角層側を上部分とした場合にセラミドが上部分に多く輸送されたほうが角層形成が促進され、皮膚バリア機能改善作用を有する。切片においてはさらにその鑑別には、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、存在位置を二次元分布として把握することが出来る。又、白点と黒点の面積比より、蛍光強度を鑑別することも出来る。かかるセラミドの組織内輸送状況は、後記の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法の指標として使用することが出来る。
<1> Method for distinguishing intracerebral transport of ceramide according to the present invention The method for distinguishing intracerebral transport of ceramide according to the present invention comprises culturing a skin or cultured skin three-dimensional model with labeled ceramide, and then the skin or cultured skin. It is characterized by observing the presence of signs in a three-dimensional model. The skin is preferably a skin fragment collected from a living body by removing body hair as desired, and excluding the stratum corneum, and composed of an epidermal granule layer, an epidermal basal layer, and a dermis portion, such as a mouse, a rat, Guinea pig, pig and rabbit skin fragments are preferred. In addition, as the cultured skin three-dimensional model, the skin cells such as normal (non-cancerous) keratinocytes and fibroblasts collected from human or non-human animal skin are cultured, and a three-dimensional structure is constructed. What simulated the structure of the skin is preferable, and a commercial product of such a form can be purchased and used. Preferable examples of commercially available products include “EFT-400” (normally cultured human three-dimensional skin model) sold by Kurashiki Boseki Co., Ltd. In particular, “EPI-200” composed only of an epidermis component, “EpiDerm” sold by USA MaTek, and the like can be more suitably exemplified. Such a three-dimensional model of skin or cultured skin is cultured in a medium containing labeled ceramide for 1 to 10 hours, preferably 3 to 5 hours, and the labeled ceramide is incorporated into the cells. After washing with PBS (phosphate buffered saline) or liquid medium, replace with fresh medium and continue culturing. After 6 to 24 hours, preferably after 12 to 18 hours, the medium is collected and the fluorescence intensity is measured, or the tissue is processed into sections and observed under a fluorescence microscope to capture the amount of ceramide incorporated as fluorescence. Quantify and identify the location. The amount of ceramide in the collected medium is large, or in the cultured skin three-dimensional model, when the horny layer side between the epidermal cells is the upper part, ceramide formation is promoted more when ceramide is transported to the upper part. Has an effect of improving the barrier function. For further differentiation of the sections, the observation image of the fluorescence microscope is taken into a computer or the like, and image processing software such as “Photoshop” manufactured by Adobe is used to perform binarization or the like, and the fluorescence sites are identified. The existence position can be grasped as a two-dimensional distribution by separating the non-fluorescent site. In addition, the fluorescence intensity can be discriminated from the area ratio of the white spot and the black spot. Such intracerebral transport status of ceramide can be used as an index of a screening method for a skin barrier function improving material described later.
＜２＞本発明の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法
本発明の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法は、前記のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能の低下を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする。セラミドの組織内輸送は、前記の如くに、蛍光部分の面積の増大と、蛍光部分の広がりによって鑑別することが出来る。
<2> Screening method for skin barrier function-improving material of the present invention The screening method for a material for improving skin barrier function of the present invention is the above-described screening method for intracerebral transport of ceramide. When the intracerebral transport of ceramide is promoted as compared with the condition in which the specimen does not exist, the specimen is identified as having an action of improving the decrease in skin barrier function due to ceramide deficiency. It is characterized by that. As described above, the intracerebral transport of ceramide can be identified by the increase in the area of the fluorescent portion and the spread of the fluorescent portion.
皮膚又は培養皮膚三次元モデルを用い、カプリン酸などのタイトジャンクション傷害剤で処置することにより、前記のセラミドの組織内輸送の鑑別法とほぼ同じ条件でタイトジャンクションの傷害からの回復促進作用を鑑別できることから、かかる回復促進作用を加味して、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニングを行うことが出来、この様なスクリーニングを行うことが好ましい。この様なタイトジャンクションの傷害回復に関するスクリーニングは以下のように行うことが出来る。 Using a three-dimensional model of skin or cultured skin, treatment with a tight-junction injury agent such as capric acid makes it possible to differentiate the recovery action from tight-junction injury under almost the same conditions as in the above-mentioned method for distinguishing intracerebral transport of ceramide Therefore, it is possible to perform screening for a skin barrier function improving material in consideration of such recovery promoting action, and it is preferable to perform such screening. Screening for recovery from such tight junction injury can be performed as follows.
