JP2013060463A - ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を標的化するための方法および組成物 - Google Patents

ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を標的化するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と選択的に相互作用するとともに、化学療法剤、遺伝子治療ベクター又は他の薬剤を適切な組織へ選択的に標的化するのに適した分子を提供する。
【解決手段】ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、該対象に配列番号１を含む組成物を投与するステップとを含む。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する方法が更に開示され、該方法は、細胞とＬｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する。
【選択図】なし

Description

関連する出願への相互参照
本願は、２００６年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／８０７，２５５号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８０７，２５５号は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
国家により補助された研究に関する申告
本願発明は、ＮＩＨ補助金第ＰＯ１ＣＡ８２７１３号、および同第ＲＯ１ＣＡ１１５４１０号；癌センター（Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ）支援補助金第Ｐ３０ＣＡ３０１９９号；ならびに国防総省補助金第ＤＡＭＤ１７−０２−１−０３１５号のもと、政府の支援でなされた。
発明の分野
本発明は、概して分子医学及び癌生物学に関し、より具体的にはｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する分子に関する。
Ｃ１ｑは古典的補体経路のＣＩ複合体の構成要素である（非特許文献１）。Ｃ１ｑの生物学的機能は多様であり、オプソニン化及び細胞溶解のための補体カスケードの開始並びにＣ１ｑ受容体を発現する細胞型に依存する複数の異なる機能の媒介を含む。Ｃ１ｑは、単球／マクロファージにおけるＦｃＲ及びＣＲ１媒介性食作用を亢進させ（Ｄ．Ａ．Ｂｏｂａｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１８：２００１−２００７；Ｄ．Ａ．Ｂｏｂａｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７；１３８：１１５０−１１５６）、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生を刺激し（Ｋ．Ｒ．Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４６：３３５６−３３６４）、血小板を活性化してαＩＩｂ／β３インテグリン，Ｐ−セレクチン及び凝固促進活性を発現させ（Ｅ．Ｉ．Ｂ．Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８：５７９−５８７；Ｅ．Ｉ．Ｂ．Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５２：５８９６−５９０１）、マクロファージの腫瘍細胞毒性を活性化し（Ｒ．Ｗ．Ｌｅｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０；１４４：２２８１−２２８６）、Ｔ細胞増殖に対して抗増殖作用を及ぼし（Ａ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５３：１４３０−１４４０）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）侵入蛋白質ＩｎＩＢの受容体として機能するＢｒａｕｎら、ＥＭＢＯ Ｊ，２０００；１９：１４５８−１４６６）。
Ｃ１ｑ分子の球状頭部に結合する、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２（或いは、ｐ３２と称され、本明細書ではｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と称される）と称される３３キロダルトン（ｋＤ）の受容体が同定され、クローニングされ、配列決定されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の結晶構造も判明している（Ｊｉａｎｇら、ＰＮＡＳ，１９９９；９６，３５７２−３５７７）。ｃＣ１ｑＲと称される別の６０ｋＤの受容体は、Ｃ１ｑのアミノ末端コラーゲン様領域に結合する（Ｂ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．１９８９；８４：２０４−２１５；Ａ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５３：１４３０−１４４０）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によるｇＣ１ｑ−Ｒ ｍＲＮＡの検出及び免疫化学的方法によるｇＣ１ｑ−Ｒ蛋白質の発現に基づき、この受容体は、多数の異なる細胞型、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、線維芽細胞、血小板、内皮細胞、肝細胞、神経細胞及び平滑筋細胞に存在することが見出された。ｇＣ１ｑ−Ｒ蛋白質は腫瘍細胞及び腫瘍において過剰発現している（非特許文献５）。
血管の内膜は高度に多様性である。多くの、また、おそらくすべての正常組織はその血管系に組織特異的「シグネチャー」を付与し、腫瘍血管は形態及び分子組成において正常血管と異なる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００２；２：８３−９０）。腫瘍は膨張性増殖を支持するため、血管新生を誘導し（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ．Ｔｈｅ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ ２０００；１００：５７−７０）、腫瘍血管の多くの変化は血管新生と関連する（Ｂｒｏｏｋｓ ＰＧら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｍｅｄ １９９４；３９：７５５−６０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３；１６３：８７１−８；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１３５９−６４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：７２２−７）。更に、腫瘍血管は腫瘍型特異的、また、一部の病期では腫瘍病期特異的特性を有する。ファージライブラリーのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにより、臓器特異的腫瘍形成の二匹のトランスジェニックマウスモデルにおいて血管新生シグネチャーを選択的に認識する、異なる集団のホーミングペプチドが生じた。ホーミングペプチドは、同一腫瘍において前悪性病変の新生血管と完全な悪性病変の新生血管とを識別することもできる。腫瘍におけるリンパ管も、腫瘍リンパ管と正常組織におけるリンパ管とを識別する特異的マーカーを保有する（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００２；８：７５１−７５５；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４；１０１：９３８１−９３８６：Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６；６６：５６９６−９７０６）。腫瘍血管及びリンパ管は腫瘍治療の重要な標的を提供する。腫瘍血管を破壊し、或いはその増殖を阻止することにより腫瘍増殖を抑制し、一方、腫瘍リンパ管は腫瘍増殖に不可欠ではないが、これを破壊することにより転移が減少する（Ｓａｈａｒｉｎｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；２５：３８７−９５）。
Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍ及びＫ．Ｂ．Ｍ．Ｒｅｉｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９９１；１２：３０７−３１１ Ｂ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：１８０９−１８２１ Ｅ．Ｉ．Ｂ．Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５２：５８９６−５９０１ Ａ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５３：１４３０−１４４０ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００４；１１０：７４１−７５０
腫瘍におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現亢進及び本明細書で報告されている知見は、ｇＣ１ｑ受容体（或いは、当該技術分野ではｇＣ１ｑＲ、本明細書ではｐ３２、全体ではｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と称される）を選択的に標的とする新規治療方法の必要性があることを示す。本発明は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と選択的に相互作用するとともに、化学療法剤、遺伝子治療ベクター又は他の薬剤を適切な組織へ選択的に標的化するのに適した分子を提供することにより、この必要性を満たす。関連する利点もまた提供される。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法であって、
ａ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、
ｂ．前記対象に配列番号１を含む組成物を投与するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記対象が癌を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が部分（ｍｏｉｅｔｙ）を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記部分（ｍｏｉｅｔｙ）が、治療成分、診断薬又はナノ粒子である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記治療成分がＤＮＡ関連プロセスを標的とする、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記治療成分が、細胞毒性剤、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、配列選択剤（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、血管新生阻害剤、シクロホスファミド、メルファラン、マイトマイシンＣ、ビゼレシン、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ＳＮ−３８、Ｅｔ−７４３、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ゲルダナマイシン、クロラムブシル、メトトレキサート及びＴＬＫ２８６からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目７）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する方法であって、
ａ．細胞とＬｙｐ−１組成物（前記Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、
ｂ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と前記Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出し、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出するステップと
を含む方法。
（項目８）
前記部分（ｍｏｉｅｔｙ）が、検出可能物質、ポリペプチド、核酸分子又は低分子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記Ｌｙｐ−１組成物がウイルスを含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｌｙｐ−１組成物がファージを含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能物質が、低分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３又はそれらの組合せである、項目８に記載の方法。
（項目１２）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体とＬｙｐ−１組成物との相互作用を検出する方法であって、前記Ｌｙｐ−１組成物が、配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
ａ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、
ｂ．前記Ｌｙｐ−１組成物と前記細胞とを接触させるステップと、
ｃ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と前記Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含む方法。
（項目１３）
前記部分（ｍｏｉｅｔｙ）が検出可能物質である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記部分（ｍｏｉｅｔｙ）が、ポリペプチド、核酸分子、低分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３又はそれらの組合せである、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法であって、前記Ｌｙｐ−１組成物が、配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、前記Ｌｙｐ−１組成物と細胞とを接触させ、これにより、前記Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達するステップを含む方法。
（項目１６）
前記細胞が対象内にあり、前記細胞が、前記対象の別の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出することにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法であって、前記Ｌｙｐ−１組成物が、配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
ａ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、
ｂ．前記Ｌｙｐ−１組成物と前記細胞とを接触させ、これにより、前記Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達するステップと
を含む方法。
（項目１８）
対象の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを評価する方法であって、
ａ．前記対象の細胞と、配列番号１を含む組成物に結合した検出可能物質を含むＬｙｐ−１組成物とを接触させるステップと、
ｂ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用するＬｙｐ−１組成物のレベルを検出し、これにより、前記細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを評価するステップと
を含む方法。
（項目１９）
前記対象におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルが、同一対象における過去の測定値と比較される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記対象におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルが、対照レベル又は標準レベルと比較される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定する方法であって
ａ．前記対象の細胞とＬｙｐ−１組成物（前記Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、
ｂ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と前記Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出し、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２の存在又はレベルを検出し、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在又はレベルにより、前記対象がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有すると確認するステップと
を含む方法。
（項目２２）
前記疾患が癌である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞が癌細胞である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験化合物、Ｌｙｐ−１組成物（前記Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む）及びｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を接触させるステップと、
ｂ．非結合Ｌｙｐ−１組成物を検出し、所与量の非結合Ｌｙｐ−１組成物が、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物を示すステップと
を含む方法。
（項目２５）
前記Ｌｙｐ−１組成物が、配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を更に含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記部分（ｍｏｉｅｔｙ）が検出可能物質を更に含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法であって、
ａ．ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、
ｂ．前記対象にｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する組成物を投与し、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置するステップと
を含む方法。
（項目２８）
前記組成物が、抗体、蛋白質又は化学物質である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、生物内、対象内、原位置、生体外、培養物中又は試験管内にある、項目１２から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する前記組成物が、Ｌｙｐ−１を模倣する、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置する方法であって、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性を調節する組成物を前記対象に投与し、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置或いは予防するステップを含む方法。
（項目３２）
前記疾患が癌である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性が阻害される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現が、阻害性核酸を用いて阻害される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記阻害性核酸がｓｉＲＮＡである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の活性が、ＬｙＰ−１ペプチド、抗体又はＬｙｐ−１の低分子模倣体によって阻害される、項目３３に記載の方法。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、該対象に配列番号１を含む組成物を投与するステップとを含む。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する方法が更に開示され、該方法は、細胞とＬｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体とＬｙｐ−１組成物との相互作用を検出する方法が更に開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、該Ｌｙｐ−１組成物と該細胞とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含む。
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法が更に開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、該Ｌｙｐ−１組成物と細胞とを接触させるステップを含み、これにより、該Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する。
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法が開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、該Ｌｙｐ−１組成物と該細胞とを接触させるステップとを含み、これにより、該Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する。
対象の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを定量且つ／或いは評価する方法が更に開示され、該方法は、該対象の細胞と配列番号１を含む組成物に結合した検出可能物質を含むＬｙｐ−１組成物とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用するＬｙｐ−１組成物のレベルを検出ステップとを含み、これにより、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを定量且つ／或いは評価する。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定する方法が本明細書で開示され、該方法は、該対象の細胞とＬｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含み、これにより、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２の存在又はレベルを検出し、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在又はレベルにより、該対象がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有すると確認される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物をスクリーニングする方法が更に開示され、該方法は、被験化合物、Ｌｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む）及びｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を接触させるステップと、非結合Ｌｙｐ−１組成物を検出するステップとを含み、所与量の該非結合Ｌｙｐ−１組成物がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物を示す。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法が更に開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、Ｌｙｐ−１と同じ部位においてｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する組成物を該対象に投与するステップとを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体は、例えば、細胞表面又は細胞内にありうる。該細胞は任意の背景にあってよく、例えば、生物内、原位置、生体外、培養液中及び／又は試験管内でよい。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置或いは予防する方法が更に開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性を調節する組成物を該対象に投与するステップを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置或いは予防する。該疾患は癌でありうる。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性は阻害されうる。これは、阻害性核酸、例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの使用によって生じうる。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の活性は、ＬｙＰ−１ペプチド、抗体又はＬｙｐ−１の低分子模倣体によって阻害されうる。
開示される方法及び組成物の更なる利点は、一部が後述の説明に示され、一部が該説明から理解され、或いは開示される方法及び組成物の実施により理解されうる。開示される方法及び組成物の利点は、添付された特許請求の範囲に詳細に示される要素及び組合せによって理解され、達成される。前述の全般的説明及び後述の詳細な説明は共に単に例示的且つ説明的であって、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、開示される方法及び組成物の複数の実施形態を示し、該説明と共に開示される方法及び組成物の原理を説明する役割を果たす。
プルダウンアッセイにおいてｇＣ１ｑ／ｐ３２ＲがＬｙｐ−１ペプチドと結合することを示す図である。プルダウンアッセイは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５培養細胞（ａ）又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片（ｂ）から得られた蛋白抽出物由来のビオチン化Ｌｙｐ−１ペプチド（配列番号１，ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ）にて示される。陰性対照として、腫瘍ホーミングペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号３）と、そのアミノ酸組成及び環状構造においてＬｙｐ−１に類似するペプチドＣＲＶ（配列番号４，ＣＲＶＲＴＲＳＧＣ）とが用いられた。（ａ）左側パネル：Ｌｙｐ−１結合蛋白質の銀染色。矢印は特異的３３ｋＤバンドを示し、これは質量分析によりｇＣ１ｑ／ｐ３２Ｒと確認された。右側パネル：ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に対するモノクローナル抗体を用いた、Ｌｙｐ−１及び対照ペプチドに結合した総細胞抽出物（総溶解物）・蛋白質の免疫ブロット。該抗体は総蛋白質溶解物及びＬｙｐ−１プルダウンにおいて３３ｋＤのバンドを認識する。両対照ペプチドからのプルダウンにおいて抗ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体反応性バンドは検出されない。Ｌｙｐ−１ペプチドによりＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片からプルダウンされた蛋白質の銀染色は、更なる７５ｋＤバンドを示し（ｂ−左側パネル）、これも質量分析によりＣ１ｑ／ｐ３２受容体と確認された。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対する該モノクローナル抗体は、Ｌｙｐ−１ペプチドプルダウンにおいてのみ７５ｋＤ及び３３ｋＤバンドを認識した（ｂ−右側パネル）。 Ｌｙｐ−１ファージが精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に特異的に結合することを示す図である。（ａ）精製ｇＣ１ｑＲ又は対照としてのＢＳＡがマイクロタイターウェルに被覆され（５μｇ／ｍｌ）、１０８ｐｆｕの無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）ファージ、Ｌｙｐ−１ファージ又は別の腫瘍ホーミングペプチド（ＣＲＥＫＡ、配列番号３）を保有する対照ファージとの結合に対して標的化された。３７℃で１６時間のインキュベーション後、結合ファージを溶出させ、プラークアッセイにより定量した。その結果は、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）に対する回収されたＬｙｐ−１及びＣＲＥＫＡ（配列番号３）の倍数として表され、５回の独立試験の典型である。（ｂ）ｇＣ１ｑＲのＮ末端に対する抗体は、精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２へのＬｙｐ−１ファージの結合を阻害する。左側パネル：前駆体（ａａ−１−２８２）及び成熟（ａａ７４−２８２）ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質の略図。ボックスは、該成熟蛋白質のそれぞれＮ末端（ａａ７６−９３）、Ｃ末端（ａａ２０４−２８２）においてモノクローナル抗体ｍＡｂ ６０．１１，ｍＡｂ ７４．５．２に認識されるアミノ酸残基を示す。ｍＡｂ ６０．１１に認識されるアミノ酸配列も示されている。右側パネル：２０μｇ／ｍｌのｍＡｂｓ６０．１１，７４．５．２又は精製マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ）の存在下又は非存在下、１．５×１０７ｐｆｕの無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）及びＬｙｐ−１ファージが、マイクロタイタープレートに被覆されたｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に３７℃で６時間結合された。その結果は、３回の独立試験の典型であり、Ｌｙｐ−１ファージ結合単独を１００％としてファージ結合のパーセントとして表される。 ＬｙＰ−１ペプチドが腫瘍細胞抽出物中のｐ３２蛋白質に結合することを示す図である。Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ−４３５培養細胞の抽出物由来のビオチン化ＬｙＰ−１ペプチド（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ、配列番号１）に結合した蛋白質。配列ＣＲＥＫＡ（配列番号３）及びＣＲＶＲＴＲＳＧＣ（ＣＲＶ、配列番号４）を有するペプチドが、プルダウンにおける陰性対照として用いられた。左側パネル：ＬｙＰ−１結合蛋白質の銀染色。矢印は質量分析によりｐ３２と確認された特異的バンドを示す。右側パネル：Ｌｙｐ−１及び対照ペプチドに結合した総細胞抽出物（溶解物）・蛋白質の抗ｐ３２免疫ブロット。 ＬｙＰ−１ペプチドが腫瘍細胞抽出物中のｐ３２蛋白質に結合することを示す図である。Ｂ．ｐ３２へのファージ結合。精製ｐ３２又は対照としてのＢＳＡがマイクロタイターウェルに被覆され、Ｌｙｐ−１ファージ、無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）ファージ並びに腫瘍ホーミングペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号３）及びＬｙＰ−２（ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ、配列番号７）を示すファージクローンの該ウェルへの結合の試験を行った。その結果は、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）に対する結合ペプチドファージの倍数として表され（±ＳＤ）、５回の独立試験の典型である。 ＬｙＰ−１ペプチドが腫瘍細胞抽出物中のｐ３２蛋白質に結合することを示す図である。Ｃ．前駆体（アミノ酸１−２８２）及び成熟（アミノ酸７４−２８２）形態のｐ３２蛋白質の図表示。ボックスは、該成熟蛋白質のそれぞれＮ末端（アミノ酸７６−９３）、Ｃ末端（アミノ酸２０４−２８２）においてモノクローナル抗体ｍＡｂ ６０．１１，ｍＡｂ ７４．５．２に認識されるアミノ酸残基を示す。ｍＡｂ ６０．１１に認識されるアミノ酸配列も示されている。 ＬｙＰ−１ペプチドが腫瘍細胞抽出物中のｐ３２蛋白質に結合することを示す図である。Ｄ．ｍＡｂ ６０．１１による精製ｐ３２へのＬｙｐ−１ファージ結合の阻害。抗ｐ３２ ｍＡｂ ７４．５．２及び精製マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ；陰性対照）は結合を阻害しない。その結果は、３回の独立試験の典型であり、Ｌｙｐ−１ファージ結合単独を１００％としてファージ結合のパーセントとして表されている（±ＳＤ）。 腫瘍細胞におけるｐ３２の発現及び細胞表面局在を示す図である。Ａ．図示培養腫瘍細胞株の抽出物における内在性ｐ３２の免疫ブロット。ｐ３２はｍＡｂ ６０．１１により検出され、ローディングコントロールとしてβ−アクチンが用いられた。Ｂ及びＣ．腫瘍細胞培養液（Ｂ）並びにＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＣ８１６１腫瘍異種移植片由来の一次細胞懸濁液（Ｃ、左側パネル）におけるｐ３２の細胞表面発現を検出するためのＦＡＣＳ解析。完全長ｐ３２に対するウサギＩｇＧ又はポリクローナル抗体が、生細胞に適用され、Ａｌｅｘａ ４８８標識二次抗体で検出された。解析のため、ヨウ化プロピジウム陰性（生）細胞をゲートした。腫瘍異種移植片由来の溶解物におけるｐ３２の総発現レベルが免疫ブロットにより検出された（Ｃ、右側パネル）。 腫瘍細胞におけるｐ３２の発現及び細胞表面局在を示す図である。Ａ．図示培養腫瘍細胞株の抽出物における内在性ｐ３２の免疫ブロット。ｐ３２はｍＡｂ ６０．１１により検出され、ローディングコントロールとしてβ−アクチンが用いられた。Ｂ及びＣ．腫瘍細胞培養液（Ｂ）並びにＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＣ８１６１腫瘍異種移植片由来の一次細胞懸濁液（Ｃ、左側パネル）におけるｐ３２の細胞表面発現を検出するためのＦＡＣＳ解析。完全長ｐ３２に対するウサギＩｇＧ又はポリクローナル抗体が、生細胞に適用され、Ａｌｅｘａ ４８８標識二次抗体で検出された。解析のため、ヨウ化プロピジウム陰性（生）細胞をゲートした。腫瘍異種移植片由来の溶解物におけるｐ３２の総発現レベルが免疫ブロットにより検出された（Ｃ、右側パネル）。 腫瘍細胞におけるｐ３２の発現及び細胞表面局在を示す図である。Ａ．図示培養腫瘍細胞株の抽出物における内在性ｐ３２の免疫ブロット。ｐ３２はｍＡｂ ６０．１１により検出され、ローディングコントロールとしてβ−アクチンが用いられた。Ｂ及びＣ．腫瘍細胞培養液（Ｂ）並びにＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＣ８１６１腫瘍異種移植片由来の一次細胞懸濁液（Ｃ、左側パネル）におけるｐ３２の細胞表面発現を検出するためのＦＡＣＳ解析。完全長ｐ３２に対するウサギＩｇＧ又はポリクローナル抗体が、生細胞に適用され、Ａｌｅｘａ ４８８標識二次抗体で検出された。解析のため、ヨウ化プロピジウム陰性（生）細胞をゲートした。腫瘍異種移植片由来の溶解物におけるｐ３２の総発現レベルが免疫ブロットにより検出された（Ｃ、右側パネル）。 ＬｙＰ−１が細胞表面にてｐ３２に結合することを示す図である。Ａ．Ｃ８１６１細胞が、空ｐＣＤＮＡ３．１ベクター又はｐ３２ ｐＣＤＮＡ３．１ベクターと共にｐＥＧＦＰを一過性にトランスフェクションされた。トランスフェクション細胞はＥＧＦＰ発現について選別され、選別された集団は抗ｐ３２によるファージ結合アッセイ及び免疫ブロット分析のために用いられた。空ベクター又はｐ３２ベクターをトランスフェクションされた細胞へのＬｙｐ−１ファージ結合は、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）に対する結合の倍数として表される。グラフは二重に行われた２回の独立試験における結合の平均を表す（ｐ３２トランスフェクション細胞におけるＬｙＰ−１対無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）ｐ＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。 ＬｙＰ−１が細胞表面にてｐ３２に結合することを示す図である。Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ Ｓ３５細胞がｐ３２特異的又は対照ｓｉＲＮＡｓを一過性にトランスフェクションされた。トランスフェクションの４８時間後、ｐ３２発現の阻害が免疫ブロット分析及び免疫染色により検定された（上部パネル）。対照としてβ−アクチンが用いられた。（下部パネル）１０μＭ ＦＩＴＣ結合ＬｙＰ−１ペプチド又はＬｙＰ−１と同じ全体的電荷を有する対照ペプチドＡＲＡＬＰＳＱＲＳＲ（ＡＲＡＬ、配列番号５）の存在下、ｐ３２ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされた細胞が、４℃で１時間インキュベートされた。ペプチドの非存在下にてインキュベートされた細胞が陰性対照として機能した。ｐ３２発現のダウンレギュレーションは該細胞へのＬｙＰ−１結合を減少させたが（左側パネル）、対照ペプチドの蛍光は影響を受けなかった（右側パネル）。３回の試験から典型的な試験が示されている。 ＬｙＰ−１が細胞表面にてｐ３２に結合することを示す図である。Ｃ．４０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１（対照）、ｍＡｂ ６０．１１又はｍＡｂ ７４．５．２の存在下でのＲａｊｉ細胞におけるＬｙＰ−１ファージ結合。バックグラウンドファージ結合を定量するため、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）が用いられた。その結果は、３回の独立試験の典型であり、ｍＩｇＧ１の存在下におけるＬｙＰ−１ファージの結合が１００％に設定されたファージ結合のパーセントとして表されている（±ＳＤ）。 腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｐ３２の発現を示す写真図である。Ａ．リンパ管に対するマーカーとしてのｐ３２及びポドプラニン或いは血管に対するマーカーとしてのＣＤ３１及びＭｅｃａ−３２に対するＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍由来切片の二重染色。ポリクローナル抗ｐ３２抗体はポドプラニン陽性領域における細胞塊を認識する。