JP2013099285A - Method for producing cell culture container - Google Patents
Method for producing cell culture container Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013099285A JP2013099285A JP2011244943A JP2011244943A JP2013099285A JP 2013099285 A JP2013099285 A JP 2013099285A JP 2011244943 A JP2011244943 A JP 2011244943A JP 2011244943 A JP2011244943 A JP 2011244943A JP 2013099285 A JP2013099285 A JP 2013099285A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- container
- functional
- substrate
- cell culture
- functional substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
本発明は、細胞培養容器の製造方法に関し、詳細には、安定した品質の細胞培養容器を効率良く製造することができる方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a cell culture container, and more particularly to a method capable of efficiently producing a cell culture container of stable quality.
近年、容器の表面に様々な機能性を付与する試みがなされている。例えば、特許文献1には、シャーレの表面に温度応答性ポリマーとなるモノマーを含む溶液を展開し、これに電子線照射してモノマーを重合させることにより作製した、温度応答性ポリマーが固定化されている細胞培養支持体が開示されている。これによれば、シャーレなどの容器の面を利用して形成されるシート状の培養細胞集合体(以下、細胞シートという。)を、細胞−細胞間の結合を壊すことなく容器から剥離して回収することができる。 In recent years, attempts have been made to impart various functionalities to the surface of containers. For example, in Patent Document 1, a temperature-responsive polymer prepared by spreading a solution containing a monomer that becomes a temperature-responsive polymer on the surface of a petri dish and polymerizing the monomer by irradiating it with an electron beam is immobilized. A cell culture support is disclosed. According to this, a sheet-like cultured cell aggregate (hereinafter referred to as a cell sheet) formed using the surface of a container such as a petri dish is peeled from the container without breaking the cell-cell bond. It can be recovered.
しかしながら、シャーレなどの容器の表面に対して、個別にバッチ処理により機能性を付与する方法は効率が悪く、大量生産には向かない。そこで、シート状の部材の表面に対して、連続処理により機能性を付与し、機能性を有するシートを生産した後、これを容器に固定すれば生産効率が良く、また、様々な大きさや形の容器への適用も可能となる。 However, the method of individually imparting functionality to the surface of a container such as a petri dish by batch processing is inefficient and is not suitable for mass production. Therefore, after providing functionality to the surface of the sheet-like member by continuous processing and producing a functional sheet, it is possible to improve the production efficiency by fixing it to a container, and various sizes and shapes. Application to a container is also possible.
ところで、表面に機能性が付与されたシート(以下、機能性基体という。)を容器に固定する方法としては、例えば、接着剤を用いる方法が挙げられる。具体的には、機能性基体の機能性が付与された面とは反対側の最外層の面上に、あらかじめ接着剤層を形成しておき、この接着剤層を介して機能性基体を容器に固定させる。接着剤を用いる方法によれば、機能性基体を容器に簡便に固定することができるため、機能性を有する容器を効率良く生産することができると考えられる。しかしながら、例えば、細胞を培養することを目的とする容器では、細胞に対する安全性や品質の安定性が強く求められるため、その点を考慮した接着剤の選択が求められる。 By the way, as a method of fixing a sheet (hereinafter, referred to as a functional substrate) having functionality on the surface to a container, for example, a method using an adhesive may be mentioned. Specifically, an adhesive layer is formed in advance on the surface of the outermost layer opposite to the surface to which the functionality of the functional substrate is imparted, and the functional substrate is placed in the container via this adhesive layer. To fix. According to the method using an adhesive, it is considered that a functional container can be efficiently produced because the functional substrate can be easily fixed to the container. However, for example, in a container intended for culturing cells, safety against cells and stability of quality are strongly demanded, and therefore selection of an adhesive in consideration of this point is required.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、機能性基体を備える細胞培養容器を、安定した品質で効率良く製造するための方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, Comprising: It aims at providing the method for manufacturing efficiently the cell culture container provided with a functional base | substrate with stable quality.
本発明者らは、細胞を培養することを目的とする容器に適した機能性基体の固定方法について研究を重ねたところ、架橋型接着剤では、架橋反応時の架橋密度などが局所的にばらつくことがあり、それが原因で安定した品質が得られない恐れがあるのに対し、非架橋型接着剤では、細胞培養容器に求められる耐久性を満たし、且つ、安定した品質の細胞培養容器を効率良く製造できることを見出し、発明を完成するに至った。具体的には、本発明は、以下のようなものを提供する。 The inventors of the present invention have conducted research on a method for fixing a functional substrate suitable for a container for culturing cells. As a result, the cross-linking density and the like during the cross-linking reaction vary locally in a cross-linking adhesive. While there is a risk that stable quality may not be obtained due to this, non-crosslinked adhesives satisfy the durability required for cell culture containers and have stable quality cell culture containers. The inventors have found that they can be manufactured efficiently, and have completed the invention. Specifically, the present invention provides the following.
(1) 底部及び当該底部の周縁に立設された側壁部を少なくとも備える容器部と、機能性基体とを備え、当該機能性基体が上記容器部の底部に貼付されている細胞培養容器の製造方法であって、上記機能性基体が、基材上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性有機化合物層を少なくとも備え、上記機能性基体と上記底部とを非架橋型接着剤を介して接着させる機能性基体接着工程を含む、上記方法。 (1) Manufacture of a cell culture container comprising: a container part comprising at least a bottom part and a side wall part standing on the periphery of the bottom part; and a functional substrate, wherein the functional substrate is adhered to the bottom part of the container part. In the method, the functional substrate includes at least a functional organic compound layer having a surface having a predetermined function on the substrate, and the functional substrate and the bottom portion are interposed via a non-crosslinking adhesive. The above-mentioned method, comprising the step of adhering a functional substrate.
(2) 上記容器部は、上記側壁部の上端部に接合され、上記底部に対向配置された天部と、上記側壁部の一部に穿設された閉栓可能な通孔と、を更に備え、細胞及び培地を収容するための内室が内部に形成されている、(1)に記載の方法。 (2) The container portion further includes a ceiling portion that is joined to the upper end portion of the side wall portion and is disposed to face the bottom portion, and a through-hole that can be plugged in a part of the side wall portion. The method according to (1), wherein an inner chamber for containing cells and a medium is formed inside.
本発明の方法によれば、機能性基体を備える細胞培養容器を、安定した品質で効率良く製造することができる。 According to the method of the present invention, a cell culture vessel provided with a functional substrate can be efficiently produced with stable quality.
以下、図面を参照しながら、本発明の特徴を説明する。本発明は、以下に説明する形態に限定されることはなく、技術思想を逸脱しない範囲において、適宜、変更を加えて実施することが可能である。また、以下に示す各図は、模式的に示した図であり、理解を容易にするために適宜、誇張して示すことがあり、実際のものとは縮尺が異なる場合がある。 The features of the present invention will be described below with reference to the drawings. The present invention is not limited to the embodiments described below, and can be implemented with appropriate modifications within the scope not departing from the technical idea. Each of the drawings shown below is a diagram schematically, and may be exaggerated as appropriate for easy understanding, and the scale may be different from the actual one.