まず、次に示す手順に従って、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを用意する。タイトジャンクション傷害皮膚モデルは、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用のものであって、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して
使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EPI-200」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。かか
る皮膚又は培養皮膚三次元モデルは、顆粒層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ2、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ2の単位あたりのエネルギー量で照射すればよく、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜
２ｍMの溶液を真皮側又は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１
５時間作用させればよい。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸溶液による処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚又は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することにより出来るし、化学的傷害手段であれば、培地又はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄する
ことによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、後記タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に用いられ、傷害されたタイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングに好適に使用される。
First, a tight junction injury skin model is prepared according to the following procedure. The tight junction injury skin model is for screening for a skin barrier function-improving component, and is characterized by injury treatment of a tight junction of a skin or a cultured skin three-dimensional model. The skin is preferably a skin fragment collected from a living body by removing body hair as desired, and excluding the stratum corneum, and composed of an epidermal granule layer, an epidermal basal layer, and a dermis portion, such as a mouse, a rat, Guinea pig, pig and rabbit skin fragments are preferred. In addition, as the cultured skin three-dimensional model, the skin cells such as normal (non-cancerous) keratinocytes and fibroblasts collected from human or non-human animal skin are cultured, and a three-dimensional structure is constructed. What simulated the structure of the skin is preferable, and a commercial product of such a form can be purchased and used. Preferable examples of commercially available products include “EPI-200” (normally cultured human three-dimensional skin model) sold by Kurashiki Boseki Co., Ltd. Such a three-dimensional model of skin or cultured skin damages a tight junction portion by taking an injury means from the granule layer side. For example, ultraviolet rays and chemical substances can be preferably exemplified as the injury means, and in the case of ultraviolet rays, ultraviolet rays having a wavelength of 280 to 320 nm are per unit of 7.5 to 200 mJ / cm 2 , more preferably 50 to 160 mJ / cm 2 . In the case of chemical treatment, the saturated saturated linear fatty acid having a medium chain length (carbon number of 8 to 12) such as capric acid or caprylic acid or a monovalent metal salt thereof may be used. 1 to 10 mM, more preferably 0.5 to
2 mM solution from the dermis side or epidermal basal layer side for 5 to 24 hours, more preferably 10 to 1
What is necessary is just to act for 5 hours. A neutralizing antibody that recognizes the extracellular domain of occludin or claudin can also be used. Among these treatments for injury, particularly preferred is treatment for chemical injury, and treatment with a capric acid solution is particularly preferred. This is because homogeneous damage can occur to tight junctions. Such homogeneous injury is a very important factor in accurately identifying the mechanism in screening for a recovery accelerator for injury tight junction described later. The post-treatment injury means is immediately removed from the skin or cultured skin three-dimensional model. Detachment can be accomplished by terminating the irradiation if ultraviolet irradiation is performed, and can be accomplished by washing with a medium or PBS (phosphate buffered saline) or the like if chemical injury is involved. The tight junction injury skin model obtained in this way is used in a method for identifying a tight junction function recovery agent described later, and is suitably used for screening a recovery accelerator for an injured tight junction.
