JP2013000066A - Method for identifying tree species of interspecific hybrid of eucalyptus - Google Patents
Method for identifying tree species of interspecific hybrid of eucalyptus Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013000066A JP2013000066A JP2011135402A JP2011135402A JP2013000066A JP 2013000066 A JP2013000066 A JP 2013000066A JP 2011135402 A JP2011135402 A JP 2011135402A JP 2011135402 A JP2011135402 A JP 2011135402A JP 2013000066 A JP2013000066 A JP 2013000066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- primer
- region
- combination
- eucalyptus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、複数の一塩基多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphism）を利用してユーカリ属の種間雑種の樹種を識別するための方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for discriminating interspecific hybrid tree species of the genus Eucalyptus using a plurality of single nucleotide polymorphisms (SNP).
ユーカリ属植物は、東南アジアを中心に植林が行われており、紙の原料として多く使われている。このような植物では、天然交雑に由来する種間交雑個体群のなかに親種に比べて優れた形質を有する場合があることが知られている。例えば、ユーカリ・ペリータとユーカリ・ブラシアーナ間の種間雑種は優れた特性を示すことから、東南アジアで植林へ利用し始めている。雑種集団から優良個体選抜など育種的試みも行われている。すなわち、このような植物では、天然交雑による種子の獲得が可能である。このように、ユーカリ属植物では、優れた特性をもつ種間交雑種を容易に選抜することが望まれている。 Eucalyptus plants are planted mainly in Southeast Asia and are often used as raw materials for paper. It is known that such a plant may have a trait superior to the parent species among interspecific hybrid populations derived from natural hybridization. For example, the interspecific hybrid between Eucalyptus Perita and Eucalyptus brushana is showing excellent characteristics and is starting to be used for planting in Southeast Asia. Breeding trials such as selection of excellent individuals from hybrid groups are also underway. That is, in such plants, seeds can be obtained by natural hybridization. Thus, in Eucalyptus plants, it is desired to easily select interspecific hybrids having excellent characteristics.
従来、形態的特徴の比較やアイソザイム分析から雑種の判定を行っているのが一般的である。しかし、形態による判定は、識別者の経験に基づく主観的判断であり、必ずしも正確な判定法ではない。また、アイソザイム分析では、タンパク質を扱うため個体の生育条件や分析時のプロテアーゼによる分解などの不確定要因により、必ずしも正確な判定が可能ではない。近年ではさらに、アカシア属植物などの熱帯早生樹、シバ属植物、果樹などにおいてDNAを用いた雑種の識別法が開発され、その手法として、例えばRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)法、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)法、SSR(Simple Sequence Repeat; Microsatellite)マーカー、ゲノムDNAの種特異的な塩基配列の長さの違い、などによる判定方法が使用されている（特許文献1、2、3、及び非特許文献1）。 Conventionally, hybrids are generally determined by comparison of morphological characteristics or isozyme analysis. However, the determination based on the form is a subjective determination based on the experience of the discriminator, and is not necessarily an accurate determination method. Further, in isozyme analysis, since proteins are handled, accurate determination is not always possible due to uncertain factors such as growth conditions of individuals and degradation by protease during analysis. In recent years, hybrid identification methods using DNA have been developed in early tropical trees such as Acacia plants, Shiba plants, fruit trees, etc., and methods such as RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment) are developed. Length polymorphism (AFLP) method, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) method, SSR (Simple Sequence Repeat; Microsatellite) marker, genomic DNA species-specific base sequence length differences, etc. are used (patents) Documents 1, 2, and 3 and Non-Patent Document 1).
RAPD法やAFLP法は、操作が簡便で少量のDNAで分析可能であり、雑種の識別の他に個体識別などにも利用されているが、再現性が悪いといった欠点があるため、必ずしも正確で確実な雑種識別法ではない。また、塩基配列の長さの違いによる種別鑑定法は、実用的に雑種を見つけ出すために約1,000個体以上の大量サンプルを対比する必要が生じるため、分析時間や費用の点で実用的ではない。SSRマーカーを使用する方法もまた、ゲノムの全塩基配列が解析されていない植物の場合、多数存在するといわれているゲノムDNAの繰り返し（マイクロサテライト）領域を検出し、他の多くの雑種との対比を行わなければならないため、効率が悪く、多くの労力と費用を要する。 RAPD and AFLP methods are easy to operate and can be analyzed with small amounts of DNA, and are used for individual identification in addition to hybrid identification. However, they are not always accurate because they have the disadvantage of poor reproducibility. It is not a reliable hybrid identification method. In addition, the type identification method based on the difference in length of base sequences is not practical in terms of analysis time and cost because it is necessary to compare a large number of samples of about 1,000 individuals or more in order to practically find hybrids. The method using the SSR marker also detects the repetitive (microsatellite) region of genomic DNA, which is said to exist in the case of plants where the entire base sequence of the genome has not been analyzed, and contrasts with many other hybrids. Is inefficient and requires a lot of labor and expense.
上記の背景技術に記載されたように、植物の種間雑種または種内雑種を正確にかつ簡単に識別または判別するための手法が非常に少ないことが分かった。ユーカリ属植物についてもこれらの交雑種のなかに成長性、病害性などの特性の点で優良な品種が存在することが認められるため、そのような優良品種を選抜するためにひとつひとつ栽培して各交雑種の特性を調べるやり方では多大の時間と労力を要することは明らかである。 As described in the background art above, it has been found that there are very few techniques for accurately and easily identifying or discriminating between interspecific or intraspecific hybrids of plants. As for Eucalyptus plants, it is recognized that there are excellent varieties among these hybrids in terms of characteristics such as growth and disease. Therefore, in order to select such excellent varieties, they are cultivated one by one. Obviously, investigating the characteristics of hybrids takes a lot of time and effort.
実際に、例えば主要樹種であるユーカリ・グロブラス（E. globulus）およびユーカリ・カマルドレンシス（E. camaldulensis）の種間雑種には、両者の利点を兼ね備えた新品種が得られる可能性があるため、形態的には雑種と思われる候補木が遺伝的にも雑種であるかを識別する手法を開発する必要性がある。また、ラオスをはじめとする東南アジア植林地では、外部から導入したユーカリ雑種クローンあるいは将来目標にあげている種間雑種の両親樹種が何であるかを調べる必要性が高まっているし、今後も東南アジアを中心とした国々で様々なクローンあるいは雑種が導入されることが予想され、樹種識別ツールは将来にわたって有用であると予想される。 In fact, for example, the interspecific hybrids of the main tree species Eucalyptus globulus (E. globulus) and Eucalyptus camaldulensis (E. camaldulensis) may have new varieties that combine the advantages of both. Therefore, there is a need to develop a method for discriminating whether a candidate tree that is morphologically hybrid is genetically hybrid. Moreover, in Southeast Asian plantations such as Laos, there is a growing need to investigate what eucalyptus hybrid clones have been introduced from the outside, or what kind of parent tree species are the interspecific hybrids that are listed as future targets. Various clones or hybrids are expected to be introduced in the central countries, and the tree species identification tool is expected to be useful in the future.
このため、本発明は、ユーカリ属植物の種間雑種を複数のSNPを利用して正確かつ容易に識別する方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for accurately and easily identifying interspecific hybrids of Eucalyptus plants using a plurality of SNPs.
本発明者らは、ユーカリ属由来の多数の樹種のサンプルを種々の産地から集め、全ゲノム中で近縁種間のSNPが存在すると考えられる3領域（NS領域、ETS領域及びCCR領域）を中心に解析して樹種間で差のある17種のSNPを見出し、そして、これらのSNPでユーカリ属9樹種を4〜8グループに分類できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors collected samples of a large number of tree species derived from the genus Eucalyptus from various sources, and classified three regions (NS region, ETS region, and CCR region) that are considered to have SNPs between related species in the entire genome. Analyzing it centrally, we found 17 SNPs that differed among the tree species, and found that these SNPs could classify 9 Eucalyptus tree species into 4-8 groups, thereby completing the present invention.
なお、NS領域とETS領域の8種のSNPを利用する樹種の識別については、この出願と同じ出願人による出願である特願2009-295174号にも記載されている。 The identification of tree species using eight types of SNPs in the NS region and the ETS region is also described in Japanese Patent Application No. 2009-295174, which is an application by the same applicant as this application.
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
(1) ユーカリ属植物のゲノムDNA中のシンナモイル-CoAリダクターゼ(CCR)をコードする遺伝子領域内の複数の一塩基多型(SNP)に基づいてユーカリ属植物の樹種を識別することを含む、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別する方法。
Accordingly, the present invention has the following features.
(1) Eucalyptus plants, including identifying species of Eucalyptus plants based on multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the gene region encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) in the genomic DNA of Eucalyptus plants A method for identifying a tree species of an interspecific hybrid of a genus plant.
(2) 上記ユーカリ属植物のゲノムDNA中のNS(すなわち、18S rDNA)領域及び葉緑体ETS(external transcribed spacer)領域内の複数のSNPに基づいて上記ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別することを行い、この識別結果と、上記CCR遺伝子領域のSNPを利用する識別結果とを組み合わせて該ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を決定することをさらに含む、上記(1)に記載の方法。 (2) Based on a plurality of SNPs in the NS (i.e., 18S rDNA) region and chloroplast ETS (external transcribed spacer) region in the genomic DNA of the Eucalyptus plant, the species of the interspecific hybrid of the Eucalyptus plant is determined. Further comprising determining the species of the interspecific hybrid of the Eucalyptus plant by combining the identification result and the identification result using the SNP of the CCR gene region. the method of.