[細胞培養容器]
本発明の方法により製造される細胞培養容器の実施形態について説明する。
本発明における容器部の好ましい実施形態の一例を図1に示す。図1に示す細胞培養容器1では、容器部100が、円形の底部101と、該底部101の周縁に立設された側壁部102とを備え、上方向に開放されている、いわゆる「ディッシュ型」と呼ばれる形状を有している。そして、容器部100の底部101の上面の略全面に、1つのシート状の機能性基体20が非架橋型接着剤(図示せず)を介して接着されている。なお、図1では、底部101の形状は円形であるが、これに限定されず、方形、楕円形、多角形などいずれの形状であってもよい。
[Cell culture vessel]
An embodiment of a cell culture container produced by the method of the present invention will be described.
An example of a preferred embodiment of the container part in the present invention is shown in FIG. In the cell culture container 1 shown in FIG. 1, a so-called “dish type” in which a
本発明における容器部の好ましい実施形態の他の例を図2に示す。図2に示す容器部200は、底部201と、該底部201の周縁に立設された側壁部202と、側壁部202の上端部に接合された、底部201に対向配置される天部203とを備えている。また、容器部200には、液体用の通孔204が設けられている。すなわち、容器部200は、側壁部202の一部に通孔204が穿設され、通孔204の周縁から容器部の外側に延びる首部205を備えており、いわゆる「フラスコ型」と呼ばれる形状を有している。容器部200の底部201には、1つの機能性基体20が非架橋型接着剤(図示せず)を介して接着されている。容器部200の首部205には、蓋210を係止するための係止部(図示せず)が形成されており、該係止部を介して蓋210が着脱可能に装着される。該蓋210により、細胞培養容器2の内側は閉じられた状態となり、安定して細胞培養を行なうことができる。通孔204より細胞や培地を供給したり、容器部200の底部201から剥離した機能性基体20を回収したりしてもよい。
Another example of a preferred embodiment of the container part in the present invention is shown in FIG. The
本発明における容器部は、底部及びその周縁に立設された側壁部を少なくとも備え、細胞及び培地を収容できる形状であれば、他の形状であってもよい。具体的には、容器部は、例えば、ビーカー、ウェルプレート、ボトル、管などの形状であってもよい。また、容器部単独で細胞と培地とを保持可能な、図1及び2に示すような構造である必要はなく、詳細は後述するが、たとえ容器部の底部が開口部を有していても、該開口部に機能性基体が貼付されることで、細胞と培地とを収容できる構造であればよい。 The container part in the present invention may have another shape as long as it has at least a bottom part and a side wall part standing on the periphery thereof and can accommodate cells and a culture medium. Specifically, the container portion may have a shape such as a beaker, a well plate, a bottle, or a tube. Moreover, it is not necessary to have a structure as shown in FIGS. 1 and 2 that can hold cells and culture medium by the container alone, and details will be described later, even if the bottom of the container has an opening. Any structure may be used as long as the functional substrate is attached to the opening to accommodate the cells and the medium.
容器部及び蓋を形成する材料は、特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えは、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂などの樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも1種を含む樹脂材料、ガラスや石英などの無機材料が挙げられ、これらの中でも樹脂材料が好ましい。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。 The material which forms a container part and a lid | cover is not specifically limited, The material generally used in cell culture can be used. For example, polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polyethylene terephthalate resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, chloride Examples thereof include resin materials such as vinyl resins, resin materials containing at least one of the above-described surface hydrophilized treatment, and inorganic materials such as glass and quartz. Among these, resin materials are preferable. The resin material is preferably a polystyrene resin or a polyethylene terephthalate resin.
図1及び2では、機能性基体は、容器部の底部に1つ配置されているが、機能性基体は、底部に少なくとも1つ配置されていればよく、例えば、複数の同一又は異なる機能性を有する機能性基体が底部に並設されていてもよい。また、図1及び2では、機能性基体は、容器部の底部の上面に配置されており、その大きさは、容器部の底部のものとほぼ同じであるが、容器部の底部に配置可能な大きさであればよい。好ましくは、配置する容器部の底部の大きさと略同様である。さらに、図1及び2では、機能性基体の形状はシート状であるが、容器部の底部の形状に沿うものであればよく、好ましくは、平坦な板状、シート状、フィルム状であり、長尺状の形態のときにロール巻取り可能な可撓性を有していることが好ましい。 1 and 2, one functional substrate is disposed at the bottom of the container, but at least one functional substrate may be disposed at the bottom, for example, a plurality of the same or different functionalities. A functional substrate having the above may be arranged in parallel at the bottom. 1 and 2, the functional substrate is disposed on the upper surface of the bottom of the container, and the size thereof is substantially the same as that of the bottom of the container, but can be disposed on the bottom of the container. Any size is acceptable. Preferably, it is substantially the same as the size of the bottom part of the container part to be arranged. Furthermore, in FIGS. 1 and 2, the shape of the functional substrate is a sheet shape, but may be any shape that conforms to the shape of the bottom of the container portion, and preferably a flat plate shape, a sheet shape, and a film shape. It is preferable that the roll is flexible so that it can be wound up in a long form.
<機能性基体>
本発明における機能性基体の好ましい実施形態の一例を図3に示す。図3に示す機能性基体20は、基材21上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性有機化合物層22が形成されている。以下、基材及び機能性有機化合物層について、詳細に説明する。
<Functional substrate>
An example of a preferred embodiment of the functional substrate in the present invention is shown in FIG. In the
(基材)
機能性基体を構成する基材は、一方の表面に後述する機能性有機化合物層を形成することが可能であり、細胞培養の際に耐え得る耐水性を有していれば、特に限定されず、機能性有機化合物に応じて種々の材料を選択して形成することができる。基材の材料としては、典型的には、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、TAC(トリアセチルセルロース)、ポリイミド(PI)、ナイロン(Ny)、低密度ポリエチレン(LDPE)、中密度ポリエチレン(MDPE)、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリルなどが挙げられる。また、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、もしくはその共重合体のような生分解性ポリマーであってもよい。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネートである。ポリエチレンテレフタレートは、低価格で入手することができ、量産に適した材料である点において好ましい。ポリスチレンは、細胞毒性が低い材料である点において好ましい。製膜方法は、特に限定されず、例えば、溶液流延法、溶融押出法、カレンダー法などの従来公知の方法を用いることができる。また、上記方法によりあらかじめフィルム状に製膜された市販の基材を用いてもよい。
(Base material)
The substrate constituting the functional substrate is not particularly limited as long as the functional organic compound layer described later can be formed on one surface, and has water resistance that can withstand cell culture. Depending on the functional organic compound, various materials can be selected and formed. Typically, the base material is polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), TAC (triacetyl cellulose), polyimide (PI), nylon (Ny), low density polyethylene (LDPE). ), Medium density polyethylene (MDPE), vinyl chloride, vinylidene chloride, polyphenylene sulfide, polyether sulfone, polyethylene naphthalate, polypropylene, acrylic and the like. Further, it may be a biodegradable polymer such as polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactan, or a copolymer thereof. Preferred are polyethylene terephthalate, polystyrene, and polycarbonate. Polyethylene terephthalate is preferable in that it can be obtained at a low price and is a material suitable for mass production. Polystyrene is preferred in that it is a material with low cytotoxicity. The film forming method is not particularly limited, and for example, a conventionally known method such as a solution casting method, a melt extrusion method, or a calendar method can be used. Moreover, you may use the commercially available base material previously formed into a film form by the said method.