次に、タイトジャンクション機能トレーサーキットを用意する。タイトジャンクション機能トレーサーキットは、標識されていてもよいビオチンと、標識されていてもよいアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする。前記標識としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、フルオテトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの発光標識、ガリウムなどの放射性標識、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素標識などが例示でき、感度高く、視覚的にタイトジャンクション機能を鑑別するには、ビオチン又はアビジンのどちらかに蛍光標識を用いることが好ましい。タイトジャンクションの機能を鑑別するためには、本発明のキットでは、標識されていてもよいビオチンを、真皮側又は表皮基底層側から作用させ、表皮顆粒層に向かって作用させる。この時、タイトジャンクションの機能が正常であれば標識されていてもよいビオチンは表皮顆粒層側で食い止められ、角層側には移動しない。タイトジャンクションの機能が不全であれば、標識されていてもよいビオチンは角層側へと移動する。この様な皮膚組織中での標識されていてもよいビオチンの移動は、標識されていてもよいアビジンを作用させることにより、可視化できる。前記アビジンとしては、ビオチンとの不可逆的結合性を有するものであれば、何れも用いることが出来、例えば、ストレプトアビジン等が、その入手の容易性から好適に例示できる。かかるアビジンの標識としては、蛍光標識されていることが好ましい。本発明のキットについて、真皮側又は表皮基底層側より作用させる物質として標識されていてもよいアビジンを選択し、組織中の標識されていてもよいアビジンの可視化手段として標識されていてもよいビオチンを用いることも出来るが、タイトジャンクションの機能の正確な鑑別には、真皮側より作用させる物質として標識されていてもよいビオチンを用い、該ビオチンの可視化手段として標識されていてもよいアビジンを用いることがより好ましい。 Next, prepare a tight junction function tray circuit. The tight junction function tray circuit is a tight junction function tray circuit composed of biotin which may be labeled and avidin which may be labeled, wherein either biotin or avidin is fluorescently labeled. And Examples of the label include fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine, fluotetramethylrhodamine, dansyl, luminescent labels such as luciferin, radioactive labels such as gallium, enzyme labels such as horseradish peroxidase, and the like. In order to visually distinguish the tight junction function, it is preferable to use a fluorescent label for either biotin or avidin. In order to discriminate the function of the tight junction, in the kit of the present invention, biotin which may be labeled is allowed to act from the dermis side or the epidermis basal layer side and act toward the epidermal granule layer. At this time, if the function of the tight junction is normal, biotin which may be labeled is stopped on the epidermal granule side and does not move to the stratum corneum side. If the tight junction function is defective, biotin that may be labeled moves to the stratum corneum. The movement of biotin which may be labeled in such skin tissue can be visualized by the action of avidin which may be labeled. Any avidin may be used as long as it has an irreversible binding property to biotin. For example, streptavidin can be preferably exemplified from its availability. Such avidin is preferably fluorescently labeled. For the kit of the present invention, avidin that may be labeled as a substance that acts from the dermis side or epidermal basal layer side is selected, and biotin that may be labeled as a means for visualizing the avidin that may be labeled in the tissue However, for accurate differentiation of tight junction functions, biotin that may be labeled as a substance that acts from the dermis side is used, and avidin that may be labeled as a means for visualizing the biotin is used. It is more preferable.
タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法は、前記タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理したものと、未処理のものとを、前記タイトジャンクション機能トレーサーキットで処理し、トレーサーの皮膚組織内における分布状況を調べ、基底層から顆粒層へのトレーサーの動きが、検体で処理することにより妨げられている蓋然性が、未処理のものに比して有意に高い場合には、前記検体の投与が皮膚のタイトジャンクションを回復
させる効果を有し、該回復によって皮膚バリア機能が向上すると鑑別することを特徴とする。前記蓋然性は、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを、蛍光顕微鏡下観察することで容易に鑑別しうる。蓋然の差の有意性は、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、蛍光部位の総面積比を求め、これを統計処理することにより明らかに出来る。検体未処理と、処理とにおける、この値の差が大きいほど、検体のタイトジャンクション傷害回復作用、言い換えればバリア機能の回復作用が優れると鑑別できる。又、検体の濃度は実際に皮膚に投与した場合に外挿出来るように設定し、ドーズを振って用量効果をみることも好ましい。本発明の鑑別法では、画像として、タイトジャンクションの傷害からの回復が鑑別できるので、蛍光部分の偏りや、時系列的変化などを追うことにより、タイトジャンクションの回復過程のメカニズムなども知ることが出来る。以上の作業を工程に分けて表現すると以下のようになる。
（工程１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害手段により傷害し、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作成する工程
（工程２）タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理する工程
