JP2013063041A - サイレンシング抑制因子およびその取得方法 - Google Patents

サイレンシング抑制因子およびその取得方法 Download PDF

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Abstract

【課題】サイレンシング抑制因子を提供する。
【解決手段】高頻度でサイレンシングが起こる系を選抜し、そのサイレンシングを抑制する活性を指標に、ゲノムライブラリーからサイレンシングを抑制するＤＮＡ配列をスクリーニングすることが可能な系。さらに、得られたＤＮＡ配列が、複数の植物で異なった原因で起こるサイレンシングを抑制する活性を持っていることを確認した（なお、このゲノム由来のサイレンシング抑制活性を有するエレメントを、抗サイレンシング領域（Ａｎｔｉ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ＝ＡＳＲ）と称することがある。）。これらの手段により、植物種において、安定した強いサイレンシング抑制効果を示すＤＮＡ配列の同定・単離を行なうことができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、サイレンシングを抑制する因子に関する。より詳細には、転写型遺伝子不活性化の抑制に関する。本発明はまた、サイレンシングを抑制する因子を取得する方法（スクリーニング等）に関する。
外来遺伝子が欠損なく導入されているにも関わらず、それが機能しなくなる遺伝子サイレンシング現象（ジーンサイレンシング、または単にサイレンシングともいい、本明細書では、主としてサイレンシングという）は、遺伝子組換え技術においてしばしば障害となっている。特に、植物における、サイレンシングの一種である転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）は後代に遺伝するため、開発途中の組換え作物でこの現象が起こると、大きな損失となる（例：非特許文献１および非特許文献２）。また、遺伝子組換え技術によって導入された遺伝子の発現は、挿入されたゲノム上の位置に依存してばらつきが生じ（位置効果）、組換え体作製の効率を低下させる。一方、ＴＧＳは「いつ、どの生物（もしくは系統）で起きるか？」が事前に予測できないため、安定して発現する組換え体作製方法開発を研究の対象とすることが難しい。
植物の組換え技術において、ＴＧＳの発生を防ぐ方法として、核マトリクス結合配列（Ｓｃａｆｆｏｌｄ／Ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（Ｓ／ＭＡＲ）） や位置効果を軽減するバリアーインスレーターが利用されている。しかし、これらすべては、生化学的手法や特定遺伝子の構造解析から同定・単離されたものであり、いずれもＴＧＳの発生抑制効果を指標に単離されたものではない。また、動物から単離されたものが大半を占めており、動植物に共通してＴＧＳの発生抑制効果を示す例も僅かに知られているが、ＴＧＳ発生抑制能力の無いものも多く含まれている。更に、植物種から単離されたＳ／ＭＡＲでも、ＴＧＳの発生抑制能を示すものが知られているが、安定しかつ高いＴＧＳ発生抑制能力が得られないため、現在まで実用化されているものはない。
位置効果を抑制するＤＮＡ配列、即ち、バリアーインスレーターは、動物から多数報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。βグロビン遺伝子５’上流で同定されたｃＨＳ４配列（１．２Ｋｂ）は、４種動物における多数の実験系において、位置効果による導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の転写抑制を回避する効果が認められている（２００４年時点ですでに１６の報告が存在している；非特許文献５）。バフンウニのゲノムで単一コピーのアリルスルファターゼ遺伝子には、その５’上流にエンハンサ―遮断効果を有する０．５Ｋｂ配列（ＡｒｓＩ）があり、この配列は、タバコ培養細胞において、ＣａＭＶ Ｐ３５Ｓ（ｃｏｒｅ）：：ＧＵＳを安定的に発現させる（非特許文献６）。一方、生化学的手法や特定遺伝子の構造解析により、多数の動植物から核マトリクス結合配列（Ｓ／ＭＡＲ）が得られている（非特許文献７）。ニワトリのリゾチーム遺伝子座の５’側上流域に存在する５’ＭＡＲやタバコ遺伝子ｒｂ７−５Ａの３’側下流に存在するＲｂ７ ＭＡＲは、４種類の植物において、Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳなどの導入遺伝子の発現レベルを上昇させ、かつ、発現のばらつきを抑制するが、それらの程度は植物種や実験系によって異なる（非特許文献７）。
非特許文献８は、リプレッサーによるプロモーターの抑制に関する文献であり、バリアーインスレーター活性でシールドしていることが示されている文献である。
Ｈａｇａｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．，Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｅ．＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１，４７９−４９０（２００３） Ｍｉｔｓｕｈａｒａ Ｉ．， Ｙａｔｏｕ Ｏ．， Ｉｗａｉ Ｔ．， Ｎａｉｔｏ Ｙ．， Ｎａｗａ Ｙ．， ＆ Ｏｈａｓｈｉ Ｙ．， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， ６３-６９ （２００６） Ｇａｓｚｎｅｒ Ｍ， Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ７：７０３−７１３ （２００６） Ｇｉｌｅｓ ＫＥ， Ｇｏｗｈｅｒ Ｈ， Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ Ｒ， Ｊｉｎ Ｃ， Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏ． ７５：７９−８５ （２０１０）Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．， １−７（２０１０） Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ Ｆ， Ｖａｌａｄｅｚ−Ｇｒａｈａｍ Ｖ， Ｆａｒｒｅｌｌ ＣＭ． Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ． ２６：７９６−８０７ （２００４） Ｎａｇａｙａ Ｓ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ， Ｋａｔｏ Ｋ， Ａｋａｓａｋａ Ｋ， Ｓｈｉｎｍｙｏ Ａ． Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２６５：４０５−４１３．（２００１） Ａｌｌｅｎ ＧＣ， Ｓｐｉｋｅｒ Ｓ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＷＦ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４３， ３６１−３７６ （２０００） Ｋｗａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１， ５５３−５５８．
本発明者らは、高頻度でサイレンシングが起こる系を選抜し、そのサイレンシングを抑制する活性を指標に、ゲノムライブラリーからサイレンシングを抑制するＤＮＡ配列をスクリーニングすることが可能な系を開発した。さらに、得られたＤＮＡ配列が、複数の植物で異なった原因で起こるサイレンシングを抑制する活性を持っていることを確認した（なお、このゲノム由来のサイレンシング抑制活性を有するエレメントを、本明細書において、抗サイレンシング領域（Ａｎｔｉ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ＝ＡＳＲ）と称することがある。）。これらの手段により、植物種において、安定した強いサイレンシング抑制効果を示すＤＮＡ配列の同定・単離を行なうことができる。
以上から、本発明は、例えば、以下を提供する。
（１）
（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；
（ｃ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列；
（ｄ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の配列の一部を含む配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の配列の相補配列；
からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
（２）前記核酸分子は、サイレンシング抑制活性を有する、項目１に記載の核酸分子。
（３）前記配列は、配列番号１、２または３に示す配列を含む、項目１または２に記載の核酸分子。
（４）項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、サイレンシング抑制因子。
（５）項目４に記載のサイレンシング抑制因子を含むベクター。
（６）さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる、項目５に記載のベクター。
（７）さらに、導入されるべき遺伝子が作動可能に前記ＴＧＳ抑制因子に連結されて含まれる、項目５または６に記載のベクター。
（８）さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる、項目７に記載のベクター。
（９）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、遺伝子を導入するための組成物。
（１０）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
（１１）植物細胞である、項目１０に記載の細胞。
（１２）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、植物組織。
（１３）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、植物器官。
（１４）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、植物体。
（１５）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、種子。
（１６）項目５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞、植物組織、植物器官、植物体および／または種子に由来する加工品。
（１７）（Ａ）高頻度でサイレンシングが起こる系を提供する工程；
（Ｂ）該高頻度でサイレンシングが起こる系に、候補核酸を導入する工程；
（Ｃ）該高頻度でサイレンシングが起こる系において、サイレンシングが抑制されるかどうかを決定する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）において、該サイレンシングの抑制をもたらした該候補核酸を選択する工程；
を包含する、サイレンシング抑制因子のスクリーニング方法。
（１８）前記サイレンシングは、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）により生じる、項目１７に記載のスクリーニング方法。
（１９）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）が高頻度で起こる系である、項目１７または１８に記載のスクリーニング方法。
（２０）前記サイレンシング抑制因子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制因子である、項目１９に記載のスクリーニング方法。
（２１）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、前記導入工程（Ｂ）は、前記候補核酸と該プロモーターとを含むベクターを用いて行われることをさらに特徴とする、項目１７〜２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（２２）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、前記（Ｂ）導入工程において使用される導入手法を用いた場合に少なくとも９０％でサイレンシングが起こる、項目１７〜２１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（２３）前記サイレンシングが生じた場合、前記系の個体は発生せず、該サイレンシングが生じない場合、該系の個体が発生する、項目１７〜２２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（２４）前記サイレンシングが生じた場合と、該サイレンシングが生じない場合とで、前記系の表現形が異なる、項目１７〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（２５）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、人工的にサイレンシングを生じさせたものである、項目１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（２６）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、天然にサイレンシングが起きる系である、項目１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（２７）高頻度でサイレンシングが起こる系を備える、サイレンシング抑制因子のスクリーニングを行うためのキット。
（２８）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、該プロモーターを含む候補核酸を導入のベクターをさらに備える、項目２７に記載のキット。
（２９）前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、アグロバクテリウム形質転換系で形質転換した場合に少なくとも９０％導入遺伝子の発現が抑制される、項目２７または２８に記載のキット。
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用され得るものであり、上記特徴は組み合わせて使用されうることが理解される。
なお、従来の例はいずれも、導入遺伝子のサイレンシング（この場合、転写型遺伝子不活性化＝ＴＧＳ）の解除を指標とした、ゲノムＤＮＡの体系的スクリーニングで見つかったのではない。従って、単離された後に、導入遺伝子のＴＧＳ抑制能の有無の研究が開始されたものである。また、植物において、高いサイレンシング抑制効果、特に高いＴＧＳ抑制効果を安定して示すＤＮＡ配列の報告、先行技術はこれまで開示されていない。外来遺伝子をサイレンシングから積極的に防御するこれらのゲノムエレメントを探索することによって得られた本発明は、従来にない格別顕著な効果を奏する発明として評価されるべきである。
本明細書において複数の実施形態が開示されるが、適用可能である限り、それらの実施形態の特徴は組み合わせて用いられうることが理解される。また、本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明から当業者には明らかになる。明らかであるように、本発明は、すべて本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、種々の明白な態様において修飾が可能である。従って、図面および詳細な説明は、実施する場合の例示であるとみなされ、制限を意図するものであるとはみなされない。
本発明により、特に、植物種において、安定した強いＴＧＳ抑制効果を示すＤＮＡ配列が提供され、そのような配列を同定・単離する方法も提供される。
本発明の核酸または因子は、形質転換用ベクターに組込むことで、導入遺伝子のTGSを抑制し安定的に外来遺伝子を発現させることができるようになる。これにより、組換え生物作出のための労力を節約することが可能になると共に、形質転換体であるにもかかわらず導入遺伝子が発現しなくなるという危険性を低減することも可能になる。また、研究用のみならず産業用のベクターとして流通することも考えられる。
図１は、ＴＧＳを防ぐ抗サイレンシング領域（ＡＳＲ）の同定を示す。ａ：ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を有する遺伝子組換えタバコ植物により、ＡＳＲを単離するためのストラテジーを示す概略図。Ｘは、外来遺伝子がサイレンシングを受けていることを示す。ｂ：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター駆動性ＨＰＴ遺伝子の再導入によるｔｒａｎｓ−ＴＧＳ植物の選択。丸の印は、再生中のシュートを示す。Ｍ６６−９植物では、通常得られるべき耐性シュートが見られないことから、３５Ｓプロモーターのｔｒａｎｓ−ＴＧＳによって３５Ｓ：：ＨＰＴ遺伝子が機能しないものと思われる。ｃ，ＡＳＲ候補の単離。矢印は、ＡＳＲ：：ＨＰＴ構築物（ａ，右下）のライブラリーを用いた、３つのスーパー形質転換体（形質転換体に再度別の組換えＤＮＡを導入する形質転換「スーパー形質転換」により得られた個体を「スーパー形質転換体」という。）。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ植物からＰＣＲで増幅したＡＳＲ候補を示す。ＡＳＲ１０２を含む植物は、ASRを含むと思われる高分子のバンドのほかに、空のベクター（Ｖ）と同じサイズのバンドを示したことから、この植物はASR候補配列をもった挿入物とは別に空のベクターの挿入物を有することが示唆された；Ｖは、ライブラリーの構築のために使用したベクターである。 遺伝子の発現を安定化させるDNA配列を単離する方法を示す図である。図１Ａは、ＴＧＳを防ぐ抗サイレンシング領域（ＡＳＲ）の同定：ｐＴＨ４を用いた、ＡＳＲ融合Ｐ３５Ｓ駆動性ＨＰＴライブラリーでのスーパー形質転換後の、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を失った復帰変異体と、ＡＳＲによってｔｒａｎｓ−ＴＧＳの影響をのがれて再生した植物の区別を示す（図２Ａもまた参照のこと）。ａ，ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を有する遺伝子組換えタバコ植物を使用することにより、ＡＳＲを選択するためのストラテジーを示す概略図。スーパー形質転換体植物は、導入されたＰ３５Ｓ：：ＨＰＴ構築物と隣接するＡＳＲによってｔｒａｎｓ−ＴＧＳから保護されたか、または、スーパー形質転換体細胞がそのｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を失った（復帰変異体）かのいずれかの場合に、ハイグロマイシンを含む培地上で再生し得る。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性の喪失は、既存の外来遺伝子（Ｐ３５Ｓ：：Ｃｅｄ９）の再活性化につながるので、この復帰変異体は、指標としてＣｅｄ−９タンパク質を検出することによってスクリーニングから除外され得る。Ｘは、外来遺伝子がサイレンシングを受けていることを示す。詳細については実施例を参照のこと。ｂ，ウェスタンブロッティングによる、既存の外来遺伝子産物の検出。ＴＧＳから復帰した個体（復帰変異体）では、既存の外来遺伝子産物であるＣｅｄ−９タンパク質が検出される。系統の名称については、図１Ａ−ａを参照のこと。ウェスタンブロッティングは、記載されたとおりに実施した（Mitsuhara, I., K. A.Mailk, M. Miura and Y. Ohashi (1999) Curr. Biol. 9: 775-778）。 本明細書では、図２は、図２−１〜図２−４として表示する。図２は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）間の相互作用によって引き起こされるｔｒａｎｓ−ＴＧＳを防ぐＡＳＲ候補の抗サイレンシング活性を示す。図２−１は図２ａを示す。ａ：ＡＳＲ候補が、同じプロモーターのコピー数の増大によって引き起こされるｔｒａｎｓ−ＴＧＳを防ぎ得るかどうかを見るためのストラテジーの概略図。 本明細書では、図２は、図２−１〜図２−４として表示する。図２は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）間の相互作用によって引き起こされるｔｒａｎｓ−ＴＧＳを防ぐＡＳＲ候補の抗サイレンシング活性を示す。図２−２は図２ｂを示す。ｂ：ＡＳＲ候補によるｔｒａｎｓ−ＴＧＳの抑制。プロモーターによって駆動されるＧＵＳ遺伝子の発現に対するＡＳＲの影響を検討した。コントロール植物（ＣＴおよびＣＳＴ）ならびにＡＳＲ候補のうちの１つを含むスーパー形質転換体（ＡＳＲ ＳＴ）のＧＵＳ活性を示す。四角の上下辺は、それぞれ第１・第３四分位数を示す（四角は、四分位範囲、即ち、データの上位２５％に当たる値から下位２５％に当たる値までの範囲を示す）；四角内の横棒は、各群の中央値を表す。なお、データを昇順に並べたとき、小さい方から１／４の所の値を第１四分位値（Ｑ１）、大きい方から１／４（小さい方から３／４）の所の値を 第３四分位値（Ｑ３）という。このとき四分位範囲（Ｉｎｔｅｒ Ｑｕａｒｔｉｌｅ Ｒａｎｇｅ， ＩＱＲ）はＩＱＲ＝Ｑ３−Ｑ１との式で算出することができる。 本明細書では、図２は、図２−１〜図２−４として表示する。図２は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）間の相互作用によって引き起こされるｔｒａｎｓ−ＴＧＳを防ぐＡＳＲ候補の抗サイレンシング活性を示す。図２−３は図２ｃを示す。ｃ：ＡＳＲ候補ＡＳＲ６０２によるプロモーター内のＤＮＡメチル化の抑制。コントロールスーパー形質転換体（ＣＳＴ）およびＡＳＲスーパー形質転換体（ＡＳＲ６０２ ＳＴ）におけるＧＵＳ構築物のプロモーター領域を調べた。各レーンは、同じスーパー形質転換体を表す。／の右と左の数字は、それぞれ、全植物の数と、メチル化されたプロモーターを有する植物の数である。 本明細書では、図２は、図２−１〜図２−４として表示する。図２は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）間の相互作用によって引き起こされるｔｒａｎｓ−ＴＧＳを防ぐＡＳＲ候補の抗サイレンシング活性を示す。図２−４は図２ｄを示す。ｄ：ＡＳＲ６０２によるｔｒａｎｓ−ＴＧＳの抑制。既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣ挿入物の活性を、ＣＳＴおよびＡＳＲ６０２ＳＴに関するスーパー形質転換体Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子の活性に対してプロットした。全体，調べた全ての植物；１コピー，単一コピーのＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ外来遺伝子の挿入を有する植物。縦軸および横軸はは対数尺であることに留意すること。 本明細書では、図２Ａは、図２Ａ−１〜図２Ａ−２として表示する。図２Ａは、本研究に使用したバイナリーベクター構築物を示す（方法の節もまた参照のこと）。図２Ａ−１では、ｐＴＨ１、ｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳ、ｐＴＨ４、ｐＰ３５Ｓｍ−ＧＵＳおよびｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳを示す。
ｐＴＨ１はｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を示す植物の選択を目的として、ＴＧＳ植物をスーパー形質転換するために用いた。このベクターは、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー領域（Ｅ３５Ｓ）とｐＢＩ１２１のプロモーター領域（Ｐ３５Ｓ）とを有し（Jefferson，R.A.，Kavanagh，T．A．& Bevan，M．W.，EMBO J．6，3901-3907（1987））、その後ろにＨＰＴを有する。ＲＢおよびＬＢ，それぞれAgrobacterium tumefaciens ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの右境界および左境界；Ｅ３５Ｓ，ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの５’上流配列（CaMV 35Sプロモーターの転写開始点から上流側−９４０塩基〜−９０塩基まで（本明細書では３５Ｓ プロモーター等プロモーターの位置の説明の数値は転写開始点からの塩基数を基準として説明する。）；Ｐ３５Ｓ，ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの５’上流配列（−９０〜−１）；ＨＰＴ，ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（選択マーカー）；Ｔｎｏｓ，Ｔｉプラスミド内のノパリン合成遺伝子（ｎｏｓ）のポリアデニル化シグナル；ＴｅｔＲ，大腸菌や中間宿主であるアグロバクテリウム内で働くテトラサイクリン耐性マーカー遺伝子。
ｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳは、別のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター駆動性構築物として用い、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ植物Ｍ６６−９のｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性の確認に用いた。この構築物におけるＧＵＳ発現カセットは、７コピーのＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー（Ｅ７）とＰ３５Ｓを含んでいた。Ｐｎｏｓ：：ＮＰＴＩＩ，カナマイシンに対する抵抗性を付与するｎｏｓプロモーター駆動性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（選択マーカー）；Ｅ７，ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの５’上流配列（−９４０〜−２９０）および（−２９０〜−９０）×７；Ω，ＴＭＶの５’非翻訳配列；Ｉｎ，ファセオリン遺伝子の第一イントロン；ＧＵＳ，β−グルクロニダーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）；Ｔ３５Ｓ，ＣａＭＶ ３５Ｓ転写産物のポリアデニル化シグナル。
ｐＴＨ４は、ＡＳＲスクリーニングを目的としたゲノムライブラリーの作製のために使用した。このベクターは、２コピーのＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー（Ｅｌ）とＰ３５Ｓを含んでいる。Ｅｌ，ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの５’上流配列（−４１９〜−９０）。
ｐＰ３５Ｓｍ−ＧＵＳは、ＡＳＲ候補がエンハンサー活性を有するかどうかを調べるために使用した。この構築物は、転写開始点から−４６塩基までの ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーター領域を有する（Jefferson，R.A.，Kavanagh，T．A．& Bevan，M．W.，EMBO J．6，3901-3907（1987））。
ｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳは、ＬＵＣタバコ植物（ＮＷ７−２４−４；Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））のスーパー形質転換のために使用した（図２ａ）。この構築物は、２コピーのＥｌとＰ３５Ｓとを有する。斜線の横棒は、そのメチル化状態がメチル化感受性制限酵素による消化後のＰＣＲアッセイによって分析される領域を示す。この斜線の横棒を挟む２つの矢印（ｐＢＩ−Ｈｉｎｄ３−５１およびＧＵＳＩ３）は、ＰＣＲアッセイに用いたプライマーセットがアニールする部位を模式的に示している（表３）。
本明細書では、図２Ａは、図２Ａ−１〜図２Ａ−２として表示する。図２Ａは、本研究に使用したバイナリーベクター構築物を示す（方法の節もまた参照のこと）。図２Ａ−２は、ｐＢＩ−ＦＷＡおよびＡＳＲ含有ｐＢＩ−ＦＷＡを示す。
ｐＢＩ−ＦＷＡおよびＡＳＲ含有ｐＢＩ−ＦＷＡは、ＡＳＲがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＦＷＡ外来遺伝子のサイレンシングを防ぐかどうかを調べるために使用した。ｐＢＩ−ＦＷＡ内にクローニングしたＦＷＡ領域の５’末端部分をＡＳＲ６０２配列で置き換え、ＡＳＲ６０２含有ｐＢＩ−ＦＷＡを得た。両方のＦＷＡ構築物はＦＷＡ遺伝子の５’タンデムリピート（５’ＴＲ）を含み、これは、新規ＤＮＡメチル化を誘導するために必要十分である（Chan et al., PLoS Biol. 4: e363, 2006）。
図３は、ＦＷＡ外来遺伝子のサイレンシングとＡＳＲ６０２による抑制を示す。遺伝子発現を安定化させるＤＮＡ配列ＡＳＲ６０２は、他種植物および他種プロモータ―においてＴＧＳを抑制する。ａ：ＦＷＡ形質転換体Ｃｏｌ株（ＦＷＡ）およびＡＳＲ６０２融合ＦＷＡで形質転換したＣｏｌ株（ＡＳＲ＋ＦＷＡ）。ｂ：ＦＷＡ形質転換体およびコントロール形質転換体（ベクターのみ）における開花時間。ベクター，ベクターのみで形質転換したＣｏｌ株。（遅い開花は、ロゼット葉の数を増加させる。）ベクター，ｎ＝１１；ＦＷＡ，ｎ＝１１７；ＡＳＲ＋ＦＷＡ，ｎ＝１４。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。**Ｐ＜０．０１；ＮＳ，有意差なし。 図３Ａは、ＡＳＲ６０２と類似するＬｏｔｕｓＤＮＡ配列の染色体分布を示す。ａ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｌｏｔｕｓ／ｃｌｏｎｅｌｉｓｔ．ｈｔｍｌにおけるアクセッション番号の総数に対する、ＡＳＲ６０２様配列を含む配列のアクセッション番号の割合。「ＡＳＲ６０２様配列を有するコンティグ」は、１以上のＡＳＲ６０２様配列を含む配列のアクセッション番号からなる。「ＡＳＲ６０２様配列を有さないコンティグ」は、ＡＳＲ６０２様配列を含まない配列のアクセッション番号からなる。ｎは、各染色体に割り当てられたか、またはマッピングされていないコンティグとして分類されたアクセッション番号の数である。ｂ，ＡＳＲ６０２に類似する配列を、１センチモルガン（ｃＭ）間隔でＬ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓの遺伝子マップ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｌｏｔｕｓ／ｃｌｏｎｅｌｉｓｔ．ｈｔｍｌ）上にマッピングした。類似配列を見つけるために、デフォルト条件による「ｂｌ２ｓｅｑ」検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおける、２つの配列を整列させるための専用のＢＬＡＳＴ）を、ＡＳＲ６０２配列をクエリーとして、そして、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｌｏｔｕｓ／ｃｌｏｎｅｌｉｓｔ．ｈｔｍｌにおける各アクセッション番号を対象として用いて使用した。同定したＡＳＲ６０２様配列を、対象として用いたアクセッション番号のマップ位置（ｃＭ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｌｏｔｕｓ／ｃｌｏｎｅｌｉｓｔ．ｈｔｍｌ）にプロットした。黒丸，Ｅ値＜１０−２０；白丸，Ｅ値＞１０−２０。 図４は、ＡＳＲ含有レトロトランスポゾン様配列（ＡＳＬ）を示す。ａ，Ｔｎｔ１（タバコ，Ｘ１３７７７）、ｃｏｐｉａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｘ０２５９９）およびＡＳＬの構造を示す。縞模様の四角は、レトロトランスポゾンがしばしばその両端にもつ長鎖末端反復配列（ＬＴＲ＝ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）様の配列を示す。ＡＳＬ１では、核酸結合タンパク質（ＮＡＢ）、プロテアーゼ（ＰＲＯ）遺伝子およびインテグラーゼ遺伝子（ＩＮＴ）の一部に対応する配列が欠失している。ＰＢＳ，プライマー結合部位；ＺＦ，ジンクフィンガードメイン；ＲＶＴ、逆転写酵素；ＲＨ，ＲＮａｓｅ Ｈ；ＰＰＴ，ポリプリン領域。ｂ，Ｔｎｔ１（Ｐ１０９７８）、ｃｏｐｉａ（Ｐ０４１４６）およびＡＳＬの逆転写酵素ドメイン間のアミノ酸の類似性。Ｔｎｔ１およびｃｏｐｉａのアミノ酸位置（括弧内）は、アクセッション番号の配列において使用されるものを示す。 本明細書では、図４Ａは、図４Ａ−１〜図４Ａ−２として表示する。図４Ａは、ＡＳＲ６０２含有レトロトランスポゾン様配列（ＡＳＬ）を示す。図４Ａ−１は、図４Ａａを示す。ａ：Ｔｎｔ１（タバコ，Ｘ１３７７７）、ｃｏｐｉａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｘ０２５９９）およびＡＳＬの構造（図４も参照のこと）を示す。陰影のついた四角は、挿入物を示す；異なる陰影のパターンは、異なる配列を表す。 本明細書では、図４Ａは、図４Ａ−１〜図４Ａ−２として表示する。図４Ａは、ＡＳＲ６０２含有レトロトランスポゾン様配列（ＡＳＬ）を示す。図４Ａ−２は、図４Ａｂを示す。ｂ：８つのＡＳＬにおけるＡＳＲ６０２およびＡＳＲ６０２様配列のＤＮＡ配列アラインメント。これらの８つのＡＳＬを同定するための手順は以下のとおりである：まず、本発明者らは、ＡＳＲ６０２のＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイト上でのＢＬＡＳＴＮ分析（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のためのクエリー配列として用い、「Ｄａｔａｂａｓｅ」を「Ｏｔｈｅｒｓ（ｎｒ ｅｔｃ．）」に設定したことを除いてデフォルトの条件を用いて、Ｅ値に基づき、ＡＳＬを含むアクセッション番号のリストを得た。次に、本発明者らは、２０番目のＥ値を持つＡＳＬ、または、２０番目の値未満のＥ値を有する全ＡＳＬを探すために、「上から２０番目まで」のアクセッション番号の配列データを使用した。第三に、このようなＡＳＬ（Ｅ値≦２０番目のＥ値）において、本発明者らは、標的部位の重複(target site duplication)を持つＬＴＲ対の間に挟まれたＡＳＬを探索した。 図５は、サツマイモにおいてＡＳＲ６０２はＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子の発現変動性を抑制することを示す。左上および右上は、それぞれＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子のみを形質転換したサツマイモカルス（ＡＳＲ６０２無し）を示す。多数のＧＵＳが発現していない細胞が認められる。ＧＵＳ発現細胞は数も少なく、発現程度のばらつきも大きいことが観察される。中央下は、ＡＳＲ６０２を融合させたＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子を形質転換したサツマイモカルスを示す。カルスの全体でＧＵＳが高発現していることが観察される。 図６は、コントロール（ｐＭＬＨ２１１３）とＡＳＲ６０２およびＡＳＲ５０１をもつ発現ベクター（ｐＭＬＨ２１１３＋ＡＳＲ６０２， ５０１）との間でのＧＵＳの発現の比較を示す。図６に示すように、ＧＵＳを全面で発現しているカルスの割合は、ＡＳＲ６０２およびＡＳＲ５０１を持つベクターを使用した場合において、それぞれ、コントロールに比べてカイ自乗検定で統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に増加しており、サイレンシング抑制効果がサツマイモで生じていることを実証する。サツマイモの胚由来のカルスをＡＳＲを持つないしは持たない改変３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ融合遺伝子をもつＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換した。形質転換された細胞は薬剤耐性によって選抜されて細胞塊を形成する。この時従来型のＡＳＲを持たない導入遺伝子で形質転換された場合は、多くの細胞塊でＧＵＳ遺伝子が発現しない細胞の割合が徐々に高いことから、かなりの頻度で３５Ｓプロモーターのサイレンシングが起きていると考えられる。一方、ＡＳＲを含む導入遺伝子をもつ細胞塊では、全体の細胞がＧＵＳを発現している割合が高く、ＡＳＲによってサイレンシングが抑制されていると考えられる。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞等の用語（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含みうる。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzeret al.、Nucleic Acid Res．19：5081(1991)；Ohtsuka et al.、J．Biol．Chem．260：2605-2608(1985)；Rossoliniet al.、Mol．Cell．Probes 8：91-98(1994)）。本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子などを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、それらが遺伝的機能を示す場合は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常ゲノム上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含するが、本明細書では通常は構造遺伝子をさす。ただし、文脈に応じて、遺伝子は、構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含しうる。本明細書では、「遺伝子」は、物質としての「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現されたタンパク質、ポリペプチド等のほか、産物として「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を包含しうる。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能、例えばサイレンシング抑制因子またはプロモーター等の機能を果たす限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．２５ （２０１１年５月１０日発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において、「対応する」ヌクレオチドとは、ある核酸分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となる核酸分子またはポリヌクレオチドにおける所定のヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドをいい、サイレンシング抑制因子またはプロモーターにあっては、サイレンシング抑制因子またはプロモーター作用において、同様の寄与をするヌクレオチドをいう。サイレンシング抑制因子またはプロモーターであれば、そのサイレンシング抑制因子またはプロモーターの特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、核酸結合タンパク質（ＮＡＢ）、プロテアーゼ（ＰＲＯ）遺伝子およびインテグラーゼ遺伝子（ＩＮＴ）、ＡＳＲ含有レトロトランスポゾン様配列（ＡＳＬ）等）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。「オルソログ（ortholog）」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous gene）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。したがって、本発明は、本発明において具体的に同定された配列に対応する他の生物において「対応する」遺伝子もまた、本発明の範囲内にあることが理解される。オルソログは、通常別の生物・ウイルス株において、もとの生物・ウイルス株と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。したがって、例えば、ある植物のトランスポゾンの遺伝子に対応する遺伝子は、他の植物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、本発明のスクリーニング方法を用いて同定することができ、同定した遺伝子をもとにさらに検索することもできる。したがって、例えば、ある植物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその植物（例えば、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」、「一部」または「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、挿入改変体、欠失改変体、短縮（truncated）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加、挿入および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加、挿入および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Mark Zoller and Michael Smith，Methods in Enzymology，100，468-500(1983)）が挙げられるが、この他にも通常ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。このような核酸はまた、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において使用される核酸分子は、目的とするサイレンシングの抑制等を達成する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加、挿入および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、挿入されること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加、挿入および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在しうる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、サイレンシング抑制機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、プロモーター、サイレンシング、サイレンシングの抑制等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、サイレンシング抑制機能を有するこれらの核酸分子またはポリペプチド自体の機能のほか、生物学的機能としては、例えば、レトロトランスポゾン活性等、これらの具体的な機能と直接的または間接的に関連する機能（例えば、サイレンシング因子との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、プロモーター、サイレンシング、サイレンシングの抑制など）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、本明細書の記載に基づき、本発明のスクリーニング方法または当該分野において周知の技術によって測定することができる。このような「活性」は、サイレンシング抑制についていえば、例えば、サイレンシングで抑制されるべき遺伝子の表現形について、その表現形の有無を確認することのほか、他の手法、例えば、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標により測定することができる。また、尺度としては、活性の測定方法に応じて適宜使用することができ、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能を尺度として測定することができる。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」または「抑制」とは、交換可能に使用され、ある因子（すなわち、発現抑制因子（発現抑制剤））を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。したがって、本明細書において「発現」（の）「抑制」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳が抑制されることをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。一般に、サイレンシングが生じる場合には、目的とする遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの発現が減少する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。したがって、本明細書において「発現」（の）「増加」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳が増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。一般に、サイレンシングの抑制が生じる場合には、目的とする遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの発現が増加する（別の言葉で表現すれば、サイレンシングによって減少すべきところが、サイレンシングのない状態に回復するとも言いうる）。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。転写の有無の判定には、このような特異的発現の有無を調べる系を用いてもよい。
本明細書において「相補配列」または「相補体」とは、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列またはその分子等の実体を示す。本明細書では、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドはその相補塩基の配列からなる第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）との対、またはＣとＧとの対である。本願明細書では、「相補（体）」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用することがある。これらの用語は、その配列のみに基づいて、ポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実として結合状態にある具体的な対を指すものと解釈されるものではない。
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Tijssen(Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第２章 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier，New York）に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd ed．，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1〜38、DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University Press(1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度のストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Sambrook et al．，Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor，N，Y．1989)；およびAnderson et al．、Nucleic Acid Hybridization：a Practical approach、IV、IRL Press Limited(Oxford，England)．Limited，Oxford，Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Anderson et al．，Nucleic Acid Hybridization：a Practical Approach、第４章、IRL Press Limited（Oxford，England）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（％G+C）−600/N-0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Suggsら、Developmental Biology Using Purified Genes、683頁、BrownおよびFox(編)(1981)を参照のこと)。