(3) 上記方法が、前記ユーカリ属植物の種間雑種のゲノムDNA中の1又は2以上のSNPを含む領域を、各SNPを挟む該ゲノムDNAの配列に相補的な約20〜約30塩基の配列からなるプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する工程、その増幅産物を配列決定し1又は2以上のSNPの各塩基を決定する工程、並びにSNPの塩基と樹種との関係を示すデータに基づいて該種間雑種の樹種を決定する工程を含む、上記(1)又は(2)に記載の方法。 (3) about 20 to about 30 bases complementary to the sequence of the genomic DNA sandwiching each SNP in a region containing one or more SNPs in the genomic DNA of the interspecific hybrid of the Eucalyptus plant Amplification by polymerase chain reaction (PCR) using a primer consisting of the sequence of, sequencing the amplification product and determining each base of one or more SNPs, and the relationship between SNP bases and tree species The method according to (1) or (2) above, comprising the step of determining a tree species of the interspecific hybrid based on the data.
(4) 識別可能なユーカリ属植物の樹種が、ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)、ユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、ユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）、ユーカリ・グランディス(E. grandis)、ユーカリ・サリグナ（E.saligna）、ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、ユーカリ・ペリータ(E. pellita)、及びユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)からなる群から選択される、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。 (4) The tree species of the genus Eucalyptus plants that can be identified are E. globulus, E. camaldulensis, E. brassiana, E. tereticornis. ), Eucalyptus grandis (E. grandis), Eucalyptus saligna (E.saligna), Eucalyptus deglupta (E. deglputa), Eucalyptus perita (E. pellita), and Eucalyptus europhylla (E. urophylla) The method according to any one of (1) to (3) above, which is selected from the group.
(5) 上記NS(すなわち、18S rDNA)領域が、ユーカリ・グランディス(E. grandis)のゲノムDNA配列（配列番号31）の約180000番目の塩基から約181000番目の塩基までの領域に相当する領域であり、上記葉緑体ETS(external transcribed spacer)領域が、該ゲノムDNA配列（配列番号31）の約193500番目の塩基から約194000番目の塩基までの領域に相当する領域であり、及び上記CCR領域が、ユーカリ・グロブラス(E. globulus)のゲノムDNA配列（配列番号32）に相当する領域である、上記(2)〜(4)のいずれかに記載の方法。 (5) The above NS (ie, 18S rDNA) region corresponds to the region from about 180000th base to about 181000th base of Eucalyptus grandis genomic DNA sequence (SEQ ID NO: 31). The chloroplast ETS (external transcribed spacer) region is a region corresponding to the region from about 193500th base to about 194000th base of the genomic DNA sequence (SEQ ID NO: 31), and the CCR The method according to any one of (2) to (4) above, wherein the region is a region corresponding to a genomic DNA sequence of E. globulus (SEQ ID NO: 32).
(6) 上記SNPの塩基と樹種との関係を示すデータが、下記の表1（NS及びETS領域を利用する場合）及び表2（CCR領域を利用する場合）に示されるものである、ただし表中のスラッシュ(/)を挟む塩基は、各アレルの塩基を表す、上記(3)に記載の方法。
(7) 上記CCR領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーが、P220（配列番号22）、CCR02（配列番号23）、P223（配列番号26）、CCR001（配列番号24）、P221（配列番号27）、P225（配列番号25）、P219（配列番号28）、及びP217（配列番号29）のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される、上記(3)〜(6)のいずれかに記載の方法。 (7) Primers for amplifying the region containing each of the CCR region SNPs by PCR are P220 (SEQ ID NO: 22), CCR02 (SEQ ID NO: 23), P223 (SEQ ID NO: 26), CCR001 (SEQ ID NO: 24) , P221 (SEQ ID NO: 27), P225 (SEQ ID NO: 25), P219 (SEQ ID NO: 28), and P217 (SEQ ID NO: 29) primers, and each primer has at least 90% identity with the base sequence The method according to any one of (3) to (6) above, which is selected from the group consisting of primers consisting of a base sequence.
(8) 上記NS領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーが、NS2（配列番号2）、NS3（配列番号3）、NS4（配列番号4）、NS6(配列番号6)、NS11(配列番号12)、及びNS13（配列番号14）のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される、上記(3)〜(6)のいずれかに記載の方法。 (8) Primers for amplifying the region containing each of the above NS region SNPs by PCR are NS2 (SEQ ID NO: 2), NS3 (SEQ ID NO: 3), NS4 (SEQ ID NO: 4), NS6 (SEQ ID NO: 6) NS11 (SEQ ID NO: 12) and NS13 (SEQ ID NO: 14) primers, and selected from the group consisting of primers consisting of a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of these primers, The method according to any one of (3) to (6).
(9) 上記ETS領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーが、ETS2（配列番号19）及びETS4（配列番号21）のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される、上記(3)〜(6)のいずれかに記載の方法。 (9) Primers for amplifying a region containing each of the ETS region SNPs by PCR are primers for ETS2 (SEQ ID NO: 19) and ETS4 (SEQ ID NO: 21), and the nucleotide sequences of these primers and 90 The method according to any one of the above (3) to (6), which is selected from the group consisting of primers consisting of nucleotide sequences having% or more identity.
(10) ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するためのPCRプライマーセットを含むキットであって、該PCRプライマーセットが、ユーカリ属植物ゲノムのNS領域及びETS領域内のSNP1〜SNP8並びにCCR領域内のSNP9〜SNP17の各々を含む領域を増幅するためのプライマーを含み、該SNP1〜SNP8がそれぞれ、ユーカリ・グランディスのNS及びETS領域のゲノムDNA配列（配列番号30）の180133番目、180769番目、193840番目、193651番目、193650番目、193624番目、193591番目、193545番目に相当する位置に存在し、該SNP9〜SNP17がそれぞれ、ユーカリ・グロブラスのCCR領域のゲノムDNA配列（配列番号31）の989番目、1163番目、1210番目、1223番目、1846番目、1878番目、2312番目、2428番目、2548番目に相当する位置に存在し、該プライマーが、該SNP1〜SNP17の各SNPを挟む該ゲノムDNAの塩基配列、又は該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列、に相補的な約20〜約30塩基長の配列からなるセンス及びアンチセンスプライマーのセットを含む、上記キット。 (10) A kit comprising a PCR primer set for identifying a tree species of an interspecific hybrid of a Eucalyptus plant using a plurality of single nucleotide polymorphisms (SNPs), the PCR primer set comprising the Eucalyptus plant genome A primer for amplifying a region containing each of SNP1 to SNP8 in the NS region and ETS region and SNP9 to SNP17 in the CCR region, wherein the SNP1 to SNP8 are the genomes of the NS and ETS regions of Eucalyptus grandis, respectively. It exists in the position corresponding to the 180133rd, 180769th, 193840th, 193651th, 193650th, 193624th, 193591th, 193545th of the DNA sequence (SEQ ID NO: 30), and the SNP9 to SNP17 are respectively Eucalyptus globulas In the genomic DNA sequence of the CCR region (SEQ ID NO: 31) is present at positions corresponding to 989, 1163, 1210, 1223, 1846, 1878, 2312, 2428, 2548, and the primer, Each SNP of SNP1 to SNP17 A set of sense and antisense primers consisting of a sequence having a length of about 20 to about 30 bases complementary to the base sequence of the genomic DNA or a base sequence having 90% or more identity with the base sequence, kit.
(11) 上記PCRプライマーセットが、下記の(a)〜(l)：
(a) SN領域内のSNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(b)SN領域内のSNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(c) ETS領域内のSNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ、及び/又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(d)CCR領域内のSNP9について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(e)CCR領域内のSNP10について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(f)CCR領域内のSNP11について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(g)CCR領域内のSNP12について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(h)CCR領域内のSNP13について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(i)CCR領域内のSNP14について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(j)CCR領域内のSNP15について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(k)CCR領域内のSNP16について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；並びに、
(l)CCR領域内のSNP17について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる、上記(10)に記載のキット。
(11) The above PCR primer set includes the following (a) to (l):
(a) For SNP1 in the SN region, amplification primers are NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) combination and / or NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS2 (SEQ ID NO: 2) combination, and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: May be;
(b) For SNP2 in the SN region, the amplification primer is a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) and / or a combination of NS3 (SEQ ID NO: 3) / NS4 (SEQ ID NO: 4), and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: As well as;
(c) For each of SNP3 to SNP8 in the ETS region, the amplification primer is a combination of ETS4 (SEQ ID NO: 21) / ETS2 (SEQ ID NO: 19) and / or ETS18S (SEQ ID NO: 16) / ETSMyrtF (SEQ ID NO: 17). A combination, provided that the primer of each combination may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of SEQ ID NO:
(d) For SNP9 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(e) For SNP10 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(f) For SNP11 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(g) For SNP12 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(h) For SNP13 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(i) For SNP14 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(j) For SNP15 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(k) For SNP16 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer consisting of a base sequence having at least% identity;
(l) For SNP17 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independent of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
The kit according to (10) above, comprising:
(12) ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するための、SNP1〜SNP8、SNP9〜17と樹種との関係を示す上記(6)に示される表1及び表2の組合せの使用方法。 (12) In the above (6) showing the relationship between SNP1 to SNP8, SNP9 to 17 and tree species for identifying the species of interspecific hybrids of Eucalyptus plants using multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) How to use the combinations of Table 1 and Table 2 shown.
本発明により、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を実験室レベルで容易にかつ正確に識別することが可能になり、これにより、各雑種をひとつひとつ栽培してその特性を調べる必要性がなくなった。すなわち、約1,000種以上も存在するといわれるユーカリ属植物の天然交雑種のなかから優良品種を従来法と比べてより効率よく正確に選抜することを本発明の方法が可能にする。 The present invention makes it possible to easily and accurately identify interspecific hybrid tree species of Eucalyptus plants at the laboratory level, thereby eliminating the need to cultivate each hybrid one by one and examine its characteristics. . That is, the method of the present invention makes it possible to more efficiently and accurately select excellent varieties from natural hybrids of Eucalyptus plants, which are said to be present in about 1,000 or more species, compared to the conventional method.
