JP2013051914A - Ethanol production from mannitol using yeast - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵母によるマンニトールからのエタノールの生産方法及びマンニトールからエタノールを生産する酵母株に関する。 The present invention relates to a method for producing ethanol from mannitol using yeast and a yeast strain that produces ethanol from mannitol.
大型海藻などの海洋バイオマスは有望なバイオ燃料の原料である。その主な理由として、(i) 陸性バイオマスと比較すると、大型海藻は高い生産性を示す、(ii) 耕作地を必要としないため、陸性バイオマスを栽培する上で不可避となる問題(灌漑や施肥など)を避けられる、(iii) リグニンを含まない、等があげられる。大型海藻は、主に緑藻、紅藻、及び褐藻から構成される。うち、少なくとも紅藻と褐藻は著量の炭水化物を含む。紅藻の一種テングサGelidium amansiiは、17％(w/w乾燥重量；以下、特に言及しない場合、w/wは全て乾燥重量を表す)のセルロース(グルコース)、58.6％(w/w)の寒天(25.6％のガラクトースと33％の3,6-アンヒドロガラクトース)を含む。褐藻類は最大で40％(w/w)のアルギン酸、最大30％(w/w)のマンニトール、及び最大30％(w/w)のラミナリンを含む。かかるがゆえに、大型海藻を原料としたバイオ燃料の生産には、これらの炭水化物の成分をバイオ燃料に変換する技術の確立が必須である。 Marine biomass such as large seaweed is a promising raw material for biofuels. The main reasons for this are (i) large seaweeds exhibit higher productivity than terrestrial biomass, and (ii) problems that are unavoidable when cultivating terrestrial biomass because they do not require cultivated land (irrigation And (iii) not containing lignin. Large seaweeds are mainly composed of green algae, red algae, and brown algae. Of these, at least red algae and brown algae contain significant amounts of carbohydrates. The red alga, Gelidium amansii, is 17% cellulose (glucose), 58.6% (w / w) agar (w / w dry weight; unless otherwise specified, w / w is all dry weight) (25.6% galactose and 33% 3,6-anhydrogalactose). Brown algae contain up to 40% (w / w) alginic acid, up to 30% (w / w) mannitol, and up to 30% (w / w) laminarin. Therefore, it is essential to establish a technology for converting these carbohydrate components into biofuels for the production of biofuels using large seaweed as a raw material.
アルギン酸は、β-D-マンヌロン酸(M)とそのC5エピマーであるα-L-グルロン酸(G)から構成される直鎖状の酸性多糖である。構成単糖は、ポリM、ポリG、あるいはポリMG構造をとる。マンニトールは、マンノースに対応する糖アルコールであり、マンニトールデヒドロゲナーゼの作用により酸化されてフルクトースになる(図1)（非特許文献１及び２を参照）。ラミナリンは、β-(1,6)枝分かれ構造を有するβ-(1,3)-D-グルカンから構成される（非特許文献３及び４を参照）。既に、本発明者らはエタノール生産性Sphingomonas sp. A1 株(以下、エタノール生産性A1株)を用いたアルギン酸からのエタノール生産システムを構築しており、1.3％(w/v)のエタノール生産に成功している（非特許文献５を参照）。本法は、アルギン酸からバイオ燃料を生産する唯一の方法である。ラミナリンからのエタノール生産例は少ないが、酵母 Kluyveromyces marxianus、Pacchysolen tannophilus、及びPhicia angophoraeの3株がラミナリンを分解してエタノールを生産するとの報告（非特許文献１を参照）、及びラミナリン分解酵素ラミナリナーゼを用いて分解したラミナリン分解物から酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いてエタノールを生産したとの報告(Adams et al., 2009)がある。マンニトールからのエタノール生産に関しては、Zymobacter palmaeとEscherichia coli KO11の両細菌が、各々、3.8％(w/v)及び9.0％(w/v)のマンニトールから、約1.3％(w/v)及び2.6％(w/v)のエタノールを、0.38g及び0.41gエタノール(gマンニトール)-1 の生産効率で生産したことが報告されている（非特許文献１及び６を参照）。しかし、エタノールを生産する上では、細菌よりも酵母の方がエタノールや発酵阻害物質への耐性能を含む様々な利点を有すると見なされている（非特許文献７を参照）(Hughes and Qureshi, 2010)。実際、Z. palmae とE. coli KO11は、5％(w/v)のエタノール存在下で生育阻害を示す（非特許文献８及び９を参照）。しかし、酵母を用いたマンニトールからのエタノール生産の研究例は少なく、酵母S. cerevisiaeポリプロイド BB1株が、5％(w/v)のマンニトールから約0.5％のエタノールを生産すること（非特許文献２を参照）、及び先述のラミナリン分解酵母(K. marxianus、P. tannophilus、及びP. angophorae)のうち、P. angophoraeのみが、4％(w/v)マンニトールから約1.0％(w/v)のエタノールを0.40gエタノール(g マンニトール)-1の生産効率で生産することが報告されているのみである（非特許文献１を参照）。このP. angophoraeを用いた研究に関しては、マンニトールとラミナリンが共存する海藻抽出物からのエタノール生産や、酸素供給量のマンニトールとラミナリン消費速度に対する影響が報告されている（非特許文献１を参照）。一方、酵母のマンニトール代謝に関する報告も少なく、酵母S. cerevisiaeには、マンニトールを資化できる株(先述のポリプロイドBB1株など、一倍体A184D株)とできない(あるいは同資化能が極めて弱い)株(ポリプロイドBB2株など、一倍体S288C株やSc41 YJO 株)が存在すること、S. cerevisiaeによるマンニトールの資化には酸素が必要でありマンニトール含有培地で生育中の酵母は高い呼吸活性を示すことなどが報告されている（非特許文献２及び１０を参照）。なお、一倍体S288C株は最初のゲノム配列決定株でもある（非特許文献１１を参照）。
Alginic acid is a linear acidic polysaccharide composed of β-D-mannuronic acid (M) and its C5 epimer, α-L-guluronic acid (G). The constituent monosaccharide has a poly-M, poly-G, or poly-MG structure. Mannitol is a sugar alcohol corresponding to mannose and is oxidized to fructose by the action of mannitol dehydrogenase (see Non-Patent
酵母を用いたマンニトールからのエタノール生産の実用化には、マンニトールからの高いエタノール生産能力やその他の様々な優良特性を示す酵母の探索あるいは育種、及び高い生産能力を発揮する最適条件の確立が必須である。さらには、海洋バイオマスからのエタノール生産系の確立には、その構成成分をもれなくエタノールに変換する技術も必要である。褐藻類の場合、アルギン酸、マンニトール、及びラミナリンなどからエタノールに変換する技術の確立を要する。アルギン酸からのエタノール生産系は、先述したエタノール生産性A1株を用いた系しか知られていない（非特許文献５を参照）。本A1株は、マンニトールやラミナリンを資化できない(未発表データ)。一方で、アルギン酸資化能はSphingomonas sp. A1株などの限られた生物にしか知られていない。 For the practical use of ethanol production from mannitol using yeast, it is essential to search for or breed yeasts that exhibit high ethanol production capacity from mannitol and various other excellent characteristics, and to establish optimal conditions that demonstrate high production capacity. It is. Furthermore, in order to establish an ethanol production system from marine biomass, it is necessary to have a technology for converting all the components into ethanol. In the case of brown algae, it is necessary to establish a technology for converting alginic acid, mannitol, laminarin and the like into ethanol. As the ethanol production system from alginic acid, only a system using the ethanol-producing A1 strain described above is known (see Non-Patent Document 5). This A1 strain cannot assimilate mannitol or laminarin (unpublished data). On the other hand, alginic acid assimilation ability is known only to limited organisms such as Sphingomonas sp. A1 strain.
本発明は、酵母によるマンニトールからのエタノールの生産方法及びマンニトールからエタノールを生産する酵母株の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing ethanol from mannitol using yeast and a yeast strain that produces ethanol from mannitol.