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、サイレンシング抑制因子等の設計において参照される。相同性があるもの（改変体）は本明細書において「ホモログ（相同体）」という。
本明細書において「因子」（agent）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよく、場合により「剤」ともいう。そのような意図する目的としては、例えば、サイレンシング抑制等を挙げることができる。そのような物質としては、例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＲＮＡのようなＲＮＡを含む）のほか、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などでもあり得、これらの複合分子も挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性（例えば、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、約９９％以上等の配列同一性）をもって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域等転写に関連する領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明において、目的とする生物学的な活性、例えば、サイレンシング抑制活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そしてなおさらにより好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味し、その対象物を天然物から区別するために用いられる。
本明細書で使用される「ベクター」、「組み換えベクター」、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用され、「ベクター」、「組み換えベクター」、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入（導入ともいう）させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび導入または組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に導入または組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「ベクター」、「組み換えベクター」、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、バイナリーベクター、アグロバクテリウムベースのベクター、プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本明細書において「植物発現ベクター」は、植物において発現を駆動するベクターをいい、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の制御配列が宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。
植物発現ベクターは、好ましくは、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。作動可能に連結させるためには、目的とする機能（遺伝子発現、サイレンシング抑制）が発揮される限り、どのような位置関係、距離であってもよいことが理解される。距離については、例えば、配列番号１の配列でＦＷＡの系で行う場合、サイレンシング抑制因子の位置は、転写開始点の５’上流側の１．０ｋｂ〜１．２ｋｂが代表例として挙げられるがそれに限定されない。また、例示的な例を挙げると、ＦＷＡ転写開始点をまたいで存在する約４５０ｂｐのダイレクトリピート配列の存在が、ＦＷＡのサイレンシングを生じさせるには必要十分である、ということが判っており（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ４（１１）：ｅ３６３． （２００６））、このような情報を用いて、適宜作動可能な連結の配置を調整することができる。
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、Jefferson et al. (Jefferson,R.A., Burgess,S.M. and Hirsh,D. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83, 8447-8451; Jefferson,R.A., Klass,M., Wolf,N. andHirsh,D. (1987) J. Mol. Biol., 193, 41-46. and The EMBO Journal vol.6 no. 13pp.3901 -3907, 1987)のpBI121を基にしたバイナリーベクター、pBE2113（例えば、pBE2113-GUS）, pBE7133、ｐE2113,pE7133 (Mitsuhara et al., Plant CellPhysiol. 37(1): 49-59 (1996)),pEl2Omega（pEl2Ω） (Ohtsubo et al., Plant Cell Physiol. 40(8): 808-817(1999)), pMLH7133 (Mochizuki et al., Entomologia Experimentalis et Applicata93: 173-178, 1999.)（これらは、改変35Sプロモーターを用いて目的の遺伝子を駆動するようにされている。）、pMLH2113-GUSにASRを挿入したもの、pTNシリーズ（例えば、pTN1,2 (Fukuoka et al., Plant Cell Reports (2000), 19:815-820)）等の空ベクターにASRを挿入して、自前の発現カセット（プロモーター＋目的の遺伝子）を挿入したもの、pANDA（奈良先端大学院大学島本教授より分譲、MikiD, Itoh R, and Shimamoto K (2005)， Plant Physiol. 138: 1903-1913）、pBE7133-GUS-Hygro（pE7ΩIGUS-Hygro）、pPZP2H-lacを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「作動可能に連結」（operably linked）とは、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいい、プロモーター等の転写翻訳調節配列または翻訳調節配列についていう場合、所望の配列の発現（作動）がその転写翻訳調節配列または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はなく、必ずしも上流でなくてもよい。したがって、本明細書において「作動可能に連結」はまた、導入（されるべき）遺伝子についていう場合、適切な条件下（例えば、プロモーター、エンハンサー等の調節配列が機能する条件下）で、その遺伝子の転写または発現が実現するように配置されることをいう。通常、プロモーターとの関係では、導入（されるべき）遺伝子の遺伝子コード領域はその下流に配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はなく、必ずしも下流でなくてもよい。距離は向き・位置が効果の有無に影響するとは想定されておらず、例えば、１０ｋｂ程度離れていても、逆向きでも、プロモーターの上流でも下流でも、抑制効果を示すと期待される。例えば、ベクター中にサイレンシング抑制因子が存在することによって、導入されるべき遺伝子の発現に対するサイレンシングが抑制されるような態様もまた、この作動可能な連結の状態に含まれる。また、作動可能に連結は、サイレンシングの作用を妨害しないということでもある。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。本発明では、プロモーターは単数使用されても良く、複数のプロモーターが使用されても良い。複数のプロモーターが使用される場合、同じベクターに含まれていても良い。プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、目的とする植物の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。本明細書において、「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。本明細書において「植物プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridge，1985，Plant Cell Rep．4，355)、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Guilley，1982，Cell 30，763）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Odell，1985，Nature 313，810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang，1991，Plant Cell 3，1155）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Cornejo 1993，Plant Mol．Biol．23，567）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Mitsuhara，1996，Plant Cell Physiol．37，49）などを用いることができる。あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhr，1986，Pro．Natl．Acad．Sci．USA 83，2358）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Aguan，1993，Mol．Gen．Genet．240，1）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Van Breusegem，1994，Planta 193，57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1406）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert，1989，EMBO J．8，651）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。本発明で用いられるプロモーターは、サイレンシング抑制機能が達成される限り、どのようなタイプのプロモーターであっても利用することができることが理解される。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに導入されまたは組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。特に、本発明の高頻度にサイレンシングが起きる系において用いられる場合は、サイレンシングが起きると薬剤耐性が付与されず、発生しなくなるように系を構築することができる。
本明細書において遺伝子の「導入」または「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換等は、互換可能に使用されうる。このように「導入」される遺伝子は、本明細書において「導入遺伝子」または「導入されるべき遺伝子」という。そのような導入遺伝子としては、有用物質（医薬、色素、芳香成分など）生産遺伝子、植物生長制御（促進/抑制）遺伝子、糖代謝関連遺伝子、耐病虫害性〔昆虫食害抵抗性、真菌（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など〕遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、光障害、紫外線）抵抗性関連遺伝子、形態（形、大きさ、器官の数など）等が挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F．A．ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY；Sambrook Jら(1987)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed．およびその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、周知のアグロバクテリウム法のほか、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子または遺伝子などとは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子または遺伝子などをいう。本発明のサイレンシング抑制の対象は、通常外来の核酸分子または遺伝子でありうる。外来の核酸分子は、ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。ある実施形態では、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない場合もありうる。遺伝子導入ベクター内に含まれる外来の核酸分子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、目的（例えば、薬剤耐性、開花遅延）を果たす核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」について言及するとき、「活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」によって実現される任意の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Nagelらの方法（Microbiol．Lett．，67，325(1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、タバコ、イネなどの外植片ないしカルスにアグロバクテリウムを感染させる方法で形質転換させる場合、例えば、必要に応じて、このような植物細胞を、シュート形成培地上で芽を再分化させた後、ホルモンフリーのＭＳ培地などで培養して発根させればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる（なお、シロイヌナズナにin planta法で形質転換する場合、花の中での次世代植物の受精と並行して形質転換が行われるので、再分化のステップは不要である）。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Fujimura，1995，Plant Tissue CultureLett．2，74）、トウモロコシ（Shillito，1989，Bio/Technol．7，581、Gorden-Kamm，1990，Plant Cell 2，603）、ジャガイモ（Visser，1989，Theor．Appl．Genet．78，594）、タバコ（Nagata，1971，Planta 99，12）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、文献（例えば、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet．2002 Dec;32 Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「細胞」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、植物について用いられる場合、植物の任意の細胞を意味する。本明細書では植物細胞は、任意の植物細胞であり得る。植物細胞の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
本明細書において「植物」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、サイレンシングが起きる可能性のある任意の植物を意味する。
本明細書において「組織」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、形態、機能の面で同じ細胞の集まりを意味する。
本明細書において「器官」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、生体の分化した構造物であり、種々の細胞および／または組織からなる特別な機能に適応しているものをいう。
本明細書において「植物体」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、農林水産植物の個体をいう。通常、植物体は、複数の器官から構成されているが、単数の器官で構成されていてもよい。特に区別しない場合は、文脈によって「植物体」は「植物」と称することもある。また、植物体には、広義には種子が包含されうる。
本明細書において「種子」とは、当該分野で使用されるのと同様の意味で用いられ、発芽して新しい植物体を形成する胚を含む受精胚珠をいう。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞または植物は、形質転換体であってもよい。なお、本明細書では、形質転換体に再度別の組換えＤＮＡを導入する形質転換を「スーパー形質転換」という。また、スーパー形質転換により得られた個体を「スーパー形質転換体」という。
本明細書において「加工品」とは、本発明の細胞、植物組織、植物器官、植物体、種子から何らかの加工を経て得られる任意の生成物をいう。そのような加工品としては、例えば、食品、医薬品などを挙げることができるが、それらに限定されない。これらの加工品は、目的とするサイレンシング抑制機能が達成されて得られたものであることから、本発明の生物学的機能に密接に関連する物（ｐｒｏｄｕｃｔ）であるということができる。
本明細書において「サイレンシング」または「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「サイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）、トウモロコシ等で見られるパラミューテション、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）、転写後型ジーンサイレンシング（ＰＴＧＳ）などが挙げられる。このように、理論に束縛されることを望まないが、サイレンシングは、植物に遺伝子（プロモーター＋コード領域＋転写終結シグナル）を形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）しても、発現すべきタンパク質が発現しない、あるいは、はじめは発現していたのに後で発現しなくなる現象ということができるところ、サイレンシングにはいくつかのメカニズムがあると考えられる。サイレンシングは、例えば、“形質転換によって植物に導入する遺伝子の塩基配列”に対して、相同性を有する配列に生ずるサイレンシング、すなわち、相同性依存型ジーンサイレンシング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＨＤＧＳ）と、“形質転換によって植物に導入する遺伝子の塩基配列”に依存しないサイレンシング、の２つに分類することができる。また、サイレンシングを、メカニズムの異なる観点から分類すれば、転写が抑制されている結果、タンパク質ができない、すなわち、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ （ＴＧＳ）と、転写はされるが、転写産物（ｍＲＮＡ）が分解されることにより、タンパク質ができない（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ， ＰＴＧＳ）の２つに分類する事が出来る。前記した２通りの分類の関係を整理すれば、次の通りである；（１）「ＨＤＧＳ」と（２）「ＨＤＧＳでないサイレンシング」；そして（１）は、さらに、（１）（ａ）「ＴＧＳ」と（１）（ｂ）「ＰＴＧＳ」に分けられる。また、（２）“ＨＤＧＳでないサイレンシング”は“転写が抑制されている結果、タンパク質ができないサイレンシング”であることが知られているため、（２）「ＨＤＧＳでないサイレンシング」は、本明細書にいうｃｉｓ−ＴＧＳのカテゴリーに分類され、他方で（１）（ａ）狭義の「ＴＧＳ」は、本明細書にいうｔｒａｎｓ−ＴＧＳのカテゴリーに分類される。このうち、ｃｉｓ−ＴＧＳを抑制する配列は色々知られている（バリヤーインスレーター等）。本発明は、特に、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを抑制する配列をもスクリーニングすることができ、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳをも抑制する活性を有する配列を提供した点が従来では見出すことができなかった点の一つであるといえる。植物における導入遺伝子の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＨＤＧＳ）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物が本来有する遺伝子制御機構であると考えられる。「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、遺伝子コード領域のホモロジーによって起こるものとして「ＰＴＧＳ」が挙げられるが、その他にプロモーター間のホモロジーに依存して転写型ジーンサイレンシング（ＴＧＳ）が起こる例もある。
本明細書において「転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）」とは、サイレンシングの一種であり、転写段階で導入した遺伝子が不活性化されることをいう。この不活性化の原因としては、主にプロモーター領域がメチル化されることが原因とされているが、必ずしもメチル化の有無とサイレンシングが相関しない例も報告されており、その詳細な機構は不明である。
本明細書において「シス（ｃｉｓ）−転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）」とは、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）の一種であり、同一染色体上の近傍からの影響による不活性化をいう。したがって、ｃｉｓ−ＴＧＳでは、（不活性化因子が）該当する遺伝子の近傍になければ転写が制御されない。
本明細書において「トランス（ｔｒａｎｓ）−転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）」とは、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）の一種であり、ｃｉｓ−ＴＧＳ以外の任意のＴＧＳをいう。したがって、本明細書では、トランスとの用語は、そのゲノムのどこにでもという意味を包含しうる。代表的には、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳは、異なった染色体間の不活性化、あるいは同一染色体領域間であれば、塩基配列相同性に基づく不活性化を含む。したがって、また、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳは、相同性依存型ジーンサイレンシングの一形態としても理解されうる。すなわち、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳには、ある特定の配列あるいはこれと高い相同性を有する配列を有するプロモーターからの転写のみが特異的にサイレンシングされる形態が含まれる。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳは、制御すべき遺伝子のそばに存在することも有りうるが、そばになくても別の染色体に有っても機能しうる。１つの実施形態では、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳは、プロモーターの塩基配列あるいはその相同性に依存する点で、「シス（ｃｉｓ）−転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）」と区別される。ｃｉｓ−ＴＧＳは、プロモーターの塩基配列又はその相同性には依存せず、プロモーターが存在する染色体上の位置に依存するからである。