基材の機能性有機化合物層が形成される側の表面は、易接着処理されていてもよい。易接着処理としては、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)などの易接着剤による処理が挙げられる。 The surface of the substrate on which the functional organic compound layer is formed may be subjected to an easy adhesion treatment. Examples of the easy adhesion treatment include treatment with an easy adhesive such as polyester, acrylic ester, polyurethane, polyethyleneimine, silane coupling agent, and perfluorooctane sulfonic acid (PFOS).
基材は、容器部の底部に設置可能な大きさであることが好ましい。基材の形状は、容器部の底部の形状に沿うものであることが好ましい。好ましくは平坦な板状、シート状、フィルム状である。細胞の培養が行いやすいからである。基材の厚みは、特に限定されないが、取り扱い性を考慮すると、好ましくは10〜500μm、より好ましくは50〜250μmである。この範囲であれば、連続帯状で供給して加工することも可能である。 It is preferable that a base material is a magnitude | size which can be installed in the bottom part of a container part. It is preferable that the shape of a base material is what follows the shape of the bottom part of a container part. A flat plate shape, a sheet shape, and a film shape are preferable. This is because it is easy to culture cells. Although the thickness of a base material is not specifically limited, When handling property is considered, Preferably it is 10-500 micrometers, More preferably, it is 50-250 micrometers. If it is this range, it is also possible to supply and process in a continuous belt shape.
(機能性有機化合物層)
機能性有機化合物層としては、例えば、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化し得る表面を有する刺激応答性ポリマー層や、1つ以上のエチレングリコール単位(CH2−CH2−O)からなるエチレングリコール鎖などの親水性化合物層が挙げられる。
(Functional organic compound layer)
Examples of the functional organic compound layer include a stimulus-responsive polymer layer having a surface that can be changed from cell adhesiveness to cell nonadhesiveness by a predetermined stimulus, and one or more ethylene glycol units (CH 2 —CH 2). And a hydrophilic compound layer such as an ethylene glycol chain composed of —O).
刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどが挙げられる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易である点において好ましい。 The stimulus-responsive polymer layer is a layer containing a polymer in which the degree of cell adhesion on the surface is changed by a predetermined stimulus. Examples of the stimulus responsive polymer include a temperature responsive polymer, a pH responsive polymer, an ion responsive polymer, and a photoresponsive polymer. Of these, a temperature-responsive polymer is preferable in that it can easily give a stimulus.
温度応答性ポリマーとしては、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着し難くする性質(細胞非接着性)を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質(細胞接着性)を示すものがよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Tが0℃〜80℃、さらに好ましくは0℃〜50℃である温度応答性ポリマーを用いることが好ましい。 As the temperature-responsive polymer, for example, a polymer that exhibits cell adhesion at a temperature for culturing cells and exhibits cell non-adhesion at a temperature at which the produced cell sheet is peeled may be used. For example, a temperature-responsive polymer has improved affinity to surrounding water at temperatures below the critical dissolution temperature, and the polymer takes up water and swells to make it difficult for cells to adhere to the surface (cell non-adhesiveness). It is preferable that the temperature is equal to or higher than the same temperature so that water is desorbed from the polymer and the polymer contracts to easily adhere cells to the surface (cell adhesion). Such a critical solution temperature is called a lower critical solution temperature. It is preferable to use a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature T of 0 ° C to 80 ° C, more preferably 0 ° C to 50 ° C.
本発明において好適に使用できる温度応答性ポリマーとしては、具体的にはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられ、より具体的にはポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(T=32℃)、ポリ−N−n−プロピルアクリルアミド(T=21℃)、ポリ−N−n−プロピルメタクリルアミド(T=32℃)、ポリ−N−エトキシエチルアクリルアミド(T=約35℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(T=約28℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(T=約35℃)、ポリ−N,N−ジエチルアクリルアミド(T=32℃)などが挙げられる。また、これらのポリマーを形成するためのモノマーが2種以上組み合わされて重合された共重合体であってもよい。 Specific examples of the temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention include acrylic polymers and methacrylic polymers, and more specifically, poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.) and poly-N. -N-propylacrylamide (T = 21 ° C), poly-Nn-propylmethacrylamide (T = 32 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (T = about 35 ° C), poly-N-tetrahydrofurfuryl Examples include acrylamide (T = about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N, N-diethylacrylamide (T = 32 ° C.), and the like. Further, it may be a copolymer obtained by combining two or more monomers for forming these polymers.
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、N−(若しくはN,N−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体などが挙げられ、これらの1種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーを複数種組み合わせて使用した場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。 As a monomer for forming these polymers, a monomer that can be polymerized by irradiation with radiation can be used. Examples of the monomer include (meth) acrylamide compounds, N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives, (meth) acrylamide derivatives having a cyclic group, vinyl ether derivatives, and the like. The above may be used. When one type of monomer is used alone, the polymer formed on the substrate is a homopolymer, and when multiple types of monomers are used in combination, the polymer formed on the substrate is a heteropolymer. These forms are also encompassed by the present invention.
また、必要に応じて、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。 Further, if necessary, other monomers other than those described above may be further added for copolymerization. Further, a graft or block copolymer of the above-mentioned polymer used in the present invention and another polymer, or a mixture of the polymer of the present invention and another polymer may be used. Moreover, it is also possible to crosslink within a range where the original properties of the polymer are not impaired.
pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。 As the pH responsive polymer and the ion responsive polymer, those suitable for the cell sheet to be prepared can be appropriately selected.
細胞接着性及び細胞非接着性は、一の領域と他の領域における細胞の接着度合いの相対的な関係を示すものである。細胞接着性とは、細胞が接着しやすいことをいう。細胞接着性は、表面の化学的性質や物理的性質などによって細胞の接着や伸展が起こりやすいか否かで決定される。細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が60%以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が80%以上の表面であることがより好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が4000cells/cm2以上30000cells/cm2未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内に保管し、14.5時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合({(接着している細胞数)/(播種した細胞数)}×100(%))と定義する。細胞の播種は、10%FBS入りDMEM培地に懸濁させて測定対象物上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象物をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所(例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁)を除いた箇所を測定箇所とする。 Cell adhesion and cell non-adhesion indicate a relative relationship between the degree of cell adhesion in one region and the other region. Cell adhesion means that cells are easily adhered. Cell adhesion is determined by whether or not cell adhesion or extension is likely to occur depending on the chemical or physical properties of the surface. As an index for determining cell adhesion, the cell adhesion spreading rate when cells are actually cultured can be used. The cell adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 60% or more, and more preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 80% or more. If the cell adhesion extension rate is high, cells can be cultured efficiently. The cell adhesion extension rate in the present invention is such that cells to be cultured within a seeding density of 4000 cells / cm 2 or more and less than 30000 cells / cm 2 are seeded on the surface to be measured, and in an incubator at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. It is defined as the ratio of cells that have adhered and spread when cultured for 14.5 hours ({(number of cells adhered) / (number of cells seeded)} × 100 (%)). Cell seeding is suspended in DMEM medium containing 10% FBS, seeded on the measurement object, and then slowly shaken the measurement object on which the cells are seeded so that the cells are distributed as uniformly as possible. It is done by. Furthermore, the measurement of the cell adhesion extension rate is performed after exchanging the medium immediately before the measurement to remove the non-adhered cells. When measuring cell adhesion spread rate, measure the location excluding the location where the cell density tends to be specific (for example, the center of the predetermined area where the density is likely to be high, the periphery of the predetermined area where the density is likely to be low) A place.