本発明者らは、褐藻類由来バイオマスのエタノール生産への有効利用には、エタノール生産性A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣に含まれるマンニトール及びラミナリンから、マンニトール及びラミナリン資化性酵母を用いてエタノールを生産する二段階発酵の実現が有効であると考え、この実現を目指して、まずマンニトールから高いエタノール生産能を示す酵母の探索を行った。 The present inventors have made effective use of brown algae-derived biomass for ethanol production using mannitol and laminarin-assimilating yeast from mannitol and laminarin contained in the ethanol fermentation residue from alginic acid by ethanol-producing A1 strain. We considered that the realization of two-stage fermentation to produce ethanol was effective, and aimed for this realization, first we searched for yeast that showed high ethanol production ability from mannitol.
海洋バイオマス(褐藻類)からのバイオ燃料(エタノール)生産には、その主要成分アルギン酸、マンニトール、及びラミナリンからエタノールを生産する技術が不可欠である。エタノール生産性Sphingomonas sp. A1株を用いたアルギン酸からのエタノール生産系は確立されている(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。本株によるアルギン酸からのエタノール発酵後の残渣に含まれるマンニトールやラミナリンのエタノールへの変換は、褐藻類主要成分の有効利用法の一つである。本発明者らは、保存酵母株の中から、マンニトール資化性エタノール生産株6株を見出した。うち、Saccharomyces paradoxus NBRC0259株のみは、ラミナリンからのエタノール生産性は示さないものの、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、エタノール耐性、及びアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性といった望ましい特性を示した。他の5株はラミナリンからのエタノール生産性を示したが、他の特性がNBRC 0259株より劣った。NBRC 0259株は、95 strokes per min (spm) の振とうによって得られる微好気環境において、10％ (w/v)マンニトールから最大37.6 g/l (3.8％ w/v)のエタノールを生産した。エタノール発酵に対するNaClの影響は小さかった。また、アルギン酸からのエタノール発酵残渣中のマンニトールからもエタノールを生産した。本菌は、海洋バイオマスからのエタノール生産に有用と考えられた。 In order to produce biofuel (ethanol) from marine biomass (brown algae), technology for producing ethanol from its main components alginic acid, mannitol, and laminarin is indispensable. An ethanol production system from alginic acid using an ethanol-producing Sphingomonas sp. A1 strain has been established (Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581). Conversion of mannitol and laminarin contained in the residue after ethanol fermentation from alginic acid by this strain to ethanol is one of the effective utilization methods of the main components of brown algae. The present inventors have found six mannitol-utilizing ethanol-producing strains among the stored yeast strains. Among them, only Saccharomyces paradoxus NBRC0259 strain did not exhibit ethanol productivity from laminarin, but exhibited desirable characteristics such as high ethanol productivity from glucose and mannitol, ethanol tolerance, and growth in ethanol fermentation residues from alginic acid. The other 5 strains showed ethanol productivity from laminarin, but other properties were inferior to NBRC 0259 strain. The NBRC 0259 strain produced up to 37.6 g / l (3.8% w / v) ethanol from 10% (w / v) mannitol in a microaerobic environment obtained by shaking at 95 strokes per min (spm). . The effect of NaCl on ethanol fermentation was small. Ethanol was also produced from mannitol in the ethanol fermentation residue from alginic acid. This fungus was considered useful for ethanol production from marine biomass.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[２] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の（１）〜（３）の少なくとも１つの特性を有する酵母である、[１]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法：
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。
[３] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus、Debaryomyces hansenii、Kuraishia capsulata、Ogataea glucozyma及びOgataea minutaからなる群から選択される、[１]又は[２]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[４] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus NBRC 0259株、Debaryomyces hansenii NBRC 0794株、 Kuraishia capsulata NBRC 0721株、Kuraishia capsulata NBRC 0974株、Ogataea glucozyma NBRC 1472株及びOgataea minuta NBRC 1473株からなる群から選択される、[３]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[５] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に0.1％(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に３％(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、[５]の方法。
[７] アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いて、褐藻原料からエタノールを産生させたときの原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養し、残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[８] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の（１）〜（３）の少なくとも１つの特性を有する酵母である、[７]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法：
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。
[９] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、[７]又は[８]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[１０] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、[９]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[１１](i) アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を褐藻原料を用いて培養し、アルギン酸からエタノールを産生させ、
(ii) (i)の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、
褐藻原料からエタノールを生産する方法。
[１２] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の（１）〜（３）の少なくとも１つの特性を有する酵母である、[１１]の褐藻原料からエタノールを生産する方法：
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。
[１３] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、[１１]又は[１２]の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
[１４] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、[１３]の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for producing ethanol using mannitol as a raw material, comprising culturing a yeast capable of assimilating mannitol and capable of producing ethanol from mannitol in a medium containing mannitol.
[2] A yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is a yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3): ethanol from mannitol of [1] as a raw material How to produce:
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
[3] The yeast according to [1] or [2], wherein the yeast capable of assimilating mannitol and capable of producing ethanol from mannitol is selected from the group consisting of Saccharomyces paradoxus, Debaryomyces hansenii, Kuraishia capsulata, Ogataea glucozyma and Ogataea minuta. A method of producing ethanol from mannitol.
[4] Saccharomyces paradoxus NBRC 0259 strain, Debaryomyces hansenii NBRC 0794 strain, Kuraishia capsulata NBRC 0721 strain, Kuraishia capsulata NBRC 0974 strain, Ogataea glucozyma NBRC 1472 strain and yeast capable of producing mannitol ethanol A method for producing ethanol using mannitol of [3] selected from the group consisting of Ogataea minuta NBRC 1473 strain.
[5] By culturing yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol, 0.1% (w / v) or more of ethanol can be accumulated in the medium, [1] to [4] Either way.
[6] The method according to [5], wherein 3% (w / v) or more of ethanol can be accumulated in the medium by culturing yeast having mannitol-assimilating ability and capable of producing ethanol from mannitol.
[7] Using a microorganism capable of assimilating alginic acid and capable of producing ethanol from alginic acid, it is possible to produce ethanol from mannitol having mannitol assimilating ability in a raw material residue when ethanol is produced from a brown algal raw material. A method in which yeast is added, cultured, and ethanol is produced using mannitol in the residue as a raw material.
[8] The yeast having the ability to assimilate mannitol and capable of producing ethanol from mannitol is a yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3): [7] mannitol in the residue How to produce ethanol as:
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
[9] A method for producing ethanol using mannitol in the residue of [7] or [8], wherein the yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is Saccharomyces paradoxus.
[10] The method for producing ethanol using mannitol in the residue of [9], wherein the yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is Saccharomyces paradoxus NBRC 0259 strain.
[11] (i) A microorganism having alginic acid assimilation ability and capable of producing ethanol from alginic acid is cultured using brown algae raw material to produce ethanol from alginic acid,
(ii) adding to the raw material residue of the culture of (i) a yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol, and culturing;
A method of producing ethanol from brown algae raw materials.
[12] Producing ethanol from the raw material of brown algae according to [11], wherein the yeast having the ability to assimilate mannitol and capable of producing ethanol from mannitol is a yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3): how to:
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
[13] The method for producing ethanol from the brown algal raw material according to [11] or [12], wherein the yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is Saccharomyces paradoxus.
[14] The method for producing ethanol from a brown algal raw material according to [13], wherein the yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is Saccharomyces paradoxus NBRC 0259 strain.
本発明のマンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母株を用いることにより、マンニトールを原料としてエタノールを生産することができる。海域由来のバイオマス、とりわけ褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのエタノール生産の残渣には、大量のマンニトールが含まれており、該残渣をエタノール生産に有効に利用することができる。 By using the yeast strain having the ability to assimilate mannitol according to the present invention and capable of producing ethanol from mannitol, ethanol can be produced using mannitol as a raw material. A large amount of mannitol is contained in the residue of ethanol production from biomass derived from sea area, especially polysaccharide alginate contained in a large amount in brown algae, and the residue can be effectively used for ethanol production.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の酵母株は、マンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得るマンニトール資化性酵母株である。マンニトールからエタノールを生産する反応を図１に示す。 The yeast strain of the present invention is a mannitol-assimilating yeast strain having mannitol-assimilating ability and capable of producing ethanol from mannitol. The reaction for producing ethanol from mannitol is shown in FIG.