ｐ３２及びポドプラニンの両方に対して陽性を示す細胞は、血管マーカーに対して陰性を示す脈管様構造体の内側を覆う場合が多い（下部パネル）。 腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｐ３２の発現を示す写真図である。Ｂ．腫瘍におけるＬｙＰ−１ペプチドとｐ３２との共局在。フルオレセイン結合ＬｙＰ−１ペプチドが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を有するマウスに静注され、１時間循環させられた後、ＬｙＰ−１蛍光のｐ３２の免疫組織化学的染色及び分析のために腫瘍が除去された。 腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｐ３２の発現を示す写真図である。Ｃ．静注ＦＩＴＣ−ＬｙＰ−１ペプチド（上部パネル）及びｐ３２蛋白質（下部パネル）のマクロファージマーカーＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１との部分的腫瘍共局在。 腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｐ３２の発現を示す写真図である。Ｄ及びＥ．ヒト組織アレイにおけるｐ３２の免疫組織化学的検出。抗ｐ３２ ｍＡｂ ６０．１１が染色に用いられた。（Ｄ）連続組織切片がｐ３２と上皮膜抗原（ＥＭＡ）とに対して別個に染色された。（Ｅ）腫瘍と対応する正常組織とにおけるｐ３２発現の比較。検討された全組織の平行切片がｍＡｂ ６０．１１ではなくｍＩｇＧとインキュベートされ、染色を示さなかった。 腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｐ３２の発現を示す写真図である。Ｄ及びＥ．ヒト組織アレイにおけるｐ３２の免疫組織化学的検出。抗ｐ３２ ｍＡｂ ６０．１１が染色に用いられた。（Ｄ）連続組織切片がｐ３２と上皮膜抗原（ＥＭＡ）とに対して別個に染色された。（Ｅ）腫瘍と対応する正常組織とにおけるｐ３２発現の比較。検討された全組織の平行切片がｍＡｂ ６０．１１ではなくｍＩｇＧとインキュベートされ、染色を示さなかった。 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞におけるｐ３２のノックダウンを示す図である。Ａ．左上パネル、ｐ３２に対してＳｈＲＮＡを安定に発現している３つのＭＤＡ−ＭＢ−４３５クローン（ｐ３２ｋｄ；Ｃｌ １，２及び３）及び塩基ミスマッチ対照ＳｈＲＮＡを発現している３つのクローン（対照、Ｃｌ ４，５及び６）由来の全細胞溶解物に対する免疫ブロット分析。右上パネル−培地におけるフェノールレッド表示のオレンジ／イエローへの色変化により示されるような、ｐ３２ノックダウンクローンの培養培地の酸性化。下部パネル：資料に記載されているように計算され、また、対照に対して示されるような（ｐ＜０．００１）、細胞播種４日後の乳酸産生及びグルコース消費。 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞におけるｐ３２のノックダウンを示す図である。Ｂ．図示グルコース濃度で培地にて４日間増殖されたｐ３２ノックダウン及び対照細胞の溶解物由来の細胞内ＡＴＰ。各溶解物に存在するＡＴＰは、２５ｍＭグルコースにて増殖された対照クローンのＡＴＰ産生に対して正規化された。その結果は、３つのｐ３２ｋｄ及び３つの対照クローンに関して行われた２回の独立試験の平均（±ＳＥＭ）である（＊＝ｐ＜０．０３，＊＊＝ｐ＜０．００２）。 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞におけるｐ３２のノックダウンを示す図である。Ｃ．酸素消費。対照クローンに対するｐ３２ノックダウンクローンの値が示されている。その結果は三重に行われた３回の独立試験（±ＳＤ）に由来する（＊＊＝ｐ＜０．００１，＊＝ｐ＜０．０５）。 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞におけるｐ３２のノックダウンを示す図である。Ｄ．細胞におけるｐ３２の局在の共焦点分析。ｐ３２ノックダウン及び対照細胞は抗Ｎ末端ｐ３２ポリクローナル抗体及び抗シトクロムｃモノクローナル抗体、次に、Ａｌｅｘａ ４８８，Ａｌｅｘａ ５９４のそれぞれ抗ウサギ二次抗体、抗マウス二次抗体で染色された。右側のパネルは融合パネルにおける白枠領域の高倍率写真である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の増殖及び生存に対するｐ３２ノックダウンの作用を示す図である。Ａ．高（２５ｍＭ）及び低（２．５ｍＭ）グルコース条件下におけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ｐ３２ノックダウン（ｋｄ）及び対照細胞の増殖。３つのｐ３２ノックダウン及び対照クローンの二重ウェル中の絶対細胞数を計算することにより、各時点における平均細胞数が測定された（ｐ＜０．０００２）。右側のパネルは、２５ｍＭ又は２．５ｍＭグルコースでの６日後の２つの対照及びｐ３２ ｋｄクローンの呈色培地を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の増殖及び生存に対するｐ３２ノックダウンの作用を示す図である。Ｂ．左側パネル−図示グルコース濃度を含む培地での３日後のｐ３２ノックダウン及び対照細胞の顕微分析。ｐ３２ ｋｄクローンは２．５ｍＭグルコースにて形態変化を示し、０．５ｍＭグルコースにて細胞死が著明となる。細胞死はＦＩＴＣ−アネキシンＶと結合する細胞のＦＡＣＳ解析により定量された（右側パネル；＊＝＜０．０５）。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の増殖及び生存に対するｐ３２ノックダウンの作用を示す図である。Ｃ．左上パネル、親ｐ３２ ｋｄクローン及びそれに由来する、ｐ３２ ｓｈＲＮＡサイレンシングに対して抵抗性のｃＤＮＡからｐ３２を発現し（Ｃｌ ＃３，８，１４）、或いは空ｃＤＮＡベクターをトランスフェクションされた（Ｃｌ ＃９，１０，１８）単一クローンの免疫ブロット分析。ｐ３２の内在レベルを検出するため、対照ＳｈＲＮＡ（対照）を発現するクローンが用いられた。左下パネルはｐ３２の再導入による培養培地ｐＨの回復を示す。中央部パネル及び右側パネルは、対照、ｐ３２ ｋｄ及びｐ３２回復（ｐ３２ｋｄ＋ｐ３２）クローンにおける乳酸産生、グルコース消費及び増殖率を示す。 ｐ３２ノックダウン細胞由来の腫瘍の増殖特性を示す図である。ヌードマウスの乳腺脂肪体における３つのｐ３２ ｋｄ及び対照クローンから腫瘍が増殖された（１クローン当たり６マウス）。Ａ．対照腫瘍はサイズが均一であるが、ｐ３２ ｋｄ腫瘍は対照細胞腫瘍より有意に小さく、或いは肥大して出血性である。中央部パネルは出血を伴う広範な壊死を有するノックダウン細胞腫瘍の一例を示す。右側パネルは期間の関数として腫瘍体積の平均を示す（±ＳＥＭ，ｐ＜０．００１）。 ｐ３２ノックダウン細胞由来の腫瘍の増殖特性を示す図である。ヌードマウスの乳腺脂肪体における３つのｐ３２ ｋｄ及び対照クローンから腫瘍が増殖された（１クローン当たり６マウス）。Ｂ．腫瘍細胞におけるＢｒｄＵの取込み。マウスは殺処分の２４時間前にＢｒｄＵのパルス投与を受けた。グラフはＢｒｄＵ染色に対して陽性を示した１フィールド当たりの細胞の数を示す。データは、１腫瘍当たり４ランダムフィールドにてＢｒｄＵ陽性細胞の数をＩｍａｇｅ−Ｊソフトウェアにより計算することによって得られた（Ｎ＝１４個の腫瘍／群）；ｐ＜０．００３。 ｐ３２ノックダウン細胞由来の腫瘍の増殖特性を示す図である。ヌードマウスの乳腺脂肪体における３つのｐ３２ ｋｄ及び対照クローンから腫瘍が増殖された（１クローン当たり６マウス）。Ｃ．ｐ３２ ｋｄ及び対照細胞クローン由来腫瘍のヘマトキシリン／エオシン染色。ｐ３２ ｋｄ腫瘍における暗色部分は広範な壊死を示す。上部画像は１０倍の拡大にて撮像され、下部画像は２００倍の拡大での図示枠部分に対応する。壊死部分のパーセントはＩｍａｇｅ−Ｊソフトウェアにより計算された（ｐ＜０．００１）。 抗ｐ３２処置による腫瘍増殖の阻害を示す図である。ヒト及びマウスｐ３２のａａ７６−９３に対するポリクローナル抗体が作製され、ｉｎ ｖｉｖｏにて腫瘍へのホーミングの試験が行われた。図１０Ａ−アフィニティー精製された抗Ｎ末端ｐ３２ポリクローナル抗体又は対照としてのウサギＩｇＧが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５又はＣ８１６１腫瘍異種移植片を有するマウスの尾静脈に注入された。腫瘍及び種々の器官が注射後１時間にて除去され、切片化され、Ａｌｅｘａ ４８８抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いてウサギＩｇＧの存在について検討された。該抗体は、ＦＩＴＣ ＬｙＰ−１の静注後、或いは腫瘍切片のｐ３２染色により可視化される細胞塊に類似する細胞塊を認識する（図１０Ａ左側パネル）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片へのホーミングはＣ８１６１腫瘍へのホーミングより効率的であり、これらはそれぞれ高レベル、低レベルのｐ３２を示す（図１０Ａ右側パネル）。 抗ｐ３２処置による腫瘍増殖の阻害を示す図である。ヒト及びマウスｐ３２のａａ７６−９３に対するポリクローナル抗体が作製され、ｉｎ ｖｉｖｏにて腫瘍へのホーミングの試験が行われた。図１０Ｂ−ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片を有するマウスが、総計３３日間、４００・８００μｇのポリクローナル抗ｐ３２又はウサギＩｇＧを３日毎に静注された（ｎ＝４マウス／群）。グラフでは、抗ｐ３２及びウサギＩｇＧで処置されたマウスにおける腫瘍増殖の動態が示されている。処置全体を通してのマウスの一定体重により示されるように、両抗体の投与は毒性作用を示すことなく、腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．００１）。
開示される方法及び組成物は、以下の特定の実施形態の詳細な説明及びその中に含まれる実施例並びに図及びその前述・後述の説明を参照することにより、より容易に理解されうる。
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法が開示・説明される前に、別記されない限り、それらが特定の合成法若しくは特定の組換えバイオテクノロジー法、又は、別記されない限り、特定の試薬に限定されるものではなく、そのようなものとして、当然、変形しうるということが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、単に特定の実施形態について説明することを目的とするものであって、限定することを目的とするものではないということも理解されるべきである。
（Ａ．定義）
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、明らかに別様に示されない限り、複数の言及物を含む。従って、例えば、「（１つの）医薬担体」は２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
本明細書で範囲は、「約」１つの特定の数値から、且つ／或いは「約」別の特定の数値までというように表されうる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態はその１つの特定の数値から、且つ／或いはその別の特定の数値までを含む。同様に、数値が先行する「約」を用いて近似値として表される場合、その特定の数値が別の実施形態を形成するということが理解されるであろう。各範囲の終点は、他の終点に関連し、且つ他の終点から独立して有意であることが更に理解されるであろう。本明細書では多くの数値が開示されるとともに、各数値がその数値自体に加えて「約」その特定の数値としても本明細書で開示されることも理解される。例えば、数値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。１つの数値が開示される場合、当業者には適切に理解されるように、その数値「以下」、その数値「以上」及び数値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、数値「１０」が開示される場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示される。本出願全体にわたり、データが多くの異なる形式にて提供されるとともに、このデータが終点及び始点並びに任意の組合せのデータ点の範囲を表すということも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示される場合、１０及び１５超、以上、未満、以下、相当並びに１０〜１５が開示されると考えられることが理解される。２つの特定の単位間における各単位も開示されるということも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１，１２，１３及び１４も開示される。
本明細書及び後述の特許請求の範囲では、多くの用語への言及がなされ、これらは以下の意味を有すると定義づけられるものとする。
「任意の」又は「任意に」とは、後述の事象又は事態が生じる場合もあれば生じない場合もあって、その記載が、前記事象又は事態が生じる場合並びにそれが生じない場合を含むということを意味する。
「マルチウェルプレート」という用語は、実質的に平坦な面に設置されたアドレス可能なウェル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｗｅｌｌｓ）の二次元配列をいう。マルチウェルプレートは任意の数の別個のアドレス可能なウェル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｗｅｌｌｓ）を含むことができ、任意の幅又は深さのアドレス可能なウェル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｗｅｌｌｓ）を含む。マルチウェルプレートの一般的な例は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート及び３４５６ウェルＮａｎｏｐｌａｔｅｓ（商標）を含む。そのようなマルチウェルプレートは任意の好適な材料から構成されうる。好適な材料の例には、プラスチック、ガラス又は任意の本質的に電気的に非伝導性の材料が含まれる。
「ノックダウン」とは、検出可能なｍＲＮＡ発現の減少を意味する。一般的に、核酸は遺伝子発現をノックダウンするのに用いられ、一般に、ｍＲＮＡのような標的配列とハイブリダイズすることができる配列を含む。そのような機能性核酸の例には、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖形成核酸、外部ガイド配列（ＥＧＳ）及び低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。
本明細書で用いられるような「遺伝子ノックアウト」という用語は、当業者には周知の任意のトランスジェニック技術によってなされた機能の完全な喪失を伴う、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子の標的破壊をいう。一例では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、標的遺伝子が、相同組換えによって非機能的にされる遺伝子を標的とする挿入によって非機能的にされたトランスジェニック動物である。
「ヒット（ｈｉｔ）」という用語は、アッセイにて所望の特性を示す被験化合物をいう。
「被験化合物」という用語は、推定モジュレーターとして１つ以上のスクリーニング法によって試験される化学物質をいう。被験化合物は任意の化学物質でよく、例えば、無機化学物質、有機化学物質、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質又はそれらの組合せでよい。通常、スクリーニングには被験化合物の様々な所定の濃度、例えば、０．０１マイクロモル、１マイクロモル及び１０マイクロモルが用いられる。対照被験化合物は、該被験化合物の非存在下におけるシグナルの測定又は標的を調節することが公知である化合物との比較を含みうる。
「トランスジェニック」という用語は、そのすべての細胞内に外来性遺伝物質を含む生物を示すのに用いられる。該用語は、初期胚若しくは受精卵のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作又は特異的な遺伝子ノックアウトを誘導する任意のトランスジェニック技術により、そのゲノムが改変された任意の生物を含む。
「トランス遺伝子」という用語は、技巧を用いて細胞に挿入され、その細胞から成長する生物のゲノムの一部となる（即ち、安定に組み込まれ、或いは安定な染色体外要素として）任意のＤＮＡ断片をいう。そのようなトランス遺伝子は、部分的又は完全に異種（即ち、外来性）である遺伝子を含み得、或いは生物の内在性遺伝子と相同の遺伝子を表しうる。この定義内に含まれるのは、ＤＮＡに転写され、それからゲノムに組み込まれるＲＮＡ配列の付与によって生成されるトランス遺伝子である。本明細書で開示されるトランス遺伝子は、非ヒトトランスジェニック動物において発現されうる蛍光又は生物発光蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含みうる。
本明細書で用いられるような「活性」という用語は、分子の相互作用の測定可能な結果をいう。これらの活性を測定する一部の例示的な方法が本明細書で示される。
本明細書で用いられるような「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、適切な対照と比べた場合のある測定可能な方法にて活性を変化させる化合物の能力をいう。アッセイにおける化合物の存在の結果として、これらの化合物の非存在下における対照と比べ、活性は上昇或いは低下しうる。好ましくは、活性の上昇は、化合物の非存在下における活性レベルと比べ、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも１００％である。同様に、活性の低下は、化合物の非存在下における活性レベルと比べ、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも１００％である。既知の活性を上昇させる化合物は「アゴニスト」である。既知の活性を低下させ、或いは阻止する化合物は「アンタゴニスト」である。
「阻害する」という用語は、活性又は発現を低減し、或いは低下させることを意味する。これは、活性又は発現の完全な阻害或いは部分的阻害でありうる。阻害は対照又は標準レベルと比較されうる。阻害は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９又は１００％となりうる。
本明細書で用いられるような「モニタリング」という用語は、活性が測定されうる、当該技術分野における任意の方法をいう。
本明細書で用いられるような「付与（する）」という用語は、化合物又は分子を当該技術分野において公知のものに加える任意の手段をいう。付与の例には、ピペット、ｐｉｐｅｔｔｅｍｅｎ、シリンジ、針、チューブ、ガンなどの使用が含まれうる。これは手動又は自動でありうる。付与は、核酸をディッシュ、細胞、組織、無細胞系に付与する任意の手段又は他の任意の手段によるトランスフェクションを含み得、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでよい。
本明細書で用いられるような「予防する」という用語は、疾患又は病状と関連する異常の身体的発現を予防するため、疾患又は病状の臨床症状の発症前に化合物を投与することをいう。
本明細書で用いられるような「処置する」という用語は、臨床症状の発症後に化合物を投与することをいう。
本明細書で用いられるような「処置を必要とする」という用語は、介護者（例えば、ヒトの場合、医師、看護師、ナースプラクティショナー又は個人；非ヒト哺乳動物を含む動物の場合、獣医）によって下される、対象が処置を必要とし、或いは処置から利益を得るという判断をいう。この判断は、介護者の専門知識の領域にあるが、本発明の化合物によって処置可能な病状の結果として対象が病気であり、或いは病気になるという知識を含む、様々な因子に基づいて下される。
本明細書で用いられるように、「対象」は、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生生物及び他の任意の生物若しくは存在物を含むが、それらに限定されない。対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長動物、ウシ、ネコ、テンジクネズミ又は齧歯動物）、サカナ、トリ又は爬虫類又は両生動物でよい。対象は、無脊椎動物、より具体的には節足動物（例えば、昆虫及び甲殻類）でよい。該用語は特定の年齢又は性別を指示しない。従って、雄又は雌にかかわらず、成体及び新生動物である対象並びに胎仔が包括されるものとする。患者とは疾患又は障害に苦しむ対象をいう。「患者」という用語はヒト及び家畜である対象を含む。
「より高い」、「増加させる」、「上昇させる」又は「上昇」とは、例えば、対照と比べた場合の基礎レベルを上回る増加をいう。「低い」、「より低い」、「減少させる」又は「減少」とは、例えば、対照と比べた場合の基礎レベルを下回る減少をいう。
本出願全体にわたって様々な文献が引用される。本出願が関連する最新技術をより十分に示すため、これらの文献の開示内容はそれらの全体を参照して本明細書に組み込まれる。また、開示される文献は、参照が拠り所となっている文において考察されている、それらに含まれる材料について個々具体的に参照して本明細書に組み込まれる。
別記されない限り、開示される方法及び組成物は特定の合成法、特定の分析手法又は特定の試薬に限定されるものではなく、そのようなものとして、変形しうるということが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、単に特定の実施形態について説明することを目的とするものであって、限定することを目的とするものではないということも理解されるべきである。
（材料）
開示される組成物及び本明細書で開示される方法の範囲内にて用いられる組成物自体を調製するために用いられる構成要素が開示される。これら及び他の材料が本明細書で開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されると同時に、これらの化合物のそれぞれの様々な個別的且つ集合的な組合せ及び置換の具体的な言及が明確に開示されないような場合、各々が本明細書で具体的に企図・説明されるということが理解される。例えば、特定のペプチドが考察・開示され、該ペプチドを含む多くの分子に対してなされうる多くの改変が考察される場合、これとは反することを具体的に示さない限り、該ペプチドのありとあらゆる組合せ及び置換並びに可能な改変が具体的に企図される。従って、分子Ａ，Ｂ及びＣのクラス並びに分子Ｄ，Ｅ及びＦのクラスが開示され、組合せ分子の一例Ａ−Ｄが開示される場合、各々が個々に列挙されなくとも、各々は個別的且つ集合的に企図され、組合せＡ−Ｅ，Ａ−Ｆ，Ｂ−Ｄ，Ｂ−Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｄ，Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆが開示されると考えられることを意味する。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せも開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ，Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅの亜群が開示されると考えられうる。この概念は、限定されないが、開示組成物を作製し使用する方法におけるステップを含む、本出願のあらゆる態様に適用される。従って、実施可能な種々の追加ステップがある場合、これらの追加ステップの各々が、開示方法の任意の具体的な実施形態又は実施形態の組合せで実施されうることが理解される。
（Ａ．Ｌｙｐ−１及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２）
Ｌｙｐ−１（配列番号１，ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ）はｇＣ１ｑ受容体（ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２、これは、文献では代替用語ｇＣ１ｑＲ及びｐ３２の１つにより述べられており、本明細書ではｇＣ１ｑＲ，ｇＣ１ｑ受容体又はｐ３２として、或いはｇＣ１ｑＲ及びｐ３２として文献において周知の蛋白質を指す“ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２”として述べられる）と選択的に相互作用することが見出されている。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は、腫瘍リンパ脈管系、例えば、乳癌腫瘍、扁平上皮癌及び骨肉腫のリンパ脈管系と関連する。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は炎症とも関連する（Ｗａｇｇｏｎｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年１０月 １；１７５（７）：４７０６−１４，ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体及び炎症に関する教示について、その全体を参照して本明細書に組み込まれる）。
本明細書で開示されるように、ペプチドＬｙｐ−１（配列番号１）とｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用は、蛋白抽出物由来のビオチン化Ｌｙｐ−１ペプチドを用いたプルダウンアッセイにより確認された（図１）。陰性対照として、腫瘍ホーミングペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号３）と、そのアミノ酸組成及び環状構造においてＬｙｐ−１に類似するペプチドＣＲＶ（ＣＲＶＲＴＲＳＧＣ、配列番号４）とが用いられた。両対照ペプチドからのプルダウンでは抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２反応性バンドは検出されなかった。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対するモノクローナル抗体は、Ｌｙｐ−１ペプチドプルダウンにおいてのみ７５ｋＤ及び３３ｋＤバンドを認識した。
更に、Ｌｙｐ−１ファージは精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に特異的に結合した。精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又は対照としてのＢＳＡは、マイクロタイターウェルに被覆され、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）、Ｌｙｐ−１ファージ又は別の腫瘍ホーミングペプチド（ＣＲＥＫＡ、配列番号３）を保有する対照ファージとの結合への標的とされた。図２ａに認められるように、Ｌｙｐ−１ファージはｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と結合したが、無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）及び対照ファージは本質的に全く相互作用を示さなかった。更に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＮ末端に対する抗体は、Ｌｙｐ−１ファージの精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２への結合を阻害した（図２Ｂ）。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の蛋白質濃度及び細胞表面発現は、培養腫瘍細胞及び腫瘍異種移植片においても示される。図４Ａは異なる腫瘍細胞株の溶解物からのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のウェスタンブロット分析を示す。共にＬｙｐ−１ファージの低バインダーであるＣ８１６１メラノーマ細胞及びＨＬ−６０前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｉｔｉｃ）白血病細胞は、より高いＬｙｐ−１ファージ結合活性を示すＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ５４９乳癌細胞と比べ、低レベルのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片由来の腫瘍細胞培養液又は一次細胞懸濁液中のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現を検出するため、ＦＡＣＳ分析が用いられた。ヨウ化プロピジウム陰性（生）細胞は分析のためにゲートされた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片由来の細胞懸濁液では、ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体は、対照ウサギＩｇＧと比べ、ＦＡＣＳピークの有意なシフトを生じさせた。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現はＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ５４９培養細胞では低かった。Ｃ８１６１細胞ではｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現はなかった。
更に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の過剰発現はＬｙｐ−１ファージのＣ８１６１メラノーマ細胞への結合を亢進させた（図５）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の過剰発現を検出するため、ファージ結合アッセイ及びウェスタンブロット分析が用いられた。Ｌｙｐ−１ファージのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２への結合は空ベクターへの結合よりはるかに多かった。また、ＲＮＡｉ媒介性ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２サイレンシングは、Ｌｙｐ−１ペプチドの細胞表面への結合を減少させる。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２特異的又は対照ｓｉＲＮＡｓを一過性にトランスフェクションされた。ペプチドの非存在下にてインキュベートされた細胞がＦＩＴＣ陰性対照として機能を果たした。対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされた細胞と比べ、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現のダウンレギュレーションはＬｙｐ−１のピークシフトを生じさせたが、対照ペプチドの蛍光では生じさせなかった。
図３はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及びＬｙｐ−１ペプチドの腫瘍局在を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片における、それぞれｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及びリンパ管若しくは血管、ポドプラニン及びＭｅｃａ３２／ＣＤ３１の染色を行った。ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体は、血管を欠くがリンパ管を含む細胞塊又はポドプラニンに対して陽性であるがＣＤ３１又はＭｅｃａ３２に対しては陽性ではない脈管様構造体の内側を覆う細胞を認識した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２陽性に局在するＬｙｐ−１ペプチドは腫瘍内でパッチする。
これらの知見に基づき、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と関連する疾患及び障害において有用なＬｙｐ−１組成物が本明細書で開示される。例えば、本明細書で開示されるＬｙｐ−１組成物は、原発腫瘍を有する癌患者において腫瘍転移を低減或いは予防するのに有用である。Ｌｙｐ−１組成物は、例えば、前転移性乳癌又は骨癌を有する患者に、或いは初期又は晩期転移性乳癌又は骨癌を有する患者に投与されうる。Ｌｙｐ−１ポリペプチドは、例えば、乳癌又は骨肉腫リンパ脈管系のような腫瘍リンパ脈管系を画像化するのにも有用となりうる。開示組成物はそれを必要とする患者における炎症を低減或いは予防するのにも有用である。
従って、アミノ酸配列ＧＮＫＲＴＲＧ（配列番号２）を含む単離ペプチド若しくはペプチド模倣体又はそのペプチド模倣体が本明細書で開示される。本発明は、アミノ酸配列ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１）を含む単離ペプチド若しくはペプチド模倣体又はそのペプチド模倣体を更に提供する。
腫瘍並びに炎症及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と関連する他の疾患及び障害の部位と選択的に相互作用する、Ｌｙｐ−１を含む組成物のような組成物が開示される。様々なＬｙｐ−１組成物が開示方法において用いられうる。そのような組成物には、限定されないが、本明細書で開示されるようなペプチドが含まれる。開示される化合物、組成物、分子及び方法は、開示されるようなペプチド及びペプチド模倣体を含む、種々の形態での開示Ｌｙｐ−１組成物を含み、或いは用いることができる。表現の便宜上、本明細書で多くの箇所においてペプチドの使用又は包含が繰り返し述べられる。そのような場合、種々の形態のＬｙｐ−１組成物も、ペプチドに関して述べられるのと同じ又は同様の態様にて用いられ、或いは含まれうると考えられると理解され、それにより、そのような使用及び包含は具体的に企図・開示される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する複数の疾患及び障害がある。その例には、限定されないが、癌及び炎症が含まれる。
配列番号１を含む組成物は部分（ｍｏｉｅｔｙ）を更に含みうる。部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の例には、限定されないが、治療又は診断成分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が含まれる。治療成分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）には、血管新生阻害剤又は細胞毒性剤が含まれうる。治療成分（ｍｏｉｅｔｙ）はＤＮＡ関連プロセスを標的としうる。治療成分（ｍｏｉｅｔｙ）は、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質及び配列選択剤（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）からなる群より選択されうる。治療成分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の他の例には、シクロホスファミド、メルファラン、マイトマイシンＣ、ビゼレシン、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ＳＮ−３８、Ｅｔ−７４３、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ゲルダナマイシン、クロラムブシル、メトトレキサート及びＴＬＫ２８６が含まれる。部分（ｍｏｉｅｔｙ）はナノ粒子でもよい。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する方法が開示され、該方法は、細胞とＬｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出する。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体は、例えば、細胞表面又は細胞内に存在しうる。該細胞は任意の背景にあってよく、例えば、生物内、原位置、生体外、培養液中及び／又は試験管内でよい。
部分（ｍｏｉｅｔｙ）は検出可能部分（ｍｏｉｅｔｙ）でありうる。そのような部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）例には、限定されないが、ポリペプチド、核酸分子、低分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３又はそれらの組合せが含まれる。
上述の細胞と接触させられるＬｙｐ−１組成物は、一例ではウイルスを含みうる。該Ｌｙｐ−１組成物はファージも含みうる。
「と選択的に相互作用する」とは、提示化合物又は物質が、非標的物質と比べて提示標的物質と優先的に相互作用することができるということである。従って、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにてＬｙｐ−１は非標的物質と比べてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と優先的に相互作用することができる。従って、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が癌細胞又は炎症部位と関連する場合、Ｌｙｐ−１は、非癌細胞又は炎症を含まない部位と比べ、癌細胞又は炎症部位と優先的に相互作用する。一般的に、例えば、腫瘍との選択的或いは優先的相互作用は、癌部位における、少なくとも２倍又はそれ以上の局在を特徴とする。Ｌｙｐ−１ペプチドは、非腫瘍性組織の複数又は多くの組織型と比べ、或いは大部分又はすべての非腫瘍性組織と比べ、５倍、１０倍、２０倍又はそれ以上の腫瘍のような癌部位への優先的局在を特徴としうる。従って、場合により、Ｌｙｐ−１はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が存在する臓器に加え、１つ又はそれ以上の正常臓器と部分的に相互作用することが理解される。選択的相互作用は標的化又はホーミングとも称されうる。
上述のように、優先的且つ／或いは選択的ホーミングを含む選択的相互作用は、Ｌｙｐ−１が正常部位及び／又は非標的部位に結合しないということではない。一部の実施形態では、対応する標的に対する相互作用選択性は、例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍又は少なくとも約２００倍となりうる。選択的相互作用は、例えば、他の非標的要素に対する相対量又は相対的Ｋｉの点からみることができる。一部の実施形態では、Ｌｙｐ−１は、対応する標的に対する少なくとも約５０倍の選択性、少なくとも約１００倍の選択性、少なくとも約２００倍の選択性、少なくとも約３００倍の選択性、少なくとも約４００倍の選択性、少なくとも約５００倍の選択性、少なくとも約６００倍の選択性、少なくとも約７００倍の選択性、少なくとも約８００倍の選択性、少なくとも約１０００倍の選択性又は少なくとも約１５００倍の選択性を有しうる。例えば、一部の好ましい実施形態では、Ｌｙｐ−１は、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満又は約７５ｎＭ未満の標的に対するＫｉ値を有しうる。一部の好ましい実施形態では、Ｌｙｐ−１は、約５０ｎＭ超、約２５ｎＭ超、約２０ｎＭ超、約１５ｎＭ超、約１０ｎＭ超、約５ｎＭ超、約３ｎＭ超又は約１ｎＭ超の標的に対するＫｉ値を有しうる。一部の好ましい実施形態では、標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、約１０−１２Ｍ未満、約１０−１３Ｍ未満又は約１０−１４Ｍ未満のＫＤにてその標的と結合する。
（Ｂ．ｐ３２／ｇＣ１ｑ受容体）