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着し難い性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質などによって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が60%未満の表面であることが好ましく、40%未満の表面であることがより好ましく、5%以下の表面であることが更に好ましく、2%以下の表面であることが最も好ましい。 On the other hand, cell non-adhesiveness refers to the property that cells are difficult to adhere. Cell non-adhesiveness is determined by whether or not cell adhesion or extension is unlikely to occur due to chemical or physical properties of the surface. The non-cell-adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate as defined above of less than 60%, more preferably less than 40%, and even more preferably 5% or less. The surface is preferably 2% or less, and most preferably.
親水性化合物層としては、例えば、1つ以上のエチレングリコール単位(CH2−CH2−O)からなるエチレングリコール鎖(複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる)などの親水性化合物の層が挙げられる。エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質などの他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、DNA、RNA、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。 As the hydrophilic compound layer, for example, an ethylene glycol chain composed of one or more ethylene glycol units (CH 2 —CH 2 —O) (an ethylene glycol chain composed of a plurality of ethylene glycol units is referred to as a “polyethylene glycol chain”) And a hydrophilic compound layer. The end of the ethylene glycol chain may be blocked with a hydroxyl group, or the other end of the ethylene glycol chain may be covalently linked to another substance such as a biological substance. A layer containing an ethylene glycol chain whose end is blocked with a hydroxyl group can provide a hydrophilic surface to which cells are difficult to adhere. Examples of biological substances that can be covalently bonded to the end of an ethylene glycol chain include antigens, antibodies, DNA, RNA, peptides, hormones, enzymes, cytokines, sugar chains, lipids, coenzymes, enzyme inhibitors, cells, and other functions. The protein which has is included. Furthermore, the low molecular weight compound which has affinity with such a biological substance, and a high molecular compound are also contained in the range of a biological substance.
図4は、図1に示す形状の細胞培養容器において、容器部に機能性基体が非架橋型接着剤を介して接着している場合の、好ましい実施形態の一例を示す摸式的断面図である。切断は、図1に示す矢印I−I´に沿って行なっている。図4に示す細胞培養容器3では、基材21上に機能性有機化合物層22が形成された機能性基体20が、該機能性基体20の底面積と略同等の面積の非架橋型接着剤層30を介して、容器部100の底部101の上面の一部の領域に接着している。図5は、図2に示す形状の細胞培養容器において、容器部に機能性基体が接着している場合の、好ましい実施形態の一例を示す摸式的断面図である。切断は、図2に示す矢印II−II´に沿って行なっている。図5に示す細胞培養容器4においても、基材21上に機能性有機化合物層22が形成された機能性基体20が、該機能性基体20の底面積と略同等の面積の非架橋型接着剤層30を介して、容器部200の底部201の上面の一部の領域に接着している。
FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a preferred embodiment in the case where the functional substrate is bonded to the container portion via a non-crosslinking adhesive in the cell culture container having the shape shown in FIG. is there. Cutting is performed along arrows II ′ shown in FIG. In the
図6及び7は、図1に示す形状の細胞培養容器において、容器部に機能性基体が接着している好ましい実施形態の他の例を示す摸式的断面図である。切断は、図1に示す矢印I−I´に沿って行なっている。図6に示す細胞培養容器5では、基材21上に機能性有機化合物層22が形成された機能性基体20は、その外周部のみが非架橋型接着剤層30を介している状態で、容器部100の底部101の上面の一部の領域に接着している。図6のような態様によれば、中央領域に接着剤が存在しないため、例えば、蛍光顕微鏡による細胞観察を行なう際に、接着剤由来の自家蛍光の影響を受け難い。
6 and 7 are schematic cross-sectional views showing another example of the preferred embodiment in which the functional substrate is adhered to the container portion in the cell culture container having the shape shown in FIG. Cutting is performed along arrows II ′ shown in FIG. In the
図7に示す細胞培養容器6では、容器部100は、図1に示す容器部と同様のディッシュ型の形状を有しているが、底部101の略中央を貫通するように円形の開口部103が1つ形成されている点で図1に示す容器部と異なる。そして、機能性基体20は、開口部103を塞ぐように配置されている。機能性基体20は、その外周部のみが非架橋型接着剤層30を介している状態で、容器部100の底部101の下面に接着している。図7では、機能性基体20を構成する機能性有機化合物層22と非架橋型接着剤層とが接している。図7に示す細胞培養容器6では、容器部100と機能性基体20とを備える形態で細胞と培地とを保持できる構造となっている。図7のような態様によれば、中央領域に接着剤が存在しないため、例えば、蛍光顕微鏡による細胞観察を行なう際に、接着剤由来の自家蛍光の影響を受け難い。
In the
図7では、容器部100の底部101の略中央に1つの開口部103が形成された例を示したが、これに限定されない。例えば、開口部は容器部の底部に複数形成されていてもよい。開口部が複数存在する場合には、開口部ごとに別個の機能性基体で塞いでもよいし、1つの機能性基体で複数の開口部を一括して塞いでもよい。また、図7では、機能性基体を容器部の底部の下面に接着させているが、機能性基体を容器部の底部の上面に接着させて、開口部を塞いでもよい。また、開口部の形状や大きさは、特に限定されるものではなく、方形、円形、楕円形、多角形などいずれであってもよい。図7に示す細胞培養容器のように容器部が底部に開口部を有している場合、機能性基体の厚さは、開口部上で支持性を確保できる厚さであることが好ましく、例えば、200μm以上とするとよい。また、機能性基体と、容器部の底部の下面との接着幅が、例えば1mm以上であると、安定的に機能性基体が支持され、また、製造安定性の面からも好ましい。
Although FIG. 7 shows an example in which one
[細胞培養容器の製造方法]
本発明の細胞培養容器の製造方法は、機能性基体と底部とを非架橋型接着剤を介して接着させる機能性基体接着工程を含むことを特徴とする。非架橋型接着剤の層を形成させる対象は、機能性基体又は容器部のいずれであってもよい。例えば、容器部の機能性基体を設置する領域の一部又は全部に、機能性基体を接着させるための非架橋型接着剤層を形成した後、該非架橋型接着剤層を介して機能性基体と容器部の底部とを接着してもよいし、機能性基体の表面の一部又は全部に、非架橋型接着剤層を形成した後、該非架橋型接着剤層を介して機能性基体と容器部の底部とを接着してもよい。
[Method for producing cell culture container]
The method for producing a cell culture container of the present invention is characterized by including a functional substrate adhesion step in which the functional substrate and the bottom are adhered via a non-crosslinking adhesive. The target for forming the non-crosslinked adhesive layer may be either a functional substrate or a container part. For example, after forming a non-crosslinked adhesive layer for adhering the functional substrate on part or all of the region where the functional substrate of the container portion is installed, the functional substrate is interposed via the non-crosslinked adhesive layer. May be bonded to the bottom of the container portion, or after forming a non-crosslinked adhesive layer on a part or all of the surface of the functional substrate, the functional substrate is bonded via the non-crosslinked adhesive layer. You may adhere | attach the bottom part of a container part.