（樹種識別法）
ユーカリ属植物は、主にオーストラリア原産であるが、今日では、東南アジア、オーストラリア、南米などの地域に植林されるようになり、世界的に有用な産業造林樹種のひとつであり、特に、紙パルプ、製材、木炭、オイルなどとして利用されている。この植物には、多数の種間交雑種が存在する。種間交雑には、天然交雑、人工交配、その他の交雑が含まれる。天然交雑は、分布域と開花期が重なった場合に起こり、例えばユーカリ・ペリータ×ユーカリ・ブラシアーナ、ユーカリ・グロブラス×ユーカリ・カマルドレンシスなどでこの種の交雑が認められている。人工交配は、優良木同士の人工交配であり、例えばユーカリ・ユーロフィラ×ユーカリ・グランディスなどで雑種育種が試みられている。
(Tree species identification method)
Eucalyptus plants are mainly native to Australia, but today they are planted in Southeast Asia, Australia, South America and other regions, and are one of the world's most useful industrial plantation tree species. Used as lumber, charcoal and oil. There are many interspecific hybrids in this plant. Interspecific crosses include natural crosses, artificial crosses, and other crosses. Natural crossing occurs when the area of distribution overlaps with the flowering period, and this type of crossing is recognized, for example, in Eucalyptus Perita x Eucalyptus Brassana, Eucalyptus Globras x Eucalyptus Camaldrensis, and the like. Artificial crossing is an artificial cross between excellent trees. For example, hybrid breeding is attempted using Eucalyptus, Eurofila x Eucalyptus, and Grandis.
多数存在する交雑種について、現在の種間雑種の判別法は形態的な指標によるものであり、より早期により確実に判別する方法としてDNAマーカーを利用する方法が求められてきた。 As for a large number of hybrids, the current method for discriminating interspecific hybrids is based on a morphological index, and a method using a DNA marker has been demanded as a method for more reliably discriminating earlier.
このような状況のなかで、本発明は、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数のSNPを利用して識別する方法であって、該雑種のゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP17の各々を含む領域を増幅する工程、増幅産物を配列決定しSNP1〜SNP17の各塩基を決定する工程、並びに表1及び表2に基づいて該雑種の樹種を判定する（又は、該雑種の親種を特定する）工程を含んでなる方法を提供する。 Under such circumstances, the present invention is a method for identifying tree species of interspecific hybrids of Eucalyptus plants using a plurality of SNPs, each of SNP1 to SNP17 using the genomic DNA of the hybrid as a template. The step of amplifying the region containing the step, the step of sequencing the amplification product and determining the bases of SNP1 to SNP17, and determining the tree species of the hybrid based on Tables 1 and 2 (or determining the parental species of the hybrid) A method comprising the step of identifying) is provided.
本発明の方法によって識別可能な（又はグループ分け可能な）ユーカリ属植物の樹種は、ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)、ユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、ユーカリ・テレティコルニス（E. tereticornis、ユーカリ・グランディス(E. grandis)、ユーカリ・サリグナ（E. saligna）、ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、ユーカリ・ペリータ(E. pellita)、及びユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)からなる9種である。 Eucalyptus plant species that can be identified (or grouped) by the method of the present invention include Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus brassiana. ), Eucalyptus Teleticornis (E. tereticornis, E. grandis), Eucalyptus Saligna (E. saligna), Eucalyptus Degluputa (E. deglputa), Eucalyptus Perita (E. pellita), and Eucalyptus Euro Nine species consisting of E. urophylla.
本発明によれば、ユーカリ属植物の上記樹種のゲノムDNA中で特定されたSNP1〜17からなる17種のSNPを利用して雑種の樹種又は親種を識別又はグループ分けすることができる。これらのSNPは3領域、すなわちNS領域、ETS領域及びCCR領域に存在しており、具体的には、NS領域に2種のSNP(SNP1及びSNP2と称する。)、ETS領域に6種のSNP(SNP3, SNP4,SNP5, SNP6, SNP7, SNP8と称する。)、CCR領域に9種のSNP(SNP9, SNP10, SNP11, SNP12, SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17と称する。)がそれぞれ存在している。これらのSNPでユーカリ属9樹種を、NS領域及びETS領域の8種のSNPを利用するとき5つのグループに、CCR領域の9種のSNPを利用するとき4つのグループに、そしてこれらの17種のSNPを利用するとき8つのグループに分類できる。 According to the present invention, hybrid tree species or parent species can be identified or grouped using 17 SNPs comprising SNPs 1 to 17 identified in the genomic DNA of the above-mentioned species of Eucalyptus plants. These SNPs are present in three regions, namely NS region, ETS region and CCR region. Specifically, two SNPs (referred to as SNP1 and SNP2) in the NS region and six SNPs in the ETS region. (Referred to as SNP3, SNP4, SNP5, SNP6, SNP7, SNP8) and 9 types of SNPs (referred to as SNP9, SNP10, SNP11, SNP12, SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17) in the CCR region, respectively. ing. Nine Eucalyptus species in these SNPs, five groups when using eight SNPs in the NS and ETS regions, four groups when using nine SNPs in the CCR region, and 17 of these When using SNP, it can be classified into 8 groups.
すなわち、SNP1〜SNP8を使用するとき、ユーカリ属植物の上記9樹種は以下の5つの群(A群〜E群)にグループ分け可能である。
(A群)ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、
(B群)ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)又はユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、又はユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）
(C群)ユーカリ・グランディス(E. grandis)、又はユーカリ・サリグナ（E.saligna）
(D群)ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、及び
(E群)ユーカリ・ペリータ(E. pellita)又はユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)。
That is, when using SNP1 to SNP8, the above nine tree species of the Eucalyptus plant can be grouped into the following five groups (Group A to Group E).
(Group A) Eucalyptus globulus (E. globulus),
(Group B) Eucalyptus camaldulensis (E. camaldulensis) or Eucalyptus brushiana (E. tereticornis)
(Group C) Eucalyptus grandis (E. grandis) or Eucalyptus saligna (E.saligna)
(Group D) Eucalyptus degrupta (E. deglputa), and
(Group E) Eucalyptus perita (E. pellita) or Eucalyptus europhylla (E. urophylla).
また、SNP9〜SNP17を使用するとき、ユーカリ属植物の上記9樹種は以下の4つの群（a群〜d群）にグループ分け可能である。
(a群)ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、
(b群)ユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）、
(c群) ユーカリ・サリグナ（E.saligna）、
(d群)ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)、ユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、ユーカリ・グランディス(E. grandis)、ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、ユーカリ・ペリータ(E. pellita)又はユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)。
Moreover, when using SNP9-SNP17, the said 9 tree species of a Eucalyptus plant can be grouped into the following four groups (a group-d group).
(Group a) Eucalyptus globulus (E. globulus),
(Group b) Eucalyptus teleticornis (E.tereticornis),
(Group c) Eucalyptus Saligna (E.saligna),
(Group d) Eucalyptus Camaldulensis (E. camaldulensis), Eucalyptus Brassiana, Eucalyptus Grandis, E. deglputa, Eucalyptus Perita (E. pellita) ) Or E. urophylla.
さらにまた、SNP1〜SNP8とSNP9〜SNP17の両方を組み合せて使用するとき、ユーカリ属植物の上記9樹種は以下の8つの群(I群〜VIII群)にグループ分け可能である。
(I群)ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、
(II群)ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)
(III群)ユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、
(IV群)ユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）、
(V群)ユーカリ・グランディス(E. grandis)、
(VI群)ユーカリ・サリグナ（E.saligna）、
(VII群)ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、及び
(VIII群)ユーカリ・ペリータ(E. pellita)又はユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)。
Furthermore, when both SNP1 to SNP8 and SNP9 to SNP17 are used in combination, the nine species of Eucalyptus plants can be grouped into the following eight groups (Group I to Group VIII).
(Group I) Eucalyptus globulus (E. globulus),
(Group II) E. camaldulensis
(Group III) Eucalyptus brushana (E. brassiana),
(Group IV) Eucalyptus Teleticornis (E.tereticornis),
(Group V) Eucalyptus Grandis (E. grandis),
(Group VI) Eucalyptus Saligna (E.saligna),
(Group VII) Eucalyptus degruputa (E. deglputa), and
(Group VIII) Eucalyptus perita (E. pellita) or Eucalyptus europhylla (E. urophylla).
したがって、本発明の方法により上記の17種のSNPを利用することによって、ユーカリ属植物の9樹種のうち7種の樹種を識別することが可能であるし、また、残りの2樹種についても、SNP1, SNP3, SNP5, SNP6, SNP7, SNP8, SNP11, SNP15, SNP17の少なくとも1つによる判定結果に基づいて、場合によっては各樹種の識別が可能になるか、或いはそうでない場合には、その2樹種のいずれかであると判定可能である。 Therefore, by utilizing the above 17 SNPs according to the method of the present invention, it is possible to identify 7 species among 9 species of Eucalyptus plants, and for the remaining 2 species, Based on the judgment result by at least one of SNP1, SNP3, SNP5, SNP6, SNP7, SNP8, SNP11, SNP15, SNP17, in some cases, each tree species can be identified or, if not, It can be determined that it is one of the tree species.
上記のSNP1〜SNP8のうち、SNP1とSNP2はユーカリゲノムDNAのNS(すなわち、18S rDNA)領域に存在し、SNP3〜SNP8はユーカリゲノムDNAの葉緑体ETS(external transcribed spacer)領域に存在する。ユーカリゲノム配列(scaffold 522、http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/)に基づくSNP1〜SNP8の位置は次のとおりである。
SNP1: scaffold 522, 180133番目T又はC
SNP2: scaffold 522, 180769番目A又はG
SNP3: scaffold 522, 193840番目A又はG
SNP4: scaffold 522, 193651番目G又はA
SNP5: scaffold 522, 193650番目T又はC
SNP6: scaffold 522, 193624番目G又はC
SNP7: scaffold 522, 193591番目T又はC
SNP8: scaffold 522, 193545番目A又はG
（ここで、scaffold 522は、ユーカリ・グランディスのゲノムDNA断片の番号を表す。）
「http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/」は、Eucspressoが提供するユーカリ遺伝子発現データベース(The Eucalyptus gene expression database)である。
Among the above SNP1 to SNP8, SNP1 and SNP2 are present in the NS (ie, 18S rDNA) region of eucalyptus genomic DNA, and SNP3 to SNP8 are present in the chloroplast ETS (external transcribed spacer) region of eucalyptus genomic DNA. The positions of SNP1 to SNP8 based on the Eucalyptus genome sequence (scaffold 522, http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/) are as follows.