腫瘍細胞におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現をノックダウンすると、その代謝が解糖に向かってシフトし、驚くべきことに、解糖表現型が、特に有害な増殖条件下、腫瘍細胞の生存及び増殖の障害と関連することが見出されている（実施例２）。同時に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞の腫瘍原性が低下する。従って、本明細書で述べられるようなｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体関連障害及び疾患を処置するため、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を標的とする方法が本明細書で開示される。そのような疾患の一例は癌である。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置する方法も本明細書で開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性を調節する組成物を該対象に投与するステップを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置する。該対象は癌を有しうる。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性は阻害されうる。これは、阻害性核酸、例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの使用によって生じうる。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の活性は、ＬｙＰ−１ペプチド、抗体又はＬｙｐ−１の低分子模倣体によって阻害されうる。本明細書で開示される癌を処置する方法は、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）に関するセクションにおける下述のような他の治療法とも併用して用いられうる。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象が本明細書で開示される。これは、該対象がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体のレベル上昇又はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体のレベル低下を有し、或いは疾患又は障害の症状を処置又は改善するため、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体が標的とされうるということである。「ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体のレベル上昇」とは、該対象におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の数が全体として、当業者に受容される正常、基礎又は標準レベルを超えて増加しているということである。これは、所定の細胞に存在するｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の数が、基礎、正常又は標準量を超えて増加しているということでもありうる。「ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体のレベル低下」とは、該対象におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の数が全体として、当業者に受容される正常、基礎又は標準レベルを超えて減少しているということである。これは、所定の細胞に存在するｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の数が、基礎、正常又は標準量を超えて減少しているということでもありうる。当業者であれば、本明細書で開示される方法及び当業者には周知の方法を用いて、対象全体及び個々の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２レベルを定量することができるであろう。それを行う一方法は、本明細書で開示されるようなＬｙｐ−１の使用を含む。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患は、例えば、癌を含む。
（Ｃ．ペプチド及びペプチド模倣体）
配列番号１を含む単離ペプチドに関する組成物（Ｌｙｐ−１）が開示される。該単離ペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号１と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列又は１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含みうる。該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、８０％、７０％又は６０％同一でありうる。配列番号１のアミノ酸配列は、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８又は９個の保存的アミノ酸置換を有しうる。該ペプチドはアミノ酸配列・配列番号１のキメラを含みうる。そのようなキメラは、１つの配列の配列が別の配列に付加される付加、１つの配列の配列が別の配列の配列に置換される置換又は組合せでありうる。特定のアミノ酸配列に関連して本明細書で用いられるように、「保存的変異体」とは、第一のアミノ酸が、該第一のアミノ酸と同様の少なくとも１つの生化学的性質を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体に置換される配列であり、同様の性質には、例えば、同様のサイズ、電荷、疎水性又は水素結合能が含まれる。
アミノ酸配列は、線状、円状又は環状でありうる。アミノ酸セグメントは、任意の好適な結合、例えば、ジスルフィド結合を介して環状化或いは環化されうる。該ペプチドは、任意の好適な長さ、例えば、１００残基未満の長さを有しうる。該ペプチドは５０残基未満の長さを有しうる。該ペプチドは２０残基未満の長さを有しうる。
開示ペプチドは単離形態でありうる。開示ペプチドに関連して本明細書で用いられるように、「単離（された）」という用語は、通常、細胞内のペプチドと会合し、或いはライブラリー又は粗調製物におけるペプチドと会合している、夾雑ポリペプチド、脂質、核酸及び他の細胞物質のような物質から比較的遊離している形態であるペプチドを意味する。
開示ペプチドは任意の好適な長さを有しうる。開示ペプチドは、例えば、６，７，８，９，１０，１２，１５，２０，２５，３０，３５又は４０残基未満の比較的短い長さを有しうる。開示ペプチドは有意により長い配列の背景においても有用となりうる。従って、該ペプチドは、例えば、最大５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，４００，５００，１０００又は２０００残基の長さを有しうる。特定の実施形態では、ペプチドは少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００又は２００残基の長さを有しうる。更なる実施形態では、ペプチドは、５〜２００残基、５〜１００残基、５〜９０残基、５〜８０残基、５〜７０残基、５〜６０残基、５〜５０残基、５〜４０残基、５〜３０残基、５〜２０残基、５〜１５残基、５〜１０残基、１０〜２００残基、１０〜１００残基、１０〜９０残基、１０〜８０残基、１０〜７０残基、１０〜６０残基、１０〜５０残基、１０〜４０残基、１０〜３０残基、１０〜２０残基、２０〜２００残基、２０〜１００残基、２０〜９０残基、２０〜８０残基、２０〜７０残基、２０〜６０残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基又は２０〜３０残基の長さを有しうる。本明細書で用いられるように、「残基」という用語はアミノ酸又はアミノ酸類似体をいう。
本明細書では様々な蛋白質及び蛋白質配列について考察するため、それらの蛋白質配列をコードしうる核酸も開示されることが理解される。これには、特定の蛋白質配列に関連するすべての縮重配列、即ち、１つの特定の蛋白質配列をコードする配列を有するすべての核酸並びに蛋白質配列の開示変異体及び誘導体をコードする、縮重核酸を含むすべての核酸が含まれうる。従って、それぞれの特定の核酸配列は本明細書で完全に記されない場合もあるが、実際には、開示蛋白質配列を通してありとあらゆる配列が本明細書で開示・説明されるということが理解される。
ペプチドに類似するが、天然のペプチド結合を介して結合されない分子が生成されうる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体の結合には、ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２Ｓ−，−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−，−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨＨ２ＳＯ−が含まれる（これら及び他は、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月）、Ｖｏｌ．１，３号、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（総説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州特許出願、ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；及びＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）に見出されうる；それらの各々は参照して本明細書に組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体は、例えば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などのように結合原子間に２つ以上の原子を有しうることが理解される。
異種蛋白質に融合した開示ペプチドを含むキメラ蛋白質も開示される。一実施形態では、該異種蛋白質は、サイトカイン活性、細胞毒性活性又はアポトーシス促進活性といった治療活性を有しうる。更なる実施形態では、該異種蛋白質は抗体又はその抗原結合断片でありうる。他の実施形態では、該キメラ蛋白質は、異種蛋白質に融合した、アミノ酸配列・配列番号１を含むペプチド又はその保存的変異体若しくはペプチド模倣体を含む。該開示ペプチドに融合した蛋白質に関連して本明細書で用いられるような「異種」という用語は、該ペプチド又は該ペプチドに由来する該ペプチド模倣体をコードする遺伝子以外の供給源から得られる蛋白質を意味する。開示キメラ蛋白質は、限定されないが、１００残基未満、２００残基未満、３００残基未満、４００残基未満、５００残基未満、８００残基未満又は１０００残基未満の長さを含む種々の長さを有しうる。
本明細書で用いられるように、「キメラ」及び「キメラ（の）」とは、２つ以上の供給源に由来する配列の任意の組合せをいう。これには、例えば、サブユニット（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸）の単一部分から他の配列に付加、挿入且つ／或いは置換される供給源配列全体までが含まれる。キメラは、例えば、１つの配列の１つ以上の部分が１つ以上の他の配列の１つ以上の部分に付加される付加；１つの配列の１つ以上の部分が１つ以上の他の配列の１つ以上の部分に置換される置換；又は組合せでよい。「保存的置換キメラ」は、キメラの供給源配列がある構造的且つ／或いは機能的関連を有し、また、同様或いは類似の構造及び／又は機能を有する配列部分が互いに置換される置換キメラを指すのに用いられうる。典型的なキメラ抗体及びヒト化抗体が保存的置換キメラの例である。
別個の機能を有する第二のペプチドに融合したＬｙｐ−１を含む二官能性ペプチドも開示される。そのような二官能性ペプチドは、完全長分子の異なる部分によって付与される、少なくとも２つの機能を有し、例えば、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と選択的に相互作用する能力に加え、抗血管新生活性又はアポトーシス促進活性を示しうる。
各々が独立してペプチド（例えば、アミノ酸配列・配列番号１又はその保存的変異体若しくはペプチド模倣体）を含む、少なくとも２つのサブ配列を含む単離多価ペプチドも開示される。該多価ペプチドは、各々が独立してペプチドを含む、例えば、少なくとも３個、少なくとも５個又は少なくとも１０個のそのようなサブ配列を有しうる。特定の実施形態では、該多価ペプチドは、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５又は２０個の同一或いは非同一サブ配列を有しうる。更なる実施形態では、該多価ペプチドは配列番号１のリピートのような同一サブ配列を含みうる。更なる実施形態では、該多価ペプチドは、介在アミノ酸によって分離されない、連続的な同一或いは非同一サブ配列を含む。一層更なる実施形態では、該多価ペプチドは環状であり、或いは配座的に制限されうる。一例では、該ペプチドはジスルフィド結合を介して環状化或いは環化されうる。
本明細書で用いられるように、「ペプチド」という用語は、ペプチド、蛋白質、蛋白質の断片などを意味するのに広範に用いられる。本明細書で用いられるような「ペプチド模倣体」という用語は、その構造的基盤となるペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。そのようなペプチド模倣体は、化学修飾ペプチド、非天然アミノ酸を含むペプチド様分子及びペプトイドを含み、ペプチド模倣体が由来するペプチドの標的との選択的相互作用のような活性を有する（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＲｏ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，“Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”Ｖｏｌ．１（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ（編）；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社 １９９５）、８０３−８６１頁を参照）。
様々なペプチド模倣体が当該技術分野において公知であり、例えば、制限アミノ酸、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分又はアミド結合同配体を含むペプチド様分子が含まれる。非天然制限アミノ酸を含むペプチド模倣体は、例えば、α−メチル化アミノ酸；α，α−ジアルキルグリシン又はα−アミノシクロアルカンカルボン酸；Ｎα−Ｃα環化アミノ酸；Ｎα．−メチル化アミノ酸；β−又はγ−アミノシクロアルカンカルボン酸；α，β−不飽和アミノ酸；β，β−ジメチル又はβ−メチルアミノ酸；β−置換−２，３−メタノアミノ酸；Ｎ−Ｃε又はＣα−ＣΔ環化アミノ酸；置換プロリン或いは別のアミノ酸模倣体を含みうる。ペプチド二次構造を模倣するペプチド模倣体は、例えば、非ペプチドβ−ターン模倣体；γ−模倣体；β−シート構造の模倣体；又はへリックス構造の模倣体を含み得、それらの各々は当該技術分野において周知である。ペプチド模倣体は、例えば、レトロ−インベルソ修飾のようなアミド結合同配体；還元アミド結合；メチレンチオエーテル又はメチレン−スルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランス−オレフィン又はフルオロオレフィン結合；１，５−二置換テトラゾール環；ケトメチレン又はフルオロケトメチレン結合或いは別のアミド同配体を含むペプチド様分子でもありうる。当業者は、これら及び他のペプチド模倣体が、本明細書で用いられるような「ペプチド模倣体」という用語の意味範囲内に包含されることを理解する。
ペプチド模倣体を同定する方法は当該技術分野において周知であり、例えば、潜在的ペプチド模倣体のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。一例として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００以上の化合物のコレクションを有する（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｑｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ，３５：２３３１（１９７９））。この構造寄託は、新たな結晶構造が決定されるため、継続的に更新され、好適な形状、例えば、開示ペプチドと同じ形状及び標的分子に対する潜在的な幾何学的・化学的な相補性を有する化合物のスクリーニングに用いられうる。ペプチド又は該ペプチドと結合する標的分子の結晶構造が得られない場合、例えば、ＣＯＮＣＯＲＤプログラムを用いて構造が生成されうる（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９）。別のデータベースであるＡｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社；カリフォルニア州Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ）は、市販されている約１００，０００個の化合物を含み、また、例えば、癌細胞と選択的に相互作用する活性を有するペプチドの潜在的ペプチド模倣体を同定するために探索されうる。
所望とあれば、Ｌｙｐ−１のような単離ペプチドは環状であり、或いは配座的に制限されうる。本明細書で用いられるように、ペプチドのような「配座的に制限された」分子は、三次元構造が経時的に実質的に１つの空間配置に維持される分子である。配座的に制限された分子は、親和性、代謝安定性、膜透過性又は可溶性の増大のような特性の向上を有しうる。構造制約の方法は当該技術分野において周知であり、本明細書の他の箇所で更に考察されるような環化を含む。
ペプチドに関連して本明細書で用いられるように、「環状」という用語は、２つの非隣接アミノ酸又はアミノ酸類似体間の分子内結合を含む構造を意味する。環化は共有結合又は非共有結合を介して生じうる。分子内結合には、限定されないが、骨格−骨格、側鎖−骨格及び側鎖−側鎖結合が含まれる。好ましい環化方法は、非隣接アミノ酸又はアミノ酸類似体の側鎖間ジスルフィド結合の形成を介するものである。ジスルフィド結合を形成することができる残基には、例えば、システイン（Ｃｙｓ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、β，β−ペンタメチレンシステイン（Ｐｍｃ）、β，β−ペンタメチレン−β−メルカプトプロピオン酸（Ｐｍｐ）及びそれらの機能的等価物が含まれる。
ペプチドは、例えば、１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体の側鎖基を用いて、アミノ末端残基のＮ末端アミンへの共有結合を形成することができるラクタム結合を介して環化することもできる。ラクタム結合を形成することができる残基には、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、オルニチン（ｏｒｎ）、α，β−ジアミノ−プロピオン酸、γ−アミノ−アジピン酸（Ａｄｐ）及びＭ−（アミノメチル）安息香酸（Ｍａｍｂ）が含まれる。更に、環化は、例えば、リシン（Ｌｙｓ）及びロイシン（Ｌｅｕ）残基間のリシノノルロイシン結合或いは２つのチロシン（Ｔｙｒ）残基間のジチロシン結合の形成を介して生じうる。当業者はこれら及び他の結合が環状ペプチドに含まれうるということを理解する。
（Ｄ．機能性核酸）
本明細書で考察されるように、機能性核酸は、例えば、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現を調節するのに用いられうる。機能性核酸は、標的分子との結合又は特定の反応の触媒のような特定の機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は以下の分類に分けられうるが、それは限定を意図するものではない。例えば、機能性核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子及び外部ガイド配列が含まれる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性の影響因子、阻害因子、調節因子及び刺激因子として作用することができ、或いは機能性核酸分子は、他のいずれの分子からも独立した新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）活性を有しうる。
機能性核酸分子は、任意の高分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は炭水化物鎖と相互作用することができる。本明細書で考察されるように、機能性核酸はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用することができる。機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との配列相同性に基づき、他の核酸と相互作用するように設計されることが多い。他の場合では、機能性核酸分子と標的分子との間の特定の認識は、機能性核酸分子と標的分子との配列相同性に基づくのではなく、むしろ特定の認識が生じることを可能とする三次構造の形成に基づく。
アンチセンス分子は、標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）或いは非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対を介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの分解を通じて標的分子の破壊を促進するように設計される。或いは、アンチセンス分子は、通常、標的分子において生じうるプロセシング機能、例えば、転写又は複製を妨害するように設計される。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計されうる。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによる、アンチセンス効率性の最適化のための多くの方法が存在する。例示的な方法はＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ選択試験及びＤＮＡ修飾試験であろう。アンチセンス分子は１０−６，１０−８，１０−１０又は１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）にて標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計・使用に役立つ方法及び技法の代表的サンプルが、以下の米国特許の非限定的一覧に見出されうる：５，１３５，９１７，５，２９４，５３３，５，６２７，１５８，５，６４１，７５４，５，６９１，３１７，５，７８０，６０７，５，７８６，１３８，５，８４９，９０３，５，８５６，１０３，５，９１９，７７２，５，９５５，５９０，５，９９０，０８８，５，９９４，３２０，５，９９８，６０２，６，００５，０９５，６，００７，９９５，６，０１３，５２２，６，０１７，８９８，６，０１８，０４２，６，０２５，１９８，６，０３３，９１０，６，０４０，２９６，６，０４６，００４，６，０４６，３１９及び６，０５７，４３７。
アプタマーは、好ましくは、特殊な態様にて標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステム・ル一プ又はＧ−カルテットのような特定の二次及び三次構造に折り畳む、長さ１５〜５０塩基の範囲の小核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｉｌｉｎｅ）（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小分子並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大分子と結合することができる。アプタマーは１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄｓにて極めて強固に結合することができる。アプタマーは、１０−６，１０−８，１０−１０又は１０−１２未満のｋｄにて標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは極めて高度の特異性にて標的分子と結合することができる。例えば、分子上の単一位置においてのみ異なる、標的分子と別の分子との結合親和性の１００００倍以上の差異を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、背景結合分子とのｋｄより少なくとも１０，１００，１０００又は１００００倍低い標的分子とのｋｄを有することが好ましい。例えば、ポリペプチドに対して比較する場合、背景分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。
種々の異なる標的分子と結合するためのアプタマーの作製及び使用の代表例が、以下の非限定的米国特許一覧に見出されうる：５，４７６，７６６，５，５０３，９７８，５．６３１，１４６，５，７３１，４２４，５，７８０，２２８，５，７９２，６１３，５，７９５，７２１，５，８４６，７１３，５，８５８，６６０，５，８６１，２５４，５，８６４，０２６，５，８６９，６４１，５，９５８，６９１，６，００１，９８８，６，００１，０２０，６，０１３，４４３，６，０２０，１３０，６，０２８，１８６，６，０３０，７７６及び６，０５１，６９８。
リボザイムは分子内又は分子間にて化学反応を触媒することができる核酸分子である。従って、リボザイムは触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。天然系において見出されるリボザイム、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：５，３３４，７１１，５，４３６，３３０，５，６１６，４６６，５，６３３，１３３，５，６４６，０２０，６，５６２，０９４，５，７１２，３８４，５，７７０，７１５，５，８５６，４６３，５，８６１，２８８，５，８９１，６８３，５，８９１，６８４，５，９８５，６２１，５，９８９，９０８，５，９９８，１９３，５，９９８，２０３，Ｌｕｄｗｉｇ及びＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５８，Ｌｕｄｗｉｇ及びＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５７並びにＬｕｄｗｉｇ及びＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：５，６３１，１１５，５，６４６，０３１，５，６８３，９０２，５，７１２，３８４，５，８５６，１８８，５，８６６，７０１，５，８６９，３３９及び６，０２２，９６２）及びテトラヒメナリボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：５，５９５，８７３及び５，６５２，１０７）に基づくヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、多くの異なるタイプのリボザイムがある。天然系には見出されないが、特殊な新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）反応を触媒するように設計されている多くのリボザイムもある（例えば、限定されないが、以下の米国特許：５，５８０，９６７，５，６８８，６７０，５，８０７，７１８及び５，９１０，４０８）。好ましいリボザイムはＲＮＡ又はＤＮＡ基質を開裂させ、より好ましくは、ＲＮＡ基質を開裂させる。通常、リボザイムは後に開裂する標的基質の認識及び結合を通じて核酸基質を開裂させる。この認識は大部分が標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）或いは非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対の相互作用に基づく場合が多い。標的基質の認識が標的基質配列に基づくため、この特性により、リボザイムは核酸の標的特異的開裂の特に良好な候補物質となる。種々の異なる反応を触媒するためのリボザイムの作製及び使用の代表例が、以下の非限定的米国特許一覧に見出されうる：５，６４６，０４２，５，６９３，５３５，５，７３１，２９５，５，８１１，３００，５，８３７，８５５，５，８６９，２５３，５，８７７，０２１，５，８７７，０２２，５，９７２，６９９，５，９７２，７０４，５，９８９，９０６及び６，０１７，７５６。
三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸と相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖と称される構造が形成され、その構造にはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対に依存する複合体を形成する三本鎖のＤＮＡがある。三重鎖分子は高親和性及び特異性にて標的領域と結合することができるため、好ましい。三重鎖形成分子は、１０−６，１０−８，１０−１０又は１０−１２未満のｋｄにて標的分子と結合することが好ましい。種々の異なる標的分子と結合するための三重鎖形成分子の作製及び使用の代表例が、以下の非限定的米国特許一覧に見出されうる：５，１７６，９９６，５，６４５，９８５，５，６５０，３１６，５，６８３，８７４，５，６９３，７７３，５，８３４，１８５，５，８６９，２４６，５，８７４，５６６及び５，９６２，４２６。
外部ガイド配列（ＥＧＳｓ）は、標的核酸分子と結合し、複合体を形成するする分子であり、この複合体は標的分子を開裂させるＲＮａｓｅ Ｐによって認識される。ＥＧＳｓは選択ＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計されうる。ＲＮＡｓｅ Ｐは細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングするのに役立つ。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いて、細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは動員されてほとんど如何なるＲＮＡ配列も開裂することができる（ＹａｌｅによるＷＯ ９２／０３５６６並びにＦｏｒｓｔｅｒ及びＡｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
同様に、真核ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐを標的化したＲＮＡの開裂を用いて、真核細胞内の所望の標的を開裂させることができる。（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ ９５／２４４８９；Ｙｕａｎ及びＡｌｔｍａｎ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５９−１６８（１９９５）並びにＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。種々の異なる標的分子の開裂を促進するためのＥＧＳ分子の作製及び使用の代表例が、以下の非限定的米国特許一覧に見出されうる：５，１６８，０５３，５，６２４，８２４，５，６８３，８７３，５，７２８，５２１，５，８６９，２４８及び５，８７７，１６２。
（Ｅ．核酸送達）
対象の細胞内への外因性ＤＮＡの投与及び取込み（即ち、遺伝子導入又はトランスフェクション）を含む、本明細書で記載される方法では、開示核酸は裸ＤＮＡ又はＲＮＡの形態でよく、或いは該核酸は該核酸を該細胞に送達するためのベクター内にあってよく、それにより、当業者には十分に理解されるように、抗体をコードしているＤＮＡ断片はプロモーターの転写調節下にある。該ベクターはアデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カナダ・ケベック州ラバル（Ｌａｖａｌ））のような市販の調製物でよい。核酸又はベクターの細胞への送達は、種々のメカニズムを介して可能である。一例として、送達は、市販のリポソーム調製物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ドイツ・ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）並びに当該技術分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを用いて、リポソームを介することが可能である。加えて、開示核酸又はベクターは、その技術がＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）から得られるエレクトロポレーションにより、また、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、アリゾナ州ツーソン（Ｔｕｃｓｏｎ））によってｉｎ ｖｉｖｏにて送達されうる。
一例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系のようなウイルス系を介することができる（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６参照）。次に、組換えレトロウイルスは細胞を感染させ、これにより、広範に中和する抗体（又はその活性断片）をコードする核酸を感染細胞に送達するのに用いられうる。勿論、改変核酸を哺乳動物細胞に導入する厳密な方法は、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。この処置に対しては他の技法が広範に利用でき、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用を含む。リポソーム送達及び受容体媒介並びに他のエンドサイトーシス機構のような物理的導入法も用いられうる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８，１９９６参照）。本開示組成物及び方法は、これら及び他の一般的に用いられる遺伝子導入法の任意の方法と併せて用いられうる。
一例として、抗体をコードしている核酸がアデノウイルスベクターにて対象の細胞に送達される場合、アデノウイルスのヒトへの投与のための用量は、１回の注射当たり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲でよいが、１回の注射当たり１０１２ｐｆｕほどの高用量でもよい（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ及びＣｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。対象は単回注射を受けることができ、或いは、追加注射が必要な場合、不定期間及び／又は処置の有効性が確定するまで６カ月間隔（又は当業者によって決定されるような適切な期間間隔）にて反復されうる。
核酸又はベクターの非経口投与が用いられる場合、一般的に、それは注射を特徴とする。注射可能物は、液体の溶液若しくは懸濁液、注射前の液状懸濁溶液に適した固体形態又は乳剤として従来の形態にて調製されうる。非経口投与の比較的最近修正された手法は、一定用量が維持されるように、徐放又は持続放出の利用を含む。治療用化合物の好適な製剤及び種々の投与経路の更なる考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）１９９５を参照されたい。
（Ｆ．抗体）
（ｉ．抗体一般）
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を調節するのに用いられうる抗体又はＬｙｐ−１が本明細書で開示される。そのような抗体の例は図１０に見出されうる。「抗体」という用語は、本明細書では広範な意味で用いられ、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。無傷免疫グロブリン分子に加え、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と相互作用する能力に対して選択される限り、「抗体」という用語には、それらの免疫グロブリン分子の断片又は重合体並びに免疫グロブリン分子のヒト若しくはヒト化変種又はその断片も含まれる。抗体は、本明細書で述べるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用い、或いは類似の方法により、その所望の活性について試験され得、その後、既知の臨床試験法に従って、そのｉｎ ｖｉｖｏでの治療活性及び／又は予防活性が試験される。
本明細書で用いられるような「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指し、即ち、集団内の個々の抗体が、抗体分子の小サブセットに存在しうる天然変異の可能性を除いて同一である。本明細書におけるモノクローナル抗体は、所望の拮抗活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種から得られ、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一或いは相同であり、一方、該鎖の他の部分が、別の種から得られ、或いは別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一或いは相同である「キメラ」抗体並びにそのような抗体の断片を具体的に含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。
開示モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生成する任意の処理を用いて作製されうる。例えば、開示モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により報告されているようなハイブリドーマ法を用いて調製されうる。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス又は他の適切な宿主動物が免疫剤で免疫化され、該免疫剤に特異的に結合する抗体を産生し、或いは産生することができるリンパ球を誘導する。或いは、リンパ球は、例えば、本明細書で述べるＨＩＶ Ｅｎｖ−ＣＤ４共受容体複合体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにて免疫化されうる。
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に述べられているような組換えＤＮＡ法によっても作製されうる。開示モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の処理を用いて容易に単離・配列決定されうる（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。例えば、Ｂｕｒｔｏｎらに対する米国特許第５，８０４，４４０号及びＢａｒｂａｓらに対する米国特許第６，０９６，４４１号に述べられているようなファージ提示法を用いて、抗体及び活性抗体断片のライブラリーを作製・スクリーニングすることもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法は一価抗体を調製するのにも適している。抗体を消化し、その断片、特に、Ｆａｂ断片を生成することは、当該技術分野において公知のルーチンの技法を用いて行われうる。例えば、消化はパパインを用いて行われうる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ ９４／２９３４８及び米国特許第４，３４２，５６６号に述べられている。典型的には、抗体のパパイン消化により、各々が単一抗原結合部位を有する、Ｆａｂ断片と称される２つの同一抗原結合断片及び残りのＦｃ断片が生じる。ペプシン処理では、２つの抗原結合部位を有し、それでも抗原を架橋することができる断片が生じる。
他の配列に結合しているか否かにかかわらず、該断片は、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換若しくは他の選択修飾も含みうる。但し、抗体又は抗体断片の活性が、非修飾抗体又は抗体断片と比べて有意に変化或いは損傷しないものとする。これらの修飾は、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去／付加し、その生体寿命を延ばし、その分泌特性を変化させるなどのような何らかの付加的特性を付与しうる。いずれの場合でも、抗体又は抗体断片は、その同種抗原への特異的結合のような生物活性特性を有する必要がある。抗体若しくは抗体断片の機能性領域又は活性領域は、蛋白質の特定領域の突然変異生成、次に、発現及び発現ポリペプチドの試験によって同定されうる。そのような方法は当業者には容易に明らかであり、抗体又は抗体断片をコードしている核酸の部位特異的突然変異生成を含みうる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