本明細書において使用しうる別の例示的な手法としては、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳがプロモーター配列特異的なものである場合、サイレンシング抑制が、プロモータあるいは転写物の配列に特異的か否かによって「峻別」する方法を利用することができる。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳがプロモータ配列特異的であれば、その抑制もプロモーター配列特異的に見られるはずであり、他方、ｃｉｓ−ＴＧＳはプロモーター・転写産物（ｍＲＮＡ）の配列にかかわらず起こることから、それに対する抑制もプロモーター・転写産物の配列に依存せずに観察されることになる。加えて、ＰＴＧＳは、転写産物の配列特異的であり、プロモーター配列には依存しないことから、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳとは区別できる。さらには、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳに対する抑制とＰＴＧＳに対する抑制とは、候補配列があった場合とない場合とで、転写物の転写効率（転写物の存在量ではない）をｒｕｎ−ｏｎアッセイ（核ｒｕｎ−ｏｆｆ転写アッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）ともいう。）で比較することによっても区別することができる。
本明細書において、１つの例示的な手法では、互いに相同性の低いプロモーターＰ１およびＰ２のいずれかと、互いに相同性の低い構造遺伝子Ｃ１およびＣ２のいずれかとの４つの組み合わせを有する発現ベクターのそれぞれに候補配列Ｘをつけた場合とつけない場合の８通りを形質転換することにより、Ｘがｃｉｓ−ＴＧＳを抑制しているのか、あるいは、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを抑制しているのか、あるいは、ＰＴＧＳを抑制しているのかを実験的に区別することができる。この場合、前提となるのは、形質転換された細胞において、Ｐ１あるいはＰ２特異的なｔｒａｎｓ−ＴＧＳが働いていることが必要で、もし、それがない場合は、Ｘがｔｒａｎｓ−ＴＧＳを抑制する活性を有していた場合であっても、見かけ上何の効果も見えないことになる。例示的な手法例としては、例えば以下がある。まずＰ１：：Ｃ１、Ｐ１：：Ｃ２、Ｐ２：：Ｃ１、Ｐ２：：Ｃ２の４つの組み合わせの融合遺伝子を作成し、それぞれを植物に導入する。Ｐ１：：Ｃ１、Ｐ１：：Ｃ２の組み合わせでサイレンシングが起こり、ほかでは起きなかった場合、Ｐ１配列に依存したサイレンシング（ＨＤＧＳ）が起きたことになる。プロモーターＰ配列に依存したサイレンシングが起きていることからこれはｔｒａｎｓ−ＴＧＳとみなすことができる。一方、Ｐ１：：Ｃ１、Ｐ２：：Ｃ１でサイレンシングが起き、ほかの組み合わせで起きなかった場合は、Ｃ１配列に依存したサイレンシング（ＨＤＧＳ）が起きたことになる。転写される領域（構造遺伝子）に依存したサイレンシングが起きていることから、これはＰＴＧＳによるものであることが分かる。いずれの組み合わせに関しても同様にサイレンシングが起きる場合、ｃｉｓ−ＴＧＳが起きやすい系であると考えられる。なお、この場合、Ｐ１、Ｃ１などに対するサイレンシングがすでに起こっていることを前提に記載しているが、そうでない場合は、Ｐ１プロモーターに無関係の構造遺伝子Ｃ３をつなげた融合遺伝子を多重導入したり、無関係のプロモーターＰ３でＣ１構造遺伝子を過剰発現させたりすることなどによっても、それぞれに対するｔｒａｎｓ−ＴＧＳやＰＴＧＳを誘発させることができる。
本明細書において、ｃｉｓ−ＴＧＳとｔｒａｎｓ−ＴＧＳとを峻別する方法は種々存在するが、例えば、遺伝的に別の染色体に有っても影響するかどうかを調べ、効果があればｔｒａｎｓ−ＴＧＳであると判断することが想定される。例えば、交配によってヘテロにした時にサイレンシングの原因領域がない染色体でも起こるないしは、再々形質転換を行い導入した遺伝子にも起こればトランスであると判断することができる。
サイレンシング抑制が、プロモータあるいは転写物の配列に特異的か否かによって「峻別」する方法を利用することができる。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳがプロモータ配列特異的であれば、その抑制もプロモーター配列特異的に見られるはずであり、他方、ｃｉｓ−ＴＧＳはプロモーター・転写産物（ｍＲＮＡ）の配列にかかわらず起こることから、それに対する抑制もプロモーター・転写産物の配列に依存せずに観察されることになる。加えて、ＰＴＧＳは、転写産物の配列特異的であり、プロモーター配列には依存しないことから、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳとは区別できる。さらには、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳに対する抑制とＰＴＧＳに対する抑制とは、候補配列があった場合とない場合とで、転写物の転写効率（転写物の存在量ではない）をｒｕｎ−ｏｎアッセイで比較することによっても区別することができる。
本明細書において、１つの例示的な手法では、互いに相同性の低いプロモーターＰ１およびＰ２のいずれかと、互いに相同性の低い転写産物（構造遺伝子）Ｃ１およびＣ２のいずれかとの４つの組み合わせを有する発現ベクターのそれぞれに候補配列Ｘをつけた場合とつけない場合の８とおりを形質転換することにより、Ｘがｃｉｓ−ＴＧＳを抑制しているのか、あるいは、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを抑制しているのか、あるいは、ＰＴＧＳを抑制しているのかを実験的に区別することができる。例えば、ＴＧＳとＰＴＧＳを区別しようとする場合、ＰＴＧＳか否かを知るためにｒｕｎ−ｏｎアッセイをし、転写活性が高ければＰＴＧＳ、顕著に低ければＴＧＳと判断しうる。また、サイレンシングされている遺伝子のプロモータ領域のメチル化状態を調べ、プロモータがメチル化されていればＴＧＳと判断しうる。あるいは、脱メチル化剤（例えば、アザシチジンなど）の処理で、サイレンシングが解除されるかどうかを調べ、ＰＴＧＳは、同処理でもサイレンシングが解除されないことで判断しうる。
本明細書中において「転写後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉによる発現抑制もＰＴＧＳの一種である。
本明細書において「サイレンシング抑制」とは、ある因子（例えば、核酸配列、核酸分子等）について言及するとき、サイレンシングを抑制することをいう。
本明細書において「転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制」とは、サイレンシング抑制の一種であり、導入した遺伝子が転写段階で不活性化することを抑制する（すなわち、サイレンシングによる不活性化が減少するかまたはなくなる）ことをいう。本明細書において「転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制活性」とは、ある因子（例えば、核酸配列、核酸分子）についていうとき、その因子が有する、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）を抑制する活性ことをいう。
本明細書において「サイレンシング抑制因子」とは、サイレンシング抑制活性を有する因子をいう。因子としては、例えば、核酸分子、その複合体等を挙げることができるがそれらに限定されない。サイレンシング抑制因子が導入されているかどうかは、例えば、「サイレンシング抑制因子＋プロモーター＋導入遺伝子」と「プロモーター＋導入遺伝子」とをそれぞれ形質転換した系を対比して、その導入遺伝子の発現のレベルを対比し、導入された遺伝子が、サイレンシング抑制因子が共存する場合により高率で発現されていることを確認することによって、サイレンシング抑制因子であることを確認することができる。サイレンシング抑制（因子）は、本明細書において、抗サイレンシング領域（ＡＳＲ）と同義で用いられることもある。
本明細書において「高頻度」にサイレンシングが起こるとは、サイレンシング事象が頻繁に起きることをいう。「高頻度」は、本発明のスクリーニングの目的に関して通常、サイレンシングが５０％以上の確率で起こることをいい、好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上などであり得る。なお、復帰変異体が生じる率をエスケープ率と称すると、１００％−エスケープ率＝サイレンシング率と算出することができる。サイレンシングの「高頻度」は、ある特定のプロモーターについての「高頻度」であってもよい。実際のスクリーニングでは、例えば、３０００個の形質転換シュートが得られるはずの規模でライブラリーを導入して、３０個のシュートが得られ、うち２７個は復帰変異体であったとすると、結果的にＴＧＳ活性を失ったものを濃縮しているとどうかに拘わらず、通常の形質転換では３０００個シュートが出てくるところを、２７個の復帰変異体しか出てこなかった（３個はＡＳＲ活性によって発現が確保された目的の形質転換シュート）と考えることができる。そうするとサイレンシングによって形質転換効率が９９％以上抑制されたといえることになる。この例の場合、実施例等で使用したタバコ形質転換体Ｍ６６−９の場合でのサイレンシング頻度（仮にＸ％）の算出手法を示す。
代表的な例として、通常であれば３０００個体が得られる条件下（すなわち、サイレンシングが起きなければ３０００個体が得られるはずの条件下）で、復帰変異体が２７個体、および本発明のサイレンシング抑制因子が機能した結果発生した個体が３個体あったとすると、合計３０個体が得られたと判断されうる。この例の場合、生ずるはずの３０００個体の内訳は、（１）サイレンシングが起きなかったため、得られた２７個体と、（２）サイレンシングが起きたために、生じてこなかった２９７０個体と、（３）そしてサイレンシングは起きている個体であるが、本発明のサイレンシング抑制因子が機能した結果、サイレンシングが抑制された（スクリーニングにおけるヒット（当たり）が３個体存在すると判断することになる。他方、実施例でも例示されるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｔｏｐｓｉｓ）でのＦＷＡ遺伝子ゲノミッククローンのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる形質転換系」では、形質転換したＦＷＡ遺伝子ゲノミッククローンは必ずサイレンシングされる（Ｓｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ６：７９１−８０２ （２０００）； Ｃａｏ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｅｎ， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １２：１１３８−４４ （２００２）； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１３３６ （２００４）参照 ）。従って、この場合のサイレンシング頻度は、１００％と算出されることになる。
本明細書において「系」（ｓｙｓｔｅｍ）とは、有機的な関連をもった部分の集まりであって、植物体などの、実験の一単位を形成する実体をいう。本発明において使用されうる系としては、サイレンシングの成否が生死を分けるような形質転換系（Promoter Inverted Repeat(IR）でプロモーター特異的配列の反転反復配列（inverted repeats）を強制発現などによってサイレンシング（ＴＧＳ）を誘導することによって作出できる。）、サイレンシングの成否では生死を分けるものではないが表現形が異なる形質転換系などを挙げることができる。
本明細書において「高頻度でサイレンシングが起きる系」は、サイレンシング抑制因子のスクリーニングを可能ならしめる頻度でサイレンシングが生じる任意の系、例えば、植物体（例えば、天然の植物、形質転換体等）をいう。高頻度でサイレンシングが起きる系は、本明細書における記載をもとに、例えば、例示されるＭ６６−９形質転換体（特許生物寄託センターへの受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１５６（Ｍ６６−９）（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２１５６；受領日２０１１年７月２５日、受託日２０１１年９月１５日）がＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター等のプロモーターからの転写に対するサイレンシング活性（ここでは、ＴＧＳ活性）を有する旨の情報をもとに、当業者はこれと同様の系であって、プロモータＡからの転写に対するＴＧＳを高頻度に起こす系を選択するなど、プロモーター等を適宜置き換えながら作製することができることが理解される。
本明細書において「候補核酸」とは、スクリーニングを行う際にその標的となる核酸をいう。このような候補核酸の供与元としては、任意の遺伝子ライブラリー、あるいはゲノムライブラリー等を用いることができるが、これらに限定されない。
本明細書において、サイレンシングが抑制されるかどうかの「決定」(判定）は、本明細書の記載および当該分野において周知の技術を考慮して、任意の手段によって実現することができ、そのサイレンシングが標的とするプロモーターからの転写が正常に近いレベルで生じたかどうかを判定することによって行なうことができる。
本明細書において、候補核酸の「選択」は、サイレンシングを抑制する活性を有する核酸を選択することをいい、本明細書の記載および当該分野において周知の技術を考慮して、任意の手段によって実現することができる。
本明細書においてプロモーターの「制御下」とは、そのプロモーターの転写促進活性の制御が及ぶことをいう。
本明細書において「導入遺伝子の発現」とは、その導入遺伝子が導入された生物（細胞）内で、転写、翻訳等が生じ予定していた分子が生じ、場合によって予定していた機能が発揮されることをいう。形質転換は、狭義には、導入遺伝子が細胞内のゲノムに組み込まれることをいうところ、その状態のみでは、必ずしも意図した転写等が生じず、予定していた機能が発揮されないこともあることから、形質転換と発現とは厳密には異なるということになる。
本明細書において「導入遺伝子の発現」の「抑制」とは、サイレンシング等の導入遺伝子の発現の抑制環境がない場合に比べて、問題としている状況において発現が減少していることをいう。例えば、そのような抑制としては、抑制がない場合に比べて、５０％、９０％、９９％、９９．９％等の発現レベルの低下があることが挙げられる。
本明細書において、サイレンシングの頻度は、通常の条件に発生すべき個体数で、サイレンシングが生じる条件下でサイレンシングが生じた個体数を除した割合で示される。
本明細書において「通常の条件」とは、野生型の植物、または形質転換などで改変された植物体であっても導入しようとする組換えＤＮＡに対してサイレンシングを起こす頻度が野生型と同等であると考えられる植物に、サイレンシングによる制御を受けることが常態ではない組換えＤＮＡを導入する場合（条件）を言う。したがって、そのような条件は、サイレンシングを受けない条件をいうこともできる。そのような「通常の条件」は当業者には明らかであり、使用する系によって適宜決定することができる。例えば、タバコ、アラビドプシス等の場合は、以下を例示することができる。例えば、タバコにアグロバクテリウムを介したリーフディスク法を用いて３５Ｓプロモーター：：ＧＵＳおよびＮｏｓプロモーター：：ＮＰＴ２遺伝子を導入する場合、通常１外植片当たり１個以上のシュートが形成され、シュートから再分化した個体の半数以上がＧＵＳ活性を有する。（ＧＵＳ活性を持たない個体は、（ｉ）Ｋｍ選抜が不十分で野生型植物が育ったエスケープ、（ｉｉ）遺伝子導入が不完全でＮｏｓ：：ＮＰＴ２が導入されたが、ＧＵＳは入っていないもの、（ｉｉｉ）サイレンシングによるもの（さらにこの中にＴＧＳだけでなくＰＴＧＳによるものが含まれる。また複数コピー導入されている個体は何らかのかたちでサイレンシングを起こしやすい。）。例えば、野生型のアラビドプシスの場合、野生型アラビドプシスに同様の３５Ｓプロモーター：：ＧＵＳおよびＮｏｓ プロモーター：：ＮＰＴ２遺伝子を導入した場合も同様にＫｍ抵抗性を示した個体の過半がＧＵＳ活性を示すが、ＦＷＡおよびＮｏｓプロモーター：：ＮＰＴ２遺伝子を導入した場合、ＦＷＡの発現の結果花芽形成が遅延する個体は原則として現れない。この場合、ＦＷＡ発現個体数／ＧＵＳ発現個体数、ＦＷＡ発現個体数／軽質転換植物数、どちらを取っても発現率は０％、逆にサイレンシング率は１００％とみなすことができる。例えば、サツマイモの場合、サツマイモに３５Ｓプロモーター：：ＧＵＳおよびＮｏｓプロモーター：：ＮＰＴ２遺伝子を導入する場合、薬剤耐性を有するカルスのうち８０％ほどがＧＵＳ活性を示さないもしくは斑状のＧＵＳ染色パターンを示す。この系では、３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒのサイレンシングが高頻度で起きているとみなされ、その割合は８０％程度であると考えられるというように、適宜条件を挙げることができる。
１つの実施形態では、通常の条件は、以下のようにして決定することができる。すなわち、本明細書において「適宜決定する」方法としては、例えば、実施例において例示されるＭ６６−９の場合、３５Ｓプロモーター特異的サイレンシング（実施例の場合ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）がかかっているため、３５Ｓプロモーターでドライブされたハイグロマイシン耐性遺伝子を入れた場合と、例えば、アクチン遺伝子プロモーターで駆動されたハイグロマイシン耐性遺伝子を入れた場合とでは、ハイグロマイシン耐性の個体が出てくる率は、３５Ｓプロモータの場合の方が低くなる。この比率（３５Ｓプロモータの場合の出現頻度／アクチン遺伝子プロモーターの場合の出現頻度）をＸとし、一方、プロモーターの強さによる違いを補正するために、上記ベクターを野生型タバコにそれぞれ入れた場合の出現頻度の比率（３５Ｓプロモータの場合の出現頻度／アクチン遺伝子プロモーターの場合の出現頻度）をＹとすれば、Ｍ６６−９でサイレンシングが起こる率は、（１−Ｘ／Ｙ）と見積もることができる。この場合、Ｍ６６−９および野生型タバコに対する遺伝子の導入頻度およびそれぞれにおける２種のプロモーター活性の比が（サイレンシングが起こっていないとすれば）同一であるとの仮定して計算することができる。
あるいは、別の実施形態では、例えば、Ｍ６６−９の場合、３５ＳプロモーターでドライブされたベクターをＭ６６−９と野生型（目的とするサイレンシング（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）が働いていないと考えられる系統）にそれぞれ導入した場合に、出現するハイグロマイシン耐性個体の出現頻度の比を１から引いたものとして頻度を算出することができる。
以上から、例えば、Ｍ６６−９の場合、通常の条件とは、野生型のタバコに３５Ｓ：：ＨＰＴを導入してハイグロマイシン抵抗性個体が得られる条件であり、サイレンシングが起きる条件：Ｍ６６−９に３５Ｓ：：ＨＰＴを導入しても形質転換個体が得られる率がごく少ない条件であるということができる。例えば、ＦＷＡの場合、通常の条件とは、シロイヌナズナに３５Ｓ：：ＧＵＳなどを導入して普通にＧＵＳ＋の個体が得られる条件をいい、サイレンシングが起こる条件とは、シロイヌナズナにＦＷＡを導入して花芽分化が遅れる個体はごく少ない条件を言う。例えば、サツマイモの場合、通常の条件とは、３５Ｓ以外のプロモーター可能ならば過去にサツマイモで機能することが確認されているプロモーター、そのようなものが知られていないとしたら、サツマイモ内在性のプロモーターやサツマイモに感染するアグロバクテリウムやＤＮＡウイルスなどサツマイモで機能することが予測されるプロモーターで駆動される外来遺伝子（ＧＵＳなど）を導入してこれらが普通に機能する条件をいう。サイレンシングが起こる条件とは、サツマイモに３５Ｓ：：ＧＵＳを導入しても半分以上の個体でＧＵＳ−ないしは多型化（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）状態となる条件である。
本明細書において「サイレンシングが生じる条件」または「サイレンシングが生じうる条件」とは、サイレンシングが通常よりも高頻度で起きうる任意の条件をいう。
本明細書において「サイレンシングが生じる条件下でサイレンシングが生じなかった個体数」とは、生死の相違を含む表現形の相違の結果、サイレンシングが生じなかった場合に生じる発現形を有する個体の数をいう。
本明細書において「系の個体」が「発生しない」とは、スクリーニングに関して言及するとき、サイレンシングが生じる結果個体が発生しないような系の場合に、サイレンシングが実際に生じた結果個体が発生しないことをいう。
本明細書において「系の個体」が「発生する」とは、スクリーニングに関して言及するとき、サイレンシングが生じる結果個体が発生しないような系の場合に、サイレンシングが実際に生じない結果個体が発生することをいう。
本明細書において「系の表現形が異なる」とは、スクリーニングに関して言及するとき、サイレンシングが生じる結果個体の表現形が異なる系の場合に、サイレンシングが実際に生じた結果と生じていない結果とで異なる表現形の個体が発生することをいう。
本明細書において、「人工的にサイレンシングを生じさせた（もの）」とは、天然ではサイレンシングが生じていない系において、人工的な操作、例えば組換え等によるサイレンシングが生じるものを選抜等を行うことによって作製したものをいう。例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを基本とする発現ベクターを導入した形質転換植物の中から、導入遺伝子がＴＧＳによって不活性化されている系統を選抜し、さらにそれらの中から、再導入した３５Ｓプロモーターが高頻度で不活性化されるサイレンシング活性を持っている１系統を選択することによって「人工的にサイレンシングを生じさせた（もの）」を作製することができる。
本明細書において、「天然にサイレンシングが起きる系」とは、天然で、サイレンシングが起きることが知られている系をいう。例えば、シロイヌナズナ内在性の遺伝子ＦＷＡ （ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＷＡＧＥＮＩＮＧＥＮ）（通常はＴＧＳによって発現が抑制されており、さらに形質転換によって新たに導入した場合も高頻度で不活性化を受ける）を有する系などを挙げることができる。
本明細書において「キット」とは、スクリーニングの目的で使用される場合、スクリーニングに必要な成分等を備えたユニットをいう。キットは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、高頻度でサイレンシングが起こる系等の植物体等の系、候補核酸、プロモーター、プロモーターを含む候補核酸を導入のベクターなど）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、酵素の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
本明細書において「指示書」は、試薬の取り扱い、使用方法、調合方法、作製方法、収縮方法など、スクリーニング法を実施する人、農業技術者などのスクリーニングまたは形質転換等の遺伝子操作を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明のスクリーニング法を実施する手順等を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記されることが好ましい。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、ＰＤＦ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質（例えば、サイレンシング抑制因子）などを、特定の操作および／または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた物質（例えば、サイレンシング抑制因子）またはその候補もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J．et al．(1989)．Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harborおよびその3rd Ed．(2001)；Ausubel，F．M．(1987)．Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F．M．(1989)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience;Innis，M．A．(1990)．PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F．M．(1992)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Ausubel，F．M．(1995)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Innis，M．A．et al．(1995)．PCR Strategies，Academic Press;Ausubel，F．M．(1999)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates;Sninsky，J．J．et al．(1999)．PCR Applications：Protocols for Functional Genomics，Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait，M．J．(1985)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRLPress；Gait，M．J．(1990)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein，F．(1991)．Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approac，IRL Press;Adams，R．L．et al．(1992)．The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman&Hall;Shabarova，Z．et al．(1994)．Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim;Blackburn，G．M．et al．(1996)．Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford University Press;Hermanson，G．T．(I996)．Bioconjugate Techniques，Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（好ましい実施形態）
本発明の好ましい実施形態を、以下に掲げる。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（サイレンシング抑制因子、核酸分子、ベクター、細胞等）
１つの局面において、本発明は、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列またはその改変体もしくはホモログ、例えば、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列；（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；（ｃ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列；（ｄ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の配列の一部を含む配列；および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の配列の相補配列；からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、生物学的機能を有することが好ましい。そのような生物学的機能としては、サイレンシング抑制機能等を挙げることができる。これらの配列の改変配列もまた本発明に包含されることが意図される。そのような改変配列は、保存的改変体であることが好ましくありうる。
配列番号１（ＡＳＲ６０２）またはそれに類似する配列としては、ＡＳＬ１〜ＡＳＬ８（それぞれ、配列番号４〜１１）等のｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ｏｆ Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ ｆａｍｉｌｙのメンバー等を挙げることができる。そして、そのような類似配列としては、以下を挙げることができる。表では、左側にアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）、右側には推定機能（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を記載している。ただし、従来技術では、いずれの配列についてもサイレンシング抑制機能は評価（実際に測定）されていない。これらの類似配列は、ＡＳＲ６０２（配列番号１）に酷似している配列であり、サイレンシング抑制効果が高いと考えられる。そして、本発明は、これらの類似配列、およびこれらの配列に対応する他の生物における配列を含む核酸分子またはサイレンシング抑制因子も包含することが企図される。
配列番号２（ＡＳＲ１０２）またはそれに類似する配列としては、以下を挙げることができる。表では、左側にアクセッション番号、右側には推定機能を記載している。ただし、従来技術では、いずれの配列についてもサイレンシング抑制機能は評価（実際に測定）されていない。そして、本発明は、これらの類似配列、およびこれらの配列に対応する他の生物における配列を含む核酸分子またはサイレンシング抑制因子も包含することが企図される。
配列番号３（ＡＳＲ５０１）またはそれに類似する配列としては、以下を挙げることができる。表では、左側にアクセッション番号、右側には推定機能を記載している。ただし、従来技術では、いずれの配列についてもサイレンシング抑制機能は評価（実際に測定）されていない。そして、本発明は、これらの類似配列、およびこれらの配列に対応する他の生物における配列を含む核酸分子またはサイレンシング抑制因子も包含することが企図される。
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列もしくはその相補体またはそれらの一部を含むか、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列もしくはその相補体またはそれらの一部からなる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体またはそれらの一部を含むか、その配列もしくはその相補体またはそれらの一部からなるものでありうる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列において、１つ以上、または１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列もしくはその相補体またはそれらの一部を含むか、その配列もしくはその相補体またはそれらの一部からなるものでありうる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、中程度または高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列もしくはその相補体またはそれらの一部を含むか、その配列もしくはその相補体またはそれらの一部からなるものでありうる。これらの配列自体は、一部公知の配列と同一のものがありうるが、そのような配列であっても、サイレンシング抑制活性については知られていなかったことから、その意味で新規性があるといいうる。
本発明の配列番号１に関連するＡＳＲ６０２様の配列は、極めて種特異的な配列であった（実施例参照）。ＡＳＲ６０２は、Ｔｙ１／ｃｏｐｉａレトロトランスポゾンにおける３’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）に隣接する部分に起源するもののようである（図４、図３Ａおよび４Ａ）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンにおいて、バリアーインスレーター活性を有する２つのＤＮＡ配列が同定されているが、これらの配列は、５’非翻訳領域（Roseman，R．R,，Pirrotta，V，& Geyer，P．K.，EMBO J．12，435-442（1993））またはＬＴＲ（Brasset E，Hermant C，Jensen S，&Vaury，C.，Gene 450，25-31（2010））に位置している。ＡＳＲ６０２は、既知の足場／マトリクス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）およびインスレーターの構造特性に類似した配列の特徴を有さなかった。ＡＳＲ６０２の機能は、Ｓ／ＭＡＲおよびインスレーターのものとは異ると考えられる。Ｓ／ＭＡＲおよびバリアーインスレーターは、外来遺伝子を両側に配置されると、位置効果から（外来）遺伝子を切り離す。すなわち、隣接するゲノム領域からの異質染色質領域（heterochoromatin）の拡大を抑制する（Bode，J.，Benham，C.，Knopp A．&Mielke C.，Crit Rev Eukaryot Gene Expr．10，73-90（2000）；Gaszner，M．&Felsenfeld，G.，Nat Rev Genet．7，703-713（2006））。これに対し、ＡＳＲ６０２は、外来性遺伝子に融合させた際に、別の染色体／領域上に位置するサイレンサー遺伝子座によって引き起こされるＴＧＳを抑制することが実証された（実施例参照）。ＡＳＲ６０２は、宿主ゲノムの後成調節系によって制御されるクロマチンを活性状態に維持するための「合図」として機能することが示唆される。
本発明の核酸分子またはサイレンシング抑制因子等についてさらに説明する。真核生物は、内因性遺伝子、外来遺伝子および侵入性核酸（invasive nucleic acid）を調節するためにエピジェネティック機構を採用している（Matzke，M．A.，Aufsatz，W.，Kanno，T.，Mette，M．F．&Matzke，A．J.，Adv．Genet．46，235-275（2002）；Wassenegger M．, Gene silencing．Int Rev Cytol．219，61-113（2002））。一部の内因性遺伝子／外来遺伝子が転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）を受ける一方で、その他の遺伝子はＴＧＳを回避するので（Wolffe，A．P.，Curr Biol．7，R796-798（1997）；Finnegan，J．&McElroy，D．，Bio/technol．12，883-888（1994））、ゲノム領域のエピジェネティックなＴＧＳ／非ＴＧＳ状態を積極的に決定するための内因性ＤＮＡ配列が存在し得るものと考えられる。理論に束縛されることを望まないが、本発明の核酸分子は、同一発現ベクター内に配置された外来遺伝子をＴＧＳから積極的に防御するこれらのゲノムエレメントでありうる。転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）は、転写の抑制を介して機能し、関与する遺伝子がプロモーター領域において配列の相同性を共有する場合に主として生じるが、広範囲の真核生物における内因性遺伝子／外来遺伝子で見られる現象である（Matzke，M．A.，Aufsatz，W.，Kanno，T.，Mette，M．F．&Matzke，A．J.，Adv．Genet．46，235-275（2002）；Wassenegger M．Gene silencing．Int Rev Cytol．219，61-113（2002）;Daxinger L, Whitelaw E. Genome Res. 20, 1623-1628 (2010).）。ＴＧＳは、広く、遺伝子組換え技術に対する非常に大きな障害と認識されており（Pannell，D．& Ellis，J.，Rev．Med．Virol．11，205-217（2001））、特に遺伝子組換え植物においては、自然に生じたＴＧＳは後代に遺伝しうるため（Assaad，F．F.，Tucker，K．L．&Signer，E．R.，Plant Mol Biol．22，1067-1085（1993）；Hagan，N．D.，Spencer，D.，Moore，A．E．&Higgins，T．J.，Plant Biotechnol．J．1，479-490（2003））、その解決は、農業上、遺伝子組換え技術を応用するためにも、重要な課題となっている。。真核生物ゲノムにおける外来遺伝子のＴＧＳは、染色体上の挿入部位（Wilson，C.，Bellen，H．J．&Gehring，W．J.，Annu Rev．Cell Biol．6，679-714（1990））と、内因性遺伝子を調節するエピジェネティックな機構（Matzke M．et al.，Biochim．Biophys．Acta．1677，129-141（2004）；Matzke，M．A.，Mette，M．F.，Aufsatz，W.，Jakowitsch，J．&Matzke，A．J.，Genetica 107，271-287（1999））に大きく依存していることから、内因性遺伝子のＴＧＳをエピジェネティックに制御するゲノムＤＮＡエレメントの存在が示唆される。従って、この様な“内在性遺伝子のＴＧＳを制御するＤＮＡエレメント”は、外来遺伝子のＴＧＳを抑制する潜在的な能力も有するであろうことが予想される。本発明者らは、本明細書において開示したように、強制的にプロモーター相同性依存性のＴＧＳに対する抑制因子を、二次的に導入した外来遺伝子がトランスにサイレンシングされる遺伝子組換えタバコ植物を用いるスクリーニング戦略によって単離したが、得られた配列は、トランス−ＴＧＳに限定されていないとの証拠も得られている。したがって、理論に束縛されることを望まないが、本発明の核酸分子は、トランス−ＴＧＳ等のＴＧＳに限定されることなく、ＰＴＧＳなどの他のサイレンシングの抑制因子としての機能を有しうることが想定される。すなわち、本発明において、本発明者らが見出したＴＧＳを予防するＤＮＡエレメント、およびスクリーニング基準としてのこのＤＮＡエレメントのＴＧＳを抑制する能力を実証したといえる。本発明者らは、実施例において例示するように、サイレンシング抑制を目的とする植物とは異なる植物種（例えば、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ））のゲノムライブラリーから抗ＴＧＳエレメントの一例を同定し、そして、その例があるゲノムエレメント（１７１塩基対）が種間で広くサイレンシング抑制活性または抗ＴＧＳ活性を有することを確認した。このエレメントに類似する配列は、この種のゲノムにおいて点在しており、３’長鎖末端反復配列（ｌｔｒ）に隣接するＴｙ１／ｃｏｐｉａレトロトランスポゾンの部分に由来していた。この知見は、宿主のサイレンシング活性（防御（ｄｅｆｅｎｓｅ））と、トランスポゾンの抗サイレンシング活性（反防御（ｃｏｕｎｔｅｒｄｅｆｅｎｓｅ））との間の拮抗する関係性の共進化に関する新たな見通しを提供する（Matzke，M．A.，et al.，2002；Matzke，M．A．et al.，1999；Vance，V．&Vaucheret，H.，Science 292，2277-2280（2001）；Buchmann，R．C.，Asad，S,，Wolf，J．N,，Mohannath，G，&Bisaro，D．M.，J Virol．83，5005-5013（2009））。さらに、本発明のサイレンシング抑制因子またはＡＳＲは、ＴＧＳを抑制し、そして、外来遺伝子発現の適切な調節を確実にするために有効なツールを提供する。植物におけるサイレンシングについては、YoshikawaM et al., 細胞工学，Vol. 30, No. 7, 2011も参照することができる。
理論に束縛されることを望まないが、本発明で達成されたサイレンシング抑制については、本発明の抑制因子がそのサイレンシング抑制機能を発揮するためには、サイレンシングを担う因子または領域（したがって、サイレンシング抑制にも関連する因子または領域）と特異的に相互作用することが必要であり得ると考えられることから、実際に得られた配列と完全に同一であることは必須ではなく、得られた配列とある程度相同であれば、目的の因子または領域に結合等の相互作用することができ、最終的なサイレンシング抑制を達成することができると考えられる。そのような結合等相互作用のためには、例えば、７０％以上の相同性もしくは同一性、好ましくは、８０％以上の相同性もしくは同一性、９０％以上の相同性もしくは同一性、より好ましくは９５％以上の相同性もしくは同一性、さらに好ましくは９８％以上の相同性もしくは同一性、さらになお好ましくは９９％以上の相同性もしくは同一性が必要でありうる。
また、理論に束縛されることを望まないが、本発明において見いだされた３種の具体的配列から、１）ＡＳＲ６０２（配列番号１）の中と、直後に存在するＡＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣ（配列番号１２）が共通していることから、この配列を有することが好ましくありうる。また、２）ＡＳＲ１０２， ＡＳＲ５０１， ＡＳＲ６０２に共通して存在する転写因子のＤｏｆの結合配列ＡＡＡＧが存在することから、この配列を有することが好ましくありうる。さらに、３）３）上記のＡＡＡＧを延長したＡＡＡＧＡＡＧ配列がＡＳＲ１０２，ＡＳＲ ６０２に共通して存在することから、この配列を有することが好ましくありうる。加えて／あるいは、４）ＡＳＲ１０２およびＡＳＲ６０２に共通して存在するＧＡＧＴＡＣＣの７ｂｐ配列が存在することから、この配列を有することが好ましくありうる。
インスレーターおよびＭＡＲは、挿入部位周辺からのヘテロクロマチン化を抑制する機能を持つことが知られているが、本発明で同定した配列は、挿入部位とは関係ないサイレンシングを抑制する活性をもつことなどから、これらとは異なる機能を有しうると考えられる。また、本発明で同定したＤＮＡ配列と同一の配列は報告されておらず、かつ相同性のある配列にもＴＧＳ抑制活性は報告されていない。ＴＧＳを抑制する配列を利用した植物用ベクターは開発されていないことから、本発明は、植物用の実用的なベクターとして有用性は高い。
導入遺伝子の発現は、挿入されたゲノム上の位置に依存してばらつきが生ずるため（位置効果）、真核生物ゲノム内には、ＴＧＳの生起を決定するＤＮＡ配列が存在することが予想される。
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、サイレンシング抑制活性を有する。種々の実施形態において、このサイレンシングは、トランス−ＴＧＳ、シス−ＴＧＳ、ＰＴＧＳ等でありうる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制活性を有する。種々の実施形態において、このＴＧＳは、トランス−ＴＧＳ、シス−ＴＧＳでありうる。
１つの好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１、２または３に示す配列を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１、２または３に示す配列からなる。
１つの局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むサイレンシング抑制因子を提供する。ここでサイレンシング抑制因子に含まれる核酸分子は、本発明の核酸分子として説明されている任意の配列を含みうることが理解される。種々の実施形態において、このサイレンシングは、トランス−ＴＧＳ、シス−ＴＧＳ、ＰＴＧＳ等でありうる。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制活性を有する。種々の実施形態において、このＴＧＳは、トランス−ＴＧＳ、シス−ＴＧＳでありうる。
１つの実施形態では、本発明のサイレンシング抑制因子は、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列；（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；（ｃ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列；（ｄ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の配列の一部を含む配列；および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の配列の相補配列；からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
別の実施形態では、本発明のサイレンシング抑制因子は、サイレンシング抑制活性に有意な影響を与えない限り他の配列または他の物質を含んでいてもよい。
別の局面において、本発明は、本発明のサイレンシング抑制因子または本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。このようなベクターとしては、本発明のサイレンシング抑制因子または本発明の核酸分子の機能を発揮させることができるものであればどのようなものでも良く、例えば、本明細書において例示されるｐＢＥ２１１３（例えば、ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ）、ｐＢＥ７１３３、ｐＥ２１１３、ｐＥ７１３３、ｐＥｌ２Ｏｍｅｇａ（ｐＥｌ２Ω）、ｐＭＬＨ７１３３（これらは、改変３５Ｓプロモーターを用いて目的の遺伝子を駆動するようにされている。）、ｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳにＡＳＲを挿入したもの、ｐＴＮシリーズ（例えば、ｐＴＮ１，２）等の空ベクターにＡＳＲを挿入して、自前の発現カセット（プロモーター＋目的の遺伝子）を挿入したものなどを挙げることができ、このほかにも、ｐＢＩ１２１を基にしたバイナリーベクターなどを利用することができる。これらのベクターは、本明細書において引用した文献において教示されており、あるいは、農業生物資源研究所（http://www.nias.affrc.go.jp/plantdefense/）等から入手することができる。
１つの実施形態では、本発明のベクターは、さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる。本発明の実施には、使用されるプロモーターは、プロモーターであれば種類を問わず原理的に実施可能である。理論に束縛されることを望まないが、本明細書において実証されたように、ウイルス由来の構成的発現を示すプロモーター (ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーター)と、植物自身の持つ組織＋期間特性発現を示すプロモーター(FWA)の両方をサイレンシングから保護できたことから、植物種およびプロモーターの種類を問わず原理的に実施可能であると考えられるからである。
別の実施形態では、本発明のベクターは、さらに、導入されるべき遺伝子が作動可能にサイレンシング抑制因子に連結されて含まれる。
別の実施形態では、本発明のベクターは、さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、遺伝子を導入するための組成物を提供する。本発明の組成物としては、遺伝子を導入する目的を阻害しない限り、どのような他の成分でも含むことができる。そのような他の成分としては、例えば、緩衝剤、安定剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、静菌剤、および分散剤等を挙げることができる。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、細胞を提供する。１つの実施形態では、本発明の細胞は、植物細胞である。このような植物細胞は、サイレンシングを抑制することが企図される任意の植物細胞でありうる。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、植物組織を提供する。このような組織としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織を挙げることができるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、植物器官を提供する。例えば、植物器官としては、茎、根、葉、花などを挙げることができるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、植物体を提供する。本発明の植物体は、再生産用のものであってもよく、それ自体を観賞用に使用してもよく、あるいは工業用製品、食品もしくは医薬品等自体またはそれらの原料として使用するものであってもよい。
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む、種子を提供する。本発明の種子は、再生産用のものであってもよく、それ自体を観賞用に私用してもよく、あるいは工業用製品、食品もしくは医薬品等自体またはそれらの原料として使用するものであってもよい。
さらに別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む細胞、植物組織、植物器官、植物体および／または種子に由来する加工品を提供する。本発明の加工品は、工業用製品、食品、医薬品、あるいはそれらの原料でありうるがそれらに限定されない。
（サイレンシング抑制因子のスクリーニング方法およびキット）