SNP1: scaffold 522, 180133rd T or C
SNP2: scaffold 522, 180769th A or G
SNP3: scaffold 522, 193840th A or G
SNP4: scaffold 522, 193651th G or A
SNP5: scaffold 522, 193650th T or C
SNP6: scaffold 522, 193624th G or C
SNP7: scaffold 522, 193591st T or C
SNP8: scaffold 522, 193545th A or G
(Where scaffold 522 represents the number of the genomic DNA fragment of Eucalyptus grandis)
“Http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/” is a Eucalyptus gene expression database provided by Eucspresso.
また、上記のSNP9〜SNP17は、ユーカリゲノムDNAのCCR(cinnamoyl-CoA reductase)領域に存在する。このCCR領域の配列情報は、例えばユーカリ・グロブラスのCCR遺伝子の塩基配列についてGenBank:AY656821（配列番号31）に記載されている。この塩基配列に基づくと、SNP9〜SNP17は、それぞれ989番目、1163番目、1210番目、1223番目、1846番目、1878番目、2312番目、2428番目、2548番目に位置する。 The above SNP9 to SNP17 are present in the CCR (cinnamoyl-CoA reductase) region of eucalyptus genomic DNA. The sequence information of this CCR region is described in GenBank: AY656821 (SEQ ID NO: 31) for the base sequence of the CCR gene of Eucalyptus globulus, for example. Based on this base sequence, SNP9 to SNP17 are located at 989, 1163, 1210, 1223, 1846, 1878, 2312, 2428, and 2548, respectively.
本発明の方法では、まず、樹種が不明のユーカリ属植物の組織（例えば、葉、根、茎など）からゲノムDNAを抽出する。具体的には、組織を粉砕し、フェノール/クロロホルム法、グアニジンイソチオシアネート/酸性フェノール法などのDNA抽出法を用いてDNAを抽出し、エタノールを加え沈殿するDNAを回収する。DNAの抽出は、市販のDNA抽出キットを使用して実施することができる。 In the method of the present invention, first, genomic DNA is extracted from a tissue of an Eucalyptus plant whose tree species is unknown (for example, leaves, roots, stems, etc.). Specifically, the tissue is pulverized, DNA is extracted using a DNA extraction method such as phenol / chloroform method, guanidine isothiocyanate / acidic phenol method, etc., and ethanol is added to recover the precipitated DNA. DNA extraction can be performed using a commercially available DNA extraction kit.
次に、抽出されたゲノムDNA（検査すべき目的の領域を含むDNA断片でもよい。）を鋳型にしてSNP1〜SNP2、SNP3〜SNP8、SNP9〜SNP17の1又は2以上のSNPの各々を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、その後、各増幅産物に対し配列決定用プライマーを使用してPCRを行って相補鎖DNAを合成し、その塩基配列を決定し、これによってSNP1〜SNP17の1又は2以上、好ましくはすべての各塩基を決定する。 Next, a region containing one or more SNPs of SNP1-SNP2, SNP3-SNP8, SNP9-SNP17 using the extracted genomic DNA (or a DNA fragment containing the target region to be examined) as a template Is amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then PCR is performed on each amplification product using a sequencing primer to synthesize complementary strand DNA, and its base sequence is determined, whereby SNP1 to SNP17. One or more, preferably all each base is determined.
上記の9樹種のユーカリ属植物における上記のSNPを含むゲノム領域をPCRによって増幅するためのプライマーセットは、該ユーカリ属植物ゲノムの上記のNS領域及びETS領域内のSNP1〜SNP8並びに上記のCCR領域内のSNP9〜SNP17の各々を含む領域を増幅するためのプライマーを含み、該SNP1〜SNP8がそれぞれ、ユーカリ・グランディスのNS及びETS領域のゲノムDNA配列（配列番号30）の180133番目、180769番目、193840番目、193651番目、193650番目、193624番目、193591番目、193545番目に相当する位置に存在し、該SNP9〜SNP17がそれぞれ、ユーカリ・グロブラスのCCR領域のゲノムDNA配列（配列番号31）の989番目、1163番目、1210番目、1223番目、1846番目、1878番目、2312番目、2428番目、2548番目に相当する位置に存在し、該プライマーが、該SNP1〜SNP17の各SNPを挟む該ゲノムDNAの塩基配列、又は、該塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列、に相補的な約20〜約30塩基長の任意の配列からなるセンス及びアンチセンスプライマーセットを含む。このようなプライマーセットを使用して上記SNPを含む領域を増幅したときの増幅産物のサイズは、少なくとも40〜70塩基長であり、好ましくは少なくとも100塩基長であり、例えば200〜1000塩基長又はそれ以上であってもよい。 The primer set for amplifying the genomic region containing the SNP in the nine species of Eucalyptus plants by PCR is the SNP1 to SNP8 in the NS region and ETS region of the Eucalyptus plant genome and the CCR region. A primer for amplifying a region containing each of SNP9 to SNP17, wherein the SNP1 to SNP8 are respectively the 180133rd, 180769th of the genomic DNA sequences (SEQ ID NO: 30) of the NS and ETS regions of Eucalyptus grandis, 193840th, 193651th, 193650th, 193624th, 193591, 193545th, SNP9 to SNP17 are each 989th of the genomic DNA sequence of the CCR region of Eucalyptus globulus (SEQ ID NO: 31) , 1163rd, 1210th, 1223rd, 1846th, 1878th, 2312th, 2428th, 2548th, and the base of the genomic DNA sandwiching each SNP of SNP1 to SNP17 Array Alternatively, a sense and an anti-sense consisting of an arbitrary sequence having a length of about 20 to about 30 bases complementary to a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with the base sequence Includes sense primer set. The size of the amplification product when a region containing the SNP is amplified using such a primer set is at least 40 to 70 bases long, preferably at least 100 bases long, for example 200 to 1000 bases long or It may be more.
上記のプライマーの例は以下のとおりである。
上記CCR領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーの例は、P220（配列番号22）、CCR02（配列番号23）、P223（配列番号26）、CCR001（配列番号24）、P221（配列番号27）、P225（配列番号25）、P219（配列番号28）、及びP217（配列番号29）のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される。
Examples of the above primers are as follows.
Examples of primers for amplifying the region containing each of the SNPs of the CCR region by PCR are P220 (SEQ ID NO: 22), CCR02 (SEQ ID NO: 23), P223 (SEQ ID NO: 26), CCR001 (SEQ ID NO: 24), P221 (SEQ ID NO: 27), P225 (SEQ ID NO: 25), P219 (SEQ ID NO: 28), and P217 (SEQ ID NO: 29) primers, and bases having 90% or more identity with each base sequence of these primers It is selected from the group consisting of primers consisting of sequences.
上記NS領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーの例は、NS2（配列番号2）、NS3（配列番号3）、NS4（配列番号4）、NS6(配列番号6)、NS11(配列番号12)、及びNS13（配列番号14）のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される。 Examples of primers for amplifying a region containing each of the SNPs of the NS region by PCR are NS2 (SEQ ID NO: 2), NS3 (SEQ ID NO: 3), NS4 (SEQ ID NO: 4), NS6 (SEQ ID NO: 6), NS11 (SEQ ID NO: 12) and NS13 (SEQ ID NO: 14) primers, and a primer consisting of a primer consisting of a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of these primers.
上記ETS領域のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーは、ETS2（配列番号19）及びETS4（配列番号21））のプライマー、並びに、これらのプライマーの各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される。 Primers for amplifying the region containing each of the SNPs of the ETS region by PCR are the primers of ETS2 (SEQ ID NO: 19) and ETS4 (SEQ ID NO: 21), and each nucleotide sequence of these primers and 90% or more Are selected from the group consisting of primers consisting of nucleotide sequences having the same identity.
増幅工程のプライマーの組合せは、SNP1〜SNP8及びSNP9〜SNP17の各塩基を含む領域を増幅するのに適したユーカリゲノム配列由来のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組合せであり、例えば、下記の(a)〜(l)に示されるプライマーの組み合わせである。 The primer combination in the amplification step is a combination of a sense primer and an antisense primer derived from a eucalyptus genome sequence suitable for amplifying a region containing each base of SNP1 to SNP8 and SNP9 to SNP17. ) To (l).
(a) SN領域内のSNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(b)SN領域内のSNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(c) ETS領域内のSNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ、及び/又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(d)CCR領域内のSNP9について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(e)CCR領域内のSNP10について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(f)CCR領域内のSNP11について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(g)CCR領域内のSNP12について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(h)CCR領域内のSNP13について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(i)CCR領域内のSNP14について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(j)CCR領域内のSNP15について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(k)CCR領域内のSNP16について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；並びに、
(l)CCR領域内のSNP17について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい。
(a) For SNP1 in the SN region, amplification primers are NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) combination and / or NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS2 (SEQ ID NO: 2) combination, and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: May be;
(b) For SNP2 in the SN region, the amplification primer is a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) and / or a combination of NS3 (SEQ ID NO: 3) / NS4 (SEQ ID NO: 4), and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: As well as;
(c) For each of SNP3 to SNP8 in the ETS region, the amplification primer is a combination of ETS4 (SEQ ID NO: 21) / ETS2 (SEQ ID NO: 19) and / or ETS18S (SEQ ID NO: 16) / ETSMyrtF (SEQ ID NO: 17). A combination, provided that the primer of each combination may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of SEQ ID NO:
(d) For SNP9 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(e) For SNP10 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(f) For SNP11 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(g) For SNP12 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(h) For SNP13 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(i) For SNP14 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(j) For SNP15 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(k) For SNP16 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer consisting of a base sequence having at least% identity;
(l) For SNP17 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independent of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 It may be a primer comprising a base sequence having at least% identity.