本明細書で用いられるように、「抗体」又は「抗体（複数）」という用語は、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体も指しうる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギ由来の抗体）はヒトにおいて天然に抗原性であり、従って、ヒトに投与されると、望ましくない免疫応答を生じさせうる。従って、本方法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を惹起する可能性を低下させるのに役立つ。
（ｉｉ．ヒト抗体）
開示されるヒト抗体は任意の技法を用いて調製されうる。ヒトモノクローナル抗体生成のための技法の例には、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（１）：８６−９５，１９９１）により述べられている技法が含まれる。ヒト抗体（及びその断片）はファージ提示ライブラリーを用いても生成されうる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。
開示ヒト抗体はトランスジェニック動物からも得られうる。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の完全レパートリーを生成することができるトランスジェニック突然変異マウスが報告されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）。具体的には、これらのキメラ及び生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合欠失は、内在性抗体生成の完全な阻害をもたらし、そのような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの良好な導入は、抗原投与後、ヒト抗体の生成をもたらす。本明細書で述べるように、所望の活性を有する抗体はＥｎｖ−ＣＤ４共受容体複合体を用いて選択される。
（ｉｉｉ．ヒト化抗体）
一般的に、抗体ヒト化技法は、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードしているＤＮＡ配列を操作するための組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。従って、非ヒト抗体（又はその断片）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部分を含むキメラ抗体又は抗体鎖（又はその断片例えば、Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’若しくは抗体の他の抗原結合部）である。
ヒト化抗体を作製するには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）由来の残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対するあるレベルの特異性及び親和性）を有することが既知であるドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲｓ由来の残基に置換される。一部の例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基も含みうる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基、及び、おそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基に置換されるヒト抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、抗体定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト抗体の定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，２：５９３−５９６（１９９２））。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において公知である。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒとその共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って作製されうる。ヒト化抗体を生成するのに用いられうる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）及び米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）にも述べられている。
（ｉｖ．抗体の投与）
抗体の投与は本明細書で開示されるように行われうる。抗体送達のための核酸手法も存在する。患者又は対象自身の細胞が核酸を吸収し、コードされた抗体又は抗体断片を生成・分泌するように、例えば、広範に中和する抗ＤＥＳ−１抗体及び抗体断片は、抗体又は抗体断片をコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）としても患者又は対象に投与されうる。核酸の送達は、例えば、本明細書で開示されるような任意の手段によるものでよい。
（Ｇ．Ｌｙｐ−１組成物）
配列番号１（Ｌｙｐ−１）を含み、任意に部分（ｍｏｉｅｔｙ）も含むＬｙｐ−１組成物が開示される。該部分（ｍｏｉｅｔｙ）は任意の分子でよい。例えば、配列番号１に結合された治療剤を含む部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が開示される。該部分（ｍｏｉｅｔｙ）はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に有用に標的化される分子であることが好ましい。例えば、治療効果を有する部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のような標的に作用する部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）又は蛍光分子若しくは放射性核種のような標的の検出、可視化若しくは画像化を容易にする部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）である。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と選択的に相互作用する配列番号１のような開示ペプチドは、例えば、腫瘍若しくは癌に作用し、炎症若しくは感染を低減又は排除し、且つ／或いは創傷治癒を促進することができる部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と有用に結合されうる。種々の治療剤がＬｙｐ−１組成物において有用であり、限定されないが、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管新生剤、ポリペプチド、核酸分子及び低分子が含まれる。
Ｌｙｐ−１組成物は、例えば、２又はそれ以上、３又はそれ以上、５又はそれ以上、１０又はそれ以上、１２又はそれ以上、３０又はそれ以上、４０又はそれ以上、５０又はそれ以上、１００又はそれ以上、２００又はそれ以上、３００又はそれ以上、４００又はそれ以上、５００又はそれ以上、１０００又はそれ以上の配列番号１のコピーを含みうる。Ｌｙｐ−１組成物はすべてが同一アミノ酸配列を有するペプチドを含みうる。別の実施形態では、Ｌｙｐ−１組成物は２又はそれ以上の非同一アミノ酸配列を含みうる。例えば、配列番号１と別の標的化ペプチドは別個或いは共に用いられうる。複数のペプチドを組み込んでいるＬｙｐ−１組成物において有用な部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）には、限定されずに、ファージ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリクス、非ポリマーマトリクス、粒子、例えば、金粒子、微小デバイス、ナノデバイス及びナノスケールの半導体物質が含まれる。
Ｌｙｐ−１組成物は、例えば、少なくとも２つのペプチドに結合されたリポソーム又は他のポリマーマトリクスを含みうる。所望とあれば、リポソーム又は他のポリマーマトリクスは、少なくとも１０、少なくとも１００又は少なくとも１０００個の配列番号１のようなペプチドに結合されうる。リポソームはそのようなコンジュゲートにて有用となりうる；リポソームはリン脂質又は他の脂質からなり、作製及び投与が比較的簡易である、非毒性で生理的に許容可能であって代謝可能な担体である（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、フロリダ州ボーカラトーン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）（１９８４））。リポソーム又は他のポリマーマトリクスは、別の成分、例えば、限定されずに、治療剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管新生剤、ポリペプチド又は核酸分子を任意に含みうる。
開示Ｌｙｐ−１組成物の成分は任意の好適な態様にて組み合わせられ、連結且つ／或いは結合されうる。例えば、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）とペプチドは、共有結合的或いは非共有結合的に、直接或いは間接に、リンカー部分の有無にかかわらず、結合されうる。
（１．部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ））
部分（ｍｏｉｅｔｙ）を標的に向けるのに有用な組成物が開示される。例えば、部分（ｍｏｉｅｔｙ）はＬｙｐ−１組成物に組み込まれうる。本明細書で用いられるように、「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、一般的に、生物学的に有用な機能を結合分子に付与する、物理的、化学的或いは生物学的物質を意味するのに広範に用いられる。部分（ｍｏｉｅｔｙ）は任意の天然或いは非天然物質でよく、限定されずに、生物学的物質、例えば、細胞、ファージ若しくは他のウイルス；有機化学物質、例えば、低分子；放射性核種；核酸分子若しくはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；又はペプチドを含む。有用な部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）には、限定されないが、治療剤、例えば、癌化学療法剤、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤及び抗血管新生剤；検出可能な標識及び造影剤；並びにタグ又は他の不溶性支持体が含まれる。有用な部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）には、限定されずに、ファージ及び他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリクス、非ポリマーマトリクス或いは粒子、例えば、金粒子、微小デバイス及びナノデバイス並びにナノスケールの半導体物質が更に含まれる。当該技術分野において公知のこれら及び他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は、コンジュゲートの成分でありうる。
（ｉ．治療剤）
部分（ｍｏｉｅｔｙ）は治療剤でありうる。本明細書で用いられるように、「治療剤」という用語は、正常或いは病変組織において１つ以上の生物活性を有する分子を意味する。様々な治療剤が部分（ｍｏｉｅｔｙ）として用いられうる。
一部の実施形態では、治療剤は癌化学療法剤でありうる。本明細書で用いられるように、「癌化学療法剤」は癌細胞の増殖、成長、寿命又は転移活性を阻害する化学物質である。そのような癌化学療法剤は、限定されずに、ドセタキセルのようなタキサン；ドキソルビシンのようなアントラサイクリン；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；代謝拮抗剤；シスプラチン又はカルボプラチンのような白金剤；メトトレキサートのようなステロイド；アドリアマイシンのような抗生物質；イソファミド；又は選択的エストロゲン受容体モジュレーター；トラスツズマブのような抗体でよい。
タキサンはＬｙｐ−１組成物において有用な化学療法剤である。有用なタキサンには、限定されずに、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ；Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）及びパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社；ニュージャージー州プリンストン）が含まれる。例えば、Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２３４１−２３５４（１９９９）及びＰａｒｉｄａｅｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：７２４（２０００）を参照されたい。
Ｌｙｐ−１組成物において有用な癌化学療法剤は、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、イダルビシン又はダウノルビシンでもよい。ドキソルビシンは一般的に用いられる癌化学療法剤であり、例えば、乳癌を処置するのに有用でありうる（Ｓｔｅｗａｒｔ及びＲａｔａｉｎ：“Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ”第５版、第１９章（ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．ら（編）；Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社 １９９７）；Ｈａｒｒｉｓら、上記“Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，”１９９７）。加えて、ドキソルビシンは抗血管新生活性を有し（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５１０（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｅｒ，“Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｋｅｙ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”４４９−４５４頁（Ｓｔｅｉｎｅｒら（編）；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ社、１９９２））、これは癌の処置においてその効果に寄与しうる。
アルキル化剤、例えば、メルファラン又はクロラムブシルも有用な癌化学療法剤でありうる。同様に、ビンカアルカロイド、例えば、ビンデシン、ビンブラスチン又はビノレルビン；或いは代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン又はそれらの誘導体は有用な癌化学療法剤でありうる。
白金剤も有用な癌化学療法剤でありうる。そのような白金剤は、例えば、Ｃｒｏｗｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８：２８−３７（２００１）において報告されているような、例えば、シスプラチン又はカルボプラチンでよい。他の有用な癌化学療法剤には、限定されずに、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、イホスファミド及びアンサマイシンが含まれる。
乳癌及び他のホルモン依存性癌の処置に有用な癌化学療法剤は、エストロゲンの作用に拮抗する薬剤、例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーター又は抗エストロゲン剤でもよい。選択的エストロゲン受容体モジュレーターであるタモキシフェンは、乳癌の処置のためにコンジュゲートにおいて用いられうる癌化学療法剤である（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ．９０：１３７１−１３８８（１９９８））。
治療剤はヒト化モノクローナル抗体のような抗体でありうる。一例として、抗上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌を処置するのに有用な治療剤でありうる（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５２：１２５−１４１（２００１））。
有用な治療剤は、本明細書で用いられるように、直接或いは間接的に細胞死を促進する任意の分子でありうる細胞毒性剤でもよい。有用な細胞毒性剤には、限定されずに、低分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、核酸分子、細胞及びウイルスが含まれる。非限定例として、有用な細胞毒性剤には、細胞毒性低分子、例えば、ドキソルビシン、ドセタキセル又はトラスツズマブ；更に下述されるような抗微生物ペプチド；カスパーゼ及び毒素のようなアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、カスパーゼ−８；ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素、例えば、ＤＡＢ３８９ＥＧＦ、トウゴマ（ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）毒素；並びに細胞毒性Ｔ細胞のような細胞毒性細胞が含まれる。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２１８−３２２４（２０００）；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ，Ｂｌｏｏｄ ９０：２５２−２５９（１９９７）；Ａｌｌａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２６１５−２６１８（１９９７）；並びにＯｓｂｏｒｎｅ及びＣｏｒｏｎａｄｏ−Ｈｅｉｎｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．２：１７５（１９９６）を参照されたい。本明細書で述べられ、或いは当該技術分野において公知のこれら及び追加の細胞毒性剤が、開示コンジュゲート及び方法において有用でありうることを当業者は理解する。
一実施形態では、治療剤は治療用ポリペプチドでよい。本明細書で用いられるように、治療用ポリペプチドは生物学的に有用な機能を有する任意のポリペプチドでよい。有用な治療用ポリペプチドは、限定されずに、サイトカイン、抗体、細胞毒性ポリペプチド；アポトーシス促進ポリペプチド；及び抗血管新生ポリペプチドを包含する。非限定例として、有用な治療用ポリペプチドは、サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン・アルファ（ＩＦＮ−α）；インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、リンフォタクチン（ＬＴＮ）又は樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）；抗ＨＥＲ２抗体又はその断片；毒素又はカスパーゼを含む細胞毒性ポリペプチド、例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素、例えば、ＤＡＢ３８９ＥＧＦ又はリシン；或いは抗血管新生ポリペプチド、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、血小板第４因子；アナステリン；又は本明細書で更に述べられ、或いは当該技術分野において公知の抗血管新生ポリペプチドの１つ（下記参照）でよい。生物活性を有するこれら及び他のポリペプチドが「治療用ポリペプチド」でありうることが理解される。
治療剤は抗血管新生剤でもよい。本明細書で用いられるように、「抗血管新生剤」という用語は、血管の成長・発達である血管新生を低減或いは阻止する分子を意味する。様々な抗血管新生剤がルーチンの方法によって調製されうる。そのような抗血管新生剤には、限定されずに、低分子；蛋白質、例えば、ドミナントネガティブ型の血管新生因子、転写因子及び抗体；ペプチド；並びにリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸分子とドミナントネガティブ型の血管新生因子及び受容体、転写因子をコードしている核酸分子及び抗体とその抗原結合断片が含まれる。例えば、Ｈａｇｅｄｏｒｎ及びＢｉｋｆａｌｖｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８９−１１０（２０００）並びにＫｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０：１４９−１６３（２０００）を参照されたい。
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの乳癌の血管新生を含む多くのタイプの癌における血管新生に重要であることが示されている（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：４２１３−４２１４（１９９９））。ＶＥＧＦの生物学的作用は、内皮細胞の増殖、生存、移動及び管形成並びに血管透過性の調節を含む。抗血管新生剤は、例えば、ＶＥＧＦの発現若しくはシグナリング又は別の血管新生因子を低下させる阻害因子又は中和抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体でよい（上記Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、１９９９）。抗血管新生剤は、別の血管新生因子、例えば、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、例えば、ＦＧＦ−１（酸性）、ＦＧＦ−２（塩基性）、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−５（Ｓｌａｖｉｎら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１９：４３１−４４４（１９９５）；Ｆｏｌｋｍａｎ及びＳｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２））或いは内皮細胞特異的Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼを介してシグナル伝達するアンジオポイエチン−１のような血管新生因子（Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ ８７：１１６１−１１６９（１９９６）；及びＳｕｒｉら、Ｃｅｌｌ ８７：１１７１−１１８０（１９９６））或いはこれらの血管新生因子の１つの受容体を阻害することもできる。様々なメカニズムが作用して血管新生因子の活性を阻害することができ、これには、限定されずに、受容体結合の直接阻害、血管新生因子の細胞外空間への分泌を低減することによる間接阻害又は血管新生因子の発現、機能若しくはシグナリングの阻害が含まれると理解される。
様々な他の分子も抗血管新生剤として機能することができ、これには、限定されずに、アンジオスタチン；アンジオスタチンのクリングルペプチド；エンドスタチン；アナステリン、フィブロネクチンのヘパリン結合断片；アンチトロンビンの改変形態；コラゲナーゼ阻害因子；基底膜ターンオーバー阻害因子；アンジオスタティックステロイド；血小板第４因子とその断片及びペプチド；トロンボスポンジンとその断片及びペプチド；並びにドキソルビシンが含まれる（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８（１９９４））；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５（１９９７）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１２０：３２７−３３２（１９８５）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８７４：６１−７１（１９８６）；及びＯ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９２６−１９２８（１９９９））。市販の抗血管新生剤には、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン及び２ＭＥ２（ＥｎｔｒｅＭｅｄ社；メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社；カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）のような抗ＶＥＧＦ抗体；並びにＶＥＧＦＲ−２阻害剤、例えば、ＶＥＧＦＲ−２の低分子阻害剤であるＳＵ５４１６（ＳＵＧＥＮ社；カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）及びＶＥＧＦＲ−２の低分子阻害剤であるＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ社）、血小板由来増殖因子及び線維芽細胞増殖因子Ｉ受容体が含まれる。これら及び他の抗血管新生剤がルーチンの方法によって調製され得、本明細書で用いられるような「抗血管新生剤」という用語に包含されることが理解される。
本明細書で開示されるＬｙｐ−１組成物は炎症部位にも用いられうる。この目的に有用な部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は、炎症を防止する抗炎症剤、組織増殖を防止する再狭窄防止剤、血栓の形成を阻害或いは制御する抗血栓形成剤又は血栓溶解剤並びに組織増殖を調節し組織の治癒を向上させる生物活性剤を含む複数の基礎群に属する治療剤を含みうる。有用な治療剤の例には、限定されないが、ステロイド、フィブロネクチン、抗凝固剤、抗血小板機能剤、血管の内面壁における平滑筋細胞増殖を防止する薬剤、ヘパリン、ヘパリン断片、アスピリン、クマジン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、抗増殖剤（メトトレキサート、シスプラチン、フルオロウラシル、アドリアマイシン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、ベータカロチン、ビタミンＥ）、代謝拮抗剤、トロンボキサン阻害剤、非ステロイド及びステロイド抗炎症剤、ベータ及びカルシウムチャンネル遮断薬、ＤＮＡ及びＲＮＡ断片を含む遺伝物質、完全発現遺伝子、抗体、リンホカイン、増殖因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン並びにインテグリンが含まれる。
有用な治療剤は抗微生物ペプチドでもよい。これは創傷又は他の感染部位を標的とするのに特に有用でありうる。従って、例えば、抗微生物ペプチドを含むＬｙｐ−１組成物も開示され、この場合、該Ｌｙｐ−１組成物は選択的に取り込まれ、標的部位に対して高毒性を示す。有用な抗微生物ペプチドは、Ｌｙｐ−１組成物に取り込まれない場合、低い哺乳動物細胞毒性を有しうる。本明細書で用いられるように、「抗微生物ペプチド」という用語は、１つ以上の微生物を死滅させ、或いはその増殖を遅延させる能力である抗微生物活性を有する天然或いは合成ペプチドを意味する。抗微生物ペプチドは、例えば、グラム陽性若しくはグラム陰性細菌又は菌類又は原虫を含む１つ以上の細菌株を死滅させ、或いはその増殖を遅延させることができる。従って、抗微生物ペプチドは、例えば、１つ以上の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株に対する、例えば、静菌或いは殺菌活性を有しうる。下述に制約されることを望まないが、抗微生物ペプチドは、自己会合の結果として膜二重層を通じたイオンチャンネルを形成する能力により、生物活性を有しうる。
典型的には、抗微生物ペプチドは高塩基性であり、線状或いは環状構造を有しうる。以下に更に考察されるように、抗微生物ペプチドは両親媒性アルファ−へリックス構造を有しうる（米国特許第５，７８９，５４２号；Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３１０７−３１１３（１９９６）；並びにＢｌｏｎｄｅｌｌｅ及びＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２６８８−１２６９４（１９９２）を参照）。抗微生物ペプチドは、例えば、Ｍａｎｃｈｅｎｏら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５１：１４２−１４８（１９９８）に述べられているようなβストランド／シート形成ペプチドでもよい。
抗微生物ペプチドは天然或いは合成ペプチドでよい。天然抗微生物ペプチドは、細菌、昆虫、両生動物及び哺乳動物のような生物源から単離されており、宿主生物を細菌感染から防護することができる誘導防御蛋白質を表すと考えられる。天然抗微生物ペプチドには、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン及びセクロピンが含まれる（例えば、Ｍａｌｏｙ及びＫａｒｉ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３７：１０５−１２２（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｒａｖｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０２：５３５−５３８（１９９４）；Ｂｅｓｓａｌｌｅら、ＦＥＢＳ ２７４：−１５１−１５５（１９９０．）；並びにＢｌｏｎｄｅｌｌｅ及びＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｒｉｓｔｏｌ（編）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５９−１６８頁 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ参照）。抗微生物ペプチドは、天然ペプチドの類似体、特に、両親媒性を保持或いは促進する天然ペプチド類似体でもよい（下記参照）。
Ｌｙｐ−１組成物に組み込まれた抗微生物ペプチドは、Ｌｙｐ−１に関連する低い哺乳動物細胞毒性を有しうる。哺乳動物細胞毒性はルーチンのアッセイを用いて容易に評価されうる。一例として、哺乳動物細胞毒性は、上記Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、１９９６に述べられているようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト赤血球の溶解により測定されうる。低い哺乳動物細胞毒性を有する抗微生物ペプチドは、ヒト赤血球に対して溶解性でなく、或いは溶解活性のためには１００μＭ超の濃度、好ましくは、２００，３００，５００又は１０００μＭ超の濃度を必要とする。
一実施形態では、抗微生物ペプチド部分が、真核細胞に取り込まれると、ミトコンドリア膜の破壊を促進するＬｙｐ−１組成物が開示される。特に、そのような抗微生物ペプチドは真核細胞膜と比べて優先的にミトコンドリア膜を破壊する。細菌細胞膜に類似するが真核細胞膜と対照的なミトコンドリア膜は、高含量の負荷電リン脂質を有する。抗微生物ペプチドは、例えば、ミトコンドリア膨張アッセイ又は当該技術分野において周知の別のアッセイを用いて、ミトコンドリア膜を破壊する活性を測定されうる。例えば、Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号６）は、真核細胞を死滅させるのに必要な濃度より有意に低い濃度１０μＭにて著明なミトコンドリア膨張を誘発する抗微生物ペプチドである。
例えば、５０μＭ，４０μＭ，３０μＭ，２０μＭ，１０μＭ又はそれ以下にて有意なミトコンドリア膨張を誘発する抗微生物ペプチドは、ミトコンドリア膜の破壊を促進するペプチドと考えられる。
一般的に、抗微生物ペプチドは希釈水溶液中にてランダムコイル構造を有するが、高レベルのらせん性が、らせん促進溶媒及び両親媒性媒体、例えば、ミセル、合成二重層若しくは細胞膜に誘導されうる。αへリックス構造は当該技術分野において公知であり、理想的なαへリックスは１回転当たり３．６残基及び１残基当たり１．５Åの移動距離（１回転当たり５．４Å；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク（１９８４）参照）を有することを特徴とする。両親媒性αへリックス構造では、極性及び非極性アミノ酸残基が両親媒性ヘリックスに配列され、これは、ペプチドがらせん軸に沿って観察されると、疎水性アミノ酸残基が一面にて優勢であり、親水性残基が対向面にて優勢であるαへリックスである。
広範に異なる配列の抗微生物ペプチドが単離されており、両親媒性αへリックス構造を共通の特徴として共有している（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：１０９−１３１（１９９４））。両親媒性及びらせん性を向上させると予測されるアミノ酸置換を有する天然ペプチド類似体は、抗微生物活性の増大を典型的に有する。概して、抗微生物活性の増大を有する類似体は、哺乳動物細胞に対する細胞毒性の増大も有する（Ｍａｌｏｙら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３７：１０５−１２２（１９９５））。
抗微生物ペプチドに関連して本明細書で用いられるように、「両親媒性αへリックス構造」という用語は、親水性面が生理的ｐＨにて複数の極性残基を含み、疎水性面が非極性残基を含むαへリックスを意味する。極性残基は、例えば、リシン又はアルギニン残基であり得、一方、非極性残基は、例えば、ロイシン又はアラニン残基でありうる。一般的に、両親媒性アルファ−へリックス構造を有する抗微生物ペプチドは、両親媒性ドメイン内での同数の極性及び非極性残基と、中性ｐＨにてペプチドに全体的な正電荷を付与するのに十分な数の塩基性残基とを有する（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：１０９−１３１（１９９４））。ロイシン又はアラニンのようならせん促進アミノ酸が抗微生物ペプチドに有利に含まれうることを当業者は理解する（例えば、上記Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４参照）。両親媒性αへリックス構造を有する合成抗微生物ペプチドは当該技術分野において公知であり、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ及びＢｅｃｋｅｒへの米国特許第５，７８９，５４２号に述べられている。
これら及び他の薬剤が有用な治療剤であって、これらが開示組成物及び方法において別個或いは共に用いられうるということが医薬腫瘍学の分野における当業者には理解される。従って、Ｌｙｐ−１組成物が１つ以上のそのような治療剤を含みことができ、また、所望とあれば、追加成分が該組成物の一部として含まれうるということが理解される。非限定例として、場合により、Ｌｙｐ−１と治療剤との間にオリゴペプチドスペーサーを用いることが望ましいこともある（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ及びＧａｒｎｅｔｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１０：１−９（１９９５））。
他の有用な薬剤には、血栓溶解剤、アスピリン、抗凝固剤、鎮痛剤及び鎮静剤、ベータ遮断薬、ａｃｅ（エース）阻害薬、硝酸塩、律動安定化剤（ｒｈｙｔｈｍ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）並びに利尿剤が含まれる。心臓への損傷を制限する薬剤は、心臓発作の数時間以内に投与されると最も奏功する。血塊を粉砕し、酸素に富む血液が遮断血管中に流れることを可能とする血栓溶解剤は、心臓発作後にできる限り早く投与されれば、患者の生存可能性を高める。心臓発作後数時間以内に投与される血栓溶解剤が最も効果的である。静注の場合、これらには、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＳＰＡＣ）若しくはアニストレプラーゼ、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒ−ｔＰＡ）及びストレプトキナーゼが含まれる。開示Ｌｙｐ−１組成物では任意のこれら又は類似薬剤を用いることができる。
（ｉｉ．検出可能物質）
開示Ｌｙｐ−１組成物中の部分（ｍｏｉｅｔｙ）は検出可能物質でもよい。様々な検出可能物質が開示方法において有用である。本明細書で用いられるように、「検出可能物質」という用語は検出されうる任意の分子をいう。有用な検出可能物質には、ｉｎ ｖｉｖｏ投与され、その後、検出されうる化合物及び分子が含まれる。開示組成物及び方法において有用な検出可能物質には、限定されないが、放射性標識及び蛍光分子が含まれる。検出可能物質は、例えば、直接或いは間接に、好ましくは、非侵襲的且つ／或いはｉｎ ｖｉｖｏ可視化法により、検出を容易にする任意の分子でよい。例えば、検出可能物質は、例えば、放射線的技法を含む、任意の公知の画像化法によって検出されうる。検出可能物質には、例えば、造影剤が含まれ得、例えば、該造影剤はイオン性或いは非イオン性である。一部の実施形態では、例えば、検出可能物質はタンタル化合物及び／又はバリウム化合物、例えば、硫酸バリウムを含む。一部の実施形態では、検出可能物質は放射性ヨウ素のようなヨウ素を含む。一部の実施形態では、例えば、検出可能物質は、有機ヨード酸、例えば、ヨードカルボン酸、トリヨードフェノール、ヨードホルム及び／又はテトラヨードエチレンを含む。一部の実施形態では、検出可能物質は、非放射性検出可能物質、例えば、非放射性同位体を含む。例えば、特定の実施形態では、非放射性検出可能物質としてＧｄが用いられうる。検出可能物質の他の例には、検出可能な放射線（例えば、蛍光励起、放射性崩壊、スピン共鳴励起など）を放出し、或いは放出させられうる分子、局所電磁場（例えば、磁性、強磁性、強磁性、常磁性且つ／或いは超常磁性種）に作用する分子、放射エネルギー（例えば、クロモフォア及び／又はフルオロフォア）、量子ドット、重元素及び／又はその化合物を吸収し、或いは散乱させる分子が含まれる。例えば、米国特許公開第２００４／０００９１２２号に述べられている検出可能物質を参照されたい。
検出可能物質の他の例には、プロトン放出分子、放射線不透過性分子及び／又は放射性分子、例えば、Ｔｃ−９９ｍ及び／又はＸｅ−１３のような放射性核種が含まれる。そのような分子は放射性医薬品として用いられうる。更に別の実施形態では、開示組成物は、本明細書で開示される検出可能物質の任意の組合せを含む、１つ又はそれ以上の異なるタイプの検出可能物質を含みうる。