以下、本発明の細胞培養容器の製造方法の好ましい実施形態の一例として、機能性有機化合物層が刺激応答性ポリマー層であり、基材の、刺激応答性ポリマー層が形成されている面とは反対側の面の全体に、非架橋型接着剤層を形成し、該非架橋型接着剤層を介して機能性基体と容器部の底部とを接着する場合について説明する。 Hereinafter, as an example of a preferred embodiment of the method for producing a cell culture container of the present invention, the functional organic compound layer is a stimulus-responsive polymer layer, and the surface of the substrate on which the stimulus-responsive polymer layer is formed A case will be described in which a non-crosslinked adhesive layer is formed on the entire opposite surface, and the functional substrate and the bottom of the container part are bonded via the non-crosslinked adhesive layer.
まず、細胞培養容器を構成する容器部となる容器を準備する。容器は、所望の大きさや形状を有する市販品を購入して準備してもよいし、射出成型法などにより所望の大きさや形状のものを作製して準備してもよい。なお、細胞培養容器の最終形態が、機能性基体を容器部の底部に接着させる操作に必要な開放部を有さない場合には、はじめに該開放部を有する容器を準備し、機能性基体の接着後、蓋などの他の部材を接合すればよい。 First, a container serving as a container part constituting a cell culture container is prepared. The container may be prepared by purchasing a commercially available product having a desired size and shape, or may be prepared by preparing a desired size and shape by an injection molding method or the like. In the case where the final form of the cell culture container does not have an open part necessary for the operation of bonding the functional substrate to the bottom of the container part, a container having the open part is prepared first, After bonding, another member such as a lid may be bonded.
次に、あらかじめ非架橋型接着剤層が形成された機能性基体を準備する。はじめに上述の基材を準備する。基材は、枚葉状態のものを用いても、ロール状態のものを用いてもよい。次に、基材の一方の面上に、非架橋型接着剤層を形成させた後、該非架橋型接着剤層を保護するための剥離層を形成する。次いで、基材の他方の面上に、刺激応答性ポリマー層を形成させる。このようにして、あらかじめ非架橋型接着剤層を備える機能性基体を準備する。 Next, a functional substrate on which a non-crosslinked adhesive layer is formed in advance is prepared. First, the above-mentioned base material is prepared. The substrate may be a single wafer or a roll. Next, after forming a non-crosslinked adhesive layer on one surface of the substrate, a release layer for protecting the non-crosslinked adhesive layer is formed. A stimulus responsive polymer layer is then formed on the other side of the substrate. In this way, a functional substrate provided with a non-crosslinked adhesive layer in advance is prepared.
機能性基体と容器部の底部とを接着するための接着剤として、非架橋型接着剤を選択した理由は、次のとおりである。架橋型接着剤では、架橋のためのエージング(養生)の工程が必要であり、また、架橋反応時の架橋密度や形成される分子の分子量が局所的にばらつくことがあるため、安定した品質の細胞培養容器を効率的に製造できない恐れがある。しかしながら、非架橋型接着剤では、架橋しないのでエージング工程が不要であり、架橋型接着剤を使用するのに比べて効率的な製造が可能となる。また、架橋反応に起因する品質のばらつきが生じないので、細胞培養への安全性が保証しやすい。 The reason why the non-crosslinked adhesive is selected as the adhesive for bonding the functional substrate and the bottom of the container is as follows. A cross-linking adhesive requires an aging process for cross-linking, and the cross-link density during the cross-linking reaction and the molecular weight of the molecules formed may vary locally. There is a possibility that the cell culture container cannot be produced efficiently. However, since the non-crosslinking adhesive does not crosslink, an aging process is not required, and the production can be performed more efficiently than when a crosslinkable adhesive is used. In addition, since there is no quality variation due to the crosslinking reaction, it is easy to guarantee safety for cell culture.
非架橋型接着剤の種類は、特に限定されず、例えば、ポリイソブチレン系接着剤などの天然ゴム系接着剤、ホットメルト接着剤、湿気硬化型接着剤、乾燥型接着剤などが挙げられ、好ましくはホットメルト接着剤である。ホットメルト接着剤は、熱可塑性樹脂を主成分とした有機溶剤を全く含まない100%固形分の接着剤であって、常温では固形又は半固形であるが、加熱溶融して低粘度の溶融状態になったものを塗布し、冷却により固化して接着が完了するものである。溶剤を使用しないので、溶剤を乾燥させる乾燥工程が不要であり、環境対応及び生産性の観点からその使用がより好ましい。ホットメルト接着剤としては、例えば、ウレタン系、ポリアミド系、ポリオレフィン系、ポリエステル系、エチレン酢酸ビニル系、スチレンブタジエン系やウレタンゴム系などの合成ゴム系の接着剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The type of the non-crosslinking adhesive is not particularly limited, and examples thereof include natural rubber adhesives such as polyisobutylene adhesives, hot melt adhesives, moisture curable adhesives, and dry adhesives. Is a hot melt adhesive. A hot-melt adhesive is a 100% solid adhesive that does not contain any organic solvent based on a thermoplastic resin. It is solid or semi-solid at room temperature, but is melted by heating to a low viscosity molten state. Then, the material is applied and solidified by cooling to complete the adhesion. Since no solvent is used, a drying step for drying the solvent is unnecessary, and its use is more preferable from the viewpoint of environmental friendliness and productivity. Examples of the hot melt adhesive include, but are not limited to, urethane, polyamide, polyolefin, polyester, ethylene vinyl acetate, styrene butadiene, urethane rubber, and other synthetic rubber adhesives. It is not something.
非架橋型接着剤層の形成方法は、例えば、ポリイソブチレン系接着剤などの天然ゴム系接着剤の場合には、有機溶媒などの溶剤に溶解させた非架橋型接着剤層形成用塗工液を調製する。次に、慣用の方法にしたがって、該塗工液を機能性基体の機能性有機化合物層が形成されている側とは反対側の最外面に塗工して塗膜を形成させる。その後、乾燥により溶剤を除去し、非架橋型接着剤層が形成された機能性基体を得る。そして、この非架橋型接着剤層を介して、機能性基体と容器部の底部とを接着させる。溶剤は、特に限定されず、接着剤を溶解しうるものを適宜、選択するとよい。塗工方法も特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法などの印刷による方法、ロールコート、リバースコート、コンマコート、ナイフコート、ダイコート、グラビアコートなどのコーティングによる方法が挙げられる。 For example, in the case of a natural rubber adhesive such as a polyisobutylene adhesive, the non-crosslinking adhesive layer forming method is a non-crosslinking adhesive layer forming coating solution dissolved in a solvent such as an organic solvent. To prepare. Next, according to a conventional method, the coating solution is applied to the outermost surface of the functional substrate opposite to the side on which the functional organic compound layer is formed to form a coating film. Thereafter, the solvent is removed by drying to obtain a functional substrate on which a non-crosslinked adhesive layer is formed. And a functional base | substrate and the bottom part of a container part are adhere | attached through this non-crosslinking-type adhesive bond layer. The solvent is not particularly limited, and a solvent that can dissolve the adhesive may be appropriately selected. The coating method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Examples thereof include printing methods such as gravure printing, flexographic printing, and offset printing, and methods using coating such as roll coating, reverse coating, comma coating, knife coating, die coating, and gravure coating.