上記プライマーは、通常、塩基数17〜30、好ましくは20〜30、より好ましくは20〜25のサイズのDNAからなり、また、自然界で植物の突然変異が起こりうることを考慮して、それぞれの上記配列番号の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーを使用することができる。変異は、1、2又は3個の塩基の置換、欠失又は挿入（若しくは、付加）を含む。 The primer is usually composed of DNA having a base number of 17 to 30, preferably 20 to 30, more preferably 20 to 25, and considering that plant mutations can occur in nature, A primer comprising a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with the base sequence of the above SEQ ID NO can be used. Mutations include substitutions, deletions or insertions (or additions) of 1, 2 or 3 bases.
配列に関する「同一性」は、2つの塩基配列を、最大の一致率となるようにギャップを導入して又はギャップを導入しないで整列（アラインメント）したときに、ギャップを含めての塩基の総数に対する同一塩基数の割合(％)を表す。％同一性は、BLAST、FASTAなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる(Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); McGinnis, S & Madden, T.L., Nucleic Acids Res. 32:W20-W25 (2004)等)。 “Identity” in terms of sequence refers to the total number of bases, including gaps, when two base sequences are aligned (aligned) with or without gaps for maximum match. It represents the percentage (%) of the same number of bases. % Identity can be determined using known algorithms such as BLAST, FASTA (Altschul, SF et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul, SF et al ., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); McGinnis, S & Madden, TL, Nucleic Acids Res. 32: W20-W25 (2004), etc.).
PCRは、変性、アニーリング及び伸長反応を1サイクルとして約20〜40サイクルを繰り返すことによって行うことができる。 PCR can be performed by repeating about 20 to 40 cycles with one cycle of denaturation, annealing, and extension reaction.
変性は、二本鎖DNAを加熱によって解離して一本鎖にする、すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖に分離する、ステップであり、そのための条件は、例えば約94〜96℃の温度で約10〜60秒間二本鎖DNAを含む溶液を加熱処理することを含む。 Denaturation is a step in which double-stranded DNA is dissociated into single strands by heating, i.e., separated into a sense strand and an antisense strand, and the conditions for this are, for example, about 10 to about 94 to 96 ° C. Heat treating the solution containing double stranded DNA for ˜60 seconds.
アニーリングは、センス鎖及びアンチセンス鎖の各鋳型DNAに、それらに対応するプライマー、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマー、を結合するステップであり、そのための条件は、鋳型DNAとプライマーを含む溶液を約50〜65℃で約10〜60秒間加熱処理することを含む。 Annealing is a step of binding the primer DNA corresponding to each template DNA of the sense strand and the antisense strand, that is, a forward primer or a reverse primer, and the conditions for this are about 50% of the solution containing the template DNA and the primer. Heat treatment at about -65 ° C for about 10-60 seconds.
伸長反応は、鋳型DNAにアニーリングしたプライマーを起点にして相補的DNA鎖を合成するステップであり、そのための条件は、耐熱性DNAポリメラーゼ及びdNTPs(NはA,T,G,Cである。)の存在下で、プライマーがアニーリングした鋳型DNAを含む溶液を約60〜80℃で約10〜60秒間加熱処理することを含む。 The extension reaction is a step of synthesizing a complementary DNA strand starting from a primer annealed to a template DNA, and the conditions for this are thermostable DNA polymerase and dNTPs (N is A, T, G, C). In the presence of the primer, the solution containing the template DNA annealed with the primer is heated at about 60-80 ° C. for about 10-60 seconds.
PCRの緩衝液は、dNTPs及びMgCl2を含むPCR用緩衝液であり、伸長反応に際して、このなかにさらに、耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼ（Thermus aquatics由来）やPfuポリメラーゼ（Pyrococcus furiosus由来）など、が添加される。 The PCR buffer is a buffer for PCR containing dNTPs and MgCl 2 , and during the extension reaction, a thermostable DNA polymerase such as Taq polymerase (derived from Thermus aquatics), Pfu polymerase (derived from Pyrococcus furiosus), etc. , Is added.
PCRは市販のサーマルサイクラーを使用して実施することによって自動的なDNA増幅が可能になる。サーマルサイクラーは、例えば宝酒造、Applied Biosystems、Bio-Rad Labsなどから市販されている。 PCR can be performed automatically using a commercially available thermal cycler. Thermal cyclers are commercially available from, for example, Takara Shuzo, Applied Biosystems, Bio-Rad Labs, and the like.
本発明の方法では、増幅されたDNAを回収、精製し、さらに配列決定のために、精製DNAを鋳型にしてPCRを行い、増幅産物のDNA配列を決定する。 In the method of the present invention, amplified DNA is collected and purified, and further, for sequencing, PCR is performed using the purified DNA as a template to determine the DNA sequence of the amplified product.
DNAの回収、精製のために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動などの電気泳動の使用のほかに、市販のPCR産物精製キット、例えばQIAquick PCR purification kit（QIAGEN）、などを使用すると便利である。 For DNA recovery and purification, it is convenient to use a commercially available PCR product purification kit such as QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) in addition to the use of electrophoresis such as polyacrylamide gel electrophoresis and agarose gel electrophoresis. It is.
また、塩基配列の決定は、ジデオキシ法(Sanger法)を利用した自動DNAシークエンサーを使用する方法などによって行うことができる。 The base sequence can be determined by a method using an automatic DNA sequencer using the dideoxy method (Sanger method).
Sanger法では、上記のPCR条件（ただし、4種類の基質(dNTPs)のほかに、蛍光標識された特異的競合阻害剤(ddNTPs)を加える。）で鋳型DNAに相補的なDNAを合成するが、この合成の際に基質と阻害剤の間で競合反応が起こり、阻害剤が取り込まれると反応が停止し、生成する相補鎖DNAはその3'末端がいずれもddNTP（N=A,T,G又はC）で停止した種々の長さのDNA断片として得られ、これをゲル電気泳動でサイズ分離し、それを読み取って塩基配列を決定する。読み取りに際しては、レーザー光を励起し、その蛍光を検出するなどの手法を使用できる。 In the Sanger method, DNA complementary to the template DNA is synthesized under the PCR conditions described above (however, in addition to the four types of substrates (dNTPs), a fluorescently labeled specific competitive inhibitor (ddNTPs) is added). In this synthesis, a competitive reaction occurs between the substrate and the inhibitor, and when the inhibitor is incorporated, the reaction stops, and the generated complementary strand DNA has ddNTP (N = A, T, DNA fragments of various lengths stopped at G or C) are obtained, size-separated by gel electrophoresis, and read to determine the base sequence. For reading, it is possible to use a technique such as exciting laser light and detecting the fluorescence.
（キット及び使用）
本発明はさらに、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するためのPCRプライマーセットを提供する。該PCRプライマーセットは、NS領域及びETS領域内のSNP1〜SNP8及びCCR領域内のSNP9〜SNP17の各々を含む領域を増幅するための上記のプライマー並びに、必要に応じて、増幅産物を配列決定するためのプライマーを含み、好ましい例として上記の(a)〜(l)のプライマーを含むセットである。
(Kit and use)
The present invention further provides a PCR primer set for discriminating interspecific hybrid tree species of Eucalyptus plants using a plurality of single nucleotide polymorphisms (SNPs). The PCR primer set includes the above primers for amplifying the region containing each of SNP1 to SNP8 in the NS region and ETS region and SNP9 to SNP17 in the CCR region, and if necessary, the amplification product is sequenced. A set including the primers (a) to (l) described above as a preferred example.
本発明はさらに、上記のプライマー、好ましくは上記の(a)〜(l)のプライマーセットを含む、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別するためのキットを提供する。キットには、上記プライマーセットのほかに、PCRのために必要な試薬類、例えば、PCRバッファー、耐熱性ポリメラーゼ、dNTPs(N=A,T,G,C)などの試薬、鋳型DNA調製用試薬、例えばゲノムDNA抽出用溶媒、制限酵素などの試薬、並びに使用説明書（手順や操作法を含む。）を含めることができる。 The present invention further provides a kit for discriminating interspecific hybrid tree species of Eucalyptus plants, comprising the above-mentioned primers, preferably the above-mentioned primer sets (a) to (l). In addition to the above primer set, the kit includes reagents necessary for PCR, for example, reagents such as PCR buffers, heat-resistant polymerases, dNTPs (N = A, T, G, C), reagents for preparing template DNA For example, a reagent for extracting genomic DNA, a reagent such as a restriction enzyme, and instructions for use (including procedures and operating methods) can be included.
上記のようにして決定されたテストサンプルのSNP1〜SNP8及びSNP9〜SNP17の各塩基について、表1及び表2に示されたそれぞれSNP1〜SNP8及びSNP9〜SNP17の各SNP塩基と樹種との関係に基づいて、後述の実施例の樹種の識別例のようにして、検査すべき交雑種の親種の樹種を決定することができる。例えば、テストサンプルのSNP1〜SNP8の塩基がそれぞれT/C, G/G, A/G, G/A, T/C, G/C, C/C, A/Aであれば、そのサンプルの樹種は、E. camaldulensis×E. deglputaであると推定される。また、例えば、ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)とユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)は、SNP1〜SNP8を利用しても識別がむずかしいが、SNP1〜SNP8とSNP9〜SNP17（例えば、SNP15及びSNP17）の組合せを利用することによって、それらの識別が可能になる。 Regarding the bases of SNP1 to SNP8 and SNP9 to SNP17 of the test sample determined as described above, the relationship between the SNP bases of SNP1 to SNP8 and SNP9 to SNP17 and the tree species shown in Table 1 and Table 2, respectively. Based on this, it is possible to determine the parent species of the hybrid species to be inspected as in the example of identifying the tree species in the examples described later. For example, if the bases of SNP1 to SNP8 of the test sample are T / C, G / G, A / G, G / A, T / C, G / C, C / C, A / A, respectively, The tree species is estimated to be E. camaldulensis x E. deglputa. In addition, for example, Eucalyptus camaldulensis (E. camaldulensis) and Eucalyptus brushiana (E. brassiana) are difficult to distinguish using SNP1-SNP8, but SNP1-SNP8 and SNP9-SNP17 (for example, SNP15 And SNP17) can be used to identify them.