本発明のマンニトールからエタノールを生産し得る酵母株の例として以下の株が挙げられる。Saccharomyces paradoxus NBRC 0259、Debaryomyces hansenii NBRC 0794、 Kuraishia capsulata NBRC 0721、Kuraishia capsulata NBRC 0974、Ogataea glucozyma NBRC 1472及びOgataea minuta NBRC 1473。これらの株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NBRC）に保存されており、該機構より入手することができる。 Examples of yeast strains that can produce ethanol from mannitol of the present invention include the following strains. Saccharomyces paradoxus NBRC 0259, Debaryomyces hansenii NBRC 0794, Kuraishia capsulata NBRC 0721, Kuraishia capsulata NBRC 0974, Ogataea glucozyma NBRC 1472 and Ogataea minuta NBRC 1473. These strains are stored in the Biological Resource Center (NBRC) of the National Institute of Product Evaluation Technology, and can be obtained from the organization.
さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくはエタノール耐性を有する。エタノール耐性はエタノール耐性化又はエタノール寛容化することによって付与される。例えば、エタノールを含有する培地中で馴養培養、及び紫外線照射によりランダム変異を誘発することにより、エタノール耐性株を得ることができる。本発明の酵母株は、0.85％(w/v)以上、好ましくは1.7％以上、さらに好ましくは３％(w/v)以上、さらに好ましくは５％(w/v)以上、さらに好ましくは６％(w/v)以上、さらに好ましくは７％(w/v)以上、さらに好ましくは８％(w/v)以上、特に好ましくは8.5％(w/v)以上のエタノール存在下で生育することができる。 Furthermore, the yeast strain having the ability to assimilate mannitol and capable of producing ethanol from mannitol preferably has ethanol resistance. Ethanol tolerance is conferred by ethanol tolerance or ethanol tolerance. For example, an ethanol-resistant strain can be obtained by inducing random mutation by culturing in a medium containing ethanol and ultraviolet irradiation. The yeast strain of the present invention is 0.85% (w / v) or higher, preferably 1.7% or higher, more preferably 3% (w / v) or higher, more preferably 5% (w / v) or higher, more preferably 6%. % (W / v) or more, more preferably 7% (w / v) or more, more preferably 8% (w / v) or more, particularly preferably 8.5% (w / v) or more. be able to.
さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくは、アルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性を有する。エタノール発酵残渣における生育性は、生育阻害物質に対する耐性能が関与していると予測される。ここで、アルギン酸からのエタノール発酵残渣とは、アルギン酸を含む褐藻等の原料からアルギン酸資化能を有する微生物を用いてエタノールを生産した場合の、原料の残渣をいう。該残渣には、アルギン酸以外の褐藻の主要成分であるマンニトールやラミナリンが含まれる。アルギン酸資化能を有する微生物として、Sphingomonas sp. A1株が挙げられ、該A1株にZymomonas mobilis等の細菌等のエタノール産生に関する酵素（ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素）をコードする遺伝子を導入したエタノール生産性Sphingomonas sp. A1株によりアルギン酸からエタノールを産生し得る。エタノール生産性Sphingomonas sp. A1株は、Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581や第WO2011/024858号国際公開パンフレットに詳述されている。本発明のマンニトール資化性を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、上記のエタノール生産性Sphingomonas sp. A1株を用いて褐藻を原料にしてエタノールを生産した後に残るマンニトールを含む残渣を原料として用いてさらにエタノールを生産することができるので、海洋バイオマスである褐藻を有効利用して大量のエタノールを生産することができる。褐藻を原料として用いて上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いてアルギン酸からエタノールを生産した後の残渣を用いて二段階発酵によりマンニトールからエタノールを生産してもよいし、褐藻由来の原料に上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物と本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株を同時に添加し、同時にアルギン酸及びマンニトールからエタノールを産生させてもよい。さらに、同時にラミナリン資化性を有し、ラミナリンからエタノールを生産し得る微生物を添加してもよい。また、褐藻を原料として用いて上記のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株を用いてマンニトールからエタノールを生産した後の残渣を用いて、上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物による二段階発酵によりアルギン酸からエタノールを生産することもできる。 Furthermore, the yeast strain having the ability to assimilate mannitol according to the present invention and capable of producing ethanol from mannitol preferably has the ability to grow in an ethanol fermentation residue from alginic acid. The viability of the ethanol fermentation residue is predicted to involve the resistance to growth inhibitors. Here, the ethanol fermentation residue from alginic acid refers to the residue of the raw material when ethanol is produced from a raw material such as brown algae containing alginic acid using a microorganism having an ability to assimilate alginic acid. The residue contains mannitol and laminarin, which are main components of brown algae other than alginic acid. Examples of microorganisms capable of assimilating alginate include the Sphingomonas sp. A1 strain. The A1 strain contains genes encoding enzymes (pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase) related to ethanol production of bacteria such as Zymomonas mobilis. Ethanol can be produced from alginate by the introduced ethanol-producing Sphingomonas sp. A1 strain. The ethanol-producing Sphingomonas sp. A1 strain is described in detail in Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581 and WO 2011/024858. The yeast strain having the mannitol assimilation property of the present invention and capable of producing ethanol from mannitol is a residue containing mannitol remaining after ethanol is produced from brown algae using the ethanol-producing Sphingomonas sp. A1 strain described above. As a raw material, ethanol can be further produced, so that a large amount of ethanol can be produced by effectively utilizing marine biomass brown algae. You may produce ethanol from mannitol by two-stage fermentation using the residue after producing ethanol from alginic acid using microorganisms that can produce ethanol from alginic acid using brown algae as a raw material, or a raw material derived from brown algae A microorganism capable of producing ethanol from alginic acid and a yeast strain capable of assimilating mannitol of the present invention and capable of producing ethanol from mannitol may be added simultaneously, and ethanol may be produced from alginic acid and mannitol at the same time. Furthermore, you may add the microorganisms which have laminarin utilization property simultaneously and can produce ethanol from laminarin. Moreover, ethanol is produced from the above alginic acid using the residue after producing ethanol from mannitol using a yeast strain that has the ability to assimilate mannitol using brown algae as a raw material and can produce ethanol from mannitol. Ethanol can also be produced from alginic acid by two-stage fermentation with a possible microorganism.
さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくは、グルコース存在下での凝集能を有する。ここで、凝集能とは、細胞どうしが、お互いに可逆的に凝集して凝集物(フロックと呼ばれることもある)を形成する能力をいう。凝集能を有する株は、酵母菌体の回収が容易になるという利点がある。すなわち、遠心分離等の分離操作を必要としないので、回収にかかるコスト、エネルギー、労力の削減が可能になる。また、凝集能を有するようになった結果、エタノール耐性能が向上した事例も知られている(Zhao and Bai, 2009, Biotechnol. Adv. 27, 849-856)。本発明の酵母株は７％(w/v)未満、好ましくは６％(w/v)以下、さらに好ましくは５％(w/v)以下、特に好ましくは３％(w/v)以下のエタノール存在下でも凝集性を有する。 Furthermore, the yeast strain having the ability to assimilate mannitol and capable of producing ethanol from mannitol preferably has the ability to aggregate in the presence of glucose. Here, the aggregation ability refers to the ability of cells to reversibly aggregate with each other to form an aggregate (sometimes referred to as floc). A strain having an aggregating ability has an advantage that yeast cells can be easily recovered. That is, since no separation operation such as centrifugation is required, the cost, energy, and labor required for recovery can be reduced. In addition, there are known cases where ethanol resistance is improved as a result of having coagulation ability (Zhao and Bai, 2009, Biotechnol. Adv. 27, 849-856). The yeast strain of the present invention is less than 7% (w / v), preferably 6% (w / v) or less, more preferably 5% (w / v) or less, particularly preferably 3% (w / v) or less. It has cohesion even in the presence of ethanol.
上記のように、本発明のマンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母は、さらに、以下の（１）〜（３）の少なくとも１つの特性、すなわち（１）の特性、（２）の特性、（３）の特性、（１）及び（２）の特性、（１）及び（３）の特性、（２）及び（３）の特定、あるいは（１）及び（２）及び（３）の特性を有し得る：
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。
As described above, the yeast having the ability to assimilate mannitol according to the present invention and capable of producing ethanol from mannitol further has at least one of the following characteristics (1) to (3): (1) 2), (3), (1) and (2), (1) and (3), (2) and (3), or (1) and (2) and It may have the characteristics of (3):
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
上記の６株の酵母株のうち、エタノール生産性、エタノール耐性、アルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性及びグルコース存在下での凝集能が良好なSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株が好ましい。また、エタノール生産性及びエタノール耐性が良好なOgataea glucozyma NBRC 1472株も好ましい。 Of the six yeast strains described above, the Saccharomyces paradoxus NBRC 0259 strain is preferred which has good ethanol productivity, ethanol tolerance, growth in ethanol fermentation residues from alginic acid, and good aggregation ability in the presence of glucose. The Ogataea glucozyma NBRC 1472 strain having good ethanol productivity and ethanol tolerance is also preferred.
本発明のマンニトール資化能を有する酵母株を培養することにより、エタノールを生産させることができる。該酵母株を培養する方法は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、公知の培地にマンニトールを添加すればよい。 Ethanol can be produced by culturing the yeast strain having the ability to assimilate mannitol according to the present invention. The method for culturing the yeast strain is carried out according to a usual method used for culturing yeast, and mannitol may be added to a known medium.
原料となるマンニトールは、終濃度１〜10％(w/v)、好ましくは１〜５％(w/v)、さらに好ましくは２〜５％(w/v)の濃度で添加すればよい。また、培養中に経時的にマンニトールを添加してもよい。 Mannitol as a raw material may be added at a final concentration of 1 to 10% (w / v), preferably 1 to 5% (w / v), more preferably 2 to 5% (w / v). Further, mannitol may be added over time during the culture.
培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜40℃、好ましくは28〜32℃、pH5.6〜9.0、好ましくはpH5.6〜8.4で数時間〜数日間、例えば４〜７日間行う。培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 Cultivation is carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture at 20 to 40 ° C., preferably 28 to 32 ° C., pH 5.6 to 9.0, preferably pH 5.6 to 8.4 for several hours to several days, for example Perform for 4-7 days. The pH of the medium may be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as necessary.
培養の際、酵母株はA600（600nmにおける吸光度）が培養開始時に0.05〜11になるように、例えば0.05〜５、好ましくは0.05〜0.2、さらに好ましくは0.1になるように添加すればよい。 During the culture, the yeast strain may be added so that the A 600 (absorbance at 600 nm) is 0.05 to 11 at the start of the culture, for example 0.05 to 5, preferably 0.05 to 0.2, and more preferably 0.1.
上記の条件での培養により、培地中に0.1％(w/v)以上、好ましくは0.3％(w/v)以上、さらに好ましくは１％(w/v)以上、さらに好ましくは３％(w/v)以上、特に好ましくは3.5％(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る。例えば、10％(w/v)のマンニトールを含む培地で培養した場合、最終的に３％(w/v)以上、特に好ましくは3.5％(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る。
また、培養により酵母も増殖し、培養終了時にA600は、0.1〜33程度まで上昇する。
By culturing under the above conditions, 0.1% (w / v) or more in the medium, preferably 0.3% (w / v) or more, more preferably 1% (w / v) or more, more preferably 3% (w / v) or more, particularly preferably 3.5% (w / v) or more of ethanol can accumulate. For example, when cultured in a medium containing 10% (w / v) mannitol, ethanol of 3% (w / v) or more, particularly preferably 3.5% (w / v) or more can finally accumulate.
Moreover, yeast also proliferates by culture, and A 600 rises to about 0.1 to 33 at the end of the culture.
さらに、褐藻等に含まれるアルギン酸からアルギン酸資化能を有する微生物を用いてエタノールを生産した場合に得られる原料の残渣を用いて培養することもできる。該残渣中には、アルギン酸資化能を有する微生物が資化できなかったマンニトールが含まれる。原料となる褐藻（Phaeophyceae）としてはマコンブ(Laminaria japonica)、ワカメ（Undaria pinnatiflida）、モズク（Nemacystus decipiens）、ホンダワラ(Sargassum fulvellum)、ヒジキ(Sargassum fulvellum)等が挙げられ、アルギン酸資化能を有する微生物としては、上記のZymomonas mobilis等の細菌等のエタノール産生に関する酵素（ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素）をコードする遺伝子を導入したエタノール生産性Sphingomonas sp. A1株が例示できる。例えば、前記残渣中には、0.5〜２％(w/v)程度の濃度のエタノール、１〜10％(w/v)程度のマンニトールが含まれる。このような残渣に本発明のマンニトール資化能を有する酵母株を添加し培養する。この際、酵母株は、A600（600nmにおける吸光度）が0.05〜11になるように、例えば１〜11、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３になるように添加すればよい。培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜40℃、好ましくは28〜32℃、pH5.6〜9.0、好ましくは5.6〜8.4で数時間〜数日間、例えば４〜７日間行う。例えば、培養４〜７日間で、エタノール濃度は、１〜５％(w/v)に達する。残渣中に存在していたアルギン酸から生産されたアルコールを差引いた値が、マンニトール資化能を有する酵母株により新たに産生されたエタノールである。マンニトール資化能を有する酵母株により産生されるエタノールにより、エタノール濃度は残渣中の濃度の1.5〜３倍、好ましくは２倍程度になる。本発明ではこのようにアルギン酸からエタノールを生産させた原料の残渣を用いて残渣中のマンニトールからさらにエタノールを産生し、大量のエタノールを得る方法を二段階発酵という。 Furthermore, it can also culture | cultivate using the residue of the raw material obtained when ethanol is produced from the alginic acid contained in brown algae using the microorganisms which have alginic acid assimilation ability. The residue contains mannitol that could not be assimilated by the microorganism having the ability to assimilate alginic acid. Examples of raw brown algae (Phaeophyceae) include Macombu (Laminaria japonica), Wakame (Undaria pinnatiflida), Mozuku (Nemacystus decipiens), Honda Walla (Sargassum fulvellum), and hydrangea (Sargassum fulvellum). Examples thereof include ethanol-producing Sphingomonas sp. A1 strain into which genes encoding enzymes (pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase) relating to ethanol production from bacteria such as Zymomonas mobilis are introduced. For example, the residue contains ethanol having a concentration of about 0.5 to 2% (w / v) and mannitol of about 1 to 10% (w / v). The yeast strain having the ability to assimilate mannitol of the present invention is added to such a residue and cultured. At this time, the yeast strain may be added so that A 600 (absorbance at 600 nm) is 0.05 to 11, for example, 1 to 11, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3. The culture is carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture at 20 to 40 ° C., preferably 28 to 32 ° C., pH 5.6 to 9.0, preferably 5.6 to 8.4 for several hours to several days, for example, 4 to 7 days. For example, in 4-7 days of culture, the ethanol concentration reaches 1-5% (w / v). The value obtained by subtracting the alcohol produced from the alginic acid present in the residue is ethanol newly produced by the yeast strain having mannitol assimilation ability. Due to the ethanol produced by the yeast strain having mannitol assimilation ability, the ethanol concentration is 1.5 to 3 times, preferably about 2 times the concentration in the residue. In the present invention, a method for producing a large amount of ethanol by further producing ethanol from mannitol in the residue using the residue of the raw material obtained by producing ethanol from alginic acid is called two-stage fermentation.
褐藻を原料として用いてエタノールを生産する場合、褐藻からアルギン酸とマンニトールを抽出し、それを炭素源として用いて培養すればよい。また、褐藻を破砕し、この破砕物そのもの（アルギン酸とマンニトールを含む）を炭素源として用いて培養してもよい。いずれの場合でも、褐藻は木質バイオマスなどとは異なりリグニンを含まないので、木質バイオマスなどの処理と比較すると比較的穏和な条件でアルギン酸とマンニトールを抽出し利用することが可能である。また、トウモロコシデンプンなどと比較しても、トウモロコシデンプンでは糖化行程が必要であるが、アルギン酸とマンニトールからのエタノール生産ではこの糖化行程が不要という利点がある。 When ethanol is produced using brown algae as a raw material, alginic acid and mannitol may be extracted from brown algae and cultured using them as a carbon source. Alternatively, brown algae may be crushed and cultured using the crushed material itself (including alginic acid and mannitol) as a carbon source. In any case, brown algae do not contain lignin unlike woody biomass and the like, and it is possible to extract and use alginic acid and mannitol under relatively mild conditions as compared with the treatment of woody biomass and the like. Compared with corn starch and the like, corn starch requires a saccharification step, but ethanol production from alginic acid and mannitol has the advantage that this saccharification step is unnecessary.
エタノールは、蒸留により回収することができる。また、エタノールの定量は、公知のアルコール脱水素酵素を用いた方法やガスクロマトグラフィーを用いた方法により行うことができる。 Ethanol can be recovered by distillation. Further, ethanol can be quantified by a method using a known alcohol dehydrogenase or a method using gas chromatography.
上記酵母株を固定化して、エタノールを生産することもできる。微生物の固定化には、包括法、架橋法、担体結合法等がある。包括法とは微生物を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、あるいは半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法であり、架橋法とは微生物を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法であり、担体結合法とは水不溶性の担体に酵素を結合させる方法である。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。 The yeast strain can be immobilized to produce ethanol. For immobilization of microorganisms, there are a comprehensive method, a crosslinking method, a carrier binding method and the like. The inclusion method is a method in which microorganisms are encapsulated in a fine lattice of polymer gel or coated with a semipermeable polymer film, and the crosslinking method is a method in which microorganisms are two or more functional groups. The carrier binding method is a method of binding an enzyme to a water-insoluble carrier. Examples of the immobilization carrier used for immobilization include glass beads, silica gel, polyurethane, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, carrageenan, alginic acid, agar, and gelatin.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実験方法
培地と培養
炭素源非含有培地(pH 5.6)は、イーストニトロジェンベース(w/o アミノ酸；ディフコ社製)0.67％(w/v)、-Leuドロップアウト サプリメント(クロンテック社製)0.69g/l、及びL-ロイシン100mg/lを含む。グルコース合成培地、マンニトール合成培地、グリセロール合成培地、及びラミナリン合成培地は、炭素源非含有培地にグルコース[終濃度2％(w/v)]、マンニトール[同2％(w/v)]、グリセロール[同3％(w/v)]、及びラミナリン[Sigma社製、製品番号L9634、Laminaria digitata由来、同2％(w/v)]を加えた培地である。YP培地(pH5.6)は、酵母エキス1％(w/v)及びトリプトン2％(w/v)を含む。pHはHClで調整した。YPD培地、YPM培地、及びYPG培地は、YP培地に各々グルコース[同2％(w/v)]、マンニトール[同2％(w/v)]、及びグリセロール[同3％(w/v)]を添加した培地である。炭素源とそれ以外の成分は、別々にオートクレーブ滅菌(ラミナリンはフィルター滅菌した)した後に混合した。特に言及しない場合は、2 x YP(pH5.6；2倍濃いYP培地)を用いてこれらの培地を調製した。このとき、YPM培地のpHは5.7であった。10 x YP (pH5.6；10倍濃いYP培地)はオートクレーブ滅菌ではなく、フィルター滅菌した。なお、2 x YP (pH 8.0; NaOHでpHを調整)を用いた場合のYPM培地のpHは7.8であった。固体培地では、これらに終濃度2％(w/v)となるように寒天(ナカライ社製)を添加した。なお、培養は30℃で行った。特に言及しない場合は、液体培地には、A600が0.1となるように細胞を接種し、YPD、YPM、及びYP液体培地を用いた培養は、50mlの液体培地を含む100mlの三角フラスコで、95 strokes per minute(spm)で振とうして行った。固体培地で前培養を行った場合は、培地上の細胞を滅菌水に懸濁してから、液体培地に接種した。
Experimental method Medium and culture Medium containing no carbon source (pH 5.6) is 0.67% (w / v) yeast nitrogen base (w / o amino acid; manufactured by Difco), 0.69 g -Leu dropout supplement (manufactured by Clontech) / l and L-leucine 100 mg / l. Glucose synthesis medium, mannitol synthesis medium, glycerol synthesis medium, and laminarin synthesis medium are prepared by adding glucose [
酵母を25μg/mlのエチジウムブロマイドで処理してミトコンドリアゲノムとYPG固体培地での生育性を欠失したρ0株を作製した(Fox et al., 1991, Methods Enzymol. 194, 149-165.)。なお、正常なミトコンドリアゲノムを有する株をρ+ 株と称する。嫌気培養は、角形ジャーをアネロパック・ケンキ(ともに三菱ガス化学株式会社製)で嫌気状態にすることにより行った。エタノール生産性形質転換Sphingomonas sp. A1株(EPv104株：後述)の培養は、5％アルギン酸培地を用いて、既報に従って行った(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。ただし、培養開始時に粉末マンニトールを2％あるいは5％(ともにw/v)となるように添加した。培養3日後の培養液中の上澄み液を遠心分離により調製し、A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣(マンニトールを含む)とした。 Yeast was treated with 25 μg / ml ethidium bromide to produce a ρ 0 strain lacking viability in the mitochondrial genome and YPG solid medium (Fox et al., 1991, Methods Enzymol. 194, 149-165.) . A strain having a normal mitochondrial genome is referred to as a ρ + strain. Anaerobic culture was performed by placing the square jar in an anaerobic state with Aneropac Kenki (both manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.). Ethanol-producing transformant Sphingomonas sp. A1 strain (EPv104 strain: described later) was cultured in a 5% alginate medium according to the previous report (Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581). ). However, powder mannitol was added at 2% or 5% (both w / v) at the start of culture. The supernatant liquid in the culture solution after 3 days of culture was prepared by centrifugation, and used as an ethanol fermentation residue (including mannitol) from alginic acid by the A1 strain.
菌株
本実施例では、マンニトール資化性酵母を探索するために、表1に示す研究室の酵母保存株48株を使用した。Saccharomyces paradoxus NBRC 0259及びS. cerevisiae BY4742のρ0 株はエチジウムブロマイド処理により作製した(Fox et al., 1991, Methods Enzymol. 194, 149-165.)。これらの酵母株は、YPD液体培地で培養後17％グリセロール存在下で-80℃で保存した。エタノール生産性A1株としては、EPv104株を用いた(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。EPv104株は、Sphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株に、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子(pdc)8コピー及び同由来アルコール脱水素酵素遺伝子(adhB)1コピーを広宿主ベクターpKS13を介して導入した、アルギン酸から最も高いエタノール生産性を示す株である(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。
Strains In this example, 48 strains of yeast stocks in the laboratory shown in Table 1 were used to search for mannitol-utilizing yeast. Ρ 0 strains of Saccharomyces paradoxus NBRC 0259 and S. cerevisiae BY4742 were prepared by ethidium bromide treatment (Fox et al., 1991, Methods Enzymol. 194, 149-165.). These yeast strains were cultured in YPD liquid medium and then stored at −80 ° C. in the presence of 17% glycerol. As ethanol-producing A1 strain, EPv104 strain was used (Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581). The EPv104 strain is a broad host vector containing 8 copies of the Zymomonas mobilis-derived pyruvate decarboxylase gene (pdc) and 1 copy of the alcohol dehydrogenase gene (adhB) derived from the Sphingomonas sp. A1 strain. This strain has the highest ethanol productivity from alginic acid introduced via pKS13 (Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581).
エタノール濃度測定
エタノール濃度は、F-キット エタノール (Roche Diagnostics K.K., Tokyo, Japan) を用いて、キットに付属のプロトコルに従い測定した。
Ethanol concentration measurement The ethanol concentration was measured using F-kit ethanol (Roche Diagnostics KK, Tokyo, Japan) according to the protocol attached to the kit.
ITS-5.8S rDNA塩基配列の解析
S. paradoxus NBRC 0259株のITS-5.8S rDNA塩基配列のPCRによる増幅及び塩基配列の解析は株式会社 テクノスルガ・ラボに委託した。
ITS-5.8S DNA sequence analysis
Amplification of the ITS-5.8S rDNA nucleotide sequence of S. paradoxus NBRC 0259 strain by PCR and analysis of the nucleotide sequence were outsourced to Techno Suruga Lab.
結果と考察
マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索
マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索の結果を図２に示す。
Results and Discussion Search for Mannitol-utilizing Ethanol-Producing Yeast Yeast Results of searching for mannitol-utilizing ethanol-producing yeast are shown in FIG.
YPD固体培地上で生育させた本発明者の研究室保存酵母48株(表1)を滅菌水に懸濁し、懸濁液5μlを合成固体培地(炭素源非含有培地、グルコース合成培地、及びマンニトール合成培地) へスポットして細胞を5日間培養した。目視で生育を観察した結果、グルコース合成固体培地では全ての株が良好に生育したが、炭素源非含有固体培地では全ての株が殆ど生育しなかった。また、表1で下線を付した14株(以下マンニトール資化性酵母と称する)がマンニトール合成固体培地で、炭素源非含有固体培地よりも良好な生育を示した。液体培地においても同様であった(図2A)。マンニトール資化能を示さないS288Cの派生株S. cerevisiae BY4742株(以下BY4742株)は(Brachmann et al., 1998, Yeast 14, 115-132.; Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 1675-1684.)、マンニトール合成固体及び液体培地で、炭素源非固体及び液体含有培地よりも良好な生育を示さなかった(図2A)。なお、14株の内、P. polymorpha IFO 0195、P. farinosa NBRC 0193、P. haplophila NBRC 0947、P. saitoi IAM 4945、H. saturnus IFO 0177、D. hansenii IFO 0023、及びY. lipolytica NBRC 0746の7株では、マンニトール及びグルコース合成液体培地で膜を形成した。S. paradoxus NBRC 0259株(以下NBRC 0259株)は、グルコース液体培地において凝集性を示した(図2B)。同株は、マンニトール合成液体培地においても若干の凝集性を示した。
The inventor's laboratory-preserved yeast strain 48 (Table 1) grown on a YPD solid medium was suspended in sterilized water, and 5 μl of the suspension was suspended in a synthetic solid medium (a carbon source-free medium, a glucose synthesis medium, and mannitol). The cells were cultured for 5 days by spotting on a synthetic medium. As a result of visual observation of growth, all the strains grew well in the glucose synthesis solid medium, but all the strains hardly grown in the carbon source-free solid medium. In addition, 14 strains underlined in Table 1 (hereinafter referred to as mannitol-assimilating yeast) showed better growth in the mannitol synthetic solid medium than in the carbon source-free solid medium. The same was true for the liquid medium (FIG. 2A). The S288 cerevisiae BY4742 strain (hereinafter referred to as BY4742 strain), a derivative of S288C that does not show mannitol assimilation ability (Brachmann et al., 1998,
次に、BY4742株(対照)及びマンニトール資化性酵母14株をマンニトール合成液体培地で3日間静置培養し、培養液上澄みのエタノール濃度を測定した。NBRC 0259、K. capsulata NBRC 0721、K. capsulata NBRC 0974、O. glucozyma NBRC 1472、O. minuta NBRC 1473、及びD. hansenii NBRC 0794各6株(以後、マンニトール資化性エタノール生産酵母と称す)のみが、少なくとも44 mg/l以上のエタノールを生産した(図2C-2)。他の8株は、7 mg/l以下のエタノール生産性しか示さなかった。マンニトールからのエタノール生産性は、NBRC 0259株が他よりも顕著に高かった(図2C-2)。同6株及びBY4742株をグルコース合成液体培地、ラミナリン合成液体培地、並びに5％(w/v)及び7％(w/v)エタノールを含むマンニトール合成液体培地で3日間静置培養した(図2C-1、2C-2及び2D)。同6株のグルコースからのエタノール生産性は、マンニトールからのそれよりも高かった(図2C-2)。とりわけNBRC 0259株は、同６株の中で最も高いグルコースからのエタノール生産性を示した。NBRC 0259株以外の5株はラミナリンからのエタノール生産性も示した(図2C-2)。マンニトール合成培地における3日間の培養では、同6株は7％(w/v)エタノール存在下で生育性を示さなかったが、5％(w/v)エタノール存在下では、NBRC 0259株、K. capsulata NBRC 0974株、及びO. glucozyma NBRC 1472株は生育性を示した(図2D)。5％(w/v)エタノール存在下においても、NBRC 0259株は凝集性を示した。
Next, BY4742 strain (control) and mannitol-utilizing
マンニトール資化における酸素要求性
マンニトール資化における酸素要求性を図３に示す。
Oxygen requirement in mannitol utilization Figure 3 shows the oxygen requirement in mannitol utilization.
本実施例で見出したマンニトール資化性エタノール生産酵母6株がマンニトール資化に酸素を必要とするかどうかを調べるため、これらをエチジウムブロマイドで処理して、ρ0株の作製を試みたところ、NBRC 0259株のみρ0株が作製できた。そこで、NBRC 0259並びにBY4742のρ0及びρ+株を用いて嫌気及び好気条件下における合成培地での生育性を調べたところ、既報(Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 1675-1684.)に一致して、NBRC 0259株はマンニトール合成培地での生育に酸素及び呼吸能を必要とすることが分かった(図3A)。さらに、通常大気条件下並びにYPG及びYPM固体培地において、同株のρ+株は生育できたが、ρ0株は生育できなかった(データ省略)。本結果は、YPM固体培地を用いたNBRC 0259 ρ+株(マンニトール資化能を保持)の選抜が可能なことを意味した。 In order to examine whether the 6 mannitol-utilizing ethanol-producing yeast strains found in this Example require oxygen for mannitol assimilation, these were treated with ethidium bromide and attempted to produce a ρ 0 strain. Only NBRC 0259 strain was able to produce ρ 0 strain. Therefore, when NBRC 0259 and BY4742 ρ 0 and ρ + strains were used to examine the viability in a synthetic medium under anaerobic and aerobic conditions, Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, Consistent with 1675-1684.), NBRC 0259 strain was found to require oxygen and respiratory capacity for growth on mannitol synthesis medium (FIG. 3A). Furthermore, the ρ + strain of the same strain was able to grow under normal atmospheric conditions and in the YPG and YPM solid media, but the ρ 0 strain was unable to grow (data not shown). This result meant that it was possible to select NBRC 0259 ρ + strain (maintaining mannitol assimilation ability) using YPM solid medium.
一方、NBRC 0259株以外の5株(ρ+株)の嫌気及び好気条件下における合成培地での生育性を調べたところ、いずれも嫌気条件ではマンニトール合成培地(図3B)及びYPM固体培地(図省略)で生育性を示さなかった。本結果から、NBRC 0259株以外の5株もマンニトールの資化に酸素を必要とすることが明らかとなった。酵母におけるマンニトール資化では、マンニトールがマンニトールデヒドロゲナーゼのはたらきでフルクトースに変換される過程で1分子の余剰NADHが形成されるが、この余剰NADHのNAD+への再生に酸素が必要とされるものと考えられている(図1)(Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 1675-1684.)。マンニトール資化性エタノール生産酵母に関しても、同様の理由でマンニトール合成培地やYPD培地での生育に酸素を必要としたと推察された。他方、NBRC 0259株以外の5株は、嫌気条件においてグルコース合成培地(図3B)及びYPD固体培地(図省略)でも生育性を示さなかった。NBRC 0259以外の5株は、NBRC 0259とは若干異なる様式でグルコースを資化している可能性が示唆された。 On the other hand, when the viability in the synthetic medium under anaerobic and aerobic conditions of 5 strains (ρ + strain) other than the NBRC 0259 strain was investigated, both mannitol synthetic medium (Figure 3B) and YPM solid medium ( The figure did not show growth. From these results, it became clear that 5 strains other than the NBRC 0259 strain also require oxygen to assimilate mannitol. In mannitol assimilation in yeast, one molecule of surplus NADH is formed in the process of mannitol being converted to fructose by the function of mannitol dehydrogenase, and oxygen is required for regeneration of this surplus NADH to NAD + . (Figure 1) (Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 1675-1684.). For mannitol-utilizing ethanol-producing yeast, it was speculated that oxygen was required for growth on mannitol synthesis medium and YPD medium for the same reason. On the other hand, 5 strains other than the NBRC 0259 strain did not show growth even in glucose synthesis medium (FIG. 3B) and YPD solid medium (not shown) under anaerobic conditions. It was suggested that 5 strains other than NBRC 0259 may assimilate glucose in a slightly different manner from NBRC 0259.
マンニトール資化性エタノール生産酵母によるエタノール生産
図４は、マンニトール資化性エタノール生産酵母によるエタノール生産を示す図である。
Ethanol production by mannitol-utilizing ethanol-producing yeast FIG. 4 is a diagram showing ethanol production by mannitol-utilizing ethanol-producing yeast.
マンニトール資化性エタノール生産酵母6株のエタノール生産能を更に詳細に調べた。以降はYPM培地を基本培地とした。同6株はマンニトール培地での生育に酸素を必要としたので(図3)、YPM液体培地を用いて、95 spmで振とう培養して生育性とエタノール生産性を調べたところ(図4A-1及び4A-2)、NBRC 0259株とO. glucozyma NBRC 1472株が高い生産性を示した。ただし、両株、とりわけO. glucozyma NBRC 1472株は長期間培養すると培養液中のエタノール濃度が著しく低下した。D. hansenii NBRC 0794株のエタノール生産性は最も低かった。 The ethanol production ability of six mannitol-utilizing ethanol-producing yeast strains was examined in more detail. Thereafter, the YPM medium was used as the basic medium. Since the 6 strains required oxygen for growth on mannitol medium (Fig. 3), using YPM liquid medium, shaking culture at 95 spm and examining the growth and ethanol productivity (Figure 4A- 1 and 4A-2), NBRC 0259 strain and O. glucozyma NBRC 1472 strain showed high productivity. However, both strains, especially the O. glucozyma NBRC 1472 strain, significantly decreased the ethanol concentration in the culture medium after long-term culture. The ethanol productivity of D. hansenii NBRC 0794 was the lowest.
次に、A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣(マンニトールを含む)からのエタノール生産(二段階発酵)を目的として、2％(w/v)マンニトールを含む発酵残渣における同6株の生育性(図4B)とエタノール生産性を調べた。同発酵残渣のpHは8.64と弱アルカリ性を示した。これに、10 x YP (pH5.6)を1/10容量添加して(この結果、初期pHは7.3となった)培養を開始した。なお、初期エタノール濃度は9.6 g/lであった。しかしながら、生育性を示したのはNBRC 0259株とD. hansenii NBRC0794株のみであった。培養7日後の培養液上澄みのエタノール濃度は全て初期エタノール濃度を下回った。さらにNBRC 0259株は凝集性を示した。発酵残渣での生育性が弱い理由として、同6株ともにpH 7.8の弱アルカリ性YPM培地では生育したことから(図4B)、同残渣のpH(pH 7.3)が原因ではなく、発酵残渣に含まれる何らかの成分が生育を阻害したと推察された。D. hansenii NBRC0794株は同発酵残渣で生育性は示したが、マンニトールからのエタノール生産性が最も低い株であった(図4A-1及び4A-2)。 Next, for the purpose of ethanol production (two-stage fermentation) from ethanol fermentation residue (including mannitol) from alginic acid by A1 strain, the viability of the six strains in the fermentation residue containing 2% (w / v) mannitol ( Figure 4B) and ethanol productivity were examined. The pH of the fermentation residue was 8.64, which was weakly alkaline. To this, 1/10 volume of 10 × YP (pH 5.6) was added (resulting in an initial pH of 7.3), and culture was started. The initial ethanol concentration was 9.6 g / l. However, only the NBRC 0259 and D. hansenii NBRC0794 strains showed viability. The ethanol concentration in the culture supernatant after 7 days of culture was lower than the initial ethanol concentration. Furthermore, NBRC 0259 strain showed aggregability. The reason for the low growth potential of the fermentation residue is that the 6 strains grew on weakly alkaline YPM medium with a pH of 7.8 (Fig. 4B), and the pH (pH 7.3) of the residue was not the cause, but included in the fermentation residue. It was inferred that some component inhibited growth. Although the D. hansenii NBRC0794 strain showed viability with the same fermentation residue, it was the strain with the lowest ethanol productivity from mannitol (FIGS. 4A-1 and 4A-2).
以上の結果より、NBRC 0259株は、ラミナリンからのエタノール生産性こそ示さないものの、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、エタノール耐性、及びA1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性を示したため、6株の中では最も優良な株と判断された(図2、図4)。次に優良な株として、ラミナリンからのエタノール生産性、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、及びエタノール耐性を示した、O. glucozyma NBRC 1472株が考えられた(図2及び図4)。ただし、本NBRC 1472株は、長時間の培養により培養液のエタノール濃度が激減すること(図4A-2)、及び発酵残渣での生育性を示さない(図4B)という望ましくない特性を示した。さらに、マンニトールからのエタノール生産性が報告されているS. cerevisiaeプロピロイドBB1株及びP. angophoraeの、マンニトールからのエタノール生産に関しては、本実施例ほど詳細に報告されていない。さらに、エタノール耐性やアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性も不明である(Horn et al., 2000, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 24, 51-57.; Quain and Boulton, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 1675-1684.)。これらの理由から、NBRC 0259株を以降の研究に用いることにした。本研究で用いているNBRC 0259株のITS-5.8S rDNA塩基配列は、データベースに登録されているS. paradoxus NBR0259株の同配列(Genbank: D89890)と100％(817/817)の相同性を示した。一方で、S. cerevisiae S288C株の同配列(Genbank: BK006945)とは98.9％(815/824)の相同性を示した。 From the above results, although NBRC 0259 strain did not show ethanol productivity from laminarin, it showed high ethanol productivity from glucose and mannitol, ethanol tolerance, and growth in ethanol fermentation residue from alginic acid by A1 strain. Among the 6 strains, it was judged as the best strain (Figs. 2 and 4). Next, as an excellent strain, O. glucozyma NBRC 1472 strain, which showed ethanol productivity from laminarin, high ethanol productivity from glucose and mannitol, and ethanol tolerance, was considered (FIGS. 2 and 4). However, this NBRC 1472 strain exhibited the undesirable characteristics that the ethanol concentration of the culture broth was drastically reduced by long-term culture (FIG. 4A-2) and that it did not show viability in fermentation residues (FIG. 4B). . Furthermore, the production of ethanol from mannitol of S. cerevisiae propyloid BB1 strain and P. angophorae, whose ethanol productivity from mannitol has been reported, has not been reported as detailed as in this example. Furthermore, ethanol tolerance and viability in ethanol fermentation residues from alginic acid are unknown (Horn et al., 2000, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 24, 51-57 .; Quain and Boulton, 1987, J. Gen Microbiol. 133, 1675-1684.). For these reasons, we decided to use the NBRC 0259 strain for further studies. The ITS-5.8S rDNA nucleotide sequence of NBRC 0259 strain used in this study is 100% (817/817) homologous to the same sequence (Genbank: D89890) of S. paradoxus NBR0259 strain registered in the database. Indicated. On the other hand, it showed 98.9% (815/824) homology with the same sequence (Genbank: BK006945) of S. cerevisiae S288C strain.
NBRC 0259株によるマンニトールからのエタノール生産
図5は、NBRC 0259株によるマンニトールからのエタノール生産を示す図である。
Ethanol Production from Mannitol by NBRC 0259 Strain FIG. 5 is a diagram showing ethanol production from mannitol by NBRC 0259 strain.
NBRC 0259株のマンニトール資化能を更に調べた。BY4742 ρ+株を対照として用いた。YPD及びYPM固体培地で前培養したNBRC 0259株はマンニトール合成液体培地で生育したが、BY4742株は生育できなかった(図5A及び5B)。また、NBRC 0259株は2％グルコース液体培地では凝集性を示した(図5B)。 The mannitol assimilation ability of NBRC 0259 strain was further investigated. BY4742 ρ + strain was used as a control. The NBRC 0259 strain pre-cultured with YPD and YPM solid medium grew on the mannitol synthetic liquid medium, but the BY4742 strain failed to grow (FIGS. 5A and 5B). In addition, NBRC 0259 strain showed aggregability in 2% glucose liquid medium (FIG. 5B).
次に、YPM液体培地を用いてエタノール生産条件を調べた。YPD固体培地上で形成されたNBRC 0259株のシングルコロニーは、高い頻度でYPM固体及び液体培地での生育能を喪失した(調べた6個のシングルコロニーのうち、5個のシングルコロニー由来の細胞がこれを喪失した)。これは、NBRC 0259株がYPD固体培地上ではミトコンドリアゲノムを欠失あるいは損傷しやすい特性を持つことを示唆した。そこで、以降はYPM固体培地上で選抜したNBRC 0259 ρ+株を用いた。同株はマンニトールの資化に酸素を要求したため(図3A)、同株をYPM液体培地で0 spmで静置培養、並びに95及び145 spmで振とう培養して、生育性とエタノール生産性に対する培養中の通気量の影響を調べた。その結果、既報に一致して、通気量が多いほど生育性も高くなった(図5C)。しかし、エタノール生産性は95 spmで適度な酸素を供給した場合に最も高く(6日間で 8.20 g/lのエタノール生産性)、0及び145 spmで培養した場合には殆どエタノール生産性が見られなかった(図5C-1及び5C-2)。一方で、グルコースを基質とした場合、すなわちYPD液体培地では、0及び95 spm両方において、マンニトールの場合よりもより高い生産性を示した(1日[0 spm]及び2日間[95 spm]で各々約12 g/lのエタノール生産性)。また、YPD液体培地でも明瞭な凝集性が観察された(図5D)。 Next, ethanol production conditions were examined using a YPM liquid medium. NBRC 0259 single colonies formed on YPD solid media frequently lost their ability to grow on YPM solid and liquid media (among the 6 single colonies examined, cells derived from 5 single colonies) Lost this). This suggested that the NBRC 0259 strain has the property of being susceptible to deletion or damage of the mitochondrial genome on YPD solid medium. Therefore, NBRC 0259 ρ + strain selected on the YPM solid medium was used thereafter. Since this strain required oxygen to assimilate mannitol (Fig. 3A), the strain was cultured at 0 spm in YPM liquid medium and shaken at 95 and 145 spm for growth and ethanol productivity. The influence of aeration volume during culture was examined. As a result, in accordance with the previous report, the larger the aeration rate, the higher the viability (FIG. 5C). However, ethanol productivity is highest when 95% oxygen is supplied at a rate of 95 spm (8.20 g / l ethanol productivity over 6 days), and almost no ethanol productivity is observed when cultured at 0 and 145 spm. None (Figures 5C-1 and 5C-2). On the other hand, when glucose was used as a substrate, that is, YPD liquid medium showed higher productivity than mannitol at both 0 and 95 spm (at 1 day [0 spm] and 2 days [95 spm]). Ethanol productivity of about 12 g / l each). In addition, clear aggregation was also observed in the YPD liquid medium (FIG. 5D).
振とう速度を95 spmとして、マンニトール濃度の影響を調べたところ、10％(w/v)マンニトールから最大37.6 g/lの(3.8％ w/v)のエタノールが生産された(図5E)。これは、マンニトールからのエタノール生産量としては最大であった。また、2及び5％(w/v)のNaCl存在下でエタノール生産性の顕著な低下は見られなかった(図5F)。次に、NBRC 0259株の前培養条件の、生育性とエタノール生産性に対する影響を調べた。すなわち、YPM固体培地で前々培養した同株をYPM又はYPD液体培地で2日間前培養して得られた菌体を洗浄後YPM液体培地に接種したところ、YPM液体培地で前培養した菌体を用いた方が、YPD液体培地で前培養した場合よりも高い生育性とエタノール生産性を示した。すなわち、エタノール生産性は、前者が培養6日で6.7g/lであったが、後者は6日でわずか0.35g/lであり培養12日でようやく5.2g/lに達したに過ぎなかった。 When the influence of mannitol concentration was examined at a shaking speed of 95 spm, a maximum of 37.6 g / l (3.8% w / v) ethanol was produced from 10% (w / v) mannitol (FIG. 5E). This was the largest ethanol production from mannitol. In addition, no significant decrease in ethanol productivity was observed in the presence of 2 and 5% (w / v) NaCl (FIG. 5F). Next, the influence of preculture conditions of NBRC 0259 strain on growth and ethanol productivity was examined. That is, the cells obtained by pre-culturing the same strain previously cultured in the YPM solid medium for 2 days in the YPM or YPD liquid medium were washed and inoculated into the YPM liquid medium. The results showed higher growth and ethanol productivity than when precultured in YPD liquid medium. In other words, ethanol productivity was 6.7 g / l in the first 6 days of culture, but the latter was only 0.35 g / l in 6 days and only reached 5.2 g / l in 12 days of culture. .
5％(w/v)マンニトールを含むアルギン酸からのエタノール発酵残渣45mlに2 xYP (pH 5.6)を5ml添加した培地(初期エタノール濃度8.5g/l)にNBRC 0259株を初期A600が2.0となるよう添加して培養したところ、培養4日で培養液上澄みのエタノール濃度は16.9g/l、培養7日では14.0g/lとなった。すなわち、二段階発酵により残渣中のマンニトールから9.4 (=16.9-8.5)g/lのエタノールが新たに生産された。二段階発酵の条件の改善による、さらなるエタノール生産性の向上が期待された。
An initial A 600 is 2.0 NBRC 0259
本発明のマンニトールからエタノールを生産する酵母株を用いることにより、大型海藻などの海洋バイオマスから有効にエタノールを生産することができる。 By using a yeast strain that produces ethanol from mannitol of the present invention, ethanol can be produced effectively from marine biomass such as large seaweeds.
Claims (14)
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。 The yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is a yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3), and produces ethanol using mannitol according to claim 1 as a raw material: Method:
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。 The yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol is yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3): How to produce:
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
(ii) (i)の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、
褐藻原料からエタノールを生産する方法。 (i) culturing a microorganism capable of assimilating alginic acid and capable of producing ethanol from alginic acid using brown algae raw materials, producing ethanol from alginic acid,
(ii) adding to the raw material residue of the culture of (i) a yeast having mannitol assimilation ability and capable of producing ethanol from mannitol, and culturing;
A method of producing ethanol from brown algae raw materials.
（１）エタノール耐性を有する；
（２）アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る；及び
（３）グルコース存在下での凝集能を有する。 The method for producing ethanol from a brown algal raw material according to claim 11, wherein the yeast capable of assimilating mannitol and capable of producing ethanol from mannitol is a yeast having at least one of the following characteristics (1) to (3): :
(1) has ethanol resistance;
(2) It can grow in the residue when ethanol is produced from a brown algae raw material using a microorganism having an alginate assimilation ability; and (3) It has an agglutination ability in the presence of glucose.
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Patent Citations (4)
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