ホットメルト接着剤の場合には、該ホットメルト接着剤を加熱し、溶融させた後、慣用の方法にしたがって、機能性基体の機能性有機化合物層が形成されている側とは反対側の最外面に塗工して塗膜を形成させることにより、非架橋型接着剤層が形成された機能性基体を得る。そして、この非架橋型接着剤層を介して、機能性基体と容器部の底部とを接着させる。ホットメルト接着剤の加熱温度は、接着剤の種類にもよるが通常160〜200℃である。塗工には、加熱ロールコーターを用いるとよい。ホットメルト接着剤の塗布量は、好ましくは10〜100g/m2である。 In the case of a hot melt adhesive, the hot melt adhesive is heated and melted, and then the outermost side of the functional substrate opposite to the side on which the functional organic compound layer is formed is formed according to a conventional method. A functional substrate on which a non-crosslinked adhesive layer is formed is obtained by coating the outer surface to form a coating film. And a functional base | substrate and the bottom part of a container part are adhere | attached through this non-crosslinking-type adhesive bond layer. The heating temperature of the hot melt adhesive is usually 160 to 200 ° C. although it depends on the type of adhesive. For coating, a heated roll coater may be used. The application amount of the hot melt adhesive is preferably 10 to 100 g / m 2 .
非架橋型接着剤層上には、剥離層を形成することが好ましい。剥離層とは、剥離性を有する剥離部材からなり、非架橋型接着剤層の表面を保護する機能を有する、いわゆる剥離シートを意味する。剥離部材は、必要な強度と柔軟性を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレンなどの合成樹脂からなるフィルム又はそれらの発泡フィルムに、シリコーン系、フッ素系、長鎖アルキル基含有カルバメートなどの剥離剤で剥離処理したものを挙げることができる。一般には、シリコーン離型処理した合成樹脂フィルムが用いられる。 It is preferable to form a release layer on the non-crosslinked adhesive layer. The release layer means a so-called release sheet made of a release member having peelability and having a function of protecting the surface of the non-crosslinked adhesive layer. The release member is not particularly limited as long as it has the necessary strength and flexibility. For example, a film made of a synthetic resin such as polyethylene terephthalate, polypropylene, polyethylene, or a foamed film thereof, silicone-based, fluorine-based, Examples thereof include those subjected to a release treatment with a release agent such as a long-chain alkyl group-containing carbamate. In general, a synthetic resin film subjected to silicone release treatment is used.
基材の他方の面上に、刺激応答性ポリマー層を形成させる方法としては、以下の方法が挙げられる。まず、重合により刺激応答性ポリマーとなる上述のモノマーを溶媒に溶解させた刺激応答性ポリマー層形成用塗工液を調製する。次に、慣用の方法にしたがって、該塗工液を基材の表面に塗工して塗膜を形成させる。その後、放射線照射などの適当な手段により塗膜中のモノマーを重合させ、ポリマーを形成させるとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより、刺激応答性ポリマー層を形成する。なお、該刺激応答性ポリマー層の表面には、必要に応じて、上記と同様の剥離層を形成してもよい。 Examples of the method for forming the stimulus-responsive polymer layer on the other surface of the substrate include the following methods. First, a coating solution for forming a stimuli-responsive polymer layer is prepared by dissolving the above-described monomer that becomes a stimulus-responsive polymer by polymerization in a solvent. Next, according to a conventional method, the coating solution is applied to the surface of the substrate to form a coating film. Thereafter, the monomer in the coating film is polymerized by appropriate means such as irradiation to form a polymer, and a grafting reaction is caused between the surface of the substrate and the polymer, thereby forming a stimulus-responsive polymer layer. Form. In addition, you may form the peeling layer similar to the above on the surface of this stimulus responsive polymer layer as needed.
溶媒は、モノマーを溶解しうるものであれば特に限定されないが、常庄下において沸点120℃以下、特に60〜110℃のものが好ましい。具体的にはメタノール、エタノール、n−プロパノール、2−プロパノール、n−ブタノール、2−ブタノール、水などが挙げられ、これらは組み合わせて使用してもよい。その他の溶媒、例えば1−ペンタノール、2−エチル−1−ブタノール、2−ブトキシエタノール、及びエチレン(若しくはジエチレン)グリコール又はそのモノエチルエーテルなども使用可能である。必要に応じて、上記溶液にはその他添加剤を配合してもよい。 The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the monomer, but a solvent having a boiling point of 120 ° C. or lower, particularly 60 to 110 ° C. is preferable under ordinary conditions. Specific examples include methanol, ethanol, n-propanol, 2-propanol, n-butanol, 2-butanol, and water, and these may be used in combination. Other solvents such as 1-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 2-butoxyethanol, and ethylene (or diethylene) glycol or monoethyl ether thereof can also be used. If necessary, other additives may be added to the solution.
塗工液中のモノマーの含有量は、1〜70重量%であることが好ましい。また、塗布用組成物中には、モノマーに加えて、複数個のモノマーが重合したオリゴマー又はプレポリマーが含まれてもよい。オリゴマー又はプレポリマーが含まれる場合には、その大きさは、ダイマー以上のものであれば特に限定されず、分子量約3,300(典型的には28分子ポリマー)より大きいものが好ましく、分子量5,700以上のものがより好ましい。 The content of the monomer in the coating liquid is preferably 1 to 70% by weight. In addition to the monomer, the coating composition may contain an oligomer or prepolymer obtained by polymerizing a plurality of monomers. When an oligomer or prepolymer is included, its size is not particularly limited as long as it is a dimer or larger, and preferably has a molecular weight of more than about 3,300 (typically 28 molecular polymers). 700 or more are more preferable.
塗工液を基材の表面に塗工する方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法などの印刷による方法、ロールコート、リバースコート、コンマコート、ナイフコート、ダイコート、グラビアコートなどのコーティングによる方法が挙げられる。 The method for coating the surface of the substrate with the coating liquid is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Examples thereof include printing methods such as gravure printing, flexographic printing, and offset printing, and methods using coating such as roll coating, reverse coating, comma coating, knife coating, die coating, and gravure coating.
刺激応答性ポリマー層の厚みは、例えば、0.5nm〜300nmの範囲内であることが好ましく、1nm〜100nmの範囲内であることがより好ましく、10〜30nmであることが最も好ましい。膜厚を0.5nm〜300nmの範囲とすることで細胞の接着と剥離の両立が容易となる。なお、刺激応答性ポリマー層には、その機能を損なわない範囲で、界面活性剤などの各種添加剤が配合されていてもよい。 The thickness of the stimulus-responsive polymer layer is, for example, preferably in the range of 0.5 nm to 300 nm, more preferably in the range of 1 nm to 100 nm, and most preferably in the range of 10 to 30 nm. By making the film thickness in the range of 0.5 nm to 300 nm, it is easy to achieve both cell adhesion and peeling. In addition, various additives, such as surfactant, may be mix | blended with the stimulus responsive polymer layer in the range which does not impair the function.