（工程３）工程２の検体で処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルと、検体で処理しないタイトジャンクション傷害皮膚モデルをタイトジャンクション機能トレーサーキットの片方、好ましくは標識されたビオチンで処理する工程
（工程４）工程３のトレーサー処理した皮膚モデルより顕微鏡用の標本を作製する工程
（工程５）工程４の標本をトレーサーキットのもう一方、好ましくは、蛍光標識アビジンで処理する工程
（工程６）工程４の標本を顕微鏡下、好ましくは蛍光顕微鏡下観察する工程
（好ましくは工程７）工程６の顕微鏡像をイメージ画像としてコンピューターに取込み、画像処理し、蛍光部と非蛍光部とに分け、蛍光部の量比を求める工程
（好ましくは工程８）工程７の蛍光部の量比と、検体処理の相関関係の程度を求め、タイトジャンクション機能の回復促進作用の有無を鑑別する工程
The method of distinguishing the tight junction function recovery agent is to treat the tight junction injury skin model with the specimen and the untreated one with the tight junction function tray circuit to determine the distribution status of the tracer in the skin tissue. If the probability that the tracer movement from the basal layer to the granule layer is hindered by treatment with the specimen is significantly higher than that of the untreated, the administration of the specimen is It has the effect of recovering the junction, and it is characterized in that the recovery improves the skin barrier function. The probability can be easily distinguished by observing a tight junction injury skin model under a fluorescence microscope. The significance of the difference in probability is that the observation image of the fluorescence microscope is taken into a computer, etc., and image processing software such as “Photoshop” made by Adobe is used for image processing such as binarization, and the fluorescence site is not detected. It can be clarified by dividing the fluorescent part and obtaining the total area ratio of the fluorescent part and statistically processing it. It can be discriminated that the larger the difference between the values of the untreated sample and the treated sample, the better the tight junction injury recovery action of the specimen, in other words, the better barrier function recovery action. It is also preferable to set the concentration of the specimen so that it can be extrapolated when actually administered to the skin, and observe the dose effect by shaking the dose. In the discrimination method of the present invention, recovery from tight junction injury can be discriminated as an image, so that the mechanism of the recovery process of tight junction can be known by following the bias of the fluorescent part, time-series changes, etc. I can do it. The above work is divided into processes and expressed as follows.
(Step 1) Step of creating a tight junction injury skin model by injuring tight junction of skin or cultured skin three-dimensional model with injury means (Step 2) Step of processing tight junction injury skin model with specimen (Step 3) The process of treating the tight junction injury skin model treated with the specimen 2 and the tight junction injury skin model not treated with the specimen with one of the tight junction functional tray circuits, preferably labeled biotin (Step 4) and the tracer treatment of Step 3 Step of preparing a specimen for microscope from the skin model (Step 5) The specimen of Step 4 is treated with the other of the tray circuit, preferably with fluorescently labeled avidin (Step 6). The specimen of Step 4 is preferably under the microscope. Is a step of observing under a fluorescence microscope (preferably step 7 The microscopic image of step 6 is taken into a computer as an image image, image-processed, divided into a fluorescent portion and a non-fluorescent portion, and a quantitative ratio of the fluorescent portion (preferably step 8). , The process of determining the degree of correlation between specimen processing and identifying the presence or absence of the recovery action of tight junction function
斯くして、鑑別されたセラミドの組織内輸送と、タイトジャンクションの傷害からの回復促進作用とは統合されて、皮膚バリア機能の改善素材として有用か、否かを鑑別される。 Thus, the intracerebral transport of the identified ceramide and the recovery promoting action from the injury of the tight junction are integrated, and it is distinguished whether or not it is useful as a material for improving the skin barrier function.
