JP2013049927A - 生体適合性を有するナノ繊維及びその製造方法並びに創傷被覆材 - Google Patents

Abstract

【課題】吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有する創傷被覆材に有用なナノ繊維を提供する。
【解決手段】このナノ繊維は、高分子化合物と、ヒアルロン酸と、高分子化合物の架橋剤とを含有する親水性溶媒の溶液を調製する調整工程と、エレクトロスピニング法によって、調整工程で得られた溶液から繊維を得る繊維化工程と、繊維化工程の後、高分子化合物を架橋する架橋工程によって製造される。得られたナノ繊維は、架橋構造を有する高分子化合物とヒアルロン酸との複合体である。高分子化合物がポリビニルアルコールであり、架橋剤がグルタルアルデヒドであれば、繊維化工程で得られた繊維を塩化水素ガスで処理することによって、ポリビニルアルコールを架橋させることができる。
【選択図】図６

Description

本発明は、創傷被覆材として有用なナノ繊維、より詳しくは吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有するナノ繊維及びその製造方法並びに創傷被覆材に関する。

近年、創傷患者の治療に用いられる培養皮膚等の創傷被覆材に関する研究が行われている（例えば、非特許文献１及び２参照。）。現在、医療現場において利用されている創傷被覆材の大部分は、ハイドロゲルシートである。しかし、創傷被覆材に必要な適度な吸水力と保水力を保つためには、ハイドロゲルシートを厚くしなければならない。厚い創傷被覆材は、患部に負担がかかる。

Ｒ．Ｅ．Ｈｏｒｃｈ、外３名、"Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ"、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、２０００年、第６巻、ｐ．５３−６７ Ｒ．Ｍ．Ｆｒａｎｃｅ、外３名、"Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｐｌａｓｍａ ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｆ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ／ｏｃｔａ−１，７−ｄｉｅｎｅ ａｎｄ ａｌｌｙｌ ａｍｉｎｅ／ｏｃｔａ−１，７−ｄｉｅｎｅ"、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第８巻、ｐ．３７−４２

本発明は、このように状況に鑑みてなされたもので、吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有する創傷被覆材に有用なナノ繊維を提供することを目的とする。

［１］本発明のナノ繊維は、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物と、ヒアルロン酸とを有することを特徴とする。

［２］本発明のナノ繊維においては、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、架橋構造を有することが好ましい。

［３］本発明のナノ繊維においては、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、キチン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、デンプン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

［４］本発明のナノ繊維においては、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコールであることが好ましい。

［５］本発明のナノ繊維の製造方法は、高分子化合物とヒアルロン酸とを含有する親水性溶媒又は水の分散液又は溶液を調製する調整工程と、エレクトロスピニング法によって、調整工程で得られた分散液又は溶液から繊維を得る繊維化工程とを有する。

［６］本発明のナノ繊維の製造方法においては、前記高分子化合物の架橋剤を更に含有することが好ましい。

［７］本発明のナノ繊維の製造方法においては、繊維化工程の後に、高分子化合物を架橋する架橋工程を更に有することが好ましい。

［８］本発明のナノ繊維の製造方法においては、架橋工程は、繊維化工程で得られた繊維を塩化水素ガスに接触させる工程を含むことが好ましい。

［９］本発明のナノ繊維の製造方法においては、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、キチン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、デンプン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

［１０］本発明のナノ繊維の製造方法においては、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコールであることが好ましい。

［１１］本発明の創傷被覆材は、本発明のナノ繊維を含むものである。

本発明によれば、吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有するナノ繊維が提供される。また、そのようなナノ繊維を含む創傷被覆材が提供される。

また、本発明によれば、細胞との親和性の高いヒアルロン酸（ＨＡ）を原料に用いているため、上記した従来の創傷被覆材（コラーゲンやポリＮ−ビニルアセトアミドのハイドロゲルシート）と比較して、膨潤度及び細胞への接着性に優れた創傷被覆材が提供される。また、既存の創傷被覆材を製造する場合よりも容易に創傷被覆材を製造することができる。