モノマーを重合させるために使用する放射線としては、例えば、α線、β線、γ線、電子線、紫外線などが挙げられる。所望のグラフトポリマーを作製するために、エネルギー効率が良い点においてγ線と電子線が好ましく、特に、生産性の面では電子線が好ましい。紫外線は、適当な重合開始剤やシランカップリング剤などのアンカー剤と組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば5Mrad〜50Mradが好ましく、γ線であれば0.5Mrad〜5Mradが好ましい。照射工程前後に、必要に応じて塗膜を乾燥させ、上記溶媒を除去する。 Examples of the radiation used for polymerizing the monomer include α rays, β rays, γ rays, electron beams, and ultraviolet rays. In order to produce a desired graft polymer, γ rays and electron beams are preferable in terms of energy efficiency, and electron beams are particularly preferable in terms of productivity. Ultraviolet rays can be used in combination with a suitable polymerization initiator or an anchor agent such as a silane coupling agent. The range of radiation dose is preferably 5 Mrad to 50 Mrad for electron beams, and preferably 0.5 Mrad to 5 Mrad for γ rays. Before and after the irradiation step, the coating film is dried as necessary to remove the solvent.
このようにして形成された刺激応答性ポリマー層を、必要に応じて洗浄してもよい。グラフト重合後の刺激応答性ポリマー層の表面上には、共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応のモノマーなどが存在していると考えられる。洗浄によれば、これら遊離ポリマーや未反応物を除去することができるので好ましい。ここで、洗浄方法は特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、揺動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄などが挙げられる。また洗浄液としては、典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。 The stimulus-responsive polymer layer thus formed may be washed as necessary. On the surface of the stimuli-responsive polymer layer after graft polymerization, not only polymer molecules immobilized by covalent bonds, but also free polymer molecules that are not immobilized or unreacted monomers are present. Conceivable. Washing is preferable because these free polymers and unreacted substances can be removed. Here, the cleaning method is not particularly limited, but typical examples include immersion cleaning, rocking cleaning, shower cleaning, spray cleaning, and ultrasonic cleaning. The cleaning liquid typically includes various water-based, alcohol-based, hydrocarbon-based, chlorine-based, and acid / alkali cleaning liquids.
上記方法により作製された機能性基体は、非架橋型接着剤層上の剥離層を剥離させ、あらかじめ準備しておいた容器の底部の所定の位置に、接着させて貼付する。機能性基体と容器の底部とを接着させた後は、必要に応じて、エタノール滅菌、エチレンオキサイドガス(EOG)滅菌、紫外線照射滅菌、γ線照射滅菌などの滅菌処理を施す。これらのなかでも、γ線照射滅菌は、全生物種を死滅させられるという点で好適である。このようにして、細胞培養容器を製造することができる。 The functional substrate produced by the above method is peeled off the release layer on the non-crosslinked adhesive layer, and is adhered and adhered to a predetermined position on the bottom of a container prepared in advance. After bonding the functional substrate and the bottom of the container, sterilization treatment such as ethanol sterilization, ethylene oxide gas (EOG) sterilization, ultraviolet irradiation sterilization, and γ-ray irradiation sterilization is performed as necessary. Among these, γ-ray irradiation sterilization is preferable in that all biological species can be killed. In this way, a cell culture container can be manufactured.
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention does not receive a restriction | limiting at all by these description.
[実施例1]細胞培養容器の製造
基材として、ポリスチレンフィルムシート(OPSシート、サンディック社製)を準備した。非架橋型接着剤(Oppanol B10SFN、ポリイソブチレン、BASF社製)をトルエンに溶解させて、非架橋型接着剤層形成用塗工液を調製した。剥離可能な保護フィルムである剥離シート(SP−PET、三井化学東セロ社製)の面上に、乾燥後の膜厚が10μmとなるように、非架橋型接着剤層形成用塗工液をアプリケータにより全面塗工した後、乾燥オーブンを使用して100℃で1分間乾燥させた。そして、ポリスチレンフィルムシートの一方にラミネートし、非架橋型接着剤層が形成された基材を得た。
Example 1 Production of Cell Culture Container A polystyrene film sheet (OPS sheet, manufactured by Sandick) was prepared as a base material. Non-crosslinked adhesive (Opanol B10SFN, polyisobutylene, manufactured by BASF) was dissolved in toluene to prepare a non-crosslinked adhesive layer forming coating solution. On the surface of the release sheet (SP-PET, manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), which is a peelable protective film, the non-crosslinked adhesive layer forming coating solution is applied so that the film thickness after drying is 10 μm. After coating the entire surface with a coater, it was dried at 100 ° C. for 1 minute using a drying oven. And it laminated on one side of the polystyrene film sheet, and obtained the base material in which the non-crosslinked adhesive layer was formed.
次に、N−イソプロアクリルアミドを最終濃度20重量%になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて温度応答性ポリマー層形成用塗工液を作製した。上記ポリスチレンフィルムシートの非架橋型接着剤層を形成した面とは反対側の面上に、温度応答性ポリマー層形成用塗工液をグラビアコートにより全面塗工した後、45℃の熱風乾燥機内を15秒間通過させ、乾燥させた。そして電子線を照射して(電子線照射線量:200kGy)、N−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ポリスチレンフィルムシートの表面にポリ−N−イソプロアクリルアミドを固定化した。その後、32mmφの円形に切り出し、5℃のイオン交換水を用いて洗浄し、乾燥させて、ポリエチレンテレフタレートのフィルム基材の表面に温度応答性ポリマー層が形成された機能性基体を得た。 Next, N-isopropylamine was dissolved in isopropyl alcohol to a final concentration of 20% by weight to prepare a temperature-responsive polymer layer forming coating solution. On the surface opposite to the surface on which the non-crosslinked adhesive layer of the polystyrene film sheet is formed, a temperature-responsive polymer layer-forming coating solution is applied on the entire surface by gravure coating, and then in a hot air dryer at 45 ° C. Was passed through for 15 seconds and dried. Then, an electron beam was irradiated (electron beam irradiation dose: 200 kGy), N-isoproacrylamide was graft-polymerized, and poly-N-isoproacrylamide was immobilized on the surface of the polystyrene film sheet. Thereafter, it was cut into a circle of 32 mmφ, washed with ion exchange water at 5 ° C., and dried to obtain a functional substrate having a temperature responsive polymer layer formed on the surface of a polyethylene terephthalate film substrate.
ディッシュ型の形状を有する容器(図1に示す容器部に相当)を準備した。切り出した機能性基体の剥離シートを剥離し、非架橋型接着剤層の面を容器の底部の上面に接着させ、貼付し、細胞培養容器を製造した。 A container having a dish shape (corresponding to the container part shown in FIG. 1) was prepared. The cut-out release sheet of the functional substrate was peeled off, and the surface of the non-crosslinked adhesive layer was adhered to the upper surface of the bottom of the container and pasted to produce a cell culture container.
