JP2005110594A - ウイルスベクター発現用dna断片およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 任意の有用タンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのcDNAにリボザイム配列を連結させたDNA断片を細胞に導入することにより、細胞内でcDNAから転写されたウイルスRNAの3’末端に付加された余分な配列をリボザイムが切断し、大幅にウイルスRNAの蓄積を増加させることが可能となった。
【選択図】 図1
Description
Mori, M., Fujihara, N., Mise, K. and Furusawa, I. (2001) Inducible high-level mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plants. Plant J 27(1), 79-86. 石川県農業短期大学附属農業資源研究所平成13年度年報 No.10 2001、p.14-15. (発行日:平成14年9月25日) Kaido, M., Mori, M., Mise, K., Okuno, T. and Furusawa, I. (1997) Auto-cleavable ribozyme sequence attached to brome mosaic virus cDNAs enhances accumulation of viral RNAs transcribed in vivo from the cDNAs. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 63, 95-98. Turpen, T.H., Turpen, A.M., Weinzettl, N., Kumagai, M.H. and Dawson W.O. (1993) Transfection of whole plants from wounds inoculated with Agrobacterium tumefaciens containing cDNA of tabacco mosaic virus. J. Virol. Methods. 42(2-3), 227-239.
1)ウイルスベクターを転写発現する形質転換体であって、任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合したDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体。
2)トバモイルス属由来のウイルスベクターを転写発現する形質転換体であって、任意のタンパク質コードする遺伝子を挿入したトバモイルス属由来ウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合したDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体(植物体または培養細胞)。
3)ウイルスベクターを転写誘導できる形質転換体であって、任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合し、かつウイルスベクターを転写誘導可能なDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体。
植物に任意の有用タンパク質を生産させるため、発明者らは大規模生産能力、高生産効率および安全性を併せ持つタンパク質合成系である、高効率mRNA誘導増幅系を構築した。以下に、発明者らが構築したブロムモザイクウイルスを用いた高効率mRNA誘導増幅系の概略を説明する(非特許文献1参照)。ブロムモザイクウイルスは非常に高い複製能力を持つウイルスで、一本鎖プラス鎖RNAを遺伝子とし、複製酵素の1aおよび2aタンパク質をそれぞれコードするRNA1およびRNA2、細胞間および全身移行に必要な3aと外被タンパク質をコードするRNA3からなる。外被タンパク質はRNA3のマイナス鎖からウイルスの複製酵素により合成されるサブゲノムmRNAから翻訳される。そこで、RNA1のcDNA、RNA2のcDNAおよび外被タンパク質遺伝子を有用タンパク質をコードする遺伝子で置換したキメラRNA3のcDNAとをそれぞれ植物細胞に導入し、3種のウイルスRNA遺伝子を持つ形質転換植物を作製した。RNA2およびキメラRNA3はカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを用いて恒常的に発現させ、RNA1はステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターにより発現を制御した。これにより、ステロイドホルモンで処理した場合のみウイルスの複製酵素が形成され、有用タンパク質のmRNAが増幅される、高効率mRNA誘導増幅系が構築できた。
1)非常に効率よく有用タンパク質のmRNAを発現できる。
2)有用タンパク質の発現は、誘導制御できる。
3)発現制御が可能なことにより、植物の生長に毒性を持つタンパク質の合成を可能にする。
4)圃場等の開放系では発現を抑制し、工場などの閉鎖系で誘導生産できることから、高い安全性を持つ。
5)導入された増幅可能なウイルス遺伝子は、外被タンパク質を持たないため、他の植物への感染能力がなく、さらに粒子化できないことから安全である。