本実施形態に係るナノ繊維のＦＴ−ＩＲスペクトルである。 本実施形態に係るナノ繊維のＴＧＡ曲線である。 本実施形態に係るナノ繊維（未架橋）のＳＥＭ写真である。 本実施形態に係るナノ繊維（架橋後）の他のＳＥＭ写真である。 本実施形態に係るナノ繊維の他のＳＥＭ写真である。 本実施形態に係るナノ繊維の膨張比を示すグラフである。 本実施形態に係るナノ繊維の細胞接着率を示すグラフである。 本実施形態に係るナノ繊維の他のＳＥＭ写真である。

以下、本発明のナノ繊維及びナノ繊維の製造方法について、実施形態に基づいて説明する。

本実施形態のナノ繊維は、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物と、ヒアルロン酸とを有し、高分子化合物が架橋構造を有する。本実施形態のナノ繊維は、吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有する。高分子化合物を架橋させることによって、吸水性と保水性に優れ、生体適合性を有するナノ繊維が得られるため、高分子化合物が架橋構造を形成する前のナノ繊維も、創傷被覆材の原料（前駆体）として有用である。

ここで、ナノ繊維とは、大部分が直径１μｍ未満である繊維をいう。また、分散とは、微粒子状になって一様に散在していることをいう。親水性溶媒又は水は、疎水性溶媒と比べて生体適合性を有しており、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物をナノ繊維の成分とすることで、ナノ繊維自体も生体適合性を有する。

また、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物とヒアルロン酸とを、親水性溶媒又は水に分散又は溶解し、その分散液又は溶液をエレクトロスピニングすれば、本実施形態のナノ繊維を得ることができる。なお、ナノ繊維は、目的に反しない限り他の成分が含まれていても良い。

本実施形態のナノ繊維では、親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物が、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、キチン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、デンプン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。これらの高分子化合物は、生体適合性に優れているからである。

これらの中でも、ポリビニルアルコールが特に好ましい。得られるナノ繊維が、吸水性と保水性に優れるからである。本実施形態の成分を有するナノ繊維が得られれば、エレクトロスピニング法以外の方法によってナノ繊維を製造しても良い。しかし、エレクトロスピニング法によって製造されたナノ繊維は、多層構造を有し、比表面積と空隙率が高いため、より吸水性と保水性に優れる。このため、エレクトロスピニング法によって製造されることが好ましい。

本実施形態のナノ繊維の製造方法は、高分子化合物とヒアルロン酸とを含有する親水性溶媒又は水の分散液又は溶液を調製する調整工程と、エレクトロスピニング法によって、調整工程で得られた分散液又は溶液から繊維を得る繊維化工程とを有する。親水性溶媒又は水の分散液又は溶液が、高分子化合物の架橋剤を更に含有することが好ましい。架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒドが挙げられる。分散液又は溶液が架橋剤を含有することによって、架橋構造を有する高分子化合物を構成要素に含むナノ繊維が容易に得られる。

本実施形態のナノ繊維の製造方法は、繊維化工程の後に、高分子化合物を架橋する架橋工程を更に有する。繊維化工程の後に架橋工程を有することによって、分散液又は溶液の粘度が低い状態で繊維化工程を行うことができる。本実施形態のナノ繊維の製造方法では、架橋工程は、繊維化工程で得られた繊維を塩化水素ガスに接触させる工程を含む。繊維化工程で得られた繊維を塩化水素ガスに接触させるという簡易な工程によって、架橋構造を有する高分子化合物を構成要素に含むナノ繊維が得られる。

本実施例では、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）とヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＡ）を有するナノ繊維をエレクトロスピニング法によって製造し、得られたナノ繊維を解析した。また、比較例としてＰＶＡのナノ繊維をエレクトロスピニング法によって製造し、得られたナノ繊維を解析した。

〔原料〕
ＰＶＡは、加水分解度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ＤＨ）８８％、重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ＤＰ）１，７００のものを株式会社クラレから入手した。ＨＡは、Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（中国）から入手した。ＰＶＡの架橋剤であるグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ；ＧＡ）は、５０ｗｔ％水溶液のものをシグマアルドリッチ社（米国）から入手した。蒸留水とエタノール（純度９９．５％）は、株式会社ワコーケミカルから入手した。全ての原料は、更なる精製を行わずそのまま使用した。