別の局面において、本発明は、（Ａ）高頻度でサイレンシングが起こる系を提供する工程；（Ｂ）該高頻度でサイレンシングが起こる系に、候補核酸を導入する工程；（Ｃ）該高頻度でサイレンシングが起こる系において、サイレンシングが抑制されるかどうかを決定する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）において、該サイレンシングの抑制をもたらした該候補核酸を選択する工程；を包含する、サイレンシング抑制因子のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニングの概念は、広範囲の生物からのサイレンシング抑制因子の単離に応用可能である。このスクリーニング法によって単離されたサイレンシング抑制因子は、遺伝子組換え技術における進展をもたらし、そして、このサイレンシング抑制因子の分析は、ゲノム調節のエピジェネティックな調節機構に関する新たな研究分野を開くものである。
本発明のスクリーニング方法において、サイレンシングについて「高頻度」は、サイレンシング抑制のスクリーニングを可能にする程度の頻度であれば、どのようなものであってもよく、通常、サイレンシングが５０％以上の確率で起こることをいい、好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上などであり得る。
高頻度かどうかの判定は、上記確率を算出することによってなすことができる。ただし、実際に人工的な系を作成した場合、復帰変異体を起こした細胞が優先的に細分化してくるので、結果的に過大評価している可能性がありうる（例えば、実施例で使用したＭ６６−９の場合、シュートの出る率が非常に低い場合、シュートが出るまで葉片を培養する；ただし、実施例で使用したＦＷＡのような天然の系の場合、サイレンシングの成否が形質転換効率に影響しない）。そのような場合、理想的には、「通常の（サイレンシング頻度がとくに高くない）条件で発生すると想定される個体数で、サイレンシングが高頻度で起こる条件下で発生した個体数を除した割合」が「エスケープ率」であるが、エスケープ率は、本件で用いた系では、通常出てこない復帰変異体も計数しており、過大評価されるため、復帰変異体数が０の場合も本件の系の場合１等と計数されることになる。このような場合でも、高頻度の判断には影響ないことが理解される。すなわち、しかし、そのような場合は、エスケープ率が高くなるだけであるため頻度評価には差しさわりがないことが理解される。すなわち、エスケープ率で見たときには通常の過大評価されない条件での評価＜過大評価した評価となるため、頻度でみると、エスケープ率で見たときには通常の過大評価されない条件での評価＞過大評価した評価となることから、設定した「高頻度」の条件を、過大評価した評価でクリアしている限り、通常の過大評価されない条件での評価で常に満たしていることになるからである。
本発明において用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、上記条件を満たす限り、どのようなものであってもよい。また、このような高頻度でサイレンシングが起こる系は、天然に存在するもの（例えば、ＦＷＡを有するシロイヌナズナ）であっても人工的に創製したもの（例えば、実施例等で使用したタバコ形質転換体M66-9）であってもよい。
例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのようなプロモーター（好ましくは、汎用のものであり、強力なものがよいがそれに限定されない。）を基本とする発現ベクターを導入した形質転換植物（例えば、タバコ植物が使用されうるがこれに限定されない。）の中から、導入遺伝子がＴＧＳ等のサイレンシングによって不活性化されている系統を選抜し、さらにそれらの中から、再導入した３５Ｓ プロモーターが高頻度で不活性化されるサイレンシング（例えば、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）活性を持っている系統を選択することができる。この系統は、ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーター：：薬剤選抜マーカー等の選抜マーカーを持つ形質転換ベクターを再導入しても形質転換体を選抜することができないが、ＣａＭＶ プロモーター：：薬剤選抜マーカーにサイレンシング抑制能（例えば、ＴＧＳ抑制能）を持つＤＮＡ配列が付加されれば薬剤選抜等による選抜が可能になる。
そこで、例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：：薬剤選抜マーカー（例えば、ハイグロマイシン薬剤耐性遺伝子であるｈｐｈ遺伝子）の上流に候補核酸（例えば、ミヤコグサゲノムＤＮＡ断片等のゲノムＤＮＡ断片）を挿入したライブラリーを構築し、このライブラリーで、上記の形質転換体を形質転換した後、選択培地（例えば、ハイグロマイシン薬剤耐性を行う場合はハイグロマイシン含有培地）で選抜された形質転換体を選抜することができる。選抜された形質転換体に挿入された候補核酸（例えば、ミヤコグサゲノムＤＮＡ断片等のゲノムＤＮＡ断片）にはサイレンシング抑制活性を有する可能性が高いことから、これらについてさらにその活性を確認する実験を行うことができる。サイレンシング抑制活性は、形質転換体（例えば、タバコ）におけるプロモーターコピー数の増加に伴うサイレンシング（例えば、ＴＧＳ）を抑制する活性を測定することによって確認することができる。（例として、図１を参照）。
選抜した候補核酸がサイレンシング抑制活性を普遍的に有するかどうかについては、別の植物（例えば、シロイヌナズナ）を用いて行なうことができる。シロイヌナズナ内在性の遺伝子ＦＷＡ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＷＡＧＥＮＩＮＧＥＮ）（通常はサイレンシング（ＴＧＳ）によって発現が抑制されており、さらに形質転換によって新たに導入した場合も高頻度で不活性化を受ける）に連結した場合、ＦＷＡ遺伝子の不活性化が抑制されることを確認することができる。従って、本発明の方法によってサイレンシング（ＴＧＳ）を抑制する活性をもつＤＮＡ配列を高効率で単離でき、単離されたサイレンシング（ＴＧＳ）抑制配列はタバコおよびシロイヌナズナにおいて別種のプロモーターで起こるＴＧＳを抑制することができる（例として、図２を参照のこと）。
別の例として、本発明の核酸配列（例えば、配列番号１〜３）を連結したＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：：ＧＵＳ遺伝子等のプロモーター：：マーカーコンストラクトを導入した別の植物（例えば、サツマイモ）の形質転換培養細胞に用いて、そのマーカー（例えば、ＧＵＳ）の発現変動性が抑制されることが明らかにすることができる（例として、図３を参照）。
したがって、本発明は、サイレンシング（例えば、ＴＧＳ）を負に制御するＤＮＡ配列を体系的に同定する方法を初めて提供する。また、このように体系的に同定されたサイレンシング（例えば、ＴＧＳ）抑制活性をもつＤＮＡ配列そのものも、導入遺伝子を安定的に発現させることができるベクターの開発に寄与する。また、本発明のスクリーニング戦略は、サイレンシング抑制因子（ＴＧＳ抑制因子）であるＤＮＡエレメントの新たなクラスを効率的に見出すのに役立つ。
なお、真核生物ゲノム内からはＴＧＳを阻止するＤＮＡ配列が見出されているが、当該配列を単離するための体系的なスクリーニングを行う方法は開発されていない。従来知られているインスレーターまたはＭＡＲ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ）など、サイレンシングを抑制する活性をもつＤＮＡ配列が知られているものの、これらは既知の遺伝子領域周辺の機能解析の結果、活性が認められたもので、本件の様なスクリーニングによって単離されたものではなく、体系的なスクリーニングは示唆すらされていなかった。また、サイレンシング抑制効果の有無を調べる研究で用いられた方法も異なっており、本発明のような方法を用いて初めて実質的な意味での「スクリーニング」が可能となった。さらに、サイレンシング、特に、TGSを抑制する配列を利用した植物用ベクターは開発されていないことから、本発明には、極めて有用性が高いというべきである。特に、理論に束縛されることを望まないが、一つの側面において、本発明は、ＴＧＳを抑制する因子を見出すためには、高頻度でサイレンシングが起きる系が必要であることを見出した点においても顕著な特徴が認められるべきである。また、本発明のスクリーニング方法を実施した結果、取れてきた配列は、本明細書において実証されているように、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを抑制する活性を有する配列が主であるが、例えばサツマイモの形質転換の結果から判断すると、この配列は、ｃｉｓ−ＴＧＳまたはＰＴＧＳをも抑制する可能性がある点において、スクリーニングがターゲットとするメカニズムが限定されていない点も特徴の一つであるといえる。
１つの実施形態では、本発明のスクリーニング方法において、前記サイレンシングは、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）により生じるものを目的としうる。
１つの実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）が高頻度で起こる系である。
別の実施形態では、本発明のスクリーニング方法が目的とするサイレンシング抑制因子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制因子である。
別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、導入工程（Ｂ）は、前記候補核酸と該プロモーターと共にを含むベクターを用いてで行われることをさらに特徴とする。この場合、前記決定工程（Ｃ）は、該ベクターに含まれる前記プロモータの制御下にある発現に対するサイレンシングが抑制されるかどうかを決定する工程であることをさらに特徴とすることができる。例示的な実施形態では、この工程（Ｃ）は、形質転換体が抗生物質耐性であるか否か（すなわち、抗生物質存在下でも成長するか否か）を決定する工程、あるいは、開花が遅くなるか否かを（例えば、視認等により）決定する工程でありうる。
別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、（Ｂ）導入工程において使用される導入手法を用いた場合に少なくとも９０％でサイレンシングが起こる。
別の実施形態では、本発明で用いられるサイレンシングの頻度は、通常の条件で発生すべき個体数で、サイレンシングが生じる条件下でサイレンシングが生じた個体数を除した割合で示される。したがって、「高頻度でサイレンシングが起こる系は、前記（Ｂ）導入工程において使用される導入手法を用いた場合に少なくとも９０％導入遺伝子の発現が抑制される」との意味は、前記サイレンシングの頻度は、通常の条件で発生すべき個体数で、サイレンシングが生じる条件下でサイレンシングが生じた個体数を除した割合で示される割合であることが理解される。
別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、本発明のスクリーニング方法においてサイレンシングが生じた場合、前記高頻度でサイレンシングが起こる系の個体は発生せず、該サイレンシングが生じない場合、該高頻度でサイレンシングが起こる系の個体が発生する系でありうる。
別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、サイレンシングが生じた場合と、サイレンシングが生じない場合とで、前記高頻度でサイレンシングが起こる系の表現形が異なる系でありうる。
別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、人工的にサイレンシングを生じさせたものである。さらに別の実施形態では、本発明で用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、天然にサイレンシングが起きる系である。
別の局面において、本発明は、高頻度でサイレンシングが起こる系を備える、サイレンシング抑制因子のスクリーニングを行うためのキットを提供する。このサイレンシング抑制因子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）の抑制因子、あるいはトランス−転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）でありうる。
１つの実施形態では、本発明のキットにおいて含まれる高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、この場合に本発明のキットは該プロモーターを含む候補核酸を導入するためのベクターをさらに備える。
別の実施形態では、本発明において用いられる高頻度でサイレンシングが起こる系は、アグロバクテリウム形質転換系で形質転換した場合に通常、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、なおいっそう好ましくは少なくとも９９．９％、さらになおいっそう好ましくは少なくとも９９．９９％導入遺伝子の発現が抑制される系である。なお、他の形質転換系で測定した場合にも、アグロバクテリウム形質転換系と同様の頻度を示すかあるいはより高い数値を示しうるが、本発明の目的においては実質的に同一とみなすことができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願等の参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に、実施例を用いて本発明を詳述する。以下の実施例は、例示の目的にのみ提供され、本発明は、以下の実施例には限定されないことが理解される。以下に使用した試薬類は、和光純薬（Ｗａｋｏ）、タカラバイオ（ＴａＫａＲａ）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ナカライテスク、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ等から入手した。
（方法および材料）
ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ植物の選択に使用した遺伝子組換えタバコ植物と、ＧＵＳ構築物を持つスーパー形質転換体に関して使用したＬＵＣ発現タバコ植物は、文献に記載されたとおりに作製した（Mitsuhara，I.，Malik，K．A.，Miura，M．& Ohashi，Y.，Curr Biol．9，775-778（1999）；Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））。ＧＵＳおよびＬＵＣアッセイは、文献に記載されたとおりに実施した（Sasaki，K．et al.，Plant Mol．Biol．62，753-768（2006））。より詳細な情報については、必要に応じて、各欄に記載する。
（一般的な方法論）
以下に、本実施例で用いた種々の技術について、項目ごとに説明する。
（植物材料および植物の形質転換）
野生型タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓｕｍｓｕｎ ＮＮ）および遺伝子組換えタバコの植物および培養細胞を、文献に記載されたとおりに成長させた（Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））。ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を有する植物を選択するために、遺伝子組換えタバコ株Ｍ６５およびＭ６６由来の植物を使用した（Mitsuhara，I.，Malik，K．A.，Miura，M．&Ohashi，Y.，Curr Biol．9，775-778（1999））。Ｍ６５株およびＭ６６株は、それぞれ、ｂｃｌ−ｘＬおよびｃｅｄ−９のオープンリーディングフレームを有しており（Hisahara，S．et al.，J Cell Sci．111，667-673（1998））30、これらを、発現ベクターｐＢＥ２１１３（Mitsuhara I．et al.，Plant Cell Physiol．37，49-59（1996））に挿入した。ｐＢＥ２１１３は、２コピーのＣａＭＶプロモーター（Ｅｌ）のエンハンサー領域（−４１９〜−９０）と、１コピーのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）のコアプロモーター（−９０〜−１）を有し、その後ろに、発現させようとする目的の遺伝子を有する。タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換は、文献に記載されたとおりに実施した（Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002）；Clough，S.J．& Bent，A.F.，Plant J．16，735-743（1998））19,31。長日性条件（１６時間の明／８時間の暗）下で、成長させた植物のロゼット葉の数を計数することにより、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（生態型：コロンビア(Col)）の開花時期を決定した。開花時期のデータを、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定により比較し、その後、Ｄｕｎｎの多重比較処理を行った。
（プラスミド構築物）
Ｐ３５Ｓ：：ＨＰＴ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を選別マーカーとして含むｐＴＨ１は、ＨＰＴ発現カセットの方向がｐＴＨ２と反対である点を除き、ｐＴＨ２ベクター（Kawahigashi，H．et al.，J Agric Food Chem．55，1241-1247（2007））と同じ特徴を有する。
ｐＭＬＨ７１３３−ｍｗｔｉ１ｂ（ＨＰＴを含む）（Mochizuki，A．et al.，Entomol Exp Appl．93，173-178（1999））の誘導体であるｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳは、ｍｗｔｉ１ｂ遺伝子をｐＥ７１３３−ＧＵＳ（Mitsuhara I．et al.，Plant Cell Physiol．37，49-59（1996））内のプロモーター−ＧＵＳカセットのＧＵＳレポーター遺伝子で置き換えることによって作製する。
ｐＴＨ４を作製するために、ｐＭＬＨ７１３３−ｍｗｔｉ１ｂ（Mochizuki，A．et al.，Entomol Exp Appl．93，173-178（1999））のＨＰＴ発現カセット（ＳｍａＩ−ＳｍａＩ領域）をｐＴＲＡ４１５（Ｒ）−ｄｅｌＮＰＴ（Fukuoka，H．et al.，Plant Cell Reports 19，815-820（2000））のＸｈｏＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化したもの）に挿入した。Ｌｏｔｕｓゲノムライブラリーの作製のために、このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＴＨ４のHind3部位に挿入した（図２Ａ）。
ｐＰ３５Ｓｍ−ＧＵＳを作製するために、ｐＢＩ１２１（Jefferson，R.A.，Kavanagh，T．A．& Bevan，M．W.，EMBO J．6，3901-3907（1987））のＣａＭＶプロモーター領域を、−４６ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーター（Ｐ３５Ｓｍ）（Jefferson，R.A.，Kavanagh，T．A．& Bevan，M．W.，EMBO J．6，3901-3907（1987））で置き換えた。この構築物内のＰ３５Ｓｍの直ぐ上流に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＡＳＲ候補を挿入し、そしてこれを、エンハンサー活性の測定に用いた（図２Ａ）。
ｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳは、ｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳのプロモーター−ＧＵＳカセットを、ｐＥ２１１３−ＧＵＳのプロモーター−ＧＵＳカセット（ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢａｍＨＩ部位まで）で置き換えることによって構築される（Mitsuhara I．et al.，Plant Cell Physiol．37，49-59（1996））。
ＦＷＡ形質転換のための「コントロール」構築物（ｐＢＩ−ＦＷＡ、図２Ａ）を作製するために、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３０７５の１３０３７０２６〜１３０４２５１９位に対応する、ＦＷＡ遺伝子の５．５キロベースフラグメントを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（生態型：コロンビア）のゲノムＤＮＡに由来するプライマーセット（創生したＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する「ＵＰ ＦＷＡ５１」と、内因性のＥｃｏＲＩ部位を有する「ＦＷＡ３２」；表３）を用いてＰＣＲで増幅した（図２Ａ）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲ産物で、ｐＢＩ１２１のプロモーター−ＧＵＳレポーターカセット（ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間の領域）（Jefferson，R.A.，Kavanagh，T．A．& Bevan，M．W.，EMBO J．6，3901-3907（1987））を置き換えた。ＡＳＲ６０２を含有するＦＷＡ形質転換のためのベクターを作製するために、ｐＢＩ−ＦＷＡの創生したＨｉｎｄＩＩＩ部位と、内因性のＸｂａＩ部位との間の領域（１７２塩基）を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を上流に、下流側に創生したＸｂａＩ部位を持つＡＳＲ６０２フラグメント（元のＡＳＲ６０２（１７１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント）の３’末端をＰＣＲにより変えたもの）で置き換えた。
（生化学分析）
免疫ブロッティングには、Ｈｉｓａｈａｒａらの方法に基づいて(Hisahara，S．et al.，J Cell Sci．111，667-673（1998））ポリクローナル抗Ｃｅｄ−９抗体(Mituhara et al. 1990, CurrentBiology)を用いて行った。タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのゲノムＤＮＡ抽出は、記載されたとおりに行った（Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））。Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（系統名：Miyakojima MG-20）のゲノムＤＮＡは、独立行政法人農業生物資源研究所の梅原洋介博士（Dr. Y. Umehara）によって提供された。
（ＧＵＳアッセイおよびＬＵＣアッセイ）
レポーター遺伝子アッセイは、記載されたとおりに実施した（Sasaki，K．et al.，Plant Mol．Biol．62，753-768（2006））。抽出物の一部（ａｌｉｑｕｏｔ）を、３７℃にて３０分間、４−メチルウンベリフェリル−β−ｄ−グルクロニドを含むバッファー中でインキュベートした。ＧＵＳ活性によって形成された４−メチルアンベリフェロンの量を、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて測定した。上清の一部２０μｌを５０μｌのＰｉｃａＧｅｎｅＴＭ（ＬＵＣアッセイのための溶液；Ｔｏｙｏ Ｂ−Ｎｅｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）中でインキュベートした。ＬＵＣ活性は、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＭＬＸＴＭ（Ｄｙｎｅｘ）を用いて１０秒間で測定した。
メチル化感受性制限酵素を用いてＤＮＡメチル化を検出するための定性的ＰＣＲアッセイ。