本発明に係るDNA断片は、細胞に任意のタンパク質を生産させるために使用するDNA断片であり、その構成には少なくとも細胞に生産させようとする任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入した、RNAを遺伝子とするウイルスベクターのcDNAと、その3’末端に結合したリボザイム配列とを有することが必要である。細胞に生産させる任意のタンパク質は特に限定されるものではなく、外来の有用タンパク質であってもよく、当該植物が本来有するタンパク質であってもよい。例えば、医薬品として利用可能なヒトのタンパク質等が好適である。
上記DNA断片およびベクターは有用な任意のタンパク質を生産する細胞を作製するために利用できるものである。したがって、上記DNA断片またはベクター、および細胞の形質転換に必要な試薬、器具等をキット化しておけば、利用者は上記DNA断片またはベクターを導入した形質転換体を簡便に作製することが可能となる。
本発明に係る形質転換体は、上記DNA断片またはベクターを植物細胞に導入することにより、または上記植物細胞形質転換用キットを使用することにより得られる形質転換体である。当該形質転換体を得ることにより、目的の有用タンパク質を生産することが可能となる。
A)ウイルスベクターを転写発現する形質転換培養細胞においてリボザイム配列を用いた点。
B)トバモウイルス属由来のウイルスベクターを転写発現する形質転換体(培養細胞および植物個体)においてリボザイム配列を用いた点。
C)ウイルスベクターを転写誘導できる形質転換体においてリボザイム配列を用いた点。
本実施例においては、発現させるタンパク質を緑色蛍光タンパク質(以下GFPと略記する。)とし、GFPをコードする遺伝子(以下GFP遺伝子と記載する。)を挿入したToMVベクターを含むベクターを使用した。図1Aに肝炎デルタウイルスのリボザイム配列を付加したベクターの模式図を示し、図1Bにサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列を付加したベクターの模式図を示した。ベクターの構築に用いたリボザイム配列(DNA配列)については、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列を配列番号1に、サテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列を配列番号2に示した。配列番号1に示した配列は、肝炎デルタウイルスのゲノム配列(GenBank accession No. X77627他)のアンチゲノミックリボザイム配列に基づいて改変したものであり、配列番号2示した配列は、サテライトタバコリングスポットウイルスのゲノム配列(GenBank accession No. M17439)のリボザイム配列に基づいて改変したものである。リボザイム配列はいずれもToMVベクターのcDNAの3’末端に連結した。リボザイム配列以外の構成はいずれのベクターも同一である。図1A中、H-Rzは肝炎デルタウイルスのリボザイム配列を表し、図1B中、S-Rzはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列を表す。図1Aおよび図1Bに共通して、6XUASGal4はステロイドホルモンで転写誘導されるプロモータ−、ToMV-GFP cDNAはGFP遺伝子を挿入したトマトモザイクウイルスのcDNA、3AはエンドウrbcS-3Aポリアデニル化配列、Hygrはハイグロマイシン耐性遺伝子、E9はエンドウrbc-E9ポリアデニル化配列、GVGはステロイドホルモンで活性化される転写因子、P35Sはカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、ハサミの印はリボザイムにより切断される位置をそれぞれ表す。
図1Aに示したベクターおよび図1Bに示したベクターをタバコ培養細胞であるBY2細胞にアグロバクテリウム法を用いて導入した。すなわち、図1Aに示したベクターおよび図1Bに示したベクターをそれぞれエレクトロポレーション法によってAgrobacterium Tumefacience EHA105系統に導入した。これをカナマイシン(50mg/L)を含むAB sucrose培地で前培養を行った。次にBY2細胞と混合してシャーレに移し、26℃、暗所で42〜48時間静置してBY2細胞を形質転換した。BY2細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン(100mg/L)およびハイグロマイシン(20mg/L)を含むBY2細胞用固形培地に広げ、形質転換BY2細胞を増殖させた。その結果、約100個の抗生物質耐性カルス(形質転換カルス)を得た。同様にコントロールベクターをBY2細胞に導入し、約50個の形質転換カルスを得た。得られたカルスを液体培養することにより、形質転換BY2細胞を得た。なお、BY2細胞の培養には、370mg/Lリン酸二水素カリウム、1mg/Lチアミン塩酸、3%スクロース、0.2mg/L 2,4-Dを含むMS液体培地を用いた。培養は、暗所、26℃、135回転/分で旋回振盪培養し、一週間ごとに1/100量を継代した。転写誘導は定常期の細胞培養液を30μMのデキサメタゾンを含む液体培地に、その1/20量になるように移すことによって行った。誘導48時間後に実体型蛍光顕微鏡(オリンパス社製)、および正立型蛍光顕微鏡(ニコン社製)を用いてGFP特異的な蛍光を観察した。GFP蛍光が認められる細胞と認められない細胞をそれぞれ計数し、発現率を算出した。