〔エレクトロスピニング〕
まず、ＧＡとＰＶＡのモル比が３．４：１、６．９：１、及び１０．３：１となるように、ＰＶＡとＧＡを４０℃の蒸留水に一晩かけて溶かし、１２．０ｗｔ％のＰＶＡ溶液を作製した。また、ＧＡとＰＶＡのモル比が８．２：１、１６．５：１、及び２４．８：１となるように、ＰＶＡとＨＡとＧＡを蒸留水とエタノールの４０℃の混合溶媒（体積比で蒸留水／エタノールが９／１）に一晩かけて溶かして、１３．０ｗｔ％のＰＶＡとＨＡの混合溶液（以下、「ＰＶＡ／ＨＡ溶液」という）を作製した。１３．０ｗｔ％の内訳はＰＶＡ１２．０ｗｔ％、ＨＡ１．０ｗｔ％であった。

次に、内径０．６ｍｍのキャピラリーチップを取り付けた５ｍｌのプラスチック注射器に、ＰＶＡ溶液とＰＶＡ／ＨＡ溶液を注入した。そして、エレクトロスピニング装置の正極（アノード）に接続された銅線が溶液内に挿入され、負極（カソード）が金属製コレクターに取り付けられた。次に、正負極間電圧を１４ｋＶに、キャピラリーチップとコレクターとの距離を１５ｃｍにそれぞれ固定した。

そして、ＰＶＡ溶液とＰＶＡ／ＨＡ溶液に直流電圧を印加し、エレクトロスピニングして繊維を製造した（以下、エレクトロスピニング法によって得られた繊維を「エレクトロスピン繊維」と、架橋剤を含有していないＰＶＡ溶液からのエレクトロスピン繊維を「ＰＶＡエレクトロスピン繊維」という）。これらの溶液は、室温下で回転する金属製コレクターにエレクトロスピンされた。次に、エレクトロスピン繊維中のＰＶＡを架橋させるため、エレクトロスピン繊維に塩化水素ガスを接触させた。

この接触工程は、デシケータ内に塩化水素を入れ、これを３０℃に加熱することによって得た塩化水素ガス中にエレクトロスピン繊維を入れることによって行った。接触時間は、１０ｓ、３０ｓ、６０ｓとした。接触工程において、塩化水素ガスの接触中に試料がわずかに収縮するのが分かった。こうして、架橋されたＰＶＡのナノ繊維（以下、単に「ＰＶＡナノ繊維」という）と、ＰＶＡが架橋されたＰＶＡとＨＡの複合ナノ繊維（以下、単に「ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維」という）を得た。

〔解析〕
（１）ＦＴ−ＩＲ
ＰＶＡナノ繊維とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維のＦＴ−ＩＲ解析は、ＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ−２１（島津製作所社製）を使用した。

図１は、ＰＶＡエレクトロスピン繊維、ＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）、及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。全てのスペクトルに、ヒドロキシル基（波数（ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ）３３００ｃｍ^−１）、アルキル基（波数２９０６〜２９０８ｃｍ^−１）、及びアセチル基（波数１７３０ｃｍ^−１）に起因する吸収があり、ＰＶＡの存在を示している。

ＰＶＡナノ繊維とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維では、波数２９０６〜２９０８ｃｍ^−１におけるヒドロキシル基の透過率（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ（任意単位（ａ．u．）））が、ＰＶＡエレクトロスピン繊維と比べてして減少していた。これは、ＰＶＡ中の−ＯＨ基とＧＡ中の−ＣＨＯとの間で架橋反応が進行したことを示している。つまり、エレクトロスピンによって繊維化し、これを架橋させることによって、ＰＶＡナノ繊維とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維が作製できた。