このアッセイの基本概念は文献（Singer-Sam，J.，LeBon，J．M.，Tanguay，R．L．& Riggs，A．D.，Nucleic Acids Res．18，687（1990））に記載されているものに基づいた。メチル化の状態について分析するタバコ植物を、ＡＳＲ６０２を有するか、または、ＡＳＲ６０２無しのスーパー形質転換体タバコ植物から無作為に選択した（図１ｂ、ＣＳＴおよびＡＳＲ６０２ ＳＴ）。ゲノムＤＮＡを個々から単離し、メチル化感受性制限酵素であるＨｇａＩ、ＡｌｕＩまたはＸｍｎＩで消化した。各ＤＮＡサンプル（１００ｎｇ）を、製造業者の説明書にしたがって０．５単位の各制限酵素で２時間消化し、その後、エタノール沈殿を行った。ＰＣＲ増幅には、製造業者の説明書にしたがって、消化したＤＮＡの各々７５ｎｇをＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＰＣＲ反応液（１０μｌ）中でテンプレートとして用いた。サイクリングの条件は以下のとおりであった：９５℃で９分間；５５℃での３０秒間のアニーリング、７２℃での１分間の伸長および９５℃での３０秒間の変性の４０サイクル；そして、７２℃で５分間。ｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳにおけるＧＵＳ遺伝子に融合させた３５Ｓエンハンサー／プロモーター領域（図２ＡのｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳの斜線の横棒）を、それぞれ、エンハンサー／プロモーター領域の５’上流配列と、ＧＵＳの５’末端領域の配列に対応するプライマーセット「ｐＢＩ−Ｈｉｎｄ３−５１」および「ＧＵＳＩ３」を用いてＰＣＲ増幅した（図２Ａ、表３）。各ＰＣＲ産物の容量の半分をゲル電気泳動後、臭化エチジウム染色によって増幅されたDNA断片を検出した。
（スーパー形質転換体における外来遺伝子のコピー数を決定するための定量的ＰＣＲアッセイ）
各スーパー形質転換体におけるｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳ構築物のコピー数を、（Seo，S．et al.，Plant Physiol．155，502-514（2011））に記載されたとおりに定量的リアルタイムＰＣＲを行い、ＧＵＳ／ＬＵＣの遺伝子量比を測定することにより定量した。全ての形質転換体植物およびスーパー形質転換体植物からＤＮＡを個別に単離し、これらのＤＮＡのＧＵＳおよびＬＵＣ遺伝子の存在量を測定した（図２ｄ）。ＧＵＳおよびＬＵＣ遺伝子を、それぞれ、２つのプライマー対（ＧＵＳについては、「ＧＵＳＩ５１」および「Ｔｎｏｓ Ｙｏｍｅｒｕ」；ＬＵＣについては「ＬＵＣＩ５１」および「Ｔｎｏｓ Ｙｏｍｅｒｕ」）を用いてＰＣＲ増幅した（表３を参照のこと。）。
（実施例１：高頻度でサイレンシングが起きる系の開発）
（高頻度でサイレンシングが起きる系の開発）
本発明者らは、プロモーターの相同性に基づいて強制的にＴＧＳを引き起こす形質転換植物をもちいて、ＡＳＲをスクリーニングするための新規の系を考案した（図１ａ）。本発明者らは、まず、組換え植物の中から、あらかじめ導入されていた構築物のプロモーターと相同性のある二次的に導入したプロモーターが相同性依存的に遺伝子不活性化を引き起こす遺伝子組換え植物を単離した。ＴＧＳを起こしている外来遺伝子は、しばしば、遺伝子座の離れた相同性プロモーターをトランスにサイレンシングさせる（Matzke，M．A.，Mette，M．F.，Aufsatz，W.，Jakowitsch，J．& Matzke，A．J.，Genetica 107，271-287（1999）；Vaucheret，H．&Fagard，M.，Trends Genet．17，29-35（2001））（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）。また、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳは、既存のサイレンシングされたプロモーターに対して相同であり、かつ、異なる遺伝子座に挿入された、二次的に導入した外来遺伝子内のプロモーター上で生じる（Fagard，M．&Vaucheret，H.，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol．51，167-194（2000）；Matzke，M．A.，Primig，M.，Trnovsky，J．&Matzke，A．J.，EMBO J．8，643-649（1989）；Park，Y．D．et al.，Plant J．9，183-194（1996）；Thierry，D．&Vaucheret，H.，Plant Mol Biol．32，1075-1083（1996））。本発明者らは、これまでに、強化型カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター：：ｂｃｌ−ｘＬ／ｃｅｄ−９（Mitsuhara，I.，Malik，K．A.，Miura，M．&Ohashi，Y.，Curr Biol．9，775-778（1999））（本明細書において、このプロモーターをenhanced Ｐ３５Ｓと称する）で形質転換した遺伝子組換えタバコ植物から、いくつかのＴＧＳ植物を見出した。これらのサイレンシングを受けた植物は、複数コピーの外来遺伝子を有しており、このサイレンシング状態は次世代に遺伝し、そして、ＤＮＡメチル化の強力なインヒビターである５−アザシチジンでの処理によって、導入遺伝子は再活性化されたことから、このサイレンシングがＴＧＳであることが示唆された。次に、本発明者らは、これらのＴＧＳ植物を、強制的ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ植物を選択するための供給源として採用した。強制的ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を示す植物を選択するために、本発明者らは、Ｐ３５Ｓ：：ＨＰＴ構築物であるｐＴＨ１を用いて、これらのＴＧＳ植物の外植片（ｅｘｐｌａｎｔ）をスーパー形質転換した（図２Ａ）。これらのＴＧＳ植物が、強力なｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を有する場合、外植片に導入されたｐＴＨ１はサイレンシングを受け、結果としてスーパー形質転換された細胞が生じたとしてもその細胞は、選抜マーカーである35S::HPTが機能しないためにハイグロマイシン含有培地では増殖できず、当然、カルスの誘導を引き起こすことも、シュートの形成を引き起こすこともない。ＴＧＳ植物Ｍ６６−９からは、ｐＴＨ１でスーパー形質転換されたカルスまたはシュートを得ることはできなかったことから（図１ｂ）、Ｍ６６−９がｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を有することが示唆された。
次に、このＴＧＳ植物Ｍ６６−９が、別の３５Ｓプロモーターにより駆動される構築物に対して強制的ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを引き起こすかどうかを確認するために、本発明者らは、各々の強化型Ｐ３５Ｓによって駆動されるＨＰＴ遺伝子(enhanced 35S::HPT)およびＧＵＳ遺伝子(enhanced 35S::GUS)を含む、別のＰ３５Ｓ駆動性構築物であるｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳを用いてＭ６６−９をスーパー形質転換した（図２Ａ）。この構築物を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの感染後２日目（２ ＤＡＩ）に、Ｍ６６−９外植体には、ＧＵＳ活性をもつスポットが検出された。しかしながら、外植体は、アグロバクテリウムを感染後７日後においてＧＵＳ染色斑を示さず、また、スーパー形質転換されたシュートを再生することもなかったことから、ＧＵＳ構築物がＭ６６−９外植体内に導入されるものの、その後ｔｒａｎｓ−ＴＧＳによって抑制されることが確認された。
このようにして、本発明者らは、Ｍ６６−９を、ＡＳＲスクリーニングに使用することができる、強制的ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ誘導植物として同定し、（図１Ａ）、ＡＳＲのスクリーニングに使用した。
このＭ６６−９は、２０１１年７月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１５６（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２１５６；「寄託者が付した識別のための表示」は、Ｍ６６−９）として寄託した。
（実施例２：サイレンシング抑制因子のスクリーニング：抗サイレンシング領域（ＡＳＲ）候補の単離）
本実施例では、サイレンシング抑制因子（ＡＳＲ）のスクリーニングを行った。サイレンシング抑制活性を持たないゲノムフラグメントを含むＰ３５Ｓ駆動性構築物をＭ６６−９にスーパー形質転換すると、この構築物内のＰ３５Ｓはサイレンシングを受け、選抜マーカーである35S::HPT遺伝子が機能しないために、スーパー形質転換体（二重形質転換体）は得られない（図１ａ、中央下）。一方、ＡＳＲを含むＰ３５Ｓ駆動性構築物をＭ６６−９にスーパー形質転換すると、35S::HPT選抜マーカーが機能しハイグロマイシン耐性を獲得したスーパー形質転換植物が再生されるはずである（図１ａ、右下）。
ＡＳＲを単離するためのライブラリー構築物として、本発明者らは、別の強化型Ｐ３５Ｓ：：ＨＰＴカセットを含むｐＴＨ４を用いた（図２Ａ）。Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＴＨ４のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、そして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入した。１μｇのｐＴＨ４および０．５μｇのＬ．ｊａｐｏｎｉｃｓゲノムＤＮＡあたり、およそ３，０００の独立したクローン（平均１，５００ｂｐの挿入サイズ）を生成した。Ｍ６６−９の約１０００の葉片を、このゲノムライブラリーを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって接種し、合計３０の独立したスーパー形質転換シュートを得た。３０のスーパー形質転換体において、元の外来遺伝子（強化型Ｐ３５Ｓ：：ｃｅｄ−９、図１ａ）がなおＴＧＳを示していることを確認するために、タンパク質ゲルプロット分析によって、Ｃｅｄ−９の発現を調べた。これらのうち２７の植物においてＣｅｄ−９タンパク質が検出され、これらの植物が、サイレンシングの状態からのエピジェネティックな復帰変異体であることを示唆された（図１Ａ−ｂ）。本発明者らは、これらのスーパー形質転換植物の元の外来遺伝子が、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を失っているので、これらの植物では再導入した構築物にASR活性をもつDNA配列が挿入されている可能性は低いと考え、以降の解析から除外した。（図１Ａ−ａ、右下）。他の３つのスーパー形質転換体は、元の外来遺伝子の発現を示さなかった。これらの結果は、これらの３つの植物における元の外来遺伝子がサイレンシングされており、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ活性を維持していたが、これらの植物におけるスーパー形質転換されたＰ３５Ｓ：：ＨＰＴ選択マーカー遺伝子はサイレンシングを受けていないことを示しており、スーパー形質転換構築物に挿入された各ゲノムフラグメントにＡＳＲ活性があることが示唆される（図１ａ、右下、図１Ａ−ａ、中央下）。本発明者らは、ベクター配列内に設計したプライマーセットを用いるＰＣＲ（図１ｃ）によって、これら３つのスーパー形質転換体から再導入構築物に挿入されたミヤコグサＤＮＡ断片をASR候補として単離した。

（実施例３：サイレンシング抑制因子のエンハンサー活性の評価)
本発明者らは、次に、これらのＡＳＲ候補がサイレンシングの抑制というよりはむしろ、強力なエンハンサー活性を有するために、ＴＧＳを克服したという可能性を検討した。３つのＡＳＲ候補の各々を、ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーター：：ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ遺伝子）カセットの５’の端に挿入した（図２Ａ）。この構築物に挿入した３つのゲノムフラグメントは、ＧＵＳ発現における有意な増加を示さず（表１）、これらのＡＳＲ候補がエンハンサー活性を有さないことを示している。
（実施例４：抗サイレンシング領域（ＡＳＲ）候補のサイレンシング抑制活性の確認：形質転換タバコを用いた例)
外来遺伝子のコピー数と発現レベルとの間の逆の関係性が、しばしば、相同性依存性のＴＧＳにおいて観察されるので（Assaad，F．F.，Tucker，K．L．& Signer，E．R.，Plant Mol Biol．22，1067-1085（1993）；Matzke，M．A.，Mette，M．F.，Aufsatz，W.，Jakowitsch，J．&Matzke，A．J.，Genetica 107，271-287（1999）；Wolffe，A．P.，Curr Biol．7，R796-798（1997））、本発明者らは、これらのＡＳＲ候補の多様な外来遺伝子に対する抗サイレンシング活性を確認するために、Ｐ３５Ｓ領域のコピー数の増加に基づくＴＧＳ誘導系を確立した。本発明者らは、これまでに、強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ（ルシフェラーゼ遺伝子）を有し、かつ、著しく高レベルのＬＵＣ発現を示す遺伝子組換えタバコ植物（図２ａ、ＮＷ７−２４−４）を作成している（Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））。この遺伝子組換え植物は、２コピーの３５Ｓエンハンサー領域と１コピーの３５Ｓプロモーター領域を有する強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ構築物に関して、単一コピーが挿入されたホモ接合体であるため、この植物は、１つの二倍体細胞につき、４コピーの３５Ｓエンハンサー領域と２コピーの３５Ｓプロモーター領域を有する（図２ａ）。本発明者らは、この強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物を、ｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳでスーパー形質転換した（図２ａ、図２Ａ）。この強化型Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳ構築物を強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物にスーパー形質転換すると、得られるスーパー形質転換体は、少なくとも８コピーの３５Ｓエンハンサー領域と４コピーの３５Ｓプロモーター領域を有するはずである（ＣＳＴ、コントロールスーパー形質転換体）（図２ａ）。強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物を強化型Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳ構築物でスーパー形質転換した場合、得られたスーパー形質転換体のおよそ半分が、極めて低いレベルのＧＵＳの発現を示した（図２ｂ）。これに対し、野生型のタバコをｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳで形質転換した場合、異なるベクターにおける同じＧＵＳカセットについて報告されたとおり（Mitsuhara I．et al.，Plant Cell Physiol．37，49-59（1996））20、形質転換体の大部分が比較的高いＧＵＳ発現を示した（ＣＴ、コントロール形質転換体）（図２ｂ）。ＣＳＴにおいてＧＵＳの発現を示さないか、または低いＧＵＳ発現を示す植物の頻度がより高いのは、スーパー形質転換体における３５Ｓエンハンサー／プロモーターのコピー数の増加によるＴＧＳに起因するものと示唆される（図２ｂ、ＣＳＴ）。
このＴＧＳ誘導系を用いて、本発明者らは、３つのＡＳＲ候補が本物の抗サイレンシング活性を示すかどうかを検討した。ＡＳＲを含むｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳ構築物（図２ａ右、図２Ａ（補足図２））を、強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物中にスーパー形質転換した。ＡＳＲ候補を含むスーパー形質転換体（ＡＳＲ ＳＴ）（図２ｂ）において、抑制されたＧＵＳ活性を示す植物の頻度は、ＡＳＲ無しのスーパー形質転換植物（ＣＳＴ、コントロールスーパー形質転換体）のものよりも低く（図２ｂ）、これらのＡＳＲ候補はこのスーパー形質転換系においても抗サイレンシング活性を有することが示唆される。ＡＳＲ１０２ ＳＴおよびＡＳＲ６０２ ＳＴは、コントロールの形質転換体／スーパー形質転換体（ＣＴおよびＣＳＴ）よりも高いＧＵＳ活性のメジアン値を示した（図２ｂ）。最も短いＡＳＲ６０２（１７１ｂｐ）を、最も有望なASR候補としてさらなる特徴付けのために、選択した。
実施例１〜４の結果から、本発明において、「高頻度でサイレンシングが起こる系」を選抜し、そのサイレンシングを抑制する活性を指標に、ゲノムライブラリーからTGSを抑制するDNA配列をスクリーニングすることが可能な系を開発することができたことが実証される。
（実施例５：サイレンシング抑制因子のさらなる特徴づけ：強化型Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物であるＮＷ７−２４−４にスーパー形質転換されたＧＵＳ構築物に対する強化型Ｐ３５ＳプロモーターのＤＮＡメチル化状態の分析）
本実施例では、サイレンシング抑制因子のさらなる特徴づけを行った。
ＴＧＳは、しばしばプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を伴う（Matzke M．et al.，Biochim．Biophys．Acta．1677，129-141（2004）；Bender J.，Annu Rev Plant Biol．55，41-68（2004））。 本発明者らは、ＰＣＲを利用したメチル化アッセイを用いて、ＡＳＲ６０２有またはＡＳＲ６０２無しのいずれかのスーパー形質転換体において、ＧＵＳ遺伝子と融合させた３５Ｓエンハンサー／プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化状態を分析した（図２ａ、ＡＳＲ６０２ ＳＴおよびＣＳＴ）。ＧＵＳ遺伝子と融合させた３５Ｓエンハンサー／プロモーター領域（図２ＡのｐＭＬＨ２１１３−ＧＵＳの斜線の横棒）を、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後、ＰＣＲ増幅を行った（プライマー等については、表３を参照）。プロモーター領域が重度にメチル化されている場合、この領域内のＤＮＡは、酵素分解に対して抵抗性であるはずであり、結果としてこの領域からのＰＣＲ産物が増幅される。ＡＳＲ６０２無しのスーパー形質転換体の多くでは、制限酵素による処理後に増幅されたＰＣＲ産物が検出され、ＧＵＳと融合させた３５Ｓエンハンサー／プロモーター領域が、ＡＳＲ６０２無しのスーパー形質転換体において重度にメチル化されることを示唆する（図２ｃ、ＣＳＴ）。これに対して、ＡＳＲを含むスーパー形質転換体からは増幅されたＤＮＡはほとんど検出されなかった（図２ｃ、ＡＳＲ６０２ ＳＴ）。このアッセイの結果は、ＡＳＲ６０２が、ＤＮＡのメチル化から、隣接するエンハンサー／プロモーター領域を保護することを示唆した。（図２Ａ）。
（実施例６：同じスーパー形質転換体における既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣ挿入物上でのサイレンシングの誘導）
本発明者らは次に、このＴＧＳがまた、同じスーパー形質転換体における既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣ挿入物上で誘導されるかどうかを検討した（図２ｄ）。Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳのスーパー形質転換体は、既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣ遺伝子座を変更しないので、スーパー形質転換体は全て、高いレベルのＬＵＣ発現を示すはずである。しかしながら、Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ植物のＰ３５Ｓ：：ＧＵＳスーパー形質転換体によって誘導されたＴＧＳが、ｔｒａｎｓ−ＴＧＳである場合、既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣの発現に影響を与えうる。本発明者らは、このスーパー形質転換された系統の中でかなりの数の植物が低いレベルのＬＵＣ発現を示すことを見出した（図２ｄ、左）。ＡＳＲ６０２無しのスーパー形質転換体（図２ｄ、右上、ＣＳＴ／全体）では、Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳとＰ３５Ｓ：：ＬＵＣの発現レベルとの間に、有意な正の相関性が存在した（表２）；低いＧＵＳ発現を有するこれらのスーパー形質転換体の大部分は、極めて低いＬＵＣの発現を示したことから、Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳおよびＰ３５Ｓ：：ＬＵＣの３５Sプロモーター間の相互作用によってお互いにＴＧＳが誘導されたことを示した（図２ｄ、左上、ＣＳＴ／全体）。
本発明者らは次に、ＡＳＲ６０２を配置したＰ３５Ｓ：：ＧＵＳをスーパー形質転換する場合に、Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣのＴＧＳが生じるかどうかを検討した。ＡＳＲ６０２（ＡＳＲ６０２ ＳＴ）を含むスーパー形質転換体では、ごく少数の植物がＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ外来遺伝子および／またはＰ３５Ｓ：：ＬＵＣ外来遺伝子の低い発現を示し（図２ｄ、左下、ＡＳＲ６０２ ＳＴ／全体）た。この結果は、ＡＳＲ６０２を含むＰ３５Ｓ：：ＧＵＳを持つスーパー形質転換体において、ＡＳＲ６０２が連結されたＰ３５Ｓ：：ＧＵＳのＴＧＳを予防した結果として、別の遺伝子座に存在するＰ３５Ｓ：：ＬＵＣに対するｔｒａｎｓ−ＴＧＳをも抑制することを示唆している。
複数コピーの外来遺伝子を有する植物は、複雑な遺伝子組換え遺伝子座を形成したり（Tzfira T.，Li，J.，Lacroix，B，& Citovsky，V.，Trends in Genet．20，375-383（2004））、そして／または、ＰＴＧＳを受けたりする（Wassenegger M．Gene silencing．Int Rev Cytol．219，61-113（2002）；Mitsuhara I．et al.，Genetics 160，343-352（2002））傾向がある。本発明者らは、検討した全植物（図２ｄ、左、全体）から、１コピーのＰ３５Ｓ：：ＧＵＳを含むスーパー形質転換体（図２ｄ、右、１コピー）、を選択するために、Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳのコピー数を測定した。スーパー形質転換体におけるＰ３５Ｓ：：ＧＵＳのコピー数を決定するために、スーパー形質転換体から単離したゲノムＤＮＡを用いたリアルタイムＰＣＲにより、ＧＵＳ／ＬＵＣの遺伝子量比を測定した（表３）。本発明者らは、１コピーの挿入を持つスーパー形質転換体を選択し、これらのＧＵＳ発現およびＬＵＣ発現のデータを再度プロットした（図２ｄ、右、１コピー）。ＡＳＲ６０２無しのスーパー形質転換体（図２ｄ、右上、ＣＳＴ／１コピー）において、およそ半分の植物（７／１３）が、既存のＰ３５Ｓ：：ＬＵＣおよびスーパー形質転換したＰ３５Ｓ：：ＧＵＳの低い発現レベルを示した（表２）。ＡＳＲ６０２を持つスーパー形質転換体（図２ｄ、右下、ＡＳＲ６０２ ＳＴ／１コピー）では、Ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ外来遺伝子および／またはＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ外来遺伝子が低い発現レベルを示す植物はなかった（０／１２）。これらの結果は、ＡＳＲ６０２が、スーパー形質転換した遺伝子の単回の挿入によって誘導されるＴＧＳ／ｔｒａｎｓ−ＴＧＳを効率的に抑制することを示した。
（実施例７：天然植物でのサイレンシング抑制の効果の確認）