前記統合においては、スクリニーング評価の結果を、１）タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有さない素材、２）タイトジャンクションの傷害からの回復促進作用は有するが、セラミドの産生促進作用は有さない素材、３）タイトジャンクションの傷害からの回復促進は有さないが、セラミドの産生促進作用は有する素材、４）タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有する素材の４つに分類し、それぞれの分類ごとに序列を決めることが好ましい。この分類において、４に分類される素材であって、実使用濃度において両方の作用が発現する素材が特に皮膚外用剤の有効成分として好ましい成分とされる。かかる成分は任意成分とともに化粧料などの皮膚外用剤に製剤化される。 In the above integration, the results of the screening evaluation are as follows: 1) a material that does not promote recovery from tight junction injury or ceramide production, and 2) that promotes recovery from injury of tight junction, Material that does not promote ceramide production 3) Does not promote recovery from injury of tight junctions, but has material that promotes production of ceramide 4) Promotes recovery from injury of tight junctions It is preferable to classify into four materials that also have a production promoting effect, and to determine the rank for each category. In this classification, materials that are classified into 4 and that exhibit both effects at the actual use concentration are particularly preferable as active ingredients of the external preparation for skin. Such ingredients are formulated into an external preparation for skin such as cosmetics together with optional ingredients.
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加える。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
実施例１
（工程１）「EPI-200」を、１ｍMカプリン酸ナトリウムを含む培地で１２時間培養した。（工程２、３）処理検体として５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む、１ｍMカプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して
培養を続け、一定時間ごとに「EPI-200」を回収する１時間前にトレーサーとして「EZ-LinkTM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン」（ピアス社製）を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるよ
うに加えた。一方、未処理検体として５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物を含まない７０％エタノール水溶液を添加し、同様に培養を続けた。
（工程４）工程１〜３で処理した「EPI-200」を回収し、「OCTコンパウンド」（サクラファインテック社製）に浸漬し、液体窒素中で凍結した。続いて凍結切片作製装置にて凍結切片標本を作製した。
（工程５）該標本をウサギ抗オクルディン抗体（インビトロジェン社製）と反応させ、その後FITC標識ロバ抗ウサギ抗体（ICN-ファーマシューティカル社製）及びストレプトアビジン-テキサスレッド（オンコジーン社製）と反応させた。
（工程６）工程５で得た標本を４８８、５４３ｎｍの２波長で、蛍光顕微鏡下で観察した。
Example 1
(Step 1) “EPI-200” was cultured in a medium containing 1 mM sodium caprate for 12 hours. (Steps 2 and 3) The culture was continued by exchanging with a medium containing no mixture of 1 mM sodium caprate containing a mixture of 500 μg / ml ε, γ-glutamyllysine and 0.1% palmaria extract as a treated specimen. One hour before collecting “EPI-200”, “EZ-Link ™ -sulfo-NHS-LC-biotin” (Pierce) was added as a tracer to a final concentration of 0.1 mg / ml. On the other hand, 500 μg / ml ε, γ-glutamyllysine and a 70% ethanol aqueous solution not containing 0.1% palmaria extract were added as untreated samples, and the culture was continued in the same manner.
(Step 4) “EPI-200” treated in
(Step 5) The specimen is reacted with a rabbit anti-occludin antibody (manufactured by Invitrogen), and then reacted with a FITC-labeled donkey anti-rabbit antibody (ICN-pharmaceutical) and streptavidin-Texas red (manufactured by Oncogene). It was.
(Step 6) The specimen obtained in Step 5 was observed under a fluorescence microscope at two wavelengths of 488 and 543 nm.