図2A、BおよびCに形質転換したBY2細胞におけるGFPの誘導発現を観察した画像を示した。図2Aはリボザイム配列を付加していないコントロールベクターで形質転換したBY2細胞、図2Bは肝炎デルタウイルスのリボザイム配列を付加したベクターで形質転換したBY2細胞、図2Cはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列を付加したベクターで形質転換したBY2細胞のGFPの発現をそれぞれ観察した画像である。図2A、BおよびCから明らかなように、図2Aと比較して図2BおよびCではGFPを発現している細胞の数が顕著に多くなった。
Claims (21)
- 細胞に任意のタンパク質を生産させるために使用するDNA断片であって、
RNAを遺伝子とするウイルスに任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのcDNAと、
上記ウイルスベクターのcDNAの3’末端に結合したリボザイム配列とを有することを特徴とするDNA断片。 - 上記ウイルスベクターは、一本鎖プラス鎖RNAを遺伝子とするウイルス由来であることを特徴とする請求項1に記載のDNA断片。
- 上記ウイルスベクターは植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項1または2に記載のDNA断片。
- 上記ウイルスベクターは、植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項3に記載のDNA断片。
- 上記ウイルスベクターは、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする請求項4に記載のDNA断片。
- 上記ウイルスベクターは、タバコモザイクウイルスベクターまたはトマトモザイクウイルスベクターであることを特徴とする請求項5に記載のDNA断片。
- 上記リボザイム配列は肝炎デルタウイルスのリボザイム配列またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする請求項1ないし6のいずれか1項に記載のDNA断片。
- 上記任意のタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター下流に挿入されることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載のDNA断片。
- 上記任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのcDNAおよびその3’末端に結合したリボザイム配列は、それらの上流に配置された転写誘導可能なプロモーターにより転写制御されることを特徴とする請求項1ないし8のいずれか1項に記載のDNA断片。
- さらに上記転写誘導可能なプロモーターの転写を制御するための転写因子をコードする遺伝子を有することを特徴とする請求項9に記載のDNA断片。
- 上記転写制御にはステロイドホルモンまたはエストロジェンを用いることを特徴とする請求項10に記載のDNA断片。
- 上記転写制御には、ステロイドホルモンで転写誘導活性化される転写因子としてGVGを用い、活性化されたGVGにより転写誘導されるプロモーターとして6XUASGal4を用いることを特徴とする請求項11に記載のDNA断片。
- 請求項1ないし12のいずれか1項に記載のDNA断片を含み、かつ細胞のゲノムに組み込まれる性質を有することを特徴とするベクター。
- 上記ベクターはTiプラスミドであることを特徴とする請求項13に記載のベクター。
- 少なくとも請求項1ないし12のいずれか1項に記載のDNA断片、あるいは請求項13または14に記載のベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換用キット。
- 請求項1ないし12のいずれか1項に記載のDNA断片、請求項13または14に記載のベクター、請求項15に記載のキットのうち、いずれかを用いることにより得られる形質転換体。
- ウイルスベクターを転写発現する形質転換体であって、任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合したDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体。
- トバモイルス属由来のウイルスベクターを転写発現する形質転換体であって、任意のタンパク質コードする遺伝子を挿入したトバモイルス属由来ウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合したDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体。
- 上記形質転換体は植物体または培養細胞であることを特徴とする請求項18に記載の形質転換体。
- ウイルスベクターを転写誘導できる形質転換体であって、任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターの3’末端にリボザイム配列を結合し、かつウイルスベクターを転写誘導可能なDNA断片または当該断片を含むベクターを用いて得られる形質転換体。
- 請求項16ないし20のいずれか1項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
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