したがって、本発明には、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するための、SNPと樹種との関係を示す表1及び表2の組合せの使用方法も包含される。 Therefore, in the present invention, the combination of Table 1 and Table 2 showing the relationship between SNPs and tree species for identifying tree species of interspecific hybrids of Eucalyptus plants using a plurality of single nucleotide polymorphisms (SNPs). Are also included.
この表に記載されるSNP/樹種の関係を利用することによって、上記のとおり、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別することが可能になる。 By using the SNP / tree species relationship described in this table, it becomes possible to identify the species of interspecific hybrids of Eucalyptus plants as described above.
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。 The invention is further illustrated by the following examples, which are not intended to limit the scope of the invention.
［実施例１］
（ユーカリ属の樹種間で差のあるSNPの探索(1)）
ユーカリ属植物の全ゲノム中で近縁種間のSNPが存在すると考えられる2領域を中心に解析し、それらの領域に含まれる複数のSNPを組み合わせることにより、未知の樹種の識別の信頼性を高めることを目的とする。これらの2領域（すなわち、領域1(NS)及び領域2(ETS)）を、E. camaldulensisとE. globulusを例に以下に示す。
[Example 1]
(Search for SNPs that differ among Eucalyptus species (1))
Analyzes centered on two regions where SNPs between related species are thought to exist in the whole genome of Eucalyptus plants, and combining multiple SNPs contained in these regions increases the reliability of identification of unknown tree species The purpose is to increase. These two regions (namely, region 1 (NS) and region 2 (ETS)) are shown below using E. camaldulensis and E. globulus as an example.
ここで、領域1(NS)は、SNP1とSNP2が存在する領域であり、scaffold 522として知られるE. grandisのゲノムDNA配列（配列番号30）の約180000番目の塩基から約181000番目の塩基までの領域に相当する領域であり、領域2(ETS)は、SNP3〜SNP8の各SNPが存在する領域であり、該ゲノムDNA配列の約193500番目の塩基から約194000番目の塩基までの領域に相当する領域である。SNP1〜SNP8のゲノム上の各位置は、雑種によって幾分異なる場合もあると予想されるが、これらの領域は比較的保存性が高いため、当業者であれば、SNP周辺の配列との対比から各SNPの位置を特定することは容易である。 Here, region 1 (NS) is a region where SNP1 and SNP2 exist, from about 180000 base to about 181000 base of the genomic DNA sequence (SEQ ID NO: 30) of E. grandis known as scaffold 522 Region 2 (ETS) is a region where each SNP of SNP3 to SNP8 exists, and corresponds to a region from about 193500th base to about 194000th base of the genomic DNA sequence It is an area to do. Although each position on the genome of SNP1 to SNP8 is expected to be somewhat different depending on the hybrid, these regions are relatively highly conserved, so those skilled in the art can compare them with the sequences around SNP. It is easy to identify the position of each SNP.
材料
発見したSNPが個体間ではなく樹種間で差のあるものであることを確かめるため、それぞれの樹種で大量のサンプルについて調査した。解析に使用したサンプルは、表3に示した。
In order to confirm that the discovered SNPs differed not between individuals but between tree species, we investigated a large number of samples in each tree species. Samples used for the analysis are shown in Table 3.
方法
（ユーカリ属全DNAの抽出）
乾燥したユーカリ属の葉約50ngをジルコニアボールとともにマイクロチューブミキサーで粉砕し、東洋紡Plant genomeを用いてゲノムDNAを抽出した。得られたDNAは滅菌水に溶解した。
Method (extraction of Eucalyptus total DNA)
About 50 ng of dried Eucalyptus leaves were pulverized with a zirconia ball with a microtube mixer, and genomic DNA was extracted using Toyobo Plant genome. The obtained DNA was dissolved in sterilized water.
（標的領域の増幅）
得られたユーカリ属のゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅を行った。PCRはゲノムDNA50ng、プライマー（NS0/NS9, ETS4/ETS2）各終濃度0.3μM、KOD-Plus-ver.2（東洋紡） 1Unit、dATP、dTTP、dGTP、dCTP各200μM、MgCl21.5mMを加えた緩衝液50μl中で行った。反応条件はサーマルサイクラー（Dice、宝酒造社製）中で、鋳型DNAを94℃で2分間変性させ、その後、変性：94℃で10秒間、アニーリング：58℃で30秒間、伸長反応：68℃で1分間を1サイクルとして30サイクル繰り返した。
増幅及び配列決定に使用したプライマーは、次の表4及び表5に示したとおりである。
(Amplification of target region)
PCR amplification was performed using the obtained Eucalyptus genome DNA as a template. PCR was performed by adding 50 ng genomic DNA, primers (NS0 / NS9, ETS4 / ETS2) each final concentration 0.3 μM, KOD-Plus-ver.2 (Toyobo) 1 Unit, dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 μM each, and MgCl 2 1.5 mM Performed in 50 μl of buffer. The reaction conditions were a thermal cycler (Dice, Takara Shuzo Co., Ltd.), template DNA was denatured at 94 ° C for 2 minutes, and then denaturation: 94 ° C for 10 seconds, annealing: 58 ° C for 30 seconds, extension reaction: 68 ° C One cycle was repeated for 30 minutes.
The primers used for amplification and sequencing are as shown in Table 4 and Table 5 below.
上記の表4及び表5に示したプライマーの塩基配列は、配列番号22〜24のDNAの塩基配列に基づいて設計された。ここで、配列番号22は、Eucalyptus lehmanniiの18S rRNA(DNA)遺伝子の部分配列（登録番号AM235528）を示し、配列番号23は、Eucalyptus camaldulensisのexternal transcribed spacer（ETS）と18S rRNA(DNA)遺伝子の部分配列（登録番号DQ352528）を示し、配列番号24は、Eucalyptus perrinianaの葉緑体external transcribed spacer（ETS）の部分配列（登録番号AM489907）を示す。 The base sequences of the primers shown in Tables 4 and 5 above were designed based on the DNA base sequences of SEQ ID NOs: 22-24. Here, SEQ ID NO: 22 shows a partial sequence (registration number AM235528) of the 18S rRNA (DNA) gene of Eucalyptus lehmannii, and SEQ ID NO: 23 shows the external transcribed spacer (ETS) of Eucalyptus camaldulensis and the 18S rRNA (DNA) gene. A partial sequence (Registration No. DQ352528) is shown, and SEQ ID No. 24 shows a partial sequence (Registration No. AM489907) of Eucalyptus perriniana chloroplast external transcribed spacer (ETS).
（PCR産物の精製）
得られたPCR産物をQIAquick PCR purification kit（QIAGEN）を用いて精製した。
(Purification of PCR products)
The obtained PCR product was purified using a QIAquick PCR purification kit (QIAGEN).
（配列決定反応）
精製したサンプルを塩基長に応じて10〜20ng、プライマー（NS0/NS2/NS3/NS4/NS5/NS6/NS9、ETS2/ETS4）各終濃度0.16μM、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を用いてシークエンス反応を行った。反応条件はサーマルサイクラー（Dice、宝酒造社製）中で、鋳型ＤＮＡを96℃で1分間変性させたのち、変性：96℃で10秒間、アニーリング：50℃で5秒間、伸長反応：60℃で1分間を1サイクルとして25サイクル繰り返した。
(Sequencing reaction)
10-20 ng of purified sample according to base length, primers (NS0 / NS2 / NS3 / NS4 / NS5 / NS6 / NS9, ETS2 / ETS4) final concentration 0.16 μM, Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI ) Was used to perform a sequence reaction. Reaction conditions were as follows: in a thermal cycler (Dice, Takara Shuzo), after denaturing the template DNA at 96 ° C for 1 minute, denaturation: 96 ° C for 10 seconds, annealing: 50 ° C for 5 seconds, extension reaction: 60 ° C 25 cycles were repeated with 1 minute as one cycle.
（精製）
得られたサンプルをBig Dye Xterminator（ABI）を用いて精製した。
(Purification)
The obtained sample was purified using Big Dye Xterminator (ABI).
（配列決定）
Genetic Analyzer 3130xl（ABI）を用いて配列決定を行った。解析条件はBDx_FASTseq_POP7_BDv3を用いた。得られたデータは変異検出ソフトSeqScape（ABI）を用いて解析した。
(Sequencing)
Sequencing was performed using Genetic Analyzer 3130xl (ABI). Analysis conditions used BDx_FASTseq_POP7_BDv3. The obtained data was analyzed using mutation detection software SeqScape (ABI).
結果
それぞれ2領域を解析した結果、樹種間で差のあるSNPが7つ見つかった（上記表1）。これらのSNPでユーカリ属9樹種を5つのグループに分類できる可能性が高い（表6）。
Results As a result of analyzing each of the two regions, seven SNPs with differences between tree species were found (Table 1 above). These SNPs are likely to classify 9 Eucalyptus species into 5 groups (Table 6).
上記表1及び表6中、1〜8の数字はそれぞれSNP1〜SNP8を表す。また、例えばA/AGという表記は、A/A又はA/Gを意味する。また、同様に、GA/GAという表記は、G/G、G/A、A/G又はA/Aのいずれかを意味する。なお、領域1及び領域2の括弧内の「NS」は18S rRNA(DNA)領域、「ETS」は葉緑体external transcribed spacerをそれぞれ表す。 In Table 1 and Table 6, numbers 1 to 8 represent SNP1 to SNP8, respectively. For example, the notation A / AG means A / A or A / G. Similarly, the notation GA / GA means G / G, G / A, A / G, or A / A. “NS” in parentheses of region 1 and region 2 represents an 18S rRNA (DNA) region, and “ETS” represents a chloroplast external transcribed spacer.