図１〜３は無処理コントロール、図４〜６は１ｍMカプリン酸ナトリウムで処理したと
きの皮膚モデル組織切片像である。以下図７〜２４も同様に、各図中点線で囲まれた部分は角層を示す。図１、４はトレーサーの染色画像、図２、５は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図３、６はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。図１〜３より表皮基底層側（下）より添加したトレーサーが細胞間を通ってタイトジャンクションの位置（矢印、抗オクルディン抗体染色部位）、即ち顆粒層のところで止まっていることが判り、図４〜６よりカプリン酸ナトリウム処理でタイトジャンクションを傷害せしめることによってトレーサーが一部顆粒層より上の角層部分に漏出していることが判る（図６＊印）。図７〜９はその後３時間経過、図１０〜１２は６時間経過後の皮膚モデル組織切片像である。一方、図１３〜１５はタイトジャンクション傷害後に５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む培地で培養した３時間経過後、図１６〜１８はその６時間経過後の皮膚モデル組織切片像である。図７、１０、１３、１６はトレーサーの染色画像、図８、１１、１４、１７は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図９、１２、１５、１８はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。図７〜９及び１０〜１２よりカプリン酸ナトリウムによってタイトジャンクション傷害後、カプリン酸ナトリウムを離脱せしめてもトレーサーが角層部分に漏出したままであったが（図９、１２＊印）、図１３〜１５及び１６〜１８に示すようにε，γ−グルタミルリジンとパルマリア抽出物の混合物で処理することによってトレーサーの角層部分への漏出が防がれていることが判る。
なお、図１９〜２１にはタイトジャンクション傷害後に５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンのみを、図２２〜２４にはタイトジャンクション傷害後に０．１％パルマリア抽出物のみを添加して６時間後の結果も示す。図１９、２２はトレーサーの染色画像、図２０、２３は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図２１、２４はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。ε，γ−グルタミルリジン、パルマリア抽出物はいずれも単独でもトレーサーの角層部分への漏出を防ぐことが判る。即ち本鑑別法は、タイトジャンクション機能に関与した皮膚バリア改善素材のスクリーニングに適していることが判る。
1 to 3 are untreated controls, and FIGS. 4 to 6 are skin model tissue slice images when treated with 1 mM sodium caprate. Similarly, in FIGS. 7 to 24, a portion surrounded by a dotted line in each drawing indicates a stratum corneum. 1 and 4 are stained images of the tracer, FIGS. 2 and 5 are stained images of the anti-occludin antibody (arrows), and FIGS. 3 and 6 are images obtained by superimposing the stained images of the tracer and the anti-occludin antibody, respectively. 1-3, it can be seen that the tracer added from the epidermal basal layer side (bottom) passes through the cells and stops at the position of the tight junction (arrow, anti-occludin antibody staining site), that is, at the granular layer. It can be seen from ˜6 that the tracer leaks in part of the horny layer above the granular layer by damaging the tight junction with sodium caprate treatment (FIG. 6 *). FIGS. 7-9 are skin model tissue slice images after 3 hours, and FIGS. 10-12 are skin model tissue images after 6 hours. On the other hand, FIGS. 13 to 15 show 3 hours after culturing in a medium containing a mixture of 500 μg / ml ε, γ-glutamyl lysine and 0.1% palmaria extract after tight junction injury, and FIGS. 16 to 18 show 6 hours after that. FIG. 7, 10, 13, and 16 are tracer staining images, FIGS. 8, 11, 14, and 17 are staining images (arrows) of anti-occludin antibodies, and FIGS. 9, 12, 15, and 18 are staining of tracer and anti-occludin antibodies, respectively. It is an image obtained by superimposing images. 7-9 and 10-12, the tracer remained leaking into the stratum corneum even after the sodium caprate was released after the tight junction injury with sodium caprate (FIG. 9, 12 *), FIG. It can be seen that leakage to the stratum corneum of the tracer is prevented by treatment with a mixture of ε, γ-glutamyllysine and palmaria extract as shown in -15 and 16-18.
In addition, only 500 microgram / ml (epsilon), (gamma) -glutamyl lysine is added to FIGS. 19-21 after a tight junction injury, and only the 0.1% palmaria extract is added to FIGS. 22-24 after a tight junction injury, and the result 6 hours after. Also shown. 19 and 22 are stained images of the tracer, FIGS. 20 and 23 are stained images of the anti-occludin antibody (arrows), and FIGS. 21 and 24 are images obtained by superimposing the stained images of the tracer and the anti-occludin antibody, respectively. It can be seen that ε, γ-glutamyllysine and palmaria extract alone prevent leakage to the stratum corneum of the tracer. That is, it can be seen that this discrimination method is suitable for screening for a skin barrier improving material involved in the tight junction function.