蛍光部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ｄｉａｚｏｌ）−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）、エリトロシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）（登録商標）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート、例えば、量子染料（商標）、蛍光エネルギー転移色素、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体並びにシアニン色素Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５及びＣｙ７が含まれる。他の具体的な蛍光標識例には、３−ヒドロキシピレン ５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン（Ａｃｉｄ Ｆｕｃｈｓｉｎ）、アリザリンコンプレクソン（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ）、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ）、アロフィコシアニン（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アミノクマリン（Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ）、アントロイルステアリン酸（Ａｎｔｈｒｏｙｌ Ｓｔｅａｒａｔｅ）、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ（Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ）、アストラゾンオレンジＲ（Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｒ）、アストラゾンレッド６Ｂ（Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｒｅｄ ６Ｂ）、アストラゾンイエロー７ ＧＬＬ（Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ ７ ＧＬＬ）、アタブリン（Ａｔａｂｒｉｎｅ）、オーラミン（Ａｕｒａｍｉｎｅ）、オーロホスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、オーロホスフィンＧ，ＢＡＯ ９（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｇ，ＢＡＯ ９）（ビスアミノフェニルオキサジアゾール（Ｂｉｓａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｏｘａｄｉａｚｏｌｅ））、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ Ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ビスベンズアミド（Ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ブランコフォアＦＦＧ溶液（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＦＦＧ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ブランコフォアＳＶ（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＳＶ）、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ ＦＦ）、カルセインブルー（Ｃａｌｃｉｅｎ Ｂｌｕｅ）、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ）、カルコフロールＲＷ溶液（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ ＲＷ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、カルコフロールホワイト（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ）、カルコフロールホワイトＡＢＴ溶液（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ ＡＢＴ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、カルコフロールホワイト標準溶液（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、カルボスチリル（Ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ）、カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ）、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ、コリホスフィンＯ（Ｃｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｏ）、クマリン−ファロイジン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）、ＣＹ３．１ ８、ＣＹ５．１ ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）（１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｉｎｏ Ｎａｐｈａｌｉｎｅ ５ Ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、Ｄａｎｓｙｌ ＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ（Ｄｉｐｈｅｎｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＦ）、ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、エリトロシンＩＴＣ（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ ＩＴＣ）、Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘起蛍光）、フラゾオレンジ（Ｆｌａｚｏ Ｏｒａｎｇｅ）、Ｆｌｕｏ ３、フルオレスカミン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、Ｆｕｒａ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ）、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １０ＧＦ）、ゲナクリルピンク３Ｇ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｐｉｎｋ ３Ｇ）、ゲナクリルイエロー５ＧＦ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｙｅｌｌｏｗ ５ＧＦ）、グロキサン酸（Ｇｌｏｘａｌｉｃ Ａｃｉｄ）、グラニュラーブルー（Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｂｌｕｅ）、ヘマトポルフィリン（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイトＣｆ液体（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ Ｌｉｑｕｉｄ）、ロイコフォアＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ）、ロイコフォアＳＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ）、ロイコフォアＷＳ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ）、リサミンローダミンＢ２００（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ２００）（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＣＨ）、ルシファーイエローＶＳ（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、マグダラレッド（Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、マキシロンブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ（Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ １０ ＧＦＦ）、マキシロンブリリアントフラビン８ ＧＦＦ（Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ８ ＧＦＦ）、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン（Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｅｅｎ Ｐｙｒｏｎｉｎｅ Ｓｔｉｌｂｅｎｅ））、ミトラマイシン（Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ＮＢＤアミン、ニトロベンズオキサジドール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ）、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）、ヌクレアイエロー（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ（Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ Ｅ８Ｇ）、オキサジアゾール（Ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、パラローザニリン（Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ）（フォイルゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ））、ホルワイトＡＲ溶液（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ホルワイトＢＫＬ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ）、ホルワイトＲｅｖ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ）、ホルワイトＲＰＡ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ）、ホスフィン３Ｒ（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ３Ｒ）、フタロシアニン（Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、フィコエリトリンＲ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ）、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック（Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ Ｂｌａｃｋ）、ポルフィリン（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、プロシオンイエロー（Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ）、ピロニン（Ｐｙｒｏｎｉｎｅ）、ピロニンＢ（Ｐｙｒｏｎｉｎｅ Ｂ）、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ（Ｐｙｒｏｚａｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ７ＧＦ）、キナクリンマスタード（Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ Ｍｕｓｔａｒｄ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３）、ローダミン５ ＧＬＤ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ５ ＧＬＤ）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ）、ローダミンＢ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）、ローダミンＢ ２００（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ２００）、ローダミンＢエクストラ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ Ｅｘｔｒａ）、ローダミンＢＢ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＢＢ）、ローダミンＢＧ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＢＧ）、ローダミンＷＴ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＷＴ）、セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、セブロンブリリアントレッド２Ｂ（Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ２Ｂ）、セブロンブリリアントレッド４Ｇ（Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ）、セブロンブリリアントレッドＢ（Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ）、セブロンオレンジ（Ｓｅｖｒｏｎ Ｏｒａｎｇｅ）、セブロンイエローＬ（Ｓｅｖｒｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌ）、ＳＩＴＳ（プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ））、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ Ｉｓｏｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、スチルベン（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）、Ｓｎａｒｆ １、スルホローダミンＢ Ｃａｎ Ｃ（ｓｕｌｐｈｏ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ Ｃａｎ Ｃ）、スルホローダミンＧエクストラ（Ｓｕｌｐｈｏ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇ Ｅｘｔｒａ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、チアジンレッドＲ（Ｔｈｉａｚｉｎｅ Ｒｅｄ Ｒ）、チオフラビンＳ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ）、チオフラビンＴＣＮ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ ＴＣＮ）、チオフラビン５（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ ５）、チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）、チオゾールオレンジ（Ｔｈｉｏｚｏｌ Ｏｒａｎｇｅ）、チノポールＣＢＳ（Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ）、トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ）、ウルトラライト（Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）、ウラニンＢ（Ｕｒａｎｉｎｅ Ｂ）、ユービテックスＳＦＣ（Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ）、キシレンオレンジ（Ｘｙｌｅｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）及びＸＲＩＴＣが含まれる。
特に有用な蛍光標識には、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）並びにシアニン色素Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５及びＣｙ７が含まれる。これらの蛍光の吸収極大と放射極大は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）、Ｃｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、従って、それらの同時検出を可能とする。フルオレセイン色素の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）及び２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）；及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社、オハイオ州クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を含む、様々な市販供給源から得られうる。蛍光プローブとその使用については、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにも述べられている。
放射性検出可能物質の更なる例には、ガンマ放出体、例えば、ガンマ放出体Ｉｎ−１１１，Ｉ−１２５及びＩ−１３１、レニウム−１８６及び１８８並びにＢｒ−７７（例えば、Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｔｈｒｏｍ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．９ ３４５頁（１９７６）；Ｐｏｗｅｒｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２ ９３８頁（１９８２）；及び米国特許第５，０１１，６８６号参照）；陽電子放射体、例えば、Ｃｕ−６４，Ｃ−１１，及びＯ−１５並びにＣｏ−５７，Ｃｕ−６７，Ｇａ−６７，Ｇａ−６８，Ｒｕ−９７，Ｔｃ−９９ｍ，Ｉｎ−１１３ｍ，Ｈｇ−１９７，Ａｕ−１９８及びＰｂ−２０３が含まれる。他の放射性検出可能物質には、例えば、トリチウム、Ｃ−１４及び／又はタリウム並びにＲｈ−１０５，Ｉ−１２３，Ｎｄ−１４７，Ｐｍ−１５１，Ｓｍ−１５３，Ｇｄ−１５９，Ｔｂ−１６１，Ｅｒ−１７１及び／又はＴｌ−２０１が含まれうる。
テクニチウム−９９ｍ（Ｔｅｃｈｎｉｔｉｕｍ−９９ｍ）（Ｔｃ−９９ｍ）の使用が好ましく、他の出願に述べられており、例えば、米国特許第４，４１８，０５２号及び米国特許第５，０２４，８２９号を参照されたい。Ｔｃ−９９ｍは、１４０ｋｅＶの単一光子エネルギー及び約６時間の半減期を有するガンマ放出体であり、Ｍｏ−９９／Ｔｃ−９９ジェネレータから容易に得られうる。
一部の実施形態では、放射性検出可能物質を含む組成物は、標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）を検出に適した放射性同位体と結合することによって調製されうる。その結合は、キレート化剤、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ−，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）及び／又はメタロチオネインを介して生じ得、これらのいずれも標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）に共有結合されうる。一部の実施形態では、テクネチウム−９９ｍ（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ）、還元剤及び水溶性リガンドの水性混合物が調製され、次に、開示標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）と反応することを許容されうる。そのような方法は当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開第ＷＯ ９９／６４４４６号を参照されたい。一部の実施形態では、放射性ヨウ素を含む組成物は交換反応を用いて調製されうる。例えば、高温ヨウ素と低温ヨウ素との交換は当該技術分野において公知である。或いは、放射性ヨウ素標識化合物はトリブチルスタンニル中間体を介し、対応するブロモ化合物から調製されうる。
磁性検出可能物質には、例えば、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）に用いられる常磁性造影剤、例えば、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸が含まれる（例えば、Ｄｅ Ｒｏｏｓ，Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｖｏｌ．７ １３３頁（１９９１）参照）。一部の好ましい実施形態では、検出可能物質として、原子番号２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，４２，４４，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９又は７０を有する元素の二価又は三価イオンである常磁性原子を用いる。好適なイオンには、限定されないが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）及びイッテルビウム（ＩＩＩ）並びにガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ｔｅｒｂｉｕｒｎ）（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ｄｙｓｏｐｒｏｓｉｕｍ）（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）が含まれる。一部の好ましい実施形態では、高磁気モーメントを有する原子、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）を用いる。
一部の実施形態では、磁性検出可能物質を含む組成物は、標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）を常磁性原子と結合することによって調製されうる。例えば、好適な常磁性原子の金属酸化物又は金属塩、例えば、硝酸塩、塩化物若しくは硫酸塩は、水／アルコール媒体、例えば、メチル、エチル及び／又はイソプロピルアルコール中に溶解或いは懸濁されうる。その混合物は、同様の水／アルコール媒体中の等モル量の標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）の溶液に加えられ、攪拌されうる。その混合物は、反応が終了或いはほぼ終了するまで適度に加熱されうる。形成された不溶性組成物は濾過によって得られ得、一方、可溶性組成物は溶媒を蒸発させることによって得られうる。キレート化部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）における酸性基が開示組成物中に残存する場合、例えば、該組成物の単離又は精製を促進するため、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム及び／又はリチウムの水酸化物、炭酸塩及び／又は重炭酸塩）を用いて酸性基を中和することができる。
好ましい実施形態では、検出可能物質は、Ｌｙｐ−１のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用能に干渉しないように、Ｌｙｐ−１に結合されうる。一部の実施形態では、検出可能物質はＬｙｐ−１に化学的に結合されうる。一部の実施形態では、検出可能物質は、それ自体がＬｙｐ−１に化学的に結合されるとともに、画像化・標的化部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を間接的に結合する部分（ｍｏｉｅｔｙ）に化学的に結合されうる。
（Ｈ．医薬組成物及び担体）
開示組成物は医薬的に許容可能な担体にてｉｎ ｖｉｖｏ投与されうる。「医薬的に許容可能」とは、生物学的或いは別様に望ましくないことがない物質を意味し、即ち、該物質は、望ましくない生物学的作用を生じさせず、或いはそれが含まれる医薬組成物の他の成分と有害的に相互作用せず、Ｌｙｐ−１組成物と共に対象に投与されうる。当業者には周知であるように、当然、担体は、活性成分の劣化を最小限にし、且つ対象における有害な副作用を最小限にするように選択されうる。該物質は溶液、懸濁液状でよい（例えば、微粒子、リポソーム又は細胞に取り込まれる）。
（１．医薬的に許容可能な担体）
抗体を含む該組成物は、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて治療に用いられうる。
好適な担体とその製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、１９９５に述べられている。通常、製剤を等張性とするため、適量の医薬的に許容可能な塩が製剤中に用いられる。医薬的に許容可能な担体例には、限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは、約７〜約７．５である。更なる担体には、持続放出調製物、例えば、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが含まれ、そのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子の形態である。例えば、投与経路及び投与組成物濃度に依存し、特定の担体がより好ましくなりうることが当業者には明らかであろう。
医薬担体は当業者には公知である。最も典型的には、これらは、生理的ｐＨでの無菌水、生理食塩水及び緩衝液のような溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的担体であろう。該組成物は筋肉内或いは皮下投与されうる。当業者に用いられる標準的処置に従って、他の化合物が投与される。
医薬組成物は選択分子に加え、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含みうる。医薬組成物は、１つ以上の活性成分、例えば、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤なども含みうる。
該医薬組成物は、局所又は全身処置が望ましいか、また、処置対象部位に依存し、多くの方法にて投与されうる。投与は、局所（経眼、経膣、経直腸、鼻腔内を含む）、経口、吸入或いは非経口、例えば、点滴静注、皮下、腹腔内又は筋肉内注射でよい。開示抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内或いは経皮投与されうる。
非経口投与用の調製物は、無菌水性或いは非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液を含み、生理食塩水及び緩衝媒質を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液或いは固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養素補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルデキストロースに基づく電解質補充物）などを含む。防腐剤及び他の添加剤は、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなどとしても存在しうる。
局所投与用の製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉末剤を含みうる。従来の医薬担体、水性、粉末或いは油性基剤、増粘剤などが必要であり、或いは望ましい可能性もある。
経口投与用の組成物は、粉末又は顆粒、懸濁液又は水溶液又は非水性媒質、カプセル、包装袋又は錠剤を含む。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい可能性もある。
一部の組成物は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸並びに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸との反応により、或いは無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム並びに有機塩基、例えば、モノ−、ジ−、トリアルキル・アリールアミン及び置換エタノールアミンとの反応により形成される、医薬的に許容可能な酸−又は塩基−付加塩として投与されうる。
（Ｉ．コンビナトリアル・ケミストリー／スクリーニング法）
開示組成物は、開示組成物と所望のように相互作用する分子又は高分子を同定するための任意のコンビナトリアル技法のための標的として用いられうる。コンビナトリアル技法又はスクリーニング技法を通じて同定される組成物も開示され、配列番号１又はその一部分にて開示される組成物がコンビナトリアル又はスクリーニングプロトコルにおける標的として用いられる。
コンビナトリアル技法又はスクリーニング法において開示組成物を用いると、特定の所望の特性、例えば、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用を有する高分子のような分子が同定されるということが理解される。Ｌｙｐ−１のような開示組成物を用いた場合に同定・単離される分子も開示される。従って、Ｌｙｐ−１のような開示組成物を含むコンビナトリアル又はスクリーニング手法を用いて生成される産物も本明細書で開示される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物をスクリーニングする方法が本明細書で開示され、該方法は、被験化合物、Ｌｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む）及びｇＣ１ｑ受容体を接触させるステップと、非結合Ｌｙｐ−１組成物を検出するステップとを含み、所与量の非結合Ｌｙｐ−１組成物がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物を示す。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性を調節する被験化合物をスクリーニングする方法も開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む細胞を被験化合物と接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性の変化を検出するステップとを含み、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性の変化レベルがｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性を調節する化合物を示す。
「活性の変化レベル」とは、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体が活性の上昇又は低下を示すことができるということである。活性の上昇は、基準、対照又は基礎レベルと比べ、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９若しくは又は１００％の上昇又は１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５若しくは１００倍以上の活性の上昇でありうる。活性の低下は、基準、対照又は基礎レベルと比べ、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９又は１００％の活性の低下でありうる。例えば、被験化合物はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の他の化合物と相互作用する能力を低下させるようにｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用することができ、これにより、その活性を低下させる。別例では、被験化合物はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の合成を阻止することができ、これにより、そのようにしてその活性を低下させる。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する被験化合物をスクリーニングする方法が開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む細胞を被験化合物と接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該被験化合物との相互作用を検出するステップとを含む。該被験化合物がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用することが示された後、該被験化合物は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体関連障害を処置する能力を含む、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性を調節する能力について更に試験されうる。
癌のようなｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体関連障害を処置するのに用いられうる被験化合物をスクリーニングする方法が更に開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む細胞を被験化合物と接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性の変化を検出するステップとを含み、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性の変化レベルがｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性を調節しうる化合物を示す。該被験化合物がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性を調節することが示された後、次に、該被験化合物はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体関連障害を処置する能力について試験されうる。
該調節は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性の低下、発現又はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体関連障害を処置する能力を含みうる。「低下」とは、活性が、該被験化合物の非存在下より該被験化合物の存在下のほうが少ないということである。該調節はｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体活性又は関連活性の上昇を含みうる。「上昇」とは、活性が、該被験化合物の非存在下より該被験化合物の存在下のほうが多いということである。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の応答は、種々の濃度の被験化合物の存在下にて測定されうる。その測定ステップは被験化合物の種々の濃度にて応答を測定するステップも含みうる。例えば、被験化合物の濃度は１ｎＭ〜１０００μＭの範囲でよい。
本発明により企図されるアッセイは結合アッセイ及び活性アッセイを含む。これらのアッセイは従来のフォーマット又はハイスループットフォーマットにて行われうる。モジュレータースクリーニングは刺激物質及び阻害物質を同定するように設計される。スクリーニングされる可能性がある物質の供給源は、天然源、例えば、細胞抽出物（例えば、細菌、真菌、藻類及び植物細胞を含むが、これらに限定されない無脊椎動物細胞）並びに合成源、例えば、化合物ライブラリー又は生物ライブラリー、例えば、抗体物質又はペプチドライブラリーを含む。物質は活性を刺激或いは阻害する能力についてスクリーニングされる。結合アッセイは活性レベルを検出するのに用いられる。活性の機能アッセイ及び結合アッセイは、アゴニスト（刺激性）及びアンタゴニスト（阻害性）化合物のようなモジュレーターのスクリーニングに容易に適合される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体（及び下流活性）のモジュレーター、例えば、アゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングし、且つ同定するための多数のアッセイが本明細書で企図される。一例では、細胞が固定され、候補モジュレーターとの相互作用が検出される。別例では、被験化合物が固定される。更に別の例では、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と被験化合物との相互作用が溶液アッセイにて評価される。別に企図されるアッセイはジハイブリッドアッセイの変形を含み、蛋白質／蛋白質相互作用のモジュレーターは、形質転換又はトランスフェクション宿主細胞における陽性シグナルの検出により同定される。
本発明の企図による候補モジュレーターのスクリーニングは、化合物ライブラリーを含む任意の化合物を含む。低分子モジュレーターの同定には多くの異なるライブラリーが用いられ、（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー及び（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド若しくは有機分子からなるコンビナトリアルライブラリーを含む。化学ライブラリーは、ランダム化学構造又は既知の化合物の類似体又は従来の薬物発見スクリーニングにおいて「ヒット（ｈｉｔｓ）」若しくは「リード（ｌｅａｄｓ）」として同定されている化合物の類似体からなり、その一部は天然産物又は非指向的合成有機化学由来でありうる。天然産物ライブラリーは、微生物、動物、植物又は海洋生物のコレクションであり、これらは、（１）土壌、植物若しくは海洋微生物由来の培養液の発酵・抽出又は（２）植物若しくは海洋生物の抽出により、スクリーニング用の混合物を作製するのに用いられる。天然産物ライブラリーは、ポリケチド、非リボソームペプチド及びそれらの変異体（非天然）を含む。概要については、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３−６８（１９９８）を参照されたい。コンビナトリアルライブラリーは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機化合物からなる。これらのライブラリーは従来の自動合成法、ＰＣＲ、クローニング又は合成法により調製が比較的容易である。特に興味深いものは非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。更に別の興味深いライブラリーには、ペプチド、蛋白質、ペプチド模倣体、マルチパラレル合成コレクション、リコンビナトリアル及びポリペプチドライブラリーが含まれる。コンビナトリアル・ケミストリー及びそれから作製されるライブラリーの概要については、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたい。本明細書で述べる種々のライブラリーの利用を通したモジュレーターの同定により、候補「ヒット（ｈｉｔ）」（又は「リード（ｌｅａｄ）」の修飾が、該「ヒット（ｈｉｔ）」の活性を調節する能力を最適化することが可能となる。
本発明により企図される候補モジュレーターは、設計され、可溶性形態の結合パートナー並びにそのキメラ又は融合蛋白質を含みうる。本明細書で用いられるような「結合パートナー」は、非ペプチドモジュレーター、ペプチドモジュレーター（例えば、ニューロペプチド変異体）、抗体（モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体を含み、本明細書で開示されるようなポリペプチドを特異的に認識する、ＣＤＲ及び／又は抗原結合配列を含む化合物を含む）、抗体断片及び発現産物に対して免疫特異的な抗体ドメインを含む修飾化合物を広範に包含する。