ＰＶＡの架橋反応においてＣ＝Ｏの含有量が一定だとすれば、Ｃ＝Ｏに起因する波数１７８８〜１６３９ｃｍ^−１における透過率は変化しない。この前提で算出したＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）中のヒドロキシル基の減少量は約５．４％であった。ヒドロキシル基の減少分は、アルデヒド基のＣ−Ｈがアセタール結合になったと判断される。さらに、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維では、Ｎ−Ｈ屈曲に起因する波数１７８８ｃｍ^−１付近の吸収が明示された。これは、架橋中における塩化水素ガスのような酸の雰囲気下でも、ＨＡが影響されないことを示している。

（２）ＴＧ／ＤＴＡ
ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維中のＨＡの量を測定するため、熱重量分析（ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＴＧＡ）を行った。熱重量分析は、２０ｍｌ／ｍｉｎの窒素気流下、室温から６００℃までの昇温条件で、ＴＧ／ＤＴＡ６２００（セイコーインスツルメンツ社製）を用いた。

図２は、ＰＶＡエレクトロスピン繊維、ＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）、及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）のＴＧＡ曲線である。ＰＶＡエレクトロスピン繊維では、３段階の重量減少（ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）が起こった。すなわち、温度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）１５０℃以下の最初の重量減少は、物理吸着及び化学吸着された水分子の除去によるものである。２段階目の重量減少は、ＰＶＡ骨格の減少によるものである。６００℃付近の３段階目の重量減少は、ＰＶＡの酢酸｛さくさん｝ビニル基の分解を示す。

ＰＶＡエレクトロスピン繊維の最大の重量減少は、３００℃付近で起こった。ＰＶＡナノ繊維は架橋構造を有するため、ＰＶＡエレクトロスピン繊維と比べて熱安定性に優れる。さらに、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維は、ヒアルロン酸の分解に伴う４％の重量減少が２１５℃付近で観測された。このことは、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維中にＨＡが十分取り込まれていることを示している。

６００℃付近での様々な炭素系物質の分解に伴うＰＶＡナノ繊維の重量減少は約５．１％であった。一方、ＧＡのアルキル基の分解に伴うＰＶＡエレクトロスピン繊維とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の６００℃付近の重量減少は、それぞれ１２．２％と１７．０％であり、ＰＶＡナノ繊維と比べてかなり大きかった。

（３）電子顕微鏡観察
ナノ繊維の形態を、走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）法によって解析した。走査電子顕微鏡装置は日立製作所社のＳ−３０００Ｎを用い（以下同じ）、Ｐｄ−Ｐｔをスパッタした各ナノ繊維を用いて測定した。また、ナノ繊維の直径とその分布を、ｉｍａｇｅ Ｊ（ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４１（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（米国）））ソフトを用いて計測した。

図３は、（ａ）はＰＶＡエレクトロスピン繊維、（ｂ）はＰＶＡとＧＡの溶液（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）からのエレクトロスピン繊維で架橋前のもの（以下、「ＰＶＡ／ＧＡエレクトロスピン繊維」という）、（ｃ）はＰＶＡとＨＡの溶液からのエレクトロスピン繊維（以下、「ＰＶＡ／ＨＡエレクトロスピン繊維」という）、及び（ｄ）はＰＶＡとＨＡとＧＡの溶液（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）からのエレクトロスピン繊維で架橋前のもの（以下、「ＰＶＡ／ＨＡ／ＧＡエレクトロスピン繊維」という）のＳＥＭ写真である。

ＳＥＭ法による分析によれば、エレクトロスピン繊維の平均直径は、（ａ）が約４３０±５０ｎｍ、（ｂ）が約４００±６０ｎｍ、（ｃ）が約２００±５０ｎｍ、及び（ｄ）が約１８０±５０ｎｍで、ほぼ均一であった。エレクトロスピン繊維の原料にＧＡが含まれるか否かは、得られたエレクトロスピン繊維の直径に影響しなかった。一方、ＨＡが含まれるエレクトロスピン繊維（ＰＶＡ／ＨＡエレクトロスピン繊維とＰＶＡ／ＨＡ／ＧＡエレクトロスピン繊維）は、ヒアルロン酸によって導電率が向上するため、ＰＶＡエレクトロスピン繊維と比べて直径が小さく算出された。