実施例２
＜工程１＞「EPI-200」を培養プレートに移し、表皮基底層側に２００μｌの5μM 「BODIPY（登録商標） FL-C5-Ceramide-BSA」（モレキュラープローブ社製）を含む維持培地(EPI-100、クラボウ製)を加え、３７℃、５%二酸化炭素で４時間培養した後、4℃冷蔵庫で１時間静置した。
＜工程２＞５００μｌの新鮮な維持培地に置換し、３７℃、５% CO2で２０時間培養した
。
＜工程３＞３００μｌの５%脱脂牛血清アルブミンを含む維持培地に置換し、４℃で３０
分間静置した。
＜工程４＞工程３を２回繰り返した。
＜工程５＞新鮮な維持培地及び１mMカプリン酸ナトリウムを含む維持培地にそれぞれ置換し、３７℃、５%二酸化炭素で培養した。
＜工程６＞培養１２時間後、１mM カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置
換した。
＜工程７＞一定時間培養後「EPI-200」を支持体から切り離し、「OCTコンパウンド」（サクラファインテック社製）に包埋して液体窒素で凍結した。
＜工程８＞凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡下、励起波長４７０ｎｍ/蛍光波長５２５ｎｍ
で観察した。
Example 2
<
<Step 2> The medium was replaced with 500 μl of a fresh maintenance medium, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 20 hours.
<Step 3> Replace with 300 μl of maintenance medium containing 5% defatted bovine serum albumin at 30 ° C.
Let stand for a minute.
<Step 4> Step 3 was repeated twice.
<Step 5> A fresh maintenance medium and a maintenance medium containing 1 mM sodium caprate were respectively replaced, and cultured at 37 ° C. and 5% carbon dioxide.
<Step 6> After 12 hours of culture, the culture medium was replaced with a fresh maintenance medium not containing 1 mM sodium caprate.
<Step 7> After culturing for a certain period of time, “EPI-200” was detached from the support, embedded in “OCT compound” (manufactured by Sakura Finetech), and frozen with liquid nitrogen.
<Step 8> A frozen section is prepared, and the excitation wavelength is 470 nm / fluorescence wavelength is 525 nm under a fluorescence microscope.
Observed at.
図２５はカプリン酸ナトリウム未処理、図２６は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２
時間後、図２７は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、カプリン酸ナトリウムを
含まない新鮮な維持培地に置換して１８時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像であ
る。角層直下の表皮顆粒層（矢印）の蛍光（セラミド）がカプリン酸ナトリウム未処理では細胞間の上部分に多く認められるのに対して（図２５）、カプリン酸ナトリウム処理により消失していることが判る（図２６）。この後カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換して１８時間後には、再び表皮顆粒層の細胞間の上部分（矢印）に蛍光（セラミド）が認められる（図２７）。つまり、カプリン酸ナトリウムはセラミドを角層方向に分泌する表皮細胞の働きを可逆的に阻害する作用を有することが判る。即ち本鑑別法は、セラミドの組織内輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の評価に適していることが判る。
25 is untreated with sodium caprate, FIG. 26 is treated with 1 mM sodium caprate 12
FIG. 27 is a fluorescence image of a frozen section of “EPI-200” 18 hours after replacement with a fresh maintenance medium not containing sodium caprate 12 hours after treatment with 1 mM sodium caprate after time. Fluorescence (ceramide) in the epidermal granule layer (arrow) directly under the stratum corneum is observed in the upper part between cells when sodium caprate is not treated (FIG. 25), but disappeared by treatment with sodium caprate (FIG. 26). Thereafter, after replacing with a fresh maintenance medium not containing sodium caprate, fluorescence (ceramide) is observed again in the upper part (arrow) between cells of the epidermal granule layer (FIG. 27). That is, it can be seen that sodium caprate has the action of reversibly inhibiting the action of epidermal cells that secrete ceramide in the stratum corneum direction. That is, it can be seen that this discrimination method is suitable for evaluating the degree of involvement of tight junctions in the intracerebral transport of ceramide.