1、2、3、4、5、6 細胞培養容器
20 機能性基体
21 基材
22 機能性有機化合物層
30 非架橋型接着剤層
100 容器部
101 底部
102 側壁部
103 開口部
200 容器部
201 底部
202 側壁部
203 天部
1, 2, 3, 4, 5, 6
Claims (2)
前記機能性基体が、基材上に、所定の機能を備えた表面を有する機能性有機化合物層を少なくとも備え、
前記機能性基体と前記底部とを非架橋型接着剤を介して接着させる機能性基体接着工程を含む、前記方法。 A method for producing a cell culture container, comprising a container part comprising at least a bottom part and a side wall part standing on the periphery of the bottom part, and a functional substrate, wherein the functional substrate is adhered to the bottom part of the container part. And
The functional substrate includes at least a functional organic compound layer having a surface having a predetermined function on the substrate,
The said method including the functional base | substrate adhesion | attachment process of adhere | attaching the said functional base body and the said bottom part through a non-crosslinking-type adhesive agent.
The container part further includes a top part joined to the upper end part of the side wall part and disposed opposite to the bottom part, and a capped through hole formed in a part of the side wall part. The method according to claim 1, wherein an inner chamber for containing the culture medium is formed therein.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011244943A JP5957850B2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | Method for producing cell culture vessel |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011244943A JP5957850B2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | Method for producing cell culture vessel |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013099285A true JP2013099285A (en) | 2013-05-23 |
JP5957850B2 JP5957850B2 (en) | 2016-07-27 |
Family
ID=48620619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011244943A Expired - Fee Related JP5957850B2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | Method for producing cell culture vessel |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5957850B2 (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016123335A (en) * | 2014-12-26 | 2016-07-11 | 大日本印刷株式会社 | Cell culture container |
WO2018225329A1 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | 株式会社日立製作所 | Cell culture container, cell culture device and cell culture method |
JP2020003805A (en) * | 2019-08-07 | 2020-01-09 | 大日本印刷株式会社 | Display member, culture vessel and culture vessel kit |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02211865A (en) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Kao Corp | Support material for culturing cell |
JPH1078388A (en) * | 1996-03-22 | 1998-03-24 | Corning Costar Corp | Microplate having ultraviolet ray transmissive bottom part well and manufacture therefor |
JP2000290629A (en) * | 1999-04-02 | 2000-10-17 | Daicel Chem Ind Ltd | Hot-melt adhesive |
JP2002125656A (en) * | 2000-10-26 | 2002-05-08 | Shinatsupusu:Kk | Cell culture container |
JP2004141072A (en) * | 2002-10-04 | 2004-05-20 | Becton Dickinson & Co | Culture flask |
WO2006123570A1 (en) * | 2005-05-17 | 2006-11-23 | Kuraray Co., Ltd. | Cell culture container |
WO2007097120A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Scivax Corporation | Cell culture construct, cell culture container, construct having spheroid, container having spheroid and method of producing the same |
JP2008220320A (en) * | 2007-03-15 | 2008-09-25 | Dainippon Printing Co Ltd | Cell culture support and method for producing the same |
JP2008263863A (en) * | 2007-04-20 | 2008-11-06 | Dainippon Printing Co Ltd | Cell culture support and method for producing the same |
JP2010063439A (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-25 | Dainippon Printing Co Ltd | Production method of cell culture support |
JP2010098979A (en) * | 2008-10-22 | 2010-05-06 | Tokyo Women's Medical College | Cell pattern recovery tool |
-
2011
- 2011-11-08 JP JP2011244943A patent/JP5957850B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02211865A (en) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Kao Corp | Support material for culturing cell |
JPH1078388A (en) * | 1996-03-22 | 1998-03-24 | Corning Costar Corp | Microplate having ultraviolet ray transmissive bottom part well and manufacture therefor |
JP2000290629A (en) * | 1999-04-02 | 2000-10-17 | Daicel Chem Ind Ltd | Hot-melt adhesive |
JP2002125656A (en) * | 2000-10-26 | 2002-05-08 | Shinatsupusu:Kk | Cell culture container |
JP2004141072A (en) * | 2002-10-04 | 2004-05-20 | Becton Dickinson & Co | Culture flask |
WO2006123570A1 (en) * | 2005-05-17 | 2006-11-23 | Kuraray Co., Ltd. | Cell culture container |
WO2007097120A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Scivax Corporation | Cell culture construct, cell culture container, construct having spheroid, container having spheroid and method of producing the same |
JP2008220320A (en) * | 2007-03-15 | 2008-09-25 | Dainippon Printing Co Ltd | Cell culture support and method for producing the same |
JP2008263863A (en) * | 2007-04-20 | 2008-11-06 | Dainippon Printing Co Ltd | Cell culture support and method for producing the same |
JP2010063439A (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-25 | Dainippon Printing Co Ltd | Production method of cell culture support |
JP2010098979A (en) * | 2008-10-22 | 2010-05-06 | Tokyo Women's Medical College | Cell pattern recovery tool |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN7015001763; 'NE-tak 透明N50-Fセパ1090' 技術資料No.393 日栄化工株式会社 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016123335A (en) * | 2014-12-26 | 2016-07-11 | 大日本印刷株式会社 | Cell culture container |
WO2018225329A1 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | 株式会社日立製作所 | Cell culture container, cell culture device and cell culture method |
JP2020003805A (en) * | 2019-08-07 | 2020-01-09 | 大日本印刷株式会社 | Display member, culture vessel and culture vessel kit |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5957850B2 (en) | 2016-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5853512B2 (en) | Cell culture container and manufacturing method thereof | |
JP5942387B2 (en) | Cell culture container and culture cell recovery method | |
WO2013069490A1 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP6011287B2 (en) | Method for producing porous film substrate having functional polymer layer | |
WO2012133514A1 (en) | Culture vessel for forming embryoid body | |
JP5895465B2 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP5957850B2 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP2010063439A (en) | Production method of cell culture support | |
JP6019771B2 (en) | Cell culture method and cell culture vessel | |
JP2008173018A (en) | Method for culturing cell and substrate for cell culture | |
WO2013047655A1 (en) | CULTURE VESSEL FOR iPS CELL | |
JP5998464B2 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP2010119304A (en) | Tool for recovering cell pattern controlled in orientation | |
JP5866983B2 (en) | Cell culture vessel | |
JP6064542B2 (en) | Method for producing cell culture substrate having temperature responsiveness | |
JP5657744B2 (en) | Method for producing cell culture support | |
JP5803597B2 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP5919776B2 (en) | Method for producing cell culture vessel | |
JP6314458B2 (en) | Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same | |
JP6349638B2 (en) | Method for producing cell culture substrate | |
JP2013116073A (en) | Manufacturing method for cell culture vessel | |
JP2016049083A (en) | Manufacturing method of temperature-responsive cell culture substrate having pattern | |
JP6123247B2 (en) | Method for producing cell culture substrate having temperature responsiveness | |
JP6229503B2 (en) | Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same | |
JP6229502B2 (en) | Method for producing cell culture substrate having temperature responsiveness |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140919 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150610 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150630 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150826 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160105 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160331 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160407 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160524 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160606 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5957850 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |