JP2013051914A - 酵母を用いたマンニトールからのエタノール生産 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
【選択図】なし
Description
[1] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[2] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、[1]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。
[3] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus、Debaryomyces hansenii、Kuraishia capsulata、Ogataea glucozyma及びOgataea minutaからなる群から選択される、[1]又は[2]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[4] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus NBRC 0259株、Debaryomyces hansenii NBRC 0794株、 Kuraishia capsulata NBRC 0721株、Kuraishia capsulata NBRC 0974株、Ogataea glucozyma NBRC 1472株及びOgataea minuta NBRC 1473株からなる群から選択される、[3]のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[5] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に0.1%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に3%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、[5]の方法。
[7] アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いて、褐藻原料からエタノールを産生させたときの原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養し、残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[8] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、[7]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。
[9] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、[7]又は[8]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[10] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、[9]の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
[11](i) アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を褐藻原料を用いて培養し、アルギン酸からエタノールを産生させ、
(ii) (i)の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、
褐藻原料からエタノールを生産する方法。
[12] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、[11]の褐藻原料からエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。
[13] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、[11]又は[12]の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
[14] マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、[13]の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。
また、培養により酵母も増殖し、培養終了時にA600は、0.1〜33程度まで上昇する。
培地と培養
炭素源非含有培地(pH 5.6)は、イーストニトロジェンベース(w/o アミノ酸;ディフコ社製)0.67%(w/v)、-Leuドロップアウト サプリメント(クロンテック社製)0.69g/l、及びL-ロイシン100mg/lを含む。グルコース合成培地、マンニトール合成培地、グリセロール合成培地、及びラミナリン合成培地は、炭素源非含有培地にグルコース[終濃度2%(w/v)]、マンニトール[同2%(w/v)]、グリセロール[同3%(w/v)]、及びラミナリン[Sigma社製、製品番号L9634、Laminaria digitata由来、同2%(w/v)]を加えた培地である。YP培地(pH5.6)は、酵母エキス1%(w/v)及びトリプトン2%(w/v)を含む。pHはHClで調整した。YPD培地、YPM培地、及びYPG培地は、YP培地に各々グルコース[同2%(w/v)]、マンニトール[同2%(w/v)]、及びグリセロール[同3%(w/v)]を添加した培地である。炭素源とそれ以外の成分は、別々にオートクレーブ滅菌(ラミナリンはフィルター滅菌した)した後に混合した。特に言及しない場合は、2 x YP(pH5.6;2倍濃いYP培地)を用いてこれらの培地を調製した。このとき、YPM培地のpHは5.7であった。10 x YP (pH5.6;10倍濃いYP培地)はオートクレーブ滅菌ではなく、フィルター滅菌した。なお、2 x YP (pH 8.0; NaOHでpHを調整)を用いた場合のYPM培地のpHは7.8であった。固体培地では、これらに終濃度2%(w/v)となるように寒天(ナカライ社製)を添加した。なお、培養は30℃で行った。特に言及しない場合は、液体培地には、A600が0.1となるように細胞を接種し、YPD、YPM、及びYP液体培地を用いた培養は、50mlの液体培地を含む100mlの三角フラスコで、95 strokes per minute(spm)で振とうして行った。固体培地で前培養を行った場合は、培地上の細胞を滅菌水に懸濁してから、液体培地に接種した。
本実施例では、マンニトール資化性酵母を探索するために、表1に示す研究室の酵母保存株48株を使用した。Saccharomyces paradoxus NBRC 0259及びS. cerevisiae BY4742のρ0 株はエチジウムブロマイド処理により作製した(Fox et al., 1991, Methods Enzymol. 194, 149-165.)。これらの酵母株は、YPD液体培地で培養後17%グリセロール存在下で-80℃で保存した。エタノール生産性A1株としては、EPv104株を用いた(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。EPv104株は、Sphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株に、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子(pdc)8コピー及び同由来アルコール脱水素酵素遺伝子(adhB)1コピーを広宿主ベクターpKS13を介して導入した、アルギン酸から最も高いエタノール生産性を示す株である(Takeda et al., 2011, Energy Environ. Sci. 4, 2575-2581)。
エタノール濃度は、F-キット エタノール (Roche Diagnostics K.K., Tokyo, Japan) を用いて、キットに付属のプロトコルに従い測定した。
S. paradoxus NBRC 0259株のITS-5.8S rDNA塩基配列のPCRによる増幅及び塩基配列の解析は株式会社 テクノスルガ・ラボに委託した。
マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索
マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索の結果を図2に示す。
マンニトール資化における酸素要求性を図3に示す。
図4は、マンニトール資化性エタノール生産酵母によるエタノール生産を示す図である。
図5は、NBRC 0259株によるマンニトールからのエタノール生産を示す図である。
Claims (14)
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項1記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。 - マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus、Debaryomyces hansenii、Kuraishia capsulata、Ogataea glucozyma及びOgataea minutaからなる群から選択される、請求項1又は2に記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomyces paradoxus NBRC 0259株、Debaryomyces hansenii NBRC 0794株、 Kuraishia capsulata NBRC 0721株、Kuraishia capsulata NBRC 0974株、Ogataea glucozyma NBRC 1472株及びOgataea minuta NBRC 1473株からなる群から選択される、請求項3記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に0.1%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に3%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、請求項5記載の方法。
- アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いて、褐藻原料からエタノールを産生させたときの原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養し、残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項7記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。 - マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、請求項7又は8記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、請求項9記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。
- (i) アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を褐藻原料を用いて培養し、アルギン酸からエタノールを産生させ、
(ii) (i)の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、
褐藻原料からエタノールを生産する方法。 - マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の(1)〜(3)の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項11記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法:
(1)エタノール耐性を有する;
(2)アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び
(3)グルコース存在下での凝集能を有する。 - マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxusである、請求項11又は12に記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
- マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomyces paradoxus NBRC 0259株である、請求項13記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法。
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