化合物の標的蛋白質との結合又は相互作用を測定するアッセイは、標的蛋白質のアンフォールディング又は変性を阻害する化合物を同定するアッセイ、親和性限外濾過（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通して標的蛋白質に結合する化合物を分離し、次に、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法又は他の物理的方法・分析法を行うアッセイ、キャピラリー電気泳動アッセイ並びに２−ハイブリッドアッセイを含む。
被験リガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する、１つのそのようなスクリーニング法が米国特許第５，５８５，２７７号に述べられており、これは参照して本明細書に組み込まれる。この方法は、一般的に、蛋白質が折り畳まれた状態及び折り畳まれていない状態の混合として存在し、且つ該２つの状態を絶えず繰り返すという原理に依存する。被験リガンドが折り畳まれた形態の標的蛋白質に結合すると（即ち、該被験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合）、該リガンドに結合される標的蛋白質分子はその折り畳まれた状態のままである。従って、折り畳まれた標的蛋白質は、リガンドの非存在下より、標的蛋白質と結合する被験リガンドの存在下のほうに多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は、標的蛋白質の折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態とを識別する任意の方法により判定されうる。このアッセイが施行されるため、標的蛋白質の機能が既知である必要はない。この方法により、被験リガンドとして実質的に如何なる物質でも評価され得、これには、限定されないが、金属、ポリペプチド、蛋白質、脂質、多糖類、ポリヌクレオチド及び有機低分子が含まれる。
標的蛋白質のリガンドを同定する別の方法が、Ｗｉｅｂｏｌｄｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）に述べられており、これは参照して本明細書に組み込まれる。この技法では、溶液相にて一度にコンビナトリアルライブラリーの２０〜３０物質の標的蛋白質への結合についてスクリーニングする。標的蛋白質に結合する物質は、簡易な膜洗浄により他のライブラリー要素から分離される。フィルターに保持される、特異的に選択された分子は、次に、標的蛋白質分子から解放され、ＨＰＬＣ及び空気補助式エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析される。この処理では、標的蛋白質に対する最大親和性を有するライブラリー要素を選択し、特に、低分子ライブラリーに有用である。
或いは、そのような結合相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９）及びＦｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１９９４）（共に参照して本明細書に組み込まれる）に報告されているイースト２ハイブリッドシステムを用いて間接的に評価される。２ハイブリッドシステムは、２つの蛋白質又はポリペプチド間の相互作用検出するための遺伝子アッセイである。これは、既知の対象蛋白質に結合する蛋白質を同定し、或いは相互作用に重要なドメイン又は残基を明示するのに用いられうる。この方法に関する変形例が、ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子をクローニングし、蛋白質に結合するペプチドを同定し、且つ薬物をスクリーニングするように開発されている。２ハイブリッドシステムは、転写活性化ドメインを、レポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインに近接させる一対の相互作用蛋白質の能力を利用し、一般的に、酵母において行われる。そのアッセイは、（１）第一の蛋白質に融合したＤＮＡ結合ドメイン及び（２）第二の蛋白質に融合した活性化ドメインをコードしている２つのハイブリッド遺伝子の構築を必要とする。該ＤＮＡ結合ドメインは第一のハイブリッド蛋白質をレポーター遺伝子のＵＡＳへ標的化するが、大部分の蛋白質が活性化ドメインを欠失しているため、このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。該活性化ドメインを含む第二のハイブリッド蛋白質は、ＵＡＳと結合しないため、単独でレポーター遺伝子の発現を活性化することはできない。しかし、両ハイブリッド蛋白質が存在すると、該第一及び第二の蛋白質の非共有結合性相互作用により、該活性化ドメインはＵＡＳに連結し、レポーター遺伝子の転写を活性化する。
文献は薬物発見のためのＨＴＳ結合アッセイにおける放射性標識リガンドの使用例に満ちている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１１：１４７−１８４（１９９１）；Ｓｗｅｅｔｎａｍら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５６：４４１−４５５（１９９３）参照。これらは、ハイスループットスクリーニングに関する教示につき、それらの全体を参照して本明細書に組み込まれる）。ＨＴＳ結合スクリーニングにおける放射性標識リガンドにより、新規の神経再生化合物をスクリーニングすることも可能である。ＨＴＳ結合アッセイに組換え受容体が好ましい他の理由には、より良好な特異性（より高い相対純度）及び大量の受容体物質を生成する能力が含まれる（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：９７３−９８０（１９９２）参照）。
組換え蛋白質の発現のための様々な異種系が利用でき、当業者には周知である。そのような異種系は、細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１３：９５−９８（１９９２））、酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４８７−４９４（１９９７））、数種類の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６４：１８９−２６８（１９９６））、両生動物細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６２９−６３４（１９９７））及び複数の哺乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳなど；Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３４：１−２３（１９９７）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２５：１３８７−１３９２（１９９８）参照）を含む。これらの例は、線虫から得られる細胞株を含む、他の可能な細胞発現系の使用を除外しない（ＷＯ ９８／３７１７７））。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又はそれに関連する下流産物若しくは遺伝子の阻害は、種々の生物学的応答を生じさせることができ、典型的には、それは、宿主細胞に発現される蛋白質によって媒介される。該蛋白質は宿主細胞の天然構成成分でよく、或いは周知の組換え技術により導入されうる。該蛋白質は天然種の突然変異体でもよい。該蛋白質は無傷或いはキメラでよい。
蛍光変化は、リガンド誘発性の膜電位又は細胞内ｐＨ変化をモニタリングするのにも用いられうる。ＨＴＳに適した自動システムがこれらを目的として報告されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １：７５−８０（１９９６））。これらのアッセイによって同定されうるモジュレーターには、天然リガンド化合物；天然リガンドの合成類似体及び誘導体；抗体、抗体断片及び／又は天然抗体若しくは抗体様コンビナトリアルライブラリー由来の抗体様化合物；並びに／或いはハイスループットスクリーニングのライブラリー及び当該技術分野において公知の他のライブラリーによって同定される合成化合物がある。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と相互作用するモジュレーターはすべて、Ｌｙｐ−１様ポリペプチドを同定するのに有用である（例えば、診断目的、病理学的目的及び当該技術分野において公知の他の目的として）。アゴニストとアンタゴニストモジュレーターは、本明細書で述べる目的のため、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２をそれぞれアップレギュレーション、ダウンレギュレーションするのに有用である。
アッセイは単一の推定モジュレーターを用いて行われうる。アッセイは候補アゴニストと組み合わせた既知のアゴニストを用いても行われうる（又はその逆（ｖｉｓａ ｖｅｒｓａ））。用いられうる検出可能分子には、限定されないが、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、放射性並びに生物発光、リン光及び蛍光を含むがこれらに限定されない光学的手段により検出可能な分子が含まれる。これらの検出可能分子は、生物学的適合性分子である必要があり、分子の生物学的機能を損なうべきではなく、検出可能分子の検出される能力を損ねてはならない。好ましい検出可能分子は、それらが化学的、機械的、電気的或いは放射活性的に励起されて蛍光、リン光又は生物発光を放出するように、光学的に検出可能な蛋白質を含む、光学的に検出可能な分子である。より好ましい検出可能分子は、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を含む蛍光蛋白質のような本質的に蛍光性の分子である。検出可能分子は、Ｂａｒａｋら（米国特許第５，８９１，６４６号及び第６，１１０，６９３号）に述べられているような方法により、ＧＲＫ蛋白質にコンジュゲートされうる。検出可能分子は、前端、後端又は中央部においてコンジュゲートされうる。
（Ｊ．コンピュータ支援薬物設計）
開示組成物は、開示組成物の構造を同定し、或いは、例えば、低分子のような開示組成物と所望の態様にて相互作用する潜在性又は実際の分子を同定するため、任意の分子モデリング技術のための標的として用いられうる。
モデリング技術において開示組成物を用いると、特定の所望の特性、例えば、阻害又は刺激又は標的分子の機能を有する高分子のような分子が同定されるということが理解される。開示組成物、例えば、Ｌｙｐ−１を用いた際に同定・単離される分子も開示される。従って、開示組成物、例えば、Ｌｙｐ−１を含む分子モデリング手法を用いて生成される産物も本明細書で開示されると考えられる。
従って、選択分子と結合する分子を単離する１つの方法は合理的設計によるものである。これは構造情報及びコンピュータモデリングにより成されうる。コンピュータモデリング技術は、選択分子の三次元原子構造の可視化及び該分子と相互作用する新規化合物の合理的設計を可能とする。通常、三次元構造体は選択分子のＸ線結晶解析又はＮＭＲ画像由来のデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新規化合物が標的分子に結合する態様の予測を可能とし、該化合物及び標的分子の構造の実験的操作が結合特異性を完全にすることを可能とする。一方又は両方においてわずかな変更がなされると、分子−化合物相互作用がどのようになるかという予測には、分子力学ソフトウェア及び、通常、分子設計プログラム・ユーザー間の使い勝手の良いメニュー方式のインターフェースと一体となった計算集約型コンピュータ（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒ）を必要とする。
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化及び分子動力学的機能を果たす。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング及び解析を行う。ＱＵＡＮＴＡは互いの分子の挙動の相互作用の構築、修正、可視化及び解析を可能とする。
多くの論文で特定の蛋白質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されており、例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙ及びＲｏｓｓｍａｎｎ，１９８９ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ及びＤａｖｉｅｓ，ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １８９−１９３頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ及びＤｅａｎ，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０及び１４１−１６２；並びに、核酸成分のモデル酵素に関し、Ａｓｋｅｗら、１９８９ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０である。化学物質をスクリーニングし、グラフィックに示す他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パサディナ（Ｐａｓａｄｅｎａ）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ、カナダ・オンタリオ州ミシサーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．、オンタリオ州ケンブリッジのような企業から入手可能である。これらは主に特定の蛋白質に特異的な薬物への適用のために設計されているが、ＤＮＡ又はＲＮＡの特定の領域（その領域が同定されると）と特異的に相互作用する分子の設計に適合されうる。
結合を変化させうる化合物の設計及び生成に関連して上述したが、基質結合又は酵素活性を変化させる化合物について、天然産物又は合成化学物質を含む既知の化合物並びに蛋白質を含む生物活性物質のライブラリーをスクリーニングすることも可能である。
（Ｋ．類似機能を有する組成物）
本明細書で開示される組成物がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用のような特定の機能を有するということが理解される。開示機能を果たすための特定の構造条件が本明細書で開示され、開示構造に関連する、同じ機能を果たすことができる様々な構造があり、また、これらの構造が最終的に、同じ結果、例えば、刺激又は阻害を成すということが理解される。
（Ｌ．キット）
本明細書で開示される方法を実施するのに用いられうる試薬に引き付けられる（ｄｒａｗｎ ｔｏ ｒｅａｇｅｎｔｓ）キットが本明細書で開示される。該キットは本明細書で考察される任意の試薬又は試薬の組合せを含むことができ、或いはそれは開示方法の実施において必要又は有益であると理解されうる。例えば、該キットはＬｙｐ−１及びｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含みうる。
（Ｍ．混合物）
該方法が組成物又は成分又は試薬を混合するステップ又は接触させるステップを含む場合には常に、該方法を実施することにより、多くの異なる混合物が生成される。例えば、該方法が３つの混合ステップを含む場合、該ステップが別個に行われると、これらのステップの各ステップの後、独特の混合物が形成される。加えて、該ステップが如何様に行われたかにかかわらず、すべてのステップの完了時に混合物が形成される。本発明の開示では、開示方法の実施により得られるこれらの混合物並びに、例えば、本明細書で開示される任意の開示試薬、組成物又は成分を含む混合物が企図される。
（Ｎ．システム）
開示方法を実施し、或いはその実施を支援するのに有用なシステムが開示される。一般的に、システムは、構造、機械、デバイスなどのような製造物品と組成物、化合物、物質などとの組合せを含む。開示され、或いは開示内容から明らかである、そのような組合せが企図される。
（Ｏ．コンピュータ読み取り可能媒体）
開示核酸及び蛋白質は、アミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表されうるということが理解される。これらの配列を示す種々の方法があり、例えば、ヌクレオチドであるグアノシンはＧ又はｇで表されうる。同様に、アミノ酸であるバリンはＶａｌ又はＶで表されうる。当業者は、存在する種々の方法の任意の方法にて任意の核酸又は蛋白質配列を示し、且つ表す方法を理解し、それらの各々は本明細書で開示されると考えられる。本明細書で具体的に企図されるのは、コンピュータ読み取り可能媒体、例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク及びビデオディスク或いは他のコンピュータ読み取り可能媒体でのこれらの配列の表示である。開示配列のバイナリコード表示も開示される。当業者はコンピュータ読み取り可能媒体が何たるものであるかを理解する。従って、核酸又は蛋白質配列が記録、保管或いは保存されるコンピュータ読み取り可能媒体である。
（Ｐ．ペプチド合成）
本明細書で開示される組成物及び開示方法を実施するのに必要な組成物は、他に特記されない限り、その特定の試薬又は化合物のために当業者には周知の任意の方法を用いて作製されうる。
開示蛋白質、例えば、配列番号１を生成する１つの方法は、蛋白質化学技法により２つ以上のペプチド又はポリペプチドを共に連結することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学を用いた、現在利用可能な実験装置を用いて化学合成されうる（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））。例えば、開示蛋白質に対応するペプチド又はポリペプチドが標準的化学反応により合成されうるということを当業者は容易に理解することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドは合成され、その合成用樹脂から切断され得ないが、一方、ペプチド又は蛋白質の他の断片は合成され、次に、該樹脂から切断され得、これにより、他の断片では機能的に遮断された末端基を露出させる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、それぞれカルボキシル末端、アミノ末端におけるペプチド結合を介して共有結合され、抗体又はその断片を形成することができる（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ及びＴｒｏｓｔ Ｂ．（編）（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．、ニューヨーク（これは、少なくともペプチド合成に関連する物質につき、参照して本明細書に組み込まれる）。或いは、ペプチド又はポリペプチドは、本明細書で述べるようにｉｎ ｖｉｖｏにて独立して合成される。これらの独立したペプチド又はポリペプチドは、単離されると、同様のペプチド縮合反応により、連結されてペプチド又はその断片を形成することができる。
例えば、クローン又は合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチド断片が結合され、より大きいペプチド断片、ポリペプチド又は全蛋白質ドメインを生成することを可能とする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。或いは、合成ペプチドの天然化学的ライゲーションを用いて、短いペプチド断片から大きいペプチド又はポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は２ステップ化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第一のステップは、非保護合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、最初の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件に変化がなければ、この中間体は自発的で迅速な細胞内反応を受け、ライゲーション部位において天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０（１９９４））。
或いは、非保護ペプチドセグメントは化学的に結合され、化学的ライゲーションの結果として該ペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技法は、蛋白質ドメインの類似体及び完全な生物活性を有する大量の比較的純粋な蛋白質を合成するのに用いられている（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、２５７−２６７頁（１９９２））。
（方法）
組成物とｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用の方法が開示される。そのような相互作用は、例えば、選択的、標的化又はホーミングでよい。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用は、Ｌｙｐ−１により媒介され得、本明細書で述べるような任意のＬｙｐ−１又はＬｙｐ−１組成物を含みうる。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用は、疾患及び病状、例えば、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と関連する疾患及び／又は病状を検出且つ／或いは処置するのに有用でありうる。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、該対象に配列番号１（Ｌｙｐ−１）を含む組成物を投与するステップとを含む。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する方法が更に開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定するステップと、Ｌｙｐ−１と同じ部位においてｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する組成物を該対象に投与するステップとを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を処置する。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する組成物は、例えば、抗体、蛋白質又は化学物質でありうる。
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法が開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、該Ｌｙｐ−１組成物と細胞とを接触させるステップを含み、これにより、該Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する。
一例では、該細胞は対象内にある。該細胞が対象内にある場合、該細胞は、該対象の別の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在を検出することにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について選択されうる。
Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する方法が更に開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、該Ｌｙｐ−１組成物と該細胞とを接触させるステップとを含み、これにより、該Ｌｙｐ−１組成物をｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体に送達する。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体とＬｙｐ−１組成物との相互作用を検出する方法が更に開示され、該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を含む可能性について細胞を選択するステップと、該Ｌｙｐ−１組成物と該細胞とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含む。
対象の細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを定量且つ／或いは評価する方法が開示され、該方法は、該対象の細胞と配列番号１を含む組成物に結合した検出可能物質を含むＬｙｐ−１組成物とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用するＬｙｐ−１組成物のレベルを検出ステップとを含み、これにより、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルを定量且つ／或いは評価する。該対象におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体レベルは、同一対象における過去の測定と比較され、或いは対照のレベル又は基準レベルと比較されうる。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有する対象を同定する方法が更に開示され、該方法は、該対象の細胞とＬｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む組成物に結合した部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む）とを接触させるステップと、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と該Ｌｙｐ−１組成物との相互作用を検出するステップとを含み、これにより、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２の存在又はレベルを検出し、該細胞におけるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の存在又はレベルにより、該対象がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する疾患を有すると確認される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する化合物をスクリーニングする方法が更に開示され、該方法は、被験化合物、Ｌｙｐ−１組成物（該Ｌｙｐ−１組成物は配列番号１を含む）及びｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体を接触させるステップと、非結合Ｌｙｐ−１組成物を検出するステップとを含み、所与量の該非結合Ｌｙｐ−１組成物がｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と相互作用する組成物を示す。該Ｌｙｐ−１組成物は部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み得、該部分（ｍｏｉｅｔｙ）は配列番号１を含む。一例では、該部分（ｍｏｉｅｔｙ）は検出可能物質でよい。スクリーニング方法は以下により詳細に考察される。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置或いは予防する方法が本明細書で更に開示され、該方法は、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性を調節する組成物を該対象に投与するステップを含み、これにより、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体と関連する対象における疾患を処置する。該対象は癌を有しうる。該組成物は癌に対する治療効果を有しうる。腫瘍サイズは縮小されうる。腫瘍増殖は、低下、停止或いは逆行されうる。
ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の発現又は活性は阻害されうる。これは、阻害性核酸、例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの使用によって生じうる。ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体の活性は、ＬｙＰ−１ペプチド、抗体又はＬｙｐ−１の低分子模倣体によって阻害されうる。これらの例は図１０及び実施例２に見出されうる。本明細書で開示される、癌を処置或いは予防する方法は他の治療法と併せて用いられてもよい。
上記に開示された組成物の治療効果は、腫瘍組織量の増加の鈍化又は減少でありうる。この腫瘍組織量の増加の鈍化又は減少は、未処置腫瘍又は異なる方法により処置される腫瘍と比べ、腫瘍組織量の増加の鈍化又は減少の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は１０００％以上の改善でありうる。
開示方法に関わるｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体は、例えば、細胞表面又は細胞内にありうる。該細胞は任意の背景にあってよく、例えば、生物内、原位置、生体外、培養液中及び／又は試験管内でよい。
開示組成物は、無制御細胞増殖が生じる任意の疾患、例えば、癌を処置するのに用いられうる。異なるタイプの癌の非限定的一覧は以下のようになりうる：リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌腫、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高グレード神経膠腫、芽腫、神経芽腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫若しくは肉腫、転移性癌又は一般の癌。
処置をするのに開示組成物が用いられうる癌の代表的ではあるが非限定的ではない一覧は以下のものである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部の扁平上皮細胞癌、腎臓癌、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ）、例えば、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、神経芽腫／膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮細胞癌、結腸癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌及び上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸癌、造血癌；精巣癌；結腸・直腸癌、前立線癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）或いは膵臓癌。
（実施例１：Ｌｙｐ−１及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２）
Ｌｙｐ−１とｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用はプルダウンアッセイにて実証された。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５培養細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片から得た蛋白抽出物由来のビオチン化Ｌｙｐ−１ペプチド（配列番号１，ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ）を用いてプルダウンアッセイを行った。陰性対照として、腫瘍ホーミングペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号３）と、そのアミノ酸組成及び環状構造においてＬｙｐ−１に類似するペプチドＣＲＶ（配列番号４、ＣＲＶＲＴＲＳＧＣ）とを用いた。銀染色及び免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｉｎｇ）を用いてＬｙｐ−１結合蛋白質を可視化した。図１（ａ）の左側パネルは銀染色の結果を示す。矢印は特異的３３ｋＤバンドを示し、これは質量分析によりｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と確認された。図１（ａ）の右側パネルは、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対するモノクローナル抗体を用いた、Ｌｙｐ−１及び対照ペプチドに結合した総細胞抽出物（総溶解物）・蛋白質の免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｉｎｇ）の結果を示す。該抗体は総蛋白溶解物及びＬｙｐ−１プルダウンにおいて３３ｋＤのバンドを認識する。抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２反応バンドは両対照ペプチドからのプルダウンでは検出されない。図１（ｂ）の左側パネルは、Ｌｙｐ−１ペプチドによりＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片からプルダウンされた蛋白質の銀染色の結果を示し、更なる７５ｋＤバンドを示し、これも質量分析によりｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と確認された。図１（ｂ）の右側パネルは免疫ブロッティングの結果を示す。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対するモノクローナル抗体は、Ｌｙｐ−１ペプチドプルダウンにおいてのみ７５ｋＤ及び３３ｋＤバンドを認識した。
Ｌｙｐ−１発現ファージは精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に特異的に結合することが示された。精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又は対照としてのＢＳＡをマイクロタイターウェルに被覆し（５μｇ／ｍｌ）、１０８ｐｆｕの無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）、Ｌｙｐ−１ファージ又は別の腫瘍ホーミングペプチド（ＣＲＥＫＡ、配列番号３）を保有する対照ファージとの結合に対して標的化した。３７℃で１６時間のインキュベーション後、結合ファージを溶出させ、プラークアッセイにより定量した。その結果を図２（ａ）に示す。結果は、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）に対する回収したＬｙｐ−１及びＣＲＥＫＡ（配列番号３）の倍数として表し、５回の独立試験の典型である。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＮ末端に対する抗体は、精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２へのＬｙｐ−１ファージの結合を阻害することが示された。図２（ｂ）の左側パネルは、前駆体（ａａ−１−２８２）及び成熟（ａａ７４−２８２）ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質の略図を示す。ボックスは、成熟蛋白質のそれぞれＮ末端（ａａ７６−９３）、Ｃ末端（ａａ２０４−２８２）においてモノクローナル抗体ｍＡｂ ６０．１１とｍＡｂ ７４．５．２に認識されるアミノ酸残基を示す。ｍＡｂ ６０．１１に認識されるアミノ酸配列も示す。２０μｇ／ｍｌのｍＡｂｓ６０．１１，７４．５．２又は精製マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ）の存在下又は非存在下、１．５×１０７ｐｆｕの無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）及びＬｙｐ−１ファージを、３７℃で６時間、マイクロタイタープレートに被覆されたｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に結合させた。その結果を図２（ｂ）の右側パネルに示す。その結果は、３回の独立試験の典型であり、Ｌｙｐ−１ファージ結合単独を１００％としてファージ結合のパーセントとして表されている。
培養腫瘍細胞及び腫瘍異種移植片においてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の蛋白質レベル及び細胞表面発現を測定した。異なる腫瘍細胞株の溶解物をｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のウェスタンブロット分析に付した。ローディングコントロールとしてアクチンを用いた。共にＬｙｐ−１ファージの低結合体である（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）Ｃ８１６１黒色腫細胞及びＨＬ−６０前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｉｔｉｃ）白血病細胞は、より高いＬｙｐ−１ファージ結合能を示すＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ５４９乳癌細胞と比べ、低レベルのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を示す（図４（ａ）参照）。（ｂ〜ｃ）腫瘍細胞培養液（図４（ｂ））又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片由来の一次細胞懸濁液（図４（ｃ））中のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現を検出するため、ＦＡＣＳ解析を用いた。解析のため、ヨウ化プロピジウム陰性（生）細胞をゲートした。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片由来の細胞懸濁液では、ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体は、対照ウサギＩｇＧと比べてＦＡＣＳピークの有意なシフトを生じさせる（図４（ｃ）参照）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ５４９培養細胞においてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現は低い（図４（ｂ）参照）。より高いＬｙｐ−１ファージ結合能を有するＭＤＡ−ＭＢ−４３５サブクローンであるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ Ｓ３５は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５親細胞と比べ、ＦＡＣＳピークのより大きなシフトを示す。Ｃ８１６１細胞ではｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は細胞表面に発現されない。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の過剰発現はＣ８１６１黒色腫細胞へのＬｙｐ−１ファージ結合を亢進させることが示された。ｐＣＤＮＡ３又はｐＣＤＮＡ３ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２（１０μｇ）と共にｐＥＧＦＰ（２μｇ）をＣ８１６１細胞に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの２２時間後、ＥＧＦＰ発現について細胞を選別した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２過剰発現を検出するため、２つの選別集団をファージ結合アッセイ及びウェスタンブロット分析に用いた。その結果を図５に示す。空ベクター又はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２トランスフェクション細胞へのＬｙｐ−１ファージ結合は、無挿入ファージ（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ ｐｈａｇｅ）に対する結合の倍数として表されている。グラフは二重に行った２回の独立試験の結合の平均倍数を表す。
ＲＮＡｉ媒介性ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２サイレンシングは、Ｌｙｐ−１ペプチドの細胞表面への結合を減少させることが示された。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞にｇＣ１ｑＲ／ｐ３２特異的又は対照ｓｉＲＮＡｓを一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ウェスタンブロット分析及び免疫染色により、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現の阻害を検討した。対照としてβ−アクチンを用いた。ウェスタンブロット分析及び免疫染色の両方においてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２サイレンシングはｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を明らかに減少させた。対照及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２−ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現を、生（ヨウ化プロピジウム陰性）細胞のＦＡＣＳ解析により定量した。染色対照としてウサギＩｇＧを用いた。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２サイレンシングは細胞表面発現を対照と同レベルまで減少させた。１０μＭ ＦＩＴＣ結合Ｌｙｐ−１ペプチド又は同じアミノ酸電荷を有するとともに（ＡＲＡＬＰＳＱＲＳＲ、配列番号５）低結合能を示す（左側の最初のグラフト（ｇｒａｆｔ））対照ペプチドＡＲＡＬの存在下、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又は対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞を４℃で１時間インキュベートした。生細胞における蛍光量をＦＡＣＳにより解析した。ペプチドの非存在下にてインキュベートした細胞をＦＩＴＣ陰性対照とした。対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞と比べ、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現のダウンレギュレーション（ｇＣ１ｑＲｐ３２ ｓｉＲＮＡの存在下）はＬｙｐ−１蛍光のピークのシフトを生じさせたが、対照ペプチド蛍光では生じなかった。対照ペプチドの検出は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡに晒された細胞における差異を示さなかった。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及びＬｙｐ−１ペプチドの腫瘍局在を可視化した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片において、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２、リンパ管若しくは血管、ポドプラニン及びＭｅｃａ３２／ＣＤ３１を蛍光標識抗体で染色した。ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体は、血管を欠くがリンパ管を含む細胞塊又はポドプラニンに対して陽性であるがＣＤ３１若しくはＭｅｃａ３２に対して陽性ではない血管様構造体の内側を覆う細胞を認識する。フルオレセイン結合Ｌｙｐ−１ペプチドを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を有するマウスに静注し、１時間循環させた後、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の免疫組織化学的分析のために腫瘍を除去した。Ｌｙｐ−１ペプチドは腫瘍内のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２陽性部分に局在する。
（実施例２：ミトコンドリア／細胞表面蛋白質ｐ３２／ｇＣ１ｑＲは、腫瘍細胞における解糖と酸化的リン酸化との均衡を調節する）
（ｉ．序文）
腫瘍ホーミングペプチドであるＬｙｐ−１は、一部の腫瘍における腫瘍関連リンパ管及び腫瘍細胞に結合し、抗腫瘍効果を示す。マルチリガンド・マルチコンパートメンタル蛋白質ｐ３２／ｇＣ１ｑＲがＬｙｐ−１に対する受容体であることを本明細書で示す。Ｌｙｐ−１ペプチドは腫瘍培養細胞の抽出物由来ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に特異的に結合し、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は、腫瘍リンパ管及びこれらの脈管に隣接した位置にある細胞において静注Ｌｙｐ−１と共局在化した。ヒト組織の免疫組織化学的分析では、対応する正常組織と比べ、複数の癌におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現の大幅な上昇を示した。ｓｈＲＮＡによるＣ１ｑＲ／ｐ３２発現のノックダウンは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞における解糖を亢進させ、ミトコンドリア呼吸を低下させた。驚くべきことに、該ノックダウンは低糖状態において腫瘍細胞の生存及び増殖能を損ない、それらの腫瘍原性をｉｎ ｖｉｖｏにて低下させた。Ｃ１ｑＲ／ｐ３２の発現回復はこれらの変化を逆行させた。
悪性細胞及び腫瘍血管系に発現される特異的分子署名により、腫瘍はその非悪性対応物と区別される。腫瘍関連抗原、例えば、ある種の増殖因子及びサイトカイン受容体、膜型マトリクスメタロプロテイナーゼ及び細胞接着分子が多くの腫瘍に高度に発現される。同様に、腫瘍血管系と正常組織の血管系を識別する生化学的特徴には、種々の血管新生関連分子の発現が含まれる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００２；Ｓｔ Ｃｒｏｉｘら、２０００）。腫瘍リンパ管は正常組織のリンパ管（又は腫瘍血管）には存在しないマーカーを示すため、腫瘍リンパ管も特殊化される（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２；Ｚｈａｎｇら、２００６）。腫瘍血管及びリンパ管におけるマーカーは腫瘍型間で異なり得、腫瘍形成が前癌病変から完全に悪性の腫瘍に進展するにつれ、血管のマーカープロファイルは変化する（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３；Ｊｏｙｃｅら、２００３；Ｚｈａｎｇら、２００６）。
腫瘍血管及び腫瘍細胞の明確な蛋白質プロファイルは、診断・治療剤のリガンドを対象とする（シナプス（ｓｙｎａｐｈｉｃ））標的化に利用されうる。標的化は化合物の特異性及び有効性を向上させるとともに副作用を低減する（Ａｒａｐら、２００２；Ａｒａｐら、１９９８ｂ；Ｊａｉｎ，１９９８）。この部分的な成功により、腫瘍において選択的に発現されるマーカーを認識する新規分子を見出す必要性が強調される。
その表面にランダムペプチド配列を示すファージライブラリーのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにより、腫瘍血管系及び腫瘍細胞に特異的な多くのホーミングペプチドが得られている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｐｏｒｋｋａら、２００２）。ホーミングペプチドに対する受容体の同定により、新規腫瘍マーカーが得られ、遮断された場合に腫瘍の増殖／悪性度に作用するシグナル伝達経路も明らかになりうる。一部の腫瘍においてリンパ管を特異的に認識する環状ノナペプチドであるＬｙｐ−１（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）は好例である。リンパ管は固形腫瘍の拡散に重要な管路であり、腫瘍内及び腫瘍周囲におけるその存在量は転移性向と相関する（Ａｌｉｔａｌｏら、２００４；Ｓｔａｃｋｅｒら、２００２）。
該Ｌｙｐ−１ペプチドはこれらの脈管に対するマーカーを提供するが、腫瘍細胞にも結合し、腫瘍リンパ管及び腫瘍細胞を選択的に標的とする能力を提供する。更に、Ｌｙｐ−１の全身投与がマウスにおける腫瘍増殖を阻害するため、該Ｌｙｐ−１ペプチドの標的分子（受容体）が腫瘍増殖に関与していると思われる（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４））。Ｌｙｐ−１の蓄積が腫瘍における低酸素領域と一致し、腫瘍の飢餓が腫瘍培養細胞においてその結合及び内在化を亢進させるため、Ｌｙｐ−１はストレスを受けている腫瘍細胞に対して細胞傷害性であるように思われる（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）。Ｌｙｐ−１系のこれらの独特の特性は、このペプチドに対する腫瘍細胞受容体の探索を促した。
本試験において、Ｌｙｐ−１に対する細胞受容体として、ｐ３２／ｐ３３／ｇＣ１ｑＲ／ＨＡＢＰ１（ｐ３２）が同定された。元々、この蛋白質は核スプライシング因子ＳＦ−２との共精製に基づいて単離された（Ｋｒａｉｎｅｒら、１９９１）。それはＣ１ｑ蛋白質の球状頭部に結合することも見出され、従って、ｇＣ１ｑ／ｐ３２受容体（ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２）と命名された（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、１９９４）。血漿蛋白質及び細胞外マトリックス成分、例えば、キニノゲン、第ＸＩＩ因子、ビトロネクチン及びヒアルロン酸がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に結合することも報告されている（Ｄｅｂ及びＤａｔｔａ，１９９６；Ｈｅｒｗａｌｄら、１９９６；Ｊｏｓｅｐｈら、１９９６；Ｌｉｍら、１９９６）。加えて、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は複数の細菌及びウイルス蛋白質と相互作用し、その微生物性病因における役割の可能性を示す（Ｂｒａｕｎら、２０００；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎら、２０００；Ｍａｔｔｈｅｗｓ及びＲｕｓｓｅｌｌ，１９９８；Ｔａｎｇｅら、１９９６）。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質は、細胞型及び生理条件により、多様な細胞コンパートメントに存在しうる。この蛋白質は、ミトコンドリア（Ｄｅｄｉｏら、１９９８；Ｍａｔｔｈｅｗｓ及びＲｕｓｓｅｌｌ，１９９８；Ｍｕｔａら、１９９７）、核（Ｋｒａｉｎｅｒら、１９９１；Ｍａｊｕｍｄａｒら、２００２）及び細胞表面（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、１９９４；Ｇｕｐｔａら、１９９１；Ｓｏｌｔｙｓら、２０００）において多様に位置づけられている。また、それは分泌され、細胞外マトリックスに結合されうる（Ｈｅｒｗａｌｄら、１９９６；Ｌｉｍら、１９９６；Ｒｏｚａｎｏｖら、２００２ａ）。その多数の蛋白質相互作用及び細胞局在に関する種々異なる観察では、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の哺乳動物細胞における生理的役割は不明瞭な状態にあった。酵母では、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２相同体が酸化的リン酸化を調節すると報告されている（Ｍｕｔａら、１９９７）。
腫瘍細胞におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現のノックダウンがそれらの代謝を解糖にシフトし、また、驚くべきことに、解糖表現型が、特に、有害な増殖条件下にて腫瘍細胞の生存及び増殖の障害と関連するということが本明細書で示される。加えて、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞の腫瘍原性が低下する。
（ｉｉ．結果）
（ａ．Ｌｙｐ−１ペプチドはｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に結合する）
Ｌｙｐ−１ペプチドに対する受容体を同定するため、ビオチン標識Ｌｙｐ−１及び対照ペプチドを、結合してＬｙｐ−１を内在化する細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の抽出物とインキュベートした（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）。Ｌｙｐ−１は対照においては認められなかった３０ｋＤａ範囲の特定のバンドと結合し（図３Ａ、左側パネル）、その対照はペンタペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号３）（Ｓｉｍｂｅｒｇら、２００７）及びノナペプチドＣＲＶＲＴＲＳＧＣ（配列番号４）であって、そのアミノ酸組成及び環状構造においてＬｙｐ−１に類似する。独立した２回のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析では、その特定のバンドが、補体成分Ｃ１ｑの球状頭部に対する受容体であるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２として公知の成熟型蛋白質を表すことが示された（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、２００２；Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、１９９４）。Ｌｙｐ−１アフィニティー分離でも、ＢＴ５４９培養乳癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍の抽出物からｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が生じた。
Ｌｙｐ−１結合蛋白質のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２としての同定は、免疫ブロッティング及びファージ結合アッセイにより確認した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を標的としたモノクローナル抗体は該バンドを特異的に認識した（図３Ａ右側パネル）。検出可能なｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は対照ペプチドによりプルダウンされなかった。Ｌｙｐ−１ファージは無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）対照ファージの平均６０倍にて精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に結合したが、ＢＳＡを被覆されたプレートへのいずれのファージの結合もわずかに認められただけであった（図３Ｂ）。Ｌｙｐ−１とコンセンサス配列を共有するが、異なるスペクトルの腫瘍リンパ管に結合するペプチドであるＬｙｐ−２（Ｚｈａｎｇら、２００６）は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に有意には結合しなかった。Ｎ末端（アミノ酸７６−９３）近傍にてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ ６０．１１は、Ｌｙｐ−１ファージのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２への結合を９０％低下させた（図３Ｃ）。対照的に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＣ末端（アミノ酸２０４−２１８）を認識するｍＡｂ ７４．５．２は、ファージ結合を阻害しなかった。これらの結果は、Ｌｙｐ−１とｇＣ１ｑＲ／ｐ３２との相互作用が特異的であり、且つアミノ酸７６−９３のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＮ末端が該相互作用に重要な役割を果たすということを示す。
免疫ブロッティングでは、多くの腫瘍細胞株におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現とＬｙｐ−１結合との相関を示した。Ｌｙｐ−１と有意には結合しないことが過去に示されている（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）ＨＬ−６０白血病細胞及びＣ８１６１黒色腫細胞は、低レベルのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質を示し、一方、２つの強力なＬｙｐ−１結合体であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ５４９（（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）は、豊富なｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を示した（図４Ａ）。
（ｂ．ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質は細胞表面に発現され、Ｌｙｐ−１結合を媒介する）
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２がＬｙｐ−１受容体として機能するには、それは細胞表面に発現される必要があるであろう。主に細胞内コンパートメント（ミトコンドリア、核及び細胞質）に局在するが、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が細胞表面に存在することも報告されている（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、１９９４；Ｇｕｏら、１９９９；Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅら、１９９４）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２は細胞表面にも見出された。ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５生細胞のＦＡＣＳ解析において、わずかであるが一定のシフトを生じさせた（図４Ｂ）。より大きなシフトがＭＤＡ−ＭＢ−４３５サブクローン（Ｓ３５）において得られ、これは親細胞株より高い効率でＬｙｐ−１と結合する。Ｒａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞は更に一層強陽性であった。興味深いことに、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の総発現レベルはＭＤＡ−ＭＢ−４３５親細胞とＳ３５変異細胞とで同様であった（図４Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片由来の単一細胞懸濁液は、細胞表面ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に対し、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５培養細胞より強陽性であり、一方、Ｃ８１６１細胞は一次腫瘍細胞としてであってもＬｙｐ−１結合に対して本質的に陰性状態であった（図４Ｃ）。
次に、Ｌｙｐ−１結合に対するｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の強制発現及びノックダウンの影響を検討した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｃＤＮＡによるＣ８１６１細胞の一過性トランスフェクションは、Ｌｙｐ−１ファージ結合を対照ファージの５倍に増加させた（図５Ａ）。空ベクターによるトランスフェクション後、２倍未満の結合が得られた。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｉＲＮＡ構築体によるトランスフェクションは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における発現を著明に低下させ（図５Ｂ、左上パネル）、ＦＩＴＣ−Ｌｙｐ−１ペプチドの細胞への結合の減少を伴った（図５Ｂ、左下パネル）。非関連ｓｉＲＮＡがｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現又はＬｙｐ−１結合に影響を与えず、また、ｓｉＲＮＡがβ−アクチンの発現も変化させないことを対照は示した。また、Ｌｙｐ−１のように３つの塩基性残基を有するが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に有意には結合しない対照ペプチド（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２））は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン及び対照細胞において同量の背景蛍光を発した（図５Ｂ、右下パネル）。最後に、Ｒａｊｉ細胞（これは高レベルの細胞表面ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を示す）におけるｍＡｂ ６０．１１によるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の阻害は、これらの細胞へのＬｙｐ−１結合を５０％低下させたが、ファージ結合はｍＡｂ ７４．５．２に影響されなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質で得られた結果と一致し（図３Ｃ）、細胞表面におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現レベルが細胞へのＬｙｐ−１結合を決定することを示す。それらは、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面局在がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の総発現から独立して調節され、また、腫瘍内微小環境が細胞表面発現を亢進させうることも示唆している。
（ｃ．ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片及びヒト癌におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現）
腫瘍におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の局在を調べるため、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片の切片をｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及びポドプラニン（リンパ管／マクロファージマーカー）に対して染色した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対して強陽性の細胞塊が腫瘍リンパ管に近接して見出され、一方、ＣＤ３１又はＭｅｃａ−３２に対する染色により可視化したように、血管との関連はなかった（図６Ａ、上部パネル）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を発現している細胞が、同様にポドプラニンに対して陽性であるが、ＣＤ３１又はＭｅｃａ−３２に対しては陽性でない脈管様構造の内側を覆っていることも見出された（図６Ａ、下部パネル）。正常組織及びＣ８１６１腫瘍異種移植片は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍よりはるかに少ないｇＣ１ｑＲ／ｐ３２染色を示した。静注ＦＩＴＣ−Ｌｙｐ−１ペプチドは、高発現レベルのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を有するとともに脈管腔と密接に関連する腫瘍領域に蓄積した（図６Ｂ）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２／Ｌｙｐ−１陽性細胞とマクロファージマーカーであるＤＣ１１ｂ及びＧｒ−１との相当程度の共局在があった（図６Ｃ）。腫瘍のリンパ管領域におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の局在は、前述したＬｙｐ−１とＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍リンパ管との関連を裏付ける。これらの腫瘍におけるリンパ管内に取り込まれたｇＣ１ｑＲ／ｐ３２陽性細胞は、リンパ管内皮細胞の腫瘍マクロファージ及び／又はマクロファージ様前駆体であると思われる。
次に、臨床サンプルにおけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対する免疫組織化学的染色により、種々のヒト癌におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現レベルを比較した。染色強度（図６Ｄ、右側パネル）を視覚的にスコアリングし、腫瘍細胞における上皮膜抗原に対する並行染色と比較した（図６Ｄ、左側パネル）。組織内腫瘍細胞パーセント及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２染色強度に基づき、各サンプルに免疫スコアを割り当てた（表１）。非悪性組織と比べ、複数の腫瘍型はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現レベルの上昇を示した（図６Ｅ）。特に、乳房の小葉癌、類内膜腺癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫及び結腸と精巣の癌腫並びに肺の扁平上皮癌は、著明に上昇したｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現を示した。検討した９個の前立腺癌のうち、有意なｇＣ１ｑＲ／ｐ３２レベルを有するものはなかった。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現は、胃、膵臓及び腎臓癌において高かったが、対応する非悪性組織も実質的レベルにてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を発現させた。これらの結果は、腺癌細胞によるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の選択的発現を示す過去の報告を裏付け、伸展させる。
（ｄ．ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の安定的ノックダウンは腫瘍細胞の代謝及び増殖を変化させる）
腫瘍生理におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の役割を明示するため、腫瘍においてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現のｓｈＲＮＡベースのノックダウンを用い、次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにて細胞を分析した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と相補的なｓｈＲＮＡｓ又は２塩基対ミスマッチ対照ｓｈＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞に発現させた。一連のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及び対照ｓｈＲＮＡ安定クローンをｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現についてスクリーニングした。検出不可能なｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現を有する３つのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｈＲＮＡクローン及び３つの対照ｓｈＲＮＡクローンを分析のために選択した（図７Ａ、左上パネル）。各ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンクローンは、対照クローンと比べて著明に減少したＦＩＴＣ−Ｌｙｐ−１ペプチドの取込みを示した。細胞播種後３〜４日時点のフェノールレッドの色変化が示すように、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンは培地の酸性化を著しく誘発した（図７Ａ、右上パネル）。ｐＨの低下と相応し、対照細胞と比べ、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンにおいて乳酸産生が有意に増大した（図７Ａ、左下パネル）。
乳酸は解糖の副産物であり、嫌気性条件下又はミトコンドリア機能障害の場合に蓄積しうる。ＡＴＰ産生のためのその後の解糖への依存は、グルコースの乳酸への高率の変換及び高率のグルコース取込みと関連する。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞が対照クローンより多くのグルコースを消費することが見出され、これは解糖の増加を示した（図７Ａ、右下パネル）。しかし、解糖率及び乳酸産生の上昇はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞の細胞増殖の増大と関連せず、それは、これらの細胞が対照細胞より緩慢に増殖したためである（以下の図８参照）。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質は各主要細胞コンパートメントに存在することが見出されているが、それは主にミトコンドリア蛋白質である（Ｄｅｄｉｏら、１９９８；Ｊｉａｎｇら、１９９９；Ｍｕｔａら、１９９７；Ｓｏｌｔｙｓら、２０００；ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ及びＯ’Ｈａｒｅ，２００１）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のミトコンドリアの役割と相応し、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２相同体を欠いている酵母の増殖障害は、ミトコンドリアのＡＴＰ合成を維持することの異常と関連している（Ｍｕｔａら、１９９７）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞は、高（２５ｍＭ）グルコースを含む通常培地で増殖させると、対照細胞より２０％低い総ＡＴＰを産生した（図７Ｂ）。解糖によるＡＴＰ産生の増大がミトコンドリアの一部の欠失したＡＴＰ合成を代償した可能性があるため、ミトコンドリアのＡＴＰ産生の低下はそれよりも大きかった可能性もある。培地中のグルコース濃度を２．５ｍＭに低下させると、対照クローンと比べてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンにおける細胞のＡＴＰ産生により有害であった（５０％低下）。これらのデータは、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）を介する効率的なＡＴＰ産生にｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が必要とされうることを示す。そのような役割と相応し、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞は対照クローンより少ない酸素を消費した（図７Ｃ）。従って、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の欠失は、おそらくミトコンドリア機能の擾乱を介してエネルギー代謝を解糖にシフトさせる。
ミトコンドリアの形態はエネルギー代謝と密接に関連する。呼吸の亢進は相互接続したミトコンドリアネットワーク及び拡大したクリステコンパートメントと相関し、一方、ＯＸＰＨＯＳの低下及び解糖の亢進は断片化ミトコンドリア及びマトリックスの拡張と相関する（Ａｌｉｒｏｌ及びＭａｒｔｉｎｏｕ，２００６）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン及び対照クローンにおけるミトコンドリアの共焦点分析は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が発現されないと、ミトコンドリアネットワークがフィブリル状というよりも断片化することを示した（図７Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２がミトコンドリア機能にとって重要であり、その不活性化がエネルギー代謝を解糖寄りに変化させるという見解を支持するものである。
（ｅ．ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の欠失は細胞増殖を損ない、細胞死を増加させる）
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞は対照細胞より緩慢に増殖した（図８Ａ、左側及び中央部パネル）。その差異は、特に、わずか２．５ｍＭのグルコースを含む培地において顕著であった。これらの低グルコース条件下、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞における培地は酸性にならず（図８Ａ、右側パネル）、該細胞が細胞増殖を支持すると思われるレベルにて解糖を行うことができなかったことを示す。
腫瘍細胞は低グルコース条件下にて細胞死を被る傾向を有する（Ｉｎｏｋｉら、２００３；Ｊｏｎｅｓら、２００５）。次に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の欠失がこの特性をＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に付与するかを判定した。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞と対照細胞におけるアネキシンＶ陽性細胞のパーセントは高グルコース培地にて同様であったが、該ノックダウン細胞のより高い感受性が低グルコース培地にて明らかとなった（図８Ｂ）。
ｓｈＲＮＡノックダウンの特異性を示すため、ノックダウン細胞においてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２産生を復元した。サイレント突然変異がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｈＲＮＡによる阻害に対する抵抗性を付与するｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｃＤＮＡを用いて、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現を元のレベルに戻した（図８Ｃ）。この処理により、乳酸蓄積、グルコース消費及びノックダウン細胞の増殖が正常化した（図８Ｃ）。これらの結果は、オフターゲット効果がノックダウンの表現型効果に関与しないことを示す。
（ｆ．ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の欠失は腫瘍細胞の悪性度を抑制する）
腫瘍におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現の上昇並びにｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞の増殖及び生存の阻害により、腫瘍形成におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の役割の検討が促された。対照及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞クローンをヌードマウスの乳腺脂肪体に正所性注射し（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ）、腫瘍増殖をモニタリングした。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞は対照より小さい腫瘍を生じさせ、或いは該腫瘍は肥大し、軟性で紫色であり、図示腫瘍内出血を止めた後、血液の放出があった（図９Ａ、左側及び中央部パネル）。出血がノックダウン腫瘍のサイズに寄与しても、これらの腫瘍の増殖率は対照腫瘍より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。ＢｒｄＵ取込みによる腫瘍における細胞増殖の評価では、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン腫瘍において有意に減少した数のＢｒｄＵ陽性細胞を示し（図９Ｂ）、これはｉｎ ｖｉｔｒｏでのノックダウン細胞の低増殖率と一致する。腫瘍切片の病理組織学的分析では、対照腫瘍と比べ、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンにおける広範な壊死を示した（図９Ｃ）。一部の壊死はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン小腫瘍においても明らかであり、これは壊死がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２欠損細胞によって生じる腫瘍の初期事象であることを示す。まとめると、これらのデータにより、腫瘍の増殖及び維持におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の重要な役割が確定される。
（ｉｉｉ．考察）
ミトコンドリア／細胞表面蛋白質ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が、特定の癌における腫瘍リンパ管及び腫瘍細胞のエピトープを特異的に認識する腫瘍ホーミングペプチドＬｙｐ−１に対する受容体であることを本明細書で示す。ｓｈＲＮＡによりｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現をノックダウンすると、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞において解糖が上昇し、ミトコンドリア呼吸が低下し、腫瘍原性が低下することを示す。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現が実験癌及びヒト癌においてアップレギュレーションされることが多いため、その結果は、解糖の上昇（ワールブルク効果）が腫瘍増殖に必ずしも有利ではないことを示す。