図４は、乾燥したＰＶＡナノ繊維と、蒸留水に３日間浸した後のＰＶＡナノ繊維のＳＥＭ写真であり、（ａ）はＧＡとＰＶＡのモル比を１０．３：１．０に固定して、架橋時間を変化させたもので、（ｂ）は架橋時間を３０ｓに固定して、ＧＡとＰＶＡのモル比を変化させたものである。

図５は、乾燥したＰＶＡ／ＨＡナノ繊維と、蒸留水に３日間浸した後のＰＶＡ／ＨＡナノ繊維のＳＥＭ写真であり、（ａ）はＧＡとＰＶＡのモル比を２４．８：１．０に固定して、架橋時間を変化させたもので、（ｂ）は架橋時間を３０ｓに固定して、ＧＡとＰＶＡのモル比を変化させたものである。

図４及び図５に示すように、蒸留水に浸したＰＶＡナノ繊維及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の形態は、架橋時間とＧＡ濃度、すなわち、架橋密度によって大きく異なる。ＰＶＡナノ繊維の最適な架橋時間は３０秒で、最適なＧＡ濃度はＧＡとＰＶＡのモル比が「１０．３：１．０」のときであった。このとき、ＰＶＡナノ繊維は鮮明な繊維の形態を示した。

ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の最適な架橋時間は３０秒で、最適なＧＡ濃度はＧＡとＰＶＡのモル比が１６．５：１．０のときであった。このとき、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維は鮮明な繊維の形態を示した。短い架橋時間及び少ないＧＡ濃度で得られたＰＶＡ／ＨＡナノ繊維は、不完全な架橋のため、蒸留水に浸した後でナノ繊維の形態が維持できず、溶けたフィルム状の形態となった。

（４）膨潤挙動
乾いたナノ繊維の大きさと重量を測定した後、乾いたナノ繊維の不織布を室温で５日間蒸留水に浸して、平衡膨張状態にした。平衡膨張状態となったナノ繊維の不織布の大きさと重量を測定する前に、ナノ繊維の不織布の表面にある過剰な水を、濾紙で注意深く吸い取って除去した。膨張比は下記によって算出した。ここで、Ｗｓは膨張時のナノ繊維の重量を、Ｗｄは乾燥時のナノ繊維の重量をそれぞれ示す。

膨張比〔ｇ／ｇ〕＝（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ

図６は、室温での浸漬時間（ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ）に対応するＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）の膨張比（ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｒａｔｉｏ）を示すグラフである。図６に示すように、浸漬１日で、ＰＶＡナノ繊維の膨張比は約６．２に、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の膨張比は約７．２に達した。これは、ナノ細孔構造に起因する毛細管力によって、速く膨張すると考えられる。

その後は、浸漬時間の経過と共に膨張比が徐々に増加した。そして、水分子が試料中に拡散し、極性基や親水基を水和させ、体積膨張を引き起こして平衡膨張状態の膨張比となった。強い親水性のＨＡの影響により、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の膨張比は、ＰＶＡナノ繊維の膨張比より常時高い値を示した。また、ＰＶＡナノ繊維とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維は、膨張した後に透明となった。膨張した試料は、乾いた試料よりも明らかに大きかった。ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の平衡膨張状態の膨張比は約１７であり、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維が吸水性と保水性に優れていることが分かった。これは、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維が創傷被覆材として有用であることを示している。

〔細胞培養〕
まず、ＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）とＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）を９９．５％エタノールに４０分間、蒸留水に２０分間浸し、残留塩化水素を除去した。次に、紫外線の下へ一晩置き殺菌を行った。次に、各ナノ繊維をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で３回洗浄して残留エタノールを除去した。そして、理研細胞バンクから入手した骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を７世代に渡り継代培養し、細胞濃度が３×１０^４細胞／ウェルとなるように、ＰＶＡナノ繊維及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維上に細胞を播種した。