ＡＳＲ６０２が、別の植物種および別のプロモーターにおいて抗サイレンシング活性を示すかどうかを検討するために、本発明者らは、ＡＳＲ６０２有／ＡＳＲ６０２無しのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ開花遺伝子（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるＦＷＡのゲノムクローンを用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓコロンビア株（Ｃｏｌ）野生型を形質転換した。内在性のFWA遺伝子は、遺伝的なサイレンシングによって発現が抑制されておりプロモーター領域に存在する直列の反復配列が高度にメチル化されている；このFWA遺伝子のメチル化が低下しているｆｗａ変異体は、異所性のＦＷＡ過剰発現を示し、遅い開花という表現型を示す（Soppe，W．J．et al.，Mol．Cell 6，791-802（2000））。直列の反復配列を含むＦＷＡゲノムクローンを野生型植物に形質転換によって導入した場合、ＦＷＡ外来遺伝子が効率的にサイレンシングされるため、開花時期は変更されない（Soppe，W．J．et al.，Mol．Cell 6，791-802（2000）；Cao，X．&Jacobsen，S．E.，Curr．Biol．12，1138-1144（2002））。ＡＳＲ６０２が抗サイレンシング活性を有する場合、ＡＳＲ６０２と連結したＦＷＡ遺伝子で形質転換した野生型植物では、このＦＷＡ外来遺伝子のサイレンシングが抑制されるはずであり、結果として、このＦＷＡ外来遺伝子が発現して遅い開花を示すはずである。ＡＳＲ６０２無しのＦＷＡゲノムクローン（図２Ａ）をＣｏｌ内に形質転換した植物（図３、ＦＷＡ）は、ベクターコントロール形質転換体（図３ｂ、ベクター）および野生型植物（Ｃｏｌ、データ示さず）と同じ開花時期を示したことから、既報のとおり導入したＦＷＡ外来遺伝子がサイレンシングされることが確認された。ＡＳＲ６０２を配置したＦＷＡゲノムクローンをＣｏｌ内に形質転換した植物（図３、ＡＳＲ＋ＦＷＡ）は、ＡＳＲなしのＦＷＡの形質転換体（図３、ＦＷＡ）およびベクターコントロール形質転換体（図３ｂ、ベクター）の両方と比べて、有意に遅い開花を示し、ＡＳＲ６０２がＦＷＡ外来遺伝子のサイレンシングを抑制することが確認された。「ＦＷＡ」形質転換体および「ＡＳＲ＋ＦＷＡ」形質転換体（Ｔ０世代、図３）の両方からの植物の次世代（Ｔ１世代）は、開花時期に関して、両方のＴ０形質転換体と同じ傾向を示した。これらの結果は、ＡＳＲ６０２がスクリーニングに用いたタバコ植物や３５Sプロモーターに限定されず、別の種（Arabidopsis）において別のプロモーター（FWA）に対してもTGS抑制活性を示すことを示唆した。
（実施例８：サツマイモでのサイレンシング抑制例）
本実施例では、サツマイモでのサイレンシング抑制例を示す。
サツマイモの形質転換には、鹿児島県農業開発総合センターバイオテクノロジー研究所で樹立した、鹿児島県サツマイモ高系１４号茎頂由来の胚発生能を有するカルス（Ｋ９カルス）を材料とした。同様の胚発生能を有するカルスは、大谷ら（１９９６年 Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４６： ２５７−２６０）の方法にしたがって作成することができる。サツマイモ高系１４号は、青果用サツマイモ「べにさつま」「鳴門金時」「ことぶき」「宮崎紅」「土佐紅」「五郎島金時」などとして一般に市販されており、容易に入手することができる。
ＡＳＲを持つないしは持たない改変３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ融合遺伝子をもつベクター（ｐＭＬＨ２１１３ＧＵＳ，ｐＭＬＨ２１１３ＧＵＳ５０１−， ｐＭＬＨ２１１３ＧＵＳ６０２−）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＨＡ１０５株を用いて形質転換した。前培養用培地（１ｍｇ／ｌ ４―フルオロフェノキシ酢酸， ３％ スクロース， ０．３％ ジェランガム（Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ），ｐＨ５．８）で培養したカルス５００ｍｇおよびアグロバクテリウム４ｍｌおよび共存培養培地（１ｍｇ／ｌ ４―フルオロフェノキシ酢酸，３％ スクロース，ｐＨ５．８） ２０ｍｌを混合して室温で３５分５０ｒｐｍで緩やかに混和したのち、静置してカルスを沈殿させた。アグロバクテリウムを含む培養液を駒込ピペットにより取り除いた後、１０ｍｌの共存培地で洗浄した。このカルスを１ｍｌの共存培地に懸濁したのち、濾紙上に広げて２５℃暗所で培養する。３日後、スルベニシリン（Ｓｕｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）２５０ｍｇ／ｌを含む共存培地２０ｍｌでカルスを洗浄し、さらに、スルベニシリン２５０ｍｇ／ｌ，パロモマイシン（Ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含むＭＳ培地でさらに２回洗浄したのち、選択培地上（１ｍｇ／ｌ ４−フルオロフェノキシ酢酸，３％スクロース， ２５０ｍｇ／ｌ カルベニシリン，２５ｍｇ／ｌ パロモマイシン，１％寒天，ｐＨ５．８）にカルスを広げた。選択培地上で２５℃、暗所で培養し、約２カ月で形質転換された細胞が増殖して、細胞塊が形成された。
得られた細胞塊を細胞塊毎に取りだし、定法（たとえばＭｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）にしたがって、ｘ−ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸）を基質とする組織化学染色を行ったところ、この時従来型のＡＳＲを持たない導入遺伝子で形質転換された場合は、多くの細胞塊でＧＵＳ遺伝子が発現しないないしはＧＵＳ活性を持たない細胞の割合が高い傾向が有った。したがって、かなりの頻度でサイレンシングが起きていると考えられる。一方、ＡＳＲを含む導入遺伝子をもつ細胞塊では、全体の細胞がＧＵＳを発現している割合が高かった。したがって、ＡＳＲによってサイレンシングが抑制されていると考えられる。
結果を図５に示す。図５に示すように、本発明で同定されたサイレンシング抑制因子（ＡＳＲ６０２， ＡＳＲ５０１）はＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子の発現変動性を抑制する。図５の左上および右上に示すように、Ｐ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子のみを形質転換したサツマイモカルス（ＡＳＲ無し）では、多数のＧＵＳが発現していない細胞が認められる。ＧＵＳ発現細胞は数も少なく、発現程度のばらつきも大きいことが分かった。一方、図５の中央下に示すように、ＡＳＲ６０２を融合させたＰ３５Ｓ：：ＧＵＳ遺伝子を形質転換したサツマイモカルスでは、カルス内のほぼ全ての細胞でＧＵＳが高発現している細胞塊の割合が高いことが分かった。細胞塊全体がＧＵＳ活性を示した細胞塊（ＧＵＳ＋＋＋）をＧＵＳ発現系統、ＧＵＳ発現が認められない（ＧＵＳ−）もしくは発現している細胞と発現していない細胞が混在している（Ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ， ＧＵＳ＋−）をＧＵＳサイレンシング系統として、２分し、両者をχ自乗検定によって優位差検定を行ったところ、ＡＳＲ６０２およびＡＳＲ５０１を導入したベクターで形質転換した場合、コントロールベクターと比べて、発現細胞塊の割合が統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に増加しており、サイレンシング抑制効果がサツマイモで生じていることを実証することができた。
以上から、得られたＤＮＡ配列が、複数の植物で異なった原因で起こるＴＧＳを抑制する活性を持っていることを確認した。
（実施例９：サイレンシング抑制因子の配列解析）
（３つのＡＳＲ候補の一次構造）
３つのＡＳＲ候補のヌクレオチド配列を、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用い、クエリーとして解析した（パラメータは、ＢＬＡＳＴ ２．２．２５の定義に従った）。これらの配列全体の間には、配列の類似性はなかった（ＢＬＡＳＴにおけるｂｌ２ｓｅｑによるＥ値＞０．００９）。ＡＳＲ１０２（約３．０ｋｂｐ）は、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム配列（ＡＰ０１０４４７．１）に対して非常に高い類似性を示した（ＢＬＡＳＴＮによる最大スコア＝５３７１、クエリー適用範囲＝１００％、Ｅ値＝０、最大同一性＝９９％）。また、ＡＳＲ１０２は、７つのＥＳＴ（Ｅ値＜１０−１1）および５２の仮想タンパク質（ＢＬＡＳＴＸによるＥ値＜１０−４０）に対する顕著な類似性を示し、ＡＳＲ１０２がタンパク質コード遺伝子の一部であることが示唆された。ＡＳＲ５０１（約３００ｂｐ）は、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム配列（ＡＰ０１０４３９．１）に対して非常に有意な類似性を示した（ＢＬＡＳＴＮによる最大スコア＝５５３、クエリー適用範囲＝１００％、Ｅ値＝１０−１５３、最大同一性＝９９％）。また、ＡＳＲ５０１は、１８のＥＳＴ（Ｅ値＜１０−７）およびいくつかの「with no lysine（リジンなし）」キナーゼ（ＢＬＡＳＴＸによるＥ値＜８ｘ１０−４）に対する顕著な類似性を示した。ＡＳＲ６０２の配列（１７１ｂｐ）は、いかなる配列データベースにも登録されていなかったが、ＡＳＲ６０２に類似する配列は、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム内に豊富にあり、また、十分に保存されていた（ＢＬＡＳＴＮによる）。
（実施例１０：ＡＳＲ６０２配列を用いた類似性検索）
ＡＳＲ６０２配列を、ＧｅｎＢａｎｋの非冗長ヌクレオチドデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のクエリーとして用いた場合、このクエリー配列は、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓから多数のヒット（１６９の非冗長エントリー、Ｅ値＜１０−１１）＜表１Ａを参照＞をもたらしたが、他の生物からはヒットをもたらさなかった（Ｅ値＞０．０５４）；このクエリー配列を、ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴデータベースに対して用いた場合、この検索は、３つのＬｏｔｕｓ ＥＳＴ（ＢＰ０３３６３３、ＢＦ１７７５２４、ＢＰ０５５５５７；Ｅ値＜１０−２１）をもたらした；ＧｅｎＢａｎｋ内のＢＬＡＳＴＮの残る１３のデータベースのいずれにおいても、このクエリー配列は、いかなる他の生物からのヒットももたらさなかった（Ｅ値＞１０−４）。ＡＳＲ６０２自体は、いかなる配列データベースにも登録されていなかったが、ＡＳＲ６０２に類似する配列は、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム内に豊富にあり、また、高度に保存されていた；この類似配列は、染色体に割り当てられたＬ．ｊａｐｏｉｎｃｕｓの独立したコンティグにおいて頻繁に見られた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｌｏｔｕｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（図３Ａ）。非冗長エントリーからなるＬ．ｊａｐｏｉｎｃｕｓのコンティグのＡＳＲ６０２に類似する配列の周辺をさらに解析すると、これらの配列がレトロトランスポゾンファミリーのメンバーに由来する部分であったことが示唆された（図４ａおよび図４Ａ）。これらの多くは、種特異的な長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）（１．２ｋｂ）を含む。このＬＴＲ間に挟まれたゲノム単位をＢｌａｓｔＸ検索した結果、検討した「ＬＴＲ間に挟まれた単位」は、全て、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａファミリーのレトロトランスポゾン内に保存されたいくつかのタンパク質ドメインを含むことが明らかになった（図４ｂ）。これらの単位の両端（LTRの外側）にはしばしば、ゲノム中の挿入位置ごとに異なる５塩基配列の標的部位の重複が隣接していた。これらの結果は、これらの単位がＴｙ１／ｃｏｐｉａファミリーのレトロトランスポゾンに起源するものであったことを示唆した。
逆に考えれば、これらのレトロトランスポゾンに存在する類似配列は、いずれも、サイレンシング抑制活性を有しうる可能性を有することが示唆された。
（実施例１１：配列絞込み例）
本実施例では、サイレンシング抑制因子の配列についてさらに分析する。
上記実施例で得られた、ＡＳＲ６０２を７０ｂｐ程度に切り分けたものと、１２ｂｐの疑わしい反復配列について、ＦＷＡ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの系で活性を確認する実験を行う。手法は実施例６、７および８に記載した手法に準じる。これらの結果が出た時点で、ある程度の予測を行い、必要に応じてさらに絞り込みの実験を行う。
（実施例１２：ベクター作成例）
本発明のサイレンシング抑制因子を含むベクターとして、汎用性のあるものを作成する。
Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ． ３７（１）： ４９−５９ （１９９６）または本明細書において引用した他の論文等を参考にして、本発明のサイレンシング抑制因子を含むベクターを作成することができる。
基本的に、例示されるｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ、ｐＥｌ２Ｏｍｅｇａ−ＧＵＳ，、ｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳ等にはユニークなＨｉｎｄ３部位があり、クローニングしてきたＡＳＲ断片にも両端にＨｉｎｄ３部位が存在する。これらのｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ， ｐＥｌ２Ｏｍｅｇａ−ＧＵＳ，、ｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳも含め主要なベクターに関して、Ｈｉｎｄ３は目的の遺伝子を駆動する改変３５Ｓプロモーターの直上流にあるため、ここに挿入すれば保護したいプロモーターと本発明のサイレンシング抑制因子（ＡＳＲ）とが隣接することになる。
より具体的には、ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳなどをＨｉｎｄ３で切断後ＣＩＡＰ または ＢＡＰ処理によって末端を脱リン酸化して自己ライゲーションを抑制しておく。ＣＩＡＰ または ＢＡＰ処理後フェノール抽出によって酵素を不活性化したのちに、ベクターＤＮＡはエタノール沈殿によって回収する。
ＡＳＲ６０２などがクローニングされたプラスミドベクターをＨｉｎｄ３で分解後、ＡＳＲ断片をアガロースゲル電気泳動によってプラスミドと分離し、ゲルからＡＳＲ配列に相当するＤＮＡを回収する（回収には、Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ， ＢＩＯ１０１などのキットを使用、方法は適用可能なものであれば、当該分野で公知のどの手法を用いても良い）。
ベクターとＡＳＲをＤＮＡリガーゼによって結合させた後、定法によって大腸菌に形質転換してＡＳＲが挿入されたベクターを持つ大腸菌を作成する。ベクターの選抜マーカー（この場合はＫｍ）抵抗性となった大腸菌コロニーからベクターＤＮＡを調整して、ＡＳＲが正しく挿入されたクローンを選択する。
これによって、本発明のサイレンシング抑制因子を含むベクターを作製することができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
本発明により、形質転換用ベクターに組込むことで、導入遺伝子のTGSを抑制し安定的に外来遺伝子を発現させることができるようになる。これにより、組換え生物作出のための労力を節約することが可能になると共に、形質転換体で有るにもかかわらず導入遺伝子が発現しなくなるという危険性を低減することも可能になる。また、研究・産業用のベクターとして流通することも考えられる。植物形質転換用ベクターシリーズは、農作物（例えば、イネ、ムギ、トウモロコシ等の穀物、果物、工芸作物等を含む）、観賞用植物などに使用されうることから、これらの用途として利用することができる。
受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２１５６
（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１５６）
配列番号１：ＡＳＲ６０２の核酸配列
配列番号２：ＡＳＲ１０１の核酸配列
配列番号３：ＡＳＲ５０１の核酸配列
配列番号４：ＡＳＬ１の核酸配列
配列番号５：ＡＳＬ２の核酸配列
配列番号６：ＡＳＬ３の核酸配列
配列番号７：ＡＳＬ４の核酸配列
配列番号８：ＡＳＬ５の核酸配列
配列番号９：ＡＳＬ６の核酸配列
配列番号１０：ＡＳＬ７の核酸配列
配列番号１１：ＡＳＬ８の核酸配列
配列番号１２：ＡＳＲ６０２の核酸配列（配列番号１）の中と、直後に存在するＡＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣ
配列番号１３：ＢＬ３１、ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＧＧＣ Ｃ
配列番号１４：Ｐ３５−３１、ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＴＡ ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｔ
配列番号１５：ｐＢＩ−Ｈｉｎｄ３−５１ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＧＣ
配列番号１６：ＧＵＳＩ３、ＴＡＣ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＧＧ ＣＧ
配列番号１７：ＧＵＳＩ５１、ＧＣＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＡ
配列番号１８：ＬＵＣＩ５１、ＧＴＡ ＡＴＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣ
配列番号１９：Ｔｎｏｓ Ｙｏｍｅｒｕ、ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＡＡＴ
配列番号２０：ＵＰ ＦＷＡ５１、ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＡＧ ＴＡＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＣＧ ＡＣＡ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＧＴＣ ＴＣ 下線は制限部位である。
配列番号２１：ＦＷＡ３２、ＴＴＡ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＴＡ ＴＡＧ ＴＧ 下線は制限部位である。
配列番号２２：ＴＮＴ１の部分配列（図４のＢ）
配列番号２３：ＣＯＰＩＡの部分配列（図４のＢ）
配列番号２４：ＡＳＬ１のアミノ酸配列（図４のｂ）
配列番号２５：ＡＳＬ２のアミノ酸配列（図４のｂ）
配列番号２６：ＡＳＬ８のアミノ酸配列（図４のｂ）

Claims (29)

  1. （ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列；
    （ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；
    （ｃ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列；
    （ｄ）配列番号１〜３のいずれか１つに示す配列に対して、高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列；
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）の配列の一部を含む配列；および
    （ｆ）（ａ）〜（ｅ）の配列の相補配列；
    からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む、
    核酸分子。
  2. 前記核酸分子は、サイレンシング抑制活性を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記配列は、配列番号１、２または３に示す配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 請求項１に記載の核酸分子を含む、サイレンシング抑制因子。
  5. 請求項４に記載のサイレンシング抑制因子を含むベクター。
  6. さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる、請求項５に記載のベクター。
  7. さらに、導入されるべき遺伝子が作動可能に前記ＴＧＳ抑制因子に連結されて含まれる、請求項５に記載のベクター。
  8. さらに、プロモーターが作動可能に連結されて含まれる、請求項７に記載のベクター。
  9. 請求項５に記載のベクターを含む、遺伝子を導入するための組成物。
  10. 請求項５に記載のベクターを含む、細胞。
  11. 植物細胞である、請求項１０に記載の細胞。
  12. 請求項５に記載のベクターを含む、植物組織。
  13. 請求項５に記載のベクターを含む、植物器官。
  14. 請求項５に記載のベクターを含む、植物体。
  15. 請求項５に記載のベクターを含む、種子。
  16. 請求項５に記載のベクターを含む細胞、植物組織、植物器官、植物体および／または種子に由来する加工品。
  17. （Ａ）高頻度でサイレンシングが起こる系を提供する工程；
    （Ｂ）該高頻度でサイレンシングが起こる系に、候補核酸を導入する工程；
    （Ｃ）該高頻度でサイレンシングが起こる系において、サイレンシングが抑制されるかどうかを決定する工程；
    （Ｄ）工程（Ｃ）において、該サイレンシングの抑制をもたらした該候補核酸を選択する工程；
    を包含する、サイレンシング抑制因子のスクリーニング方法。
  18. 前記サイレンシングは、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）により生じる、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  19. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、トランス−転写型遺伝子不活性化（ｔｒａｎｓ−ＴＧＳ）が高頻度で起こる系である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  20. 前記サイレンシング抑制因子は、転写型遺伝子不活性化（ＴＧＳ）抑制因子である、請求項１９に記載のスクリーニング方法。
  21. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、前記導入工程（Ｂ）は、前記候補核酸と該プロモーターとを共に含むベクターを用いて行われることをさらに特徴とする、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  22. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、前記（Ｂ）導入工程において使用される導入手法を用いた場合に少なくとも９０％でサイレンシングが起こる、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  23. 前記サイレンシングが生じた場合、前記系の個体は発生せず、該サイレンシングが生じない場合、該系の個体が発生する、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
  24. 前記サイレンシングが生じた場合と、該サイレンシングが生じない場合とで、前記系の表現型が異なる、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
  25. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、人工的にサイレンシングを生じさせたものである、請求項１７に記載の方法。
  26. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、天然にサイレンシングが起きる系である、請求項１７に記載の方法。
  27. 高頻度でサイレンシングが起こる系を備える、サイレンシング抑制因子のスクリーニングを行うためのキット。
  28. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、あるプロモーターについて高頻度でサイレンシングが起こる系であり、該プロモーターを含む候補核酸を導入のベクターをさらに備える、請求項２７に記載のキット。
  29. 前記高頻度でサイレンシングが起こる系は、アグロバクテリウム形質転換系で形質転換した場合に少なくとも９０％導入遺伝子の発現が抑制される、請求項２７に記載のキット。
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