実施例３
実施例２と同様に＜工程６＞まで行うが、＜工程６＞の後、別個の「EPI-200」を、５
００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジン、０．１％パルマリア抽出物それぞれ単独で含有する維持培地に置換し６時間培養を続けた。その後培地を回収し、細胞外に分泌された「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ
）を、ARVO SX Multilabel Counter（PerkinElmer社製）を用いて測定した。さらに、そ
の後＜工程８＞まで進めた。
Example 3
Similar to Example 2, the process is performed up to <Step 6>. After <Step 6>, a separate “EPI-200” is added to 5
The culture medium was replaced with a maintenance medium containing 00 μg / ml ε, γ-glutamyllysine and 0.1% palmaria extract alone, and the culture was continued for 6 hours. Thereafter, the medium is collected, and the fluorescence intensity (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 535 nm) of “BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA” secreted extracellularly.
) Was measured using an ARVO SX Multilabel Counter (manufactured by PerkinElmer). Furthermore, it advanced to <process 8> after that.
結果を図２８に示すが、ε，γ−グルタミルリジン、パルマリア抽出物は、いずれも無添加コントロールよりも有意に蛍光標識セラミド「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」の細胞
外への分泌量を促進する。また図２９は１ｍＭカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、維持培地に置換して１２時間後、図３０は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、５
００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンを含有する維持培地に置換して１２時間後、図３１は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、０．１％パルマリア抽出物を含有す
る維持培地に置換して１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像である。角層直下
の表皮顆粒層の蛍光（セラミド）が図２９では細胞間の上部分には多く認められないのに対して、図３０、３１ではそれぞれ表皮顆粒層の細胞間の上部分（矢印）に多く認められる。つまり、ε，γ−グルタミルリジン及びパルマリア抽出物はそれぞれ単独で、セラミドを角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有することが判る。即ち本鑑別法は、実施例１及び２の結果も加味して、セラミドの組織内輸送へのタイトジャンクションの関与の程度に基づいた、皮膚バリア改善素材のスクリーニングに適していることが判る。
The results are shown in FIG. 28. As for ε, γ-glutamyllysine and palmaria extract, the amount of extracellularly secreted fluorescently labeled ceramide “BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA” is significantly higher than that of the control without addition. Facilitate. 29 shows 12 hours after treatment with 1 mM sodium caprate, 12 hours after replacement with the maintenance medium, and FIG. 30 shows 5 hours after treatment with 1 mM sodium caprate.
12 hours after replacement with maintenance medium containing 00 μg / ml ε, γ-glutamyllysine, FIG. 31 shows 12 hours after replacement with maintenance medium containing 0.1% palmaria extract 12 hours after treatment with 1 mM sodium caprate. It is the fluorescence image of the frozen section of “EPI-200” after time. In FIG. 29, not much fluorescence (ceramide) in the epidermal granule layer immediately below the stratum corneum is observed in the upper part between cells, whereas in FIGS. 30 and 31, the upper part (arrow) between the cells in the epidermal granule layer. Many are recognized. That is, it turns out that (epsilon), (gamma) -glutamyl lysine and a palmaria extract each have the effect which accelerates | stimulates the function of the epidermal cell which secretes ceramide toward a stratum corneum. That is, it can be seen that this discrimination method is suitable for screening of a skin barrier improving material based on the degree of involvement of tight junctions in the intracerebral transport of ceramide in consideration of the results of Examples 1 and 2.
本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分の評価に応用できる。 The present invention can be applied to the evaluation of active ingredients of external preparations for skin such as cosmetics.
Claims (1)
上記培養した皮膚又は培養皮膚三次元モデルを検体で処理し、
皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察し、
セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された検体であると鑑別された、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、皮膚バリア機能改善剤。 Cultivate skin or cultured skin 3D model with labeled ceramide,
Treat the cultured skin or cultured skin three-dimensional model with a specimen,
Observe the presence of labeled ceramide in the skin or cultured skin 3D model,
A skin barrier function-improving agent comprising ε, γ-glutamyllysine and / or palmaria extract, which has been identified as a specimen in which ceramide transport in tissue is accelerated compared to a condition in which no specimen is present.
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