具体的には、ＰＶＡナノ繊維及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の骨格にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を接種し、１時間、３時間、６時間、及び２４時間細胞培養したものを、温度４℃の条件下で、２．５％グルタルアルデヒド溶液中にそれぞれ一晩浸した。次に、エタノール勾配法を用いてＰＶＡ／ＨＡナノ繊維上の細胞を固定した。最後に、細胞培養したＰＶＡナノ繊維及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維を一晩凍結乾燥させて、走査電子顕微鏡によってＰＶＡナノ繊維及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の足場に接着した細胞の形態を分析した。

培養は、培養器内をＣＯ_２５％雰囲気下、温度３７℃とし、αＭＥＭ（商品名ＧＩＢＣＯ）の培地を用いて行った。培地は、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンと、０．１％のβ−グリセロリン酸エステルとを含む。

また、全ての細胞調査において、組織培養皿（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈｅ；ＴＣＤ）上での細胞培養を対照として評価した。なお、組織培養皿は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（デンマーク）のポリスチレン皿（ブランド名Ｎｕｎｃ）を用いた。なお、細胞の播種と培養は、ＰＶＡナノ繊維およびＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の場合と同一条件で行った。

図７は、ＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）へのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞接着率（ｃｅｌｌｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）を示すグラフである。細胞接着率は、１時間、３時間、６時間、２４時間後にそれぞれ培地中に浮いている浮遊細胞数を数え、以下の式により算出した。

細胞接着率（％）＝｛１−浮遊細胞数／（３．０×１０^４）｝×１００

培養時間１時間における細胞接着率は、ＰＶＡナノ繊維と比べＰＶＡ／ＨＡナノ繊維の方が大きかった。これは、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維が界面の生体適合性に優れており、創傷被覆材として有用であることを示している。さらに、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維では、６時間の細胞培養後に細胞接着率が１００％に達した。

図８は、ＴＣＤ、ＰＶＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が１０．３：１．０）、及びＰＶＡ／ＨＡナノ繊維（ＧＡとＰＶＡのモル比が２４．８：１．０）でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を培養したときの培養時間毎のＳＥＭ写真である。ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維では、ＰＶＡナノ繊維と異なり、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１がよく接着していることが分かった。この傾向は、細胞接着率の傾向と合致している。ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１がよく接着するのは、ＨＡが生体適合性に優れた材料であるためであると考えられる。

また、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維では、活発な細胞移動が起こっており、ナノ繊維表面に多くの微絨毛が観測された。これは、ＨＡと細胞との間における特異性相互作用によるものと考えられる。特に２４時間の細胞培養後では、細胞間作用により、ＰＶＡ／ＨＡナノ繊維上でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１が活発に移動していることが確認できた。

Claims (11)

1. 親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物と、ヒアルロン酸とを有することを特徴とするナノ繊維。
2. 前記親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、架橋構造を有することを特徴とする請求項１に記載のナノ繊維。
3. 前記親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、キチン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、デンプン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ繊維。
4. 前記親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ繊維ナノ繊維。
5. 高分子化合物とヒアルロン酸とを含有する親水性溶媒又は水の分散液又は溶液を調製する調整工程と、
   エレクトロスピニング法によって、前記調整工程で得られた分散液又は溶液から繊維を得る繊維化工程とを有することを特徴とするナノ繊維の製造方法。
6. 前記親水性溶媒又は水の分散液又は溶液は、前記高分子化合物の架橋剤を更に含有することを特徴とする請求項５に記載のナノ繊維の製造方法。
7. 前記繊維化工程の後に、前記高分子化合物を架橋する架橋工程を更に有することを特徴とする請求項６に記載のナノ繊維の製造方法。
8. 前記架橋工程は、前記繊維化工程で得られた繊維を塩化水素ガスに接触させる工程を含むことを特徴とする請求項７に記載のナノ繊維の製造方法。
9. 前記親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、キチン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、デンプン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のナノ繊維の製造方法。
10. 前記親水性溶媒又は水に分散又は溶解する高分子化合物は、ポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のナノ繊維の製造方法。
11. 請求項１〜４のいずれかに記載のナノ繊維を含む創傷被覆材。