SNP1〜SNP8のユーカリゲノム上の位置について、SNP1とSNP2はユーカリゲノムDNAの領域1に、SNP3〜SNP8はユーカリゲノムDNAの領域2にそれぞれ由来し、ユーカリ・グランディスのゲノム配列(http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/)（配列番号30）に基づくSNP1〜SNP8の位置は、上で説明したとおりである。 Regarding the positions of SNP1 to SNP8 on the eucalyptus genome, SNP1 and SNP2 are derived from region 1 of eucalyptus genomic DNA, and SNP3 to SNP8 are derived from region 2 of eucalyptus genomic DNA, respectively, and the genome sequence of Eucalyptus Grandis (http: // eucalyptusdb The positions of SNP1 to SNP8 based on .bi.up.ac.za /) (SEQ ID NO: 30) are as described above.
また、SNP1〜SNP8の各塩基をPCRによって特定するために、SNP1〜SNP8を含む領域を増幅するプライマー、及び増幅産物を配列決定するためのプライマーを次のように決定した。
SNP1: NS11/NS13又はNS11/NS2又はNS11/NS6で増幅し、NS11及びNS2を用いて配列決定する。
SNP2: NS11/NS13又はNS3/NS4又はNS11/NS6で増幅し、NS3及びNS4を用いて配列決定する。
SNP3〜SNP8：ETS4/ETS2又はETS18S/ETSMyrtFで増幅し、ETS2/ETS4、あるいは、ETS18S/ETSMyrtFで配列決定する。
In addition, in order to identify each base of SNP1 to SNP8 by PCR, a primer for amplifying a region containing SNP1 to SNP8 and a primer for sequencing the amplification product were determined as follows.
SNP1: amplified with NS11 / NS13 or NS11 / NS2 or NS11 / NS6 and sequenced using NS11 and NS2.
SNP2: Amplify with NS11 / NS13 or NS3 / NS4 or NS11 / NS6 and sequence with NS3 and NS4.
SNP3-SNP8: Amplified with ETS4 / ETS2 or ETS18S / ETSMyrtF and sequenced with ETS2 / ETS4 or ETS18S / ETSMyrtF.
［実施例２］
（ユーカリ属樹種の識別例）
供試材料
・ユーカリ・カマルドレンシスと考えられるユーカリ（DH2）の葉
・ユーカリ・カマルドレンシス×ユーカリ・デグルプタと考えられるユーカリ（K7）の葉
[Example 2]
(Example of identification of Eucalyptus species)
Eucalyptus (DH2) leaf considered to be the test material , eucalyptus, camaldolensis, eucalyptus (K2) leaf considered to be eucalyptus, chamaldrensis x eucalyptus, deglupta
方法
１）DNA抽出：乾燥した葉約20mgをMag - Extractor Plant Genome（TOYOBO）用いて抽出した。
２）PCR：KOD-plus-ver.2（TOYOBO）を用いて対象領域を増幅した。対象領域はNS, ETSの2領域でそれぞれに対応したプライマー（NS11-NS13 もしくは NS11-NS2/ NS3-NS4, ETS4-ETS2）を用いた。PCR条件は変性94℃10sec, アニール60℃30sec, 伸長68℃30-60sec, 30cycleとした。PCR後、マルチスクリーンμ96（Millipore）を用いて精製した。
３）配列決定：Genetic Analyzer 3130xl（ABI）を用いて配列解析を行った。配列決定プライマーはそれぞれSNP1:NS11/NS2, SNP2:NS3/NS4, SNP3-SNP8: ETS4/ETS2を用いた。
Method 1) DNA extraction: About 20 mg of dried leaves were extracted using Mag-Extractor Plant Genome (TOYOBO).
2) The target region was amplified using PCR: KOD-plus-ver.2 (TOYOBO). Primers (NS11-NS13 or NS11-NS2 / NS3-NS4, ETS4-ETS2) corresponding to the two regions NS and ETS were used. The PCR conditions were denaturation 94 ° C. 10 sec, annealing 60 ° C. 30 sec, extension 68 ° C. 30-60 sec, 30 cycles. After PCR, purification was performed using a multiscreen μ96 (Millipore).
3) Sequencing: Sequence analysis was performed using Genetic Analyzer 3130xl (ABI). SNP1: NS11 / NS2, SNP2: NS3 / NS4, SNP3-SNP8: ETS4 / ETS2 were used as sequencing primers, respectively.
結果
結果を表7（樹種「unkown DH2」及び「unkown K7」）に示す。
DH2は、ユーカリ・カマルドレンシスである可能性が高いことが確認できた。また、K7は、ユーカリ・カマルドレンシス×ユーカリ・デグルプタの雑種である可能性が高いことが確認できた。
The results are shown in Table 7 (tree species “unkown DH2” and “unkown K7”).
It was confirmed that DH2 is highly likely to be eucalyptus camaldrensis. In addition, it was confirmed that K7 is highly likely to be a hybrid of Eucalyptus / Camaldrense x Eucalyptus / Deglupta.
［実施例３］
（ユーカリ属の樹種間で差のあるSNPの探索(2)）
この実施例では、実施例1に記載の手法と同様の手法が使用された。
ユーカリ属植物9樹種（ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)、ユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、ユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）、ユーカリ・グランディス(E. grandis)、ユーカリ・サリグナ（E.saligna）、ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、ユーカリ・ペリータ(E. pellita)、及びユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)）について、それらの核ゲノムDNA中のCCR（Cinnamoyl-CoA Reductase）をコードする遺伝子領域の塩基配列を比較した。その結果、CCR遺伝子領域に9ヶ所のSNPが存在することを見出した。これら9つのSNPのそれぞれを、該遺伝子の5'側からSNP9, SNP10, SNP11, SNP12, SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17と称した。なお、例えばユーカリ・グロブラスのCCR遺伝子領域の配列は、例えばGenBankのデータベースから入手可能であり、AY656821の登録番号が付与されている。この配列（配列番号31）を利用して、配列が不明のユーカリ属植物のCCR遺伝子領域の増幅をPCR法で行い、該遺伝子領域を配列決定した。各樹種、少なくとも3個体以上についてCCR遺伝子領域の配列決定を行い、樹種内で共通している配列を決定した。さらに樹種間で変異があるSNPを決定した。なお、各個体、各樹種の塩基配列の比較はGENETYX Ver.9.0.5（株式会社 ゼネティックス）を用いて行った。
[Example 3]
(Search for SNPs that differ among Eucalyptus species (2))
In this example, a method similar to that described in Example 1 was used.
9 species of Eucalyptus plants (E. globulus, E. camaldulensis, E. brassiana, E. tereticornis, Eucalyptus grandis (E grandis), eucalyptus saligna (E.saligna), eucalyptus deglupta (E. deglputa), eucalyptus peritata (E. pellita), and eucalyptus europhylla (E. urophylla)) in their nuclear genomic DNA The nucleotide sequences of the gene regions encoding CCR (Cinnamoyl-CoA Reductase) were compared. As a result, it was found that nine SNPs exist in the CCR gene region. Each of these nine SNPs was called SNP9, SNP10, SNP11, SNP12, SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 from the 5 ′ side of the gene. For example, the sequence of the CCR gene region of Eucalyptus globulus can be obtained from the GenBank database, for example, and is assigned the registration number of AY656821. Using this sequence (SEQ ID NO: 31), the CCR gene region of the Eucalyptus plant whose sequence was unknown was amplified by PCR, and the gene region was sequenced. The sequence of the CCR gene region was determined for each tree species and at least 3 individuals, and the sequences common within the tree species were determined. Furthermore, SNPs with mutations between tree species were determined. In addition, the comparison of the base sequence of each individual and each tree type was performed using GENETYX Ver.9.0.5 (Genetics Co., Ltd.).
上記のSNP9〜SNP17の1又は2つ以上のSNPを含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーは次のとおりである。プライマーの位置関係は図1に示されている。 Primers for amplifying the region containing one or more SNPs of SNP9 to SNP17 described above by PCR are as follows. The positional relationship of the primers is shown in FIG.
また、増幅用プライマー及び塩基配列（配列番号）は、P220（配列番号22）、CCR02（配列番号23）、CCR001（配列番号24）、P225（配列番号25）、P223（配列番号26）、P221（配列番号27）、P219（配列番号28）、P217（配列番号29）である。 The amplification primer and the base sequence (SEQ ID NO :) are P220 (SEQ ID NO: 22), CCR02 (SEQ ID NO: 23), CCR001 (SEQ ID NO: 24), P225 (SEQ ID NO: 25), P223 (SEQ ID NO: 26), P221. (SEQ ID NO: 27), P219 (SEQ ID NO: 28), P217 (SEQ ID NO: 29).
これらの配列、及びプライマーの組合せ（フォワード(F)とリバース(R)）は、表8に示すとおりである。このような組合せによってSNP9〜SNP17のすべてを増幅することができる。 These sequences and primer combinations (forward (F) and reverse (R)) are as shown in Table 8. With such a combination, all of SNP9 to SNP17 can be amplified.
増幅産物は、配列決定プライマーを用いて配列決定され、各SNPの塩基が特定された。その結果は、表2（上記）に示されたとおりである。SNP9〜SNP17によって、ユーカリ属9樹種を4つのグループに分けることができた（表9）。さらに実施例1で決定されたSNP1〜SNP8と、本実施例で決定されたSNP9〜SNP17とを組合せて雑種の各SNPのアレル塩基を対比することによって、上記9樹種を8つのグループに分けることが可能であった（表9）。 Amplification products were sequenced using sequencing primers and the base of each SNP was identified. The results are as shown in Table 2 (above). SNP9 to SNP17 allowed 9 Eucalyptus species to be divided into 4 groups (Table 9). Further, the above 9 tree species are divided into 8 groups by combining SNP1 to SNP8 determined in Example 1 and SNP9 to SNP17 determined in this Example and comparing allele bases of each hybrid SNP. Was possible (Table 9).