複数の系統のエビデンスが、ＬｙＰ−１ペプチドが、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２、即ち、補体のＣ１ｑ成分に対する受容体ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２として周知の蛋白質と特異的に結合することを示している。第一に、ＬｙＰ−１ファージは精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質と結合し、その相互作用はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＮ末端に対する抗体によって阻害された。第二に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の内在性発現レベル及び細胞表面局在は、異なる細胞株のＬｙＰ−１と結合する能力と相関した。第三に、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の過剰発現は細胞へのＬｙＰ−１結合を亢進させ、ＲＮＡｉサイレンシングはそれを低下させた。最後に、静注ＦＩＴＣ−ＬｙＰ−１ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏにてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現が高い腫瘍領域へホーミングした。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のＬｙＰ−１受容体としての同定により、癌におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現及び役割の更なる研究が促された。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質は主にミトコンドリア蛋白質であるが、細胞質、核、また、ＬｙＰ−１結合に最も重要である細胞表面に見出されうる（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔら、１９９４；Ｇｕｏら、１９９９；Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅら、１９９４）。他の複数のミトコンドリア蛋白質はミトコンドリア外部位においても見出される（Ｓｏｌｔｙｓ及びＧｕｐｔａ，１９９９）。例えば、ミトコンドリアシャペロン蛋白質ＨＳＰ６０及びＨＳＰ７０は細胞表面（Ｓｏｌｔｙｓ及びＧｕｐｔａ，１９９７）及び小胞体においても認められている（Ｓｉｎｇｈら、１９９７；Ｓｏｌｔｙｓ及びＧｕｐｔａ，１９９６）。腫瘍細胞及び負荷細胞の表面に見出されるＨＳＰ６０（Ｋａｕｒら、１９９３；Ｘｕら、１９９４）は、特定の蛋白質に対するシャペロンとして機能しうる（Ｋｈａｎら、１９９８）。興味深いことに、シャペロン様機能はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２に対しても示唆されている（Ｈｉｒａｓａｗａら、２００１；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎら、２０００；Ｒｏｂｌｅｓ−Ｆｌｏｒｅｓら、２００２；Ｒｏｚａｎｏｖら、２００２ｂ；Ｓｃｈａｅｒｅｒら、２００１；Ｓｔｏｒｚら、２０００）。ＦＡＣＳデータは、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面局在性に関する先行知見を裏付け、腫瘍内微小環境がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の細胞表面発現を亢進させうることを示す。
該表面におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の量は細胞内ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の総量と必ずしも相関せず、これは該局在が別個に制御されていることを示す。興味深いことに、２つの遍在細胞内蛋白質ヌクレオリン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２００３）及びアネキシン１（Ｏｈら、２００４）が、腫瘍血管内細胞表面に異常に発現されることが示されており、それらは血管新生の特異的マーカーとして機能する。組織におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現はヌクレオリン又はアネキシン１の発現よりはるかに限定されるが、ＬｙＰ−１ペプチド（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）及び抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２（本研究）が全身投与後のそれらの腫瘍内蓄積において著しく特異的であるため、その細胞表面発現は更なる腫瘍特異度を付加しうる。
抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体による組織切片の抗体染色及び静注抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２により、過去に報告されているＬｙＰ−１と腫瘍の特定領域との関連性が確認された。ＬｙＰ−１ペプチド（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）と同様に、抗体は腫瘍内の２つの主要位置：リンパ管に富むが血管が少ない領域での細胞塊及び明らかにリンパ管を示す脈管様構造体を概略的に示した。リンパ管新生（ｌｙｍｐｈａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に寄与する骨髄由来マクロファージが報告されており（Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉら、２００６；Ｍａｒｕｙａｍａら、２００７；Ｍａｒｕｙａｍａら、２００５）、腫瘍内の有意な数のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２強陽性細胞が、マクロファージマーカーに対しても陽性であることが見出された。ＬｙＰ−１／抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２陽性細胞が、リンパ管内皮細胞の前駆体として機能しうる稀なマクロファージ集団を表すと仮定された。
ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンに関する知見は、腫瘍細胞におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の重要な役割を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏにて該ノックダウンは腫瘍細胞によるグルコース代謝の解糖経路の利用の著しい増加をもたらした。これらの代謝変化は、酵母におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２相同体を不能にする突然変異によって生じる代謝変化に類似する（Ｍｕｔａら、１９９７）。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウンは、細胞増殖の阻害、細胞死の増加及び腫瘍原性の障害とも関連した。ｓｈＲＮＡ抵抗性ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２構築体がそれらを逆行させたため、これらの変化は該ノックダウンによって特異的に生じた。
乳癌及び他の一部の腺癌はｇＣ１ｑＲ／ｐ３２をアップレギュレーションするが、他の一部の癌、特に前立腺癌は検出可能レベルにてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を発現しないということが見出された。マウス及びヒトゲノムはわずか１つのｇＣ１ｑＲ／ｐ３２関連遺伝子を含むように思われ、関連遺伝子がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を欠失する腫瘍において同じ役割にて機能しうる可能性は低くなる。興味深いことに、大部分の悪性腫瘍と対照的に、大部分の前立腺癌は高解糖性ではない（Ｅｆｆｅｒｔら、１９９６；Ｈｏｆｅｒら、１９９９；Ｌｉｕ，２００６）。従って、それらはｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の相殺作用を必要としないであろう。
腫瘍において解糖反応を誘導する一因子は癌遺伝子ｍｙｃである（Ｓｈｉｍら、１９９７）。ｃ−ｍｙｃの変化が、高解糖活性を示す（Ｉｓｉｄｏｒｏら、２００５）乳癌において一般的である（Ｂｌａｎｃａｔｏら、２００４；Ｌｉａｏ及びＤｉｃｋｓｏｎ，２０００）ことは注目に値する。従って、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の役割は、ｃ−ｍｙｃの過度の解糖促進活性を抑制すると同時に、その腫瘍促進作用を残存させることでありうる。
また、ミトコンドリア代謝、自食作用及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２間に関連が存在しうる。自食作用は細胞内分解の動的プロセスである。高分子分解から生じる栄養物を動員することにより、自食作用は酵母から哺乳動物に至る生物における代謝ストレスを緩衝するように作用する（Ｌｅｖｉｎｅ，２００７；Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎら、２００７）。自食作用におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質の役割が過去に示唆されており（Ｓｅｎｇｕｐｔａら、２００４）、最近になり、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２がミトコンドリアにおける自食作用誘導蛋白質ｓｍＡＲＦと相互作用し、それを安定化することが報告されている（Ｒｅｅｆら、２００７）。更に、酵母における種々の自食作用関連蛋白質に対する遺伝子の欠損は、ミトコンドリアの異常形態を生じさせ、酸化的リン酸化を低下させ、増殖障害を伴った（Ｚｈａｎｇら、２００７）。これはノックダウンｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を有する腫瘍細胞における所見を表現型模写するものであり、それはこれらの細胞もミトコンドリアの変化、酸化的リン酸化から解糖へのシフト及び増殖不良を示したためである。
自食作用は腫瘍抑制因子として作用しうるが、腫瘍増殖も亢進させうる（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、２００６；Ｌｅｖｉｎｅ，２００７）。腫瘍抑制機能は、ＤＮＡ損傷を引き起こし、その結果、腫瘍の進行を促進しうる突然変異の蓄積を生じさせうる酸素ラジカル源の除去における自食作用の役割に関連しうる。見方を変えると、自食作用はストレス下にある細胞の生存機構である。腫瘍はそれらの血液供給を上回ることが多く、これは局所部位の低酸素及び栄養枯渇を生じさせる。自食作用を作動させると、そのようなストレス下での生存のための共食い的機構が付与される。
これらの結果は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現が自食作用反応に関与するという想定と一致する。第一に、ＬｙＰ−１ペプチドは腫瘍における低酸素（また、おそらく栄養欠乏）領域に蓄積し（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）、これらの領域がｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を選択的に発現するということが抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体を用いた本発明の研究において実証されている。第二に、自食作用反応を欠く腫瘍は、代謝カタストロフィーと称されるプロセスを通じて壊死する傾向がある（Ｊｉｎら、２００７）。これはまさしく、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン細胞から増殖させた腫瘍に認められたものである。これらの腫瘍は壊死性・出血性大コアを含む場合が多かった。更に、ＬｙＰ−１ペプチド処置はｉｎ ｖｉｖｏにて腫瘍におけるＴＵＮＥＬ陽性病変を誘発し（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）、これらの部位におけるアポトーシス又は初期壊死を示した。
腫瘍形成に対する自食作用の二重作用（また、おそらく、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２発現の拡張による）を考慮すると、自食作用の抑制が腫瘍の処置に役立ちうるか、或いはそれは有害となりうるかということに関する疑問が生じる。自食作用の抑制から生じる部分的腫瘍壊死は有害な結果を生じさせうる一機構であり、それは壊死が炎症を生じさせ、炎症メディエーターが腫瘍増殖を促進しうるためである（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、２００６）。その結果は、自食作用抑制に誘発される壊死が治療法として有益となりうることを示す。大部分のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ノックダウン腫瘍において広範な壊死が認められたが、腫瘍は野生型腫瘍より緩慢に増殖した。その結果は、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２が腫瘍治療のための新規標的を表すことを示す。例えば、ＲＮＡｉ又はヒトモノクローナル抗体及びＬｙＰ−ペプチドを模倣する低分子量化合物は、この可能性を役立てるのに用いられうる。
（ｉｖ．試験手順）
（ａ．試薬）
６０．１１及び７４．５．２マウスモノクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ社（カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ）から購入した。ラットモノクローナル抗マウスＣＤ−３１、ラット抗ＭＥＣＡ−３２、ラット抗マウスＣＤ−１１ｂ及びＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ラット抗マウスＧｒ−１をＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（カリフォルニア州サンホセ）から、抗上皮膜抗原（クローンＥ２９）をＣｈｅｍｉｃｏｎ社から、抗β−アクチンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。モノクローナル抗シトクロムｃをＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入した。ラット抗ポドプラニン抗体はＤｒｓ．Ｔ．Ｐｅｔｒｏｖａ及びＫ．Ａｌｉｔａｌｏ（ヘルシンキ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）、フィンランド・ヘルシンキ）から提供を受けた。ＣｈｒｏｍＰｕｒｅウサギＩｇＧ（全分子）をＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルベニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）から、精製マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ）をＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入した。精製ポリクローナル抗全長ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２はＤｒ．Ｂ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ（ストーニーブルック大学（Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ニューヨーク州）からの寛大なる寄贈物であった。ニュージーランド白ウサギにおいて、マウス（ＴＥＧＤＫＡＦＶＥＦＬＴＤＥＩＫＥＥ、配列番号８）及びヒト（ＴＤＧＤＫＡＦＶＤＦＬＳＤＥＩＫＥＥ、配列番号９）ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質のアミノ酸７６−９３に対応するペプチドの混合物に対するポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体 ＮＨ２末端抗体を作製した。該ペプチドを、そのＮ末端にて付加したシステイン残基を介してキーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））に結合し、該ヘモシアニンの製造業者の使用説明書に従って、そのコンジュゲートを用いて該ウサギを免疫化した。該抗体を、Ｎ末端システインを介してＳｕｌｆｏｌｉｎｋゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社、）に結合した該ペプチドに対してアフィニティー精製した。Ｄｒ．Ａ．Ｓｔｒｏｎｇｉｎ（バーナム医学研究所（Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））から、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏ及びｐＥＴ−１５ｂベクターにてヒトｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｃＤＮＡの提供を受けた。ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の一過性ｓｉＲＮＡノックダウン（Ｃ１ＱＢＰ−ＨＳＳ１０１１４６−４７−４８ Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ）のオリゴヌクレオチド二本鎖及び陰性対照二本鎖（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ対照低ＧＣ及び中程度ＧＣ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））から購入した。パラホルムアルデヒド固定・パラフィン包埋された腫瘍及び正常組織サンプルの組織アレイ（コア径０．６ｍｍ）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｅｎｏｍｉｃｓ ＬＬＣ（エストニア・タルトゥ（Ｔａｒｔｕ））から購入した。
（ｂ．細胞培養及び安定細胞株の作製）
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，Ｃ８１６１，ＢＴ５４９，ＨＬ６０及びＲａｊｉ細胞を、４５００ｍｇ／ｍｌ（２５ｍＭ）のグルコースを含むとともに、１０％ＦＢＳ及び１％グルタミンペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州ターザナ（Ｔａｒｚａｎａ））を補充したＤＭＥＭ（ピルビン酸ナトリウム無し）中、３７℃／５％ＣＯ２にて維持した。高・低グルコース条件における試験のため、まず、細胞を、１０％透析（ｄｉａｌｉｚｅｄ）ＦＢＳ（ｄＦＢＳ；グルコース≦５ｍｇ／ｄｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＤＭＥＭ（２５ｍＭのグルコース）に数日間適合させた。
ＢＬＯＣＫ−ｉＴレンチウイルスＲＮＡｉ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における対照及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｈＲＮＡの安定発現を果たした。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２と相補的なｓｈＲＮＡｓ配列の設計を行った（Ｇｅｎｅ−Ｂａｎｋ ＮＭ＿００１２１２）。まず、該二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＥＮＴＲＴＭ／Ｕ６ベクター中にクローン化し、一過性トランスフェクションにより、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２サイレンシングの試験を行った。次に、製造業者の使用説明書に従って、２９３ＦＴ細胞株におけるレンチウイルスＲＮＡｉ産生のため、至適ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｈＲＮＡ配列（標的化ヌクレオチド５’−ＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡ−３’、配列番号１０）をｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ−ＤＥＳＴベクターに移入した。対照ｓｈＲＮＡとして、異なる領域のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｃＤＮＡ（５’−ＣＣＣＡＡＴａＴＣＧＴＧＧＴＴＧＡｔＧＴＴＡＴＡＡ−３’、配列番号１１）小文字のヌクレオチドは塩基対ミスマッチを示す）を標的とする２塩基対ミスマッチｓｈＲＮＡを用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞にｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及び対照ＲＮＡｉレンチウイルスストックを導入した。ブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有培地にて安定導入クローンの選択を行った。
選択ｓｈＲＮＡに対して抵抗性を示すｇＣ１ｑＲ／ｐ３２構築体を生成するため、ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社；テキサス州Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ）を用いて、ｓｈＲＮＡにより標的となるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２配列（５’−ＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡｇＧＡｇＧＡ−３’、配列番号１２、小文字のヌクレオチドはサイレント突然変異を示す）内に２つのサイレント突然変異を導入した。テンプレートとしてｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２構築体を用いた。その結果生じた構築体を、ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２ ｓｈＲＮＡを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞クローンにトランスフェクションし、Ｚｅｏｃｉｎ（６００μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現回復を有するクローンを選択した。
（ｃ．プルダウンアッセイ及び質量分析）
氷上にて２時間、ストレプトアビジンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を２容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、３μｇ／１０μｌのビオチン化（ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ）ペプチドビーズにコンジュゲートした。インキュベーション後、ＰＢＳ／５０ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社；カリフォルニア州サンディエゴ）でビーズを３回洗浄し、遊離ペプチドを除去した。冷ＰＢＳ／２００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシド及び１％プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に、８０〜９０％集密での細胞をペレット状にし、溶解した。その溶解物を氷上にて３０分間インキュベートし、その後、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。蛋白質１ｍｇを含む上清のアリコートを４℃で２時間、４０μｌのストレプトアビジンビーズで予め清澄化し、次に、ビオチン化ペプチドをロードしたストレプトアビジンビーズと４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ／５０ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシドによる６回の洗浄後、該ビーズを４０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で５分間煮沸し、溶出物質を４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により可視化した。ＬｙＰ−１ペプチドプルダウンに現れたが対照ペプチドプルダウンには現れなかったバンドを切除し、トリプシンで消化し、生じたペプチドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法により分析した。その情報をＰｒｏｆｏｕｎｄソフトウェアにより蛋白質配列データに対してクエリーした。
（ｄ．ｉｎ ｖｉｔｒｏファージ結合アッセイ）
マイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ社、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））に、１００μｌ／ウェルのカーボネート緩衝液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム、３５ｍＭ重炭酸ナトリウム）にて、５μｇ／ｍｌの精製ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又はＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４℃で一晩被覆した。製造業者の使用説明書に従って、ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋバッファーでブロックした。１０８ｐｆｕのＬｙＰ−１及び対照ファージを、１００μｌ／ウェルのＴＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０にてウェルに加え、３７℃で１６時間インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０中で６回洗浄した後、結合したファージを２００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ７．５／０．５％ＳＤＳで３０分間溶出させ、次に、プラークアッセイにより定量した。抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体によるファージ結合の阻害のため、２０μｇ／ｍｌのｍＡｂ抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体又はｍＩｇＧの存在下、１．５×１０７ｐｆｕのＬｙＰ−１又は無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）ファージをｇＣ１ｑＲ／ｐ３２蛋白質に３７℃で６時間結合させた点が異なる態様にて、上述のようにアッセイを行った。細胞に関してアッセイを行った際、２×１０６個のＲａｊｉ細胞を５００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、４０μｇ／ｍｌのｍＡｂ抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２抗体又はｍＩｇＧと４℃で１時間プレインキュベートした。次に、１０８ｐｆｕの無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）又はＬｙＰ−１ファージを該細胞に加え、４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで５回洗浄し、結合したファージをプラークアッセイにより定量した。
（ｅ．免疫ブロッティング及び免疫組織学）
組織培養プレートにて増殖させた細胞を、ＰＢＳで洗浄し、完全プロテアーゼインヒビターカクテルを含有するＮＥＴバッファー１％ＮＰ４０（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７．５，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８，１％ＮＰ４０）で溶解した。１４，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、非結合物質を除去した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイにより、上清の蛋白質濃度を定量した。腫瘍溶解物を調製するため、腫瘍を除去し、切片化し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を補充したＤＭＥＭ（重量体積比１：４）にて３７℃で３０分間解離させた。その細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄し、その後、１％ＮＰ４０を含有するＮＥＴバッファーに溶解した。等量の蛋白質を含む各溶解物のアリコートを４〜２０％勾配ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、蛋白質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に移した。１μｇ／ｍｌの一次抗体６０．１１モノクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２、ポリクローナル抗ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及び抗β−アクチン並びにヤギ抗ウサギ又はウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（希釈率１：１０００，Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社；カリフォルニア州Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ）で免疫ブロットを調製した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））を用いてブロットを発色させた。
アセトン固定及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からの試薬を用いて、凍結組織切片の免疫組織化学的染色を行った。二次抗体はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４ヤギ抗ラット又はウサギＩｇＧ，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧであった。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）と５分間インキュベートし、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェード試薬でマウントした。室温で２０分間、４％ＰＦＡに固定し、次に、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５分間透過化処理した培養細胞において、シトクロムｃ及びｇＣ１ｑＲ／ｐ３２を検出した。パラフィン包埋された正常及び悪性ヒト組織アレイ切片を脱パラフィン化し、次に、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍｅｔｉｏｎ社）で処理した。ビオチン化抗マウスＩｇＧ及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）で検出されたｇＣ１ｑＲ／ｐ３２及び上皮膜抗原を除き、該組織アレイ切片を上述のように染色した。内在性ビオチンによる非特異的染色を阻止するため、抗体のインキュベーション前に切片をＤＡＫＯ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇシステムにより処理した。
（ｆ．ＦＡＣＳ解析）
培養細胞を細胞酵素非含有解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で解離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳＢ）中に回収した。腫瘍由来の単一細胞懸濁液を上記のように得た。ＦＡＣＳ染色のため、２．５×１０５個の細胞を１００μｌのＰＢＳＢ中に再懸濁させ、ＰＢＳＢ中でポリクローナル抗完全長ｇＣ１ｑＲ／ｐ３２又はウサギＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）と４℃で３０分間インキュベートした。該細胞をＰＢＳＢで洗浄し、４℃で３０分間、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８（２．５μｇ／ｍｌ）で染色した。結合したＦＩＴＣ−ペプチドのＦＡＣＳ解析のため、培養細胞を上記のように解離し、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中で１０μＭのＦＩＴＣ−ペプチドと４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＢによる洗浄後、生細胞と死細胞とを識別するため、該細胞を、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳｏｒｔを用いて１サンプル当たり１０，０００個の細胞を分析した。
（ｇ．増殖率及び細胞死の定量）
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５クローンを、１２ウェルプレートにて１ウェルあたり２．５×１０４個の細胞密度で二重にＤＭＥＭ（２５ｍＭグルコース）／１０％透析ＦＢＳに播種し、一晩付着させた。該培地を洗浄により除去し、１０％透析ＦＢＳ及び２５若しくは２．５ｍＭグルコースを補充したグルコース非含有（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、バージニア州ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ））と交換した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたフローサイトメトリーにより、各時点における各ウェル中の絶対細胞数を定量した。細胞死の定量では、細胞を２５，２．５又は０．５ｍＭグルコースにて３日間増殖させ、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ社（カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ））が提供しているＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣキットを用いて、フローサイトメトリーにより死細胞を定量した。
（ｈ．乳酸産生及びグルコース消費の定量）
概してＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ処置Ｎｏ８３６−ＵＶに従って、培養培地に存在する乳酸の量を定量した。すべての構成要素をＳｉｇｍａ社から別個に購入した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（１０ｍｇ）を２ｍｌのグリシン緩衝液、４ｍｌの水及び１００μｌの乳酸脱水素酵素（１０００Ｕ／ｍｌ）中に溶解した。９６ウェルプレートにて５μｌの培地サンプルを１４５μｌの酵素混合物に加え、室温で３０分間インキュベートした。ＮＡＤＨ産生による３４０ｎｍにおける吸光度増加を培地に元々存在する乳酸の尺度として用いた。所与の時点（Ｔｘ）における乳酸産生／ウェルを（ＴｘにおけるＡ３４０ｎｍの細胞培地−Ａ３４０ｎｍの培地のみ［Ｔｏ］）÷Ｔｘにおける細胞数から求めた。培地に存在するグルコースの量を、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ社が提供するＧｌｕｃｏｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｋ６０６−１００）を用いて定量した。グルコース消費／ウェルを（培地のみにおけるｎｍｏｌグルコース（Ｔｏ）−Ｔｘにおける細胞培地でのｎｍｏｌグルコース）÷Ｔｘにおける細胞数として計算した。
（ｉ．細胞内ＡＴＰの測定）
ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＣＬＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社；シティー、ステート（ｃｉｔｙ，ｓｔａｔｅ））を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼベースのアッセイにより、細胞内ＡＴＰレベルを定量した。細胞（２．５×１０６個）をＤＭＥＭ（２５ｍＭグルコース）／１０％ｄＦＣＳでの６ウェルプレートに播種した。細胞を洗浄した翌日、２５又は２．５ｍＭグルコースを含む新鮮培地を加えた。４日後、１％ＮＰ４０を含む３００μｌのＮＥＴバッファー中に該細胞を溶解させた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７５）にて上清を４回希釈し、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダーにて５０μｌのルシフェラーゼ試薬を用いて５０μｌのサンプルを二重にアッセイした。１秒の遅延後、光シグナルを１０秒間集積した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））により定量した蛋白質濃度に対して生物発光単位を正規化した。
（ｊ．酸素消費の定量）
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社が提供しているＢＤ Ｏｘｙｇｅｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＯＢＳ）を用いて、培養下の細胞の酸素消費率を測定した。
２００μｌの最終培地体積での９６ウェルＯＢＳプレート上に播種した１２，０００個の細胞の三重サンプルを測定に用いた。並列プレート上に播種した細胞をサンプリングすることにより、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓ）を用いて各時点における細胞数を測定した。ボトムプレート読み取り構成を用いて、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（励起４８５ｎｍ及び発光６３０ｎｍ）にて２４時間毎に蛍光を測定した。細胞付加前の同じウェル由来のブランク値及び測定時におけるウェル中の細胞数を計算に入れることにより、各測定を正規化した（Ｇｕａｒｉｎｏら、２００４）。
（ｋ．マウス及び腫瘍）
腫瘍を生成するため、２×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞／１００μｌのＰＢＳをＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの乳腺脂肪体に正所性注射した（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ）。動物実験はすべて、バーナム医学研究所動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から承認を受けた。３日毎に腫瘍のサイズをモニタリングし、測定した。腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのＢｒｄＵ標識のため、腫瘍を有するマウスにＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ社）１ｍｇを腹腔内注射した。２４時間後にマウスを殺処分し、腫瘍を除去し、Ｂｏｕｉｎ液（Ｒｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、テキサス州アーリントン（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ））にて７２時間固定し、その後、パラフィン包埋に対するプロセシングを行った。
表１． 悪性組織及び正常組織におけるｇＣ１ｑＲ／ｐ３２の発現の免疫スコア。Ｉ＝染色強度（スケール １〜３）、％＝所与のｇＣ１ｑＲ／ｐ３２染色強度を有する腫瘍細胞（ＥＭＡ陽性）のパーセント（スケール ０〜１００）。ＩＳ＝免疫スコア：Ｉ×％（スケール ０〜３００）。ＮＴ（非腫瘍）はサンプルに腫瘍細胞が確認されないことを示すのに用いられた。
Figure 2013060463
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Claims (1)

  1. 明細書中に記載の発明。
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