［実施例４］
（雑種の識別例）
(1) E.cam x E.gloの識別例
実施例2と同様に領域1（NS）のSNPと領域2（ETS）のSNPを利用することでグループA（グロブラス）とグループBの雑種であることが判るが、樹種の特定は出来なかった。しかし、実施例3と同様にCCR（この場合、CCR4、5、6、7）のSNPを利用することで、グロブラスとカマルドレンシスの雑種であることが特定できた（表10，11）。
[Example 4]
(Example of hybrid identification)
(1) Identification example of E.cam x E.glo By using the SNP of region 1 (NS) and SNP of region 2 (ETS) in the same way as in Example 2, the hybrid of group A (globula) and group B It turns out that there is, but I could not identify the tree species. However, by using the SNP of CCR (in this case, CCR4, 5, 6, 7) as in Example 3, it was possible to identify a hybrid of globulas and camaldrensis (Tables 10 and 11).
(2) E.gra x E.camの識別例
実施例2と同様に領域1のSNPと領域2のSNPを利用することでグループBとグループCの雑種であることが判る。しかし実施例3と同様にCCR（この場合、CCR1、4、5、6、7、8）のSNPを利用することで、グランディスとカマルドレンシスの雑種であることが特定できた（表10，11）。
(2) Identification Example of E.gra x E.cam As in Example 2, it can be seen that it is a hybrid of Group B and Group C by using the SNP in Region 1 and the SNP in Region 2. However, as in Example 3, by using the SNP of CCR (in this case, CCR1, 4, 5, 6, 7, 8), it was possible to identify a hybrid of Grandis and Camaldrensis (Table 10, 11).
本発明により、ユーカリ属植物の種間雑種を正確にかつ容易に識別することが可能になるため、ユーカリ天然交雑種のなかの優良品種の選抜が容易に行えるようになり、林業、紙パルプなどの産業で利用価値が高いと考えられる。 According to the present invention, it becomes possible to accurately and easily identify interspecific hybrids of Eucalyptus plants, making it easy to select excellent varieties among natural eucalyptus hybrids, such as forestry, paper pulp, etc. It is considered that the utility value is high in other industries.
配列番号1〜29：プライマー Sequence number 1-29: Primer
Claims (12)
(a) SN領域内のSNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(b)SN領域内のSNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ、及び/又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、及び/又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(c) ETS領域内のSNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ、及び/又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(d)CCR領域内のSNP9について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(e)CCR領域内のSNP10について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(f)CCR領域内のSNP11について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(g)CCR領域内のSNP12について、増幅プライマーがPP20（配列番号22）/P223（配列番号26）の組み合わせ又はCCR002（配列番号23）/P221（配列番号27）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(h)CCR領域内のSNP13について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(i)CCR領域内のSNP14について、増幅プライマーがCCR001（配列番号24）/P219（配列番号28）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(j)CCR領域内のSNP15について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(k)CCR領域内のSNP16について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；並びに、
(l)CCR領域内のSNP17について、増幅プライマーがP225（配列番号25）/P217（配列番号29）の組み合わせであり、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
を含む、請求項10に記載のキット。 The PCR primer set includes the following (a) to (l):
(a) For SNP1 in the SN region, amplification primers are NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) combination and / or NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS2 (SEQ ID NO: 2) combination, and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: May be;
(b) For SNP2 in the SN region, the amplification primer is a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS13 (SEQ ID NO: 14) and / or a combination of NS3 (SEQ ID NO: 3) / NS4 (SEQ ID NO: 4), and / or Or a combination of NS11 (SEQ ID NO: 12) / NS6 (SEQ ID NO: 6), wherein the primer of each combination is independently a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of the SEQ ID NO: As well as;
(c) For each of SNP3 to SNP8 in the ETS region, the amplification primer is a combination of ETS4 (SEQ ID NO: 21) / ETS2 (SEQ ID NO: 19) and / or ETS18S (SEQ ID NO: 16) / ETSMyrtF (SEQ ID NO: 17). A combination, provided that the primer of each combination may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity to each base sequence of SEQ ID NO:
(d) For SNP9 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(e) For SNP10 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(f) For SNP11 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(g) For SNP12 in the CCR region, the amplification primer is a combination of PP20 (SEQ ID NO: 22) / P223 (SEQ ID NO: 26) or a combination of CCR002 (SEQ ID NO: 23) / P221 (SEQ ID NO: 27), but each combination The primer may independently be a primer comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence of the SEQ ID NO:
(h) For SNP13 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(i) For SNP14 in the CCR region, the amplification primer is a combination of CCR001 (SEQ ID NO: 24) / P219 (SEQ ID NO: 28), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(j) For SNP15 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
(k) For SNP16 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independently of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer consisting of a base sequence having at least% identity;
(l) For SNP17 in the CCR region, the amplification primer is a combination of P225 (SEQ ID NO: 25) / P217 (SEQ ID NO: 29), provided that the primer of each combination is independent of each nucleotide sequence of the above SEQ ID NO: 90 May be a primer comprising a base sequence having at least% identity;
The kit according to claim 10, comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011135402A JP5799600B2 (en) | 2011-06-17 | 2011-06-17 | Species identification method of Eucalyptus hybrids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011135402A JP5799600B2 (en) | 2011-06-17 | 2011-06-17 | Species identification method of Eucalyptus hybrids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013000066A true JP2013000066A (en) | 2013-01-07 |
| JP5799600B2 JP5799600B2 (en) | 2015-10-28 |
Family
ID=47669328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011135402A Expired - Fee Related JP5799600B2 (en) | 2011-06-17 | 2011-06-17 | Species identification method of Eucalyptus hybrids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5799600B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706265A (en) * | 2019-03-11 | 2019-05-03 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | A kind of SNP combination and its application in Eucalyptus clone identification |
| CN114097519A (en) * | 2021-12-06 | 2022-03-01 | 丽水市森林资源保护管理总站 | Chinese torreya planting method |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107385052B (en) * | 2017-08-08 | 2020-10-30 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | STR primer for identifying clone of eucalyptus and application thereof |
| CN107354222B (en) * | 2017-08-30 | 2020-10-30 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | STR primer, PCR kit and method for identifying clone of eucalyptus |
-
2011
- 2011-06-17 JP JP2011135402A patent/JP5799600B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6015005356; 三重大学生物資源学部演習林報告 第２１号, 199703, 第５７-６１頁 * |
| JPN6015005358; Ｌｉｇｎｉｎ ａｎｄ Ｌｉｇｎａｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ , 1998, ｐ． ６５-７５ * |
| JPN6015005359; 第６１回日本木材学会大会研究発表要旨集 , 201103, Ｂ１９-Ｐ-ＡＭ０７ * |
| JPN6015005361; 紙パ技協誌 第６３巻第５号, 200905, 第２-７頁 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706265A (en) * | 2019-03-11 | 2019-05-03 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | A kind of SNP combination and its application in Eucalyptus clone identification |
| CN109706265B (en) * | 2019-03-11 | 2022-04-01 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | SNP combination and application thereof in clone identification of eucalyptus |
| CN114097519A (en) * | 2021-12-06 | 2022-03-01 | 丽水市森林资源保护管理总站 | Chinese torreya planting method |
| CN114097519B (en) * | 2021-12-06 | 2022-09-13 | 丽水市森林资源保护管理总站 | Chinese torreya planting method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5799600B2 (en) | 2015-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101923647B1 (en) | SNP markers for discrimination of Jubilee type or Crimson type watermelon cultivar | |
| KR101883117B1 (en) | SNP marker for selecting tomato cultivars resistant to tomato Bacterial wilt and use thereof | |
| KR102198566B1 (en) | Tetra primers ARMS-PCR molecular marker for discriminating cultivars of sweet potato and uses thereof | |
| KR101409012B1 (en) | Specific primers for Pines distinction, analysis kit using its primers, and Pines distinciton method using thereof | |
| KR20180077873A (en) | SNP markers for selection of marker-assisted backcross in watermelon | |
| KR101979218B1 (en) | Composition for determining bud mutation cultivar of Fuji apple | |
| KR101970264B1 (en) | CAPS marker for discriminating bacterial wilt-resistant pepper cultivar and uses thereof | |
| JP5799600B2 (en) | Species identification method of Eucalyptus hybrids | |
| Sun et al. | A simple and rapid technique for the authentication of the ginseng cultivar, Yunpoong, using an SNP marker in a large sample of ginseng leaves | |
| WO2003104491A1 (en) | Method of distinguishing rice varieties | |
| KR102052428B1 (en) | SSR molecular markers for discriminating Korean wild grape accessions and uses thereof | |
| KR102192666B1 (en) | SNP marker for identification of yellow-fleshed peach cultivar | |
| KR20170024388A (en) | Markers for the differentiation of Polygonum multiflorum Thumberg, Cynanchum wilfordii Max. Hemsl, Cynanchum auriculatum Royle ex Wight | |
| KR101229271B1 (en) | Method of discriminating Korean native Prunus mume cultivars using SSR markers | |
| KR101940286B1 (en) | Primer Set for Identifying Maternal origin of Ilex x wandoensis and Uses Thereof | |
| KR102654961B1 (en) | Marker composition for identification of cucurbita spp. and identification method using the same | |
| KR102458440B1 (en) | Primer set for selecting Phytophthora blight resistant pepper and selection method using the same primer set | |
| KR20150056407A (en) | SNP molecular markers associated with distinction of grape understock variety and uses thereof | |
| KR101745071B1 (en) | SNP marker for discriminating resistance to leaf mold and use thereof | |
| KR101481734B1 (en) | Microsatellite marker of Korean Astragalus mongholicus and primer set for amplifying the same | |
| JP2011130741A (en) | Method for identifying species of interspecies hybrid of eucalyptus | |
| CN107345252B (en) | Primer combination and kit for identifying 96 of flue-cured tobacco Qin tobacco, application and identification method | |
| KR101955072B1 (en) | Snp markers for discrimination of raphanus sativus | |
| KR102273447B1 (en) | A set of SNP molecular markers for discriminating radish accessions using KASP assay and uses thereof | |
| KR102226016B1 (en) | Marker for identification of chloroplast derived from Ilex integra and Primer set for identification of Ilex x wandoensis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150210 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150410 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150728 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150810 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5799600 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |