JP2012523818A - インスリン分泌増強剤のスクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
Description
directly activated by cAMP 2:cAMPにより活性化される,small Gタンパク質Rap1のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の一つである。〕が介在するものが知られている(非特許文献4〜6)。cAMPが直接結合することによって活性化されたEpac2は,Rap1に対するグアニンヌクレオチド交換活性を有し,この活性によりRap1を活性化することで,インスリン分泌を促進させる。
1.互いに異なる波長の蛍光を発する2種の異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする2種の異なるDNAと,Epac2をコードするDNAとを,イン・フレーム(in-frame)で融合させてなる,蛍光標識Epac2をコードするDNA。
2.該2種の異なる蛍光タンパク質がシアン蛍光タンパク質及びイエロー蛍光タンパク質である,上記1のDNA。
3.該シアン蛍光タンパク質をコードするDNAと該イエロー蛍光タンパク質をコードするDNAを,Epac2をコードするDNAの,それぞれ5’末端側及び3’末端側に融合させてなるものである,上記2のDNA。
4.該シアン蛍光タンパク質がECFPであり該イエロー蛍光タンパク質がEYFPである,上記2又は3のDNA。
5.上記1ないし4の何れかのDNAが組み込まれてなる発現ベクター。
6.哺乳動物細胞用である,上記5の発現ベクター。
7.上記5または6の発現ベクターを保持する形質転換体である細胞。
8.哺乳動物細胞である,上記7の細胞。
9.SUR1遺伝子を発現しないことを特徴とする,上記8の哺乳動物細胞。
10.COS細胞である,上記9の哺乳動物細胞。
11.Epac2とこれに融合させた2種の異なる蛍光タンパク質とを含んでなる融合タンパク質である蛍光標識Epac2であって,該2種の異なる蛍光タンパク質が互いに異なる波長の蛍光を発するものである,蛍光標識Epac2。
12.上記7ないし10の何れかの細胞内で該発現ベクターにより産生させることにより得られる,該2種の異なる蛍光タンパク質とEpac2とを含んでなる融合タンパク質である,蛍光標識Epac2。
13.インスリン分泌増強剤の候補物質を準備し,上記7ないし10の何れかの細胞に該候補物質の各々を接触させ,該候補物質との接触の前後において該細胞に該2種の異なる蛍光タンパク質のうち短波長側の蛍光タンパク質に対する励起光を照射して,該細胞内の該蛍光標識Epac2に含まれる該2種の異なる蛍光タンパク質から発せられた蛍光の強度をそれぞれ測定し,該細胞との該候補物質の接触の前対後での該2種の異なる蛍光の強度比における変化を検出し,変化を生じさせた候補物質をインスリン分泌増強剤として選択することを含んでなる,インスリン分泌増強剤のスクリーニング方法。
14.インスリン分泌増強剤の候補物質を準備し,上記11又は12の蛍光標識Epac2に該候補物質の各々を接触させ,該候補物質との接触の前後において該2種の異なる蛍光タンパク質のうち短波長側の蛍光タンパク質に対する励起光を照射して該蛍光標識Epac2に含まれる該2種の異なる蛍光タンパク質から発せられた蛍光の強度をそれぞれ測定し,該候補物質との接触の前対後での該2種の異なる蛍光の強度比における変化を検出し,変化を生じさせた候補物質をインスリン分泌増強剤として選択することを含んでなる,インスリン分泌増強剤のスクリーニング方法。
Plechstrin (DEP)ドメイン,Ras-exchanger モチーフ (REM)ドメイン,カルボキシル末端のGEFドメイン,アミノ末端のcAMP結合ドメイン,Rasと相互作用するRas-association (RA)ドメインを含む,Epac2の部分アミノ酸配列からなるペプチドも含む。
グリベンクラミドはALEXIS社(米国サンジエゴ)から購入した。トルブタミド,クロルプロパミド,アセトヘキサミド,グリピジド,ナテグリニドおよび12−O−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート(TPA)はSIGMA社(米国セントルイス)から購入した。グリクラジドはLKTラボラトリー社(米国セントポール)から購入した。トリチウム標識グリベンクラミドはPerkinElmer社(米国ウォルサム)から購入した。
Epac2欠損マウスは,Shibasaki T.et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 104, 19333-9 (2007) に開示された手法により作成した。すべての動物実験において,コントロール動物として野生型マウス(C57BL/6)を使用した。
Epac2欠損膵β細胞は,Shibasaki T.Et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 19333-9 (2007) に開示された手法に従い,Epac2欠損マウスとヒトインスリン遺伝子プロモーターの制御下にSV40ラージT抗原を発現するIT6マウスとを交雑して育種したマウスから単離することにより得た。IT6マウスの製造方法は,Miyazaki J, et al., Endocrinology, 127, 126-132 (1990) に記載されている。また,MIN6細胞は,特開2002-125661号公報に開示された手法により作成した。
マウス野生型Epac2発現ベクター(pFLAG-Epac2:図1)及びマウス変異型Epac2発現ベクター(pFLAG-Epac2 G114E G422D:図2)としては,Ozaki N. et.al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2, 805-811(非特許文献13)に開示されているものを用いた。マウス野生型Epac2のcDNA(上記配列番号1)中,先頭の14塩基及び終止コドン「tag」を除いた末尾12塩基は,PCRに用いたプライマー配列である。
上記のマウスEpac2発現ベクター(pFLAG-Epac2)を鋳型として,プライマーBglII-Epac2(5’-agatctatggtcgctgcgca-3’:配列番号9)とプライマーEpac2-EcoRI(5’-gaattctggccttcgagg-3’:配列番号10)をプライマーとしてPCR反応を行い,マウスEpac2のcDNAを増幅した。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,68℃:2分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,50℃:30秒,68℃:3分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させた。増幅したマウス野生型Epac2 のcDNA(上記配列番号1)をBglIIとEcoRIで消化した後,BglIIとEcoRI で消化したシアン蛍光タンパク質(ECFP)発現ベクターpECFP-C1(図4,Clontech)(そのマルチクローニングサイトのDNA配列を配列番号11に示す。)に挿入した。これをpECFP−マウスEpac2発現ベクターとした。シアン蛍光発現タンパク質(ECFP)のcDNA配列を配列番号12に,アミノ酸配列を配列番号13に,それぞれ示す。
イエロー蛍光タンパク質発現ベクターpEYFP-N1 (図5,Clontech)(本発明ベクターのマルチクローニングサイトのDNA配列を配列番号14に示す。)を鋳型として,プライマーGFP-fw(5’-atggtgagcaagggcg-3’:配列番号15)とプライマーGFP-rv(5’-cttgtacagctcgtccat-3’:配列番号16)を用いてPCR反応を行い,イエロー蛍光タンパク質であるEYFPのcDNAを増幅させた。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,72℃:1分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,52℃:30秒,68℃:1分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させた。次いで,PCR反応で得られたEYFPのcDNAを鋳型として,プライマーEcoRI-EYFP(5’-gaattcatggtgagcaagg-3’:配列番号17)とプライマーEYFP-EcoRI(5’-gaattccttgtacagctcgt-3’:配列番号18) をプライマーとしてPCR反応を行い,EcoRIサイト付加EYFP
cDNAを増幅した。イエロー蛍光タンパク質(EYFP)のcDNA配列を配列番号19に,アミノ酸配列を配列番号20に,それぞれ示す。当該cDNAにおいて,先頭の13塩基,及び終止コドン「tga」を除いた末尾14塩基は,プライマー配列である。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,72℃:1分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,52℃:30秒,68℃:1分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させた。増幅したEcoRIサイト付加EYFP cDNAをEcoRIで消化し,EcoRI
で消化した前記pECFP−マウスEpac2発現ベクターに挿入した。これを蛍光標識マウスEpac2発現ベクターとした。
上記変異型マウスEpac2発現ベクター(pFLAG-Epac2 G114E G422D)を鋳型として,プライマーBglII-Epac2(5’-agatctatggtcgctgcgca-3’:上記配列番号9)とプライマーEpac2-EcoRI(5’-gaattctggccttcgagg-3’:上記配列番号10)を用いてPCR反応を行い,マウスEpac2のcDNAを増幅した。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,68℃:2分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,50℃:30秒,68℃:3分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させた。増幅したマウスEpac2 のcDNAをBglIIとEcoRIで消化した後,pECFP-C1ベクター(Clontech)に挿入した。こうして得られたベクターを,変異型pECFP−マウスEpac2発現ベクターとした。
上記pEYFP-N1 ベクター(Clontech)を鋳型として,プライマーGFP-fw(5’-atggtgagcaagggcg-3’:上記配列番号15)とプライマーGFP-rv(5’-cttgtacagctcgtccat-3’:上記配列番号16) を用いてPCR反応を行い,イエロー蛍光タンパク質であるEYFPのcDNAを増幅した。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,72℃:1分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,52℃:30秒,68℃:1分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させた。次いで,PCR反応で得られたEYFPのcDNAを鋳型として,プライマーEcoRI-EYFP(5’-gaattcatggtgagcaagg-3’:上記配列番号17)とプライマーEYFP-EcoRI(5’-gaattccttgtacagctcgt-3’:上記配列番号18) を用いてPCR反応を行い,EcoRIサイト付加EYFP
cDNAを増幅した。PCR反応は,PfuDNAポリメラーゼを用いて[95℃:30秒,55℃:30秒,72℃:1分]で10サイクルした後,[94℃:30秒,52℃:30秒,68℃:1分]で30サイクルし,最後に68℃で5分間反応させることにより行った。増幅したEcoRIサイト付加EYFP cDNAをEcoRIで消化し,EcoRI
で消化した変異型pECFP−マウスEpac2発現ベクターに挿入した。こうして得られたベクターを,変異型蛍光標識マウスEpac2発現ベクターとした。
MIN6細胞とCOS-1細胞の培養は,10%の熱不活化ウシ胎児血清を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を用いて,5%CO2存在下で行った。細胞の形質転換はFuGENE6トランスフェクション試薬(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社,スイス国バーゼル)を用いて行った。
測定日の2日前に細胞を蛍光標識マウスEpac2発現ベクターで形質転換させて培養した。測定日の1日前に直径25mmのガラス製培養皿に細胞を移し培養を継続した。形質転換してから約48時間後に,培養液をHEPES-KRB緩衝液(NaClを133.4mM ,KClを4.7mM,KH2PO4を1.2mM,MgSO4を1.2mM,CaCl2を2.5mM,NaHCO3を5.0mM,グルコースを2.8mM,BSAを0.2%含む20mM HEPES(pH7.4)緩衝液)に置き換えた。細胞をUPlanSApo対物レンズ(100×oil/1.40NA)を取り付けた共焦点顕微鏡(FV1000,オリンパス社)を用いて観察してレンズの焦点を細胞に合わせ,これに波長440nmの励起光を440nmLDレーザー(FV5-LDPSU,オリンパス社)を用いて0.5%の出力で照射した。このとき励起された蛍光標識マウスEpac2から放射される蛍光を,480DF30(480nm光用)と535DF25(535nm光用)の2種類の蛍光フィルターを用いて二重蛍光の画像として5秒毎に観察し,放射される蛍光の動態解析を行った。動態解析の結果は,まず各測定時における535nmと480nm蛍光の強度比R(535nmでの強度/480nmでの強度の比)を算出し,次いでこれを初期値R0(薬剤を添加する前の535nmでの強度/480nmでの強度の比)で除した値(R/R0値)として表した。なお全ての観察は室温で行った。
COS-1細胞をマウスEpac2発現ベクターで形質転換させた。形質転換した2日後に,細胞を緩衝液(NaClを119mM,KClを4.7mM,CaCl2を2.5mM, KH2PO4を1.2mM,MgSO4を1.2mM,NaHCO3を5.0mM,含む20mM HEPES(pH7.4)緩衝液)で2回洗浄し,これを同緩衝液中に2.5〜5.2×105個/400μLの濃度で懸濁させた。細胞を400μLずつ分注し室温で1時間トリチウム標識グリベンクラミドを加えて静置した。このとき,同時に非放射ラベルのグリベンクラミドまたはトルブタミド等を加えて,トリチウム標識グリベンクラミドと競合させた。COS-1細胞を破壊し,COS-1細胞内のタンパク質と結合したトリチウム標識グリベンクラミドを,真空ろ過によりワットマンGF/C膜(ワットマン社,英国メイドストーン)に吸着させた。膜を4回氷冷した同緩衝液で洗浄し,液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
GTP-RAP1プルダウンアッセイは,Shibasaki T.et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 104, 19333-9 (2007)に記載された手法により実施した。すなわち,予めHEPES-KRB緩衝液中に30分間放置した細胞を,所望の薬剤と2.8mMのグルコースを含むHEPES-KRB緩衝液で更に15分間培養した。次に,細胞を破壊して得た細胞溶解物にGST-RalGDS-RIDを結合させたグルタチオン樹脂(SIGMA社)を加えた。4℃で90分間インキュベートした後,同樹脂を遠心分離し,これをHEPES-KRB緩衝液で数回洗浄した後,SDS−PAGEゲル電気泳動に供した。SDS−PAGEゲル電気泳動後,ウェスタンブロット法によりタンパク質をPVDF膜に転写し,抗RAP1抗体(米国サンタクルズバイオテクノロジー社)を用いて膜状に転写されたRap1を検出した。
マウス膵島を野生型マウス(C57BL/6)またはEpac2欠損マウスから単離し,2日間培養した。マウス膵島を2.8mMのグルコースを含むHEPES-KRB緩衝液中で30分間放置した。次いで96ウェルプレートに,1ウェル当たり大きさの揃ったマウス膵島が5個含まれるように分注し,所望の薬剤と2.8mMのグルコースを含む100μLのHEPES-KRB緩衝液で15分間培養した。培地中に放出されたインスリン量と細胞内のインスリン量をインスリンアッセイキット(メディカルバイオロジカルラボラトリー社)を用いて測定した。インスリン分泌量は細胞内インスリン量で標準化して表した。
体重1kg当たり1.5gの量のグルコースを単独で,あるいは体重1kg当たり1.5gの量のグルコースとともに体重1kg当たり100mgの量のトルブタミドを16時間絶食させたマウスに経口投与した。末梢血を所定の時間に採取し,血清中のインスリン濃度と血中グルコース濃度を,それぞれELISAキット(モリナガ社)とAntsense IIIグルコース分析装置(バイエル薬品)を用いて測定した。
蛍光標識マウスEpac2発現ベクターで形質転換させたCOS-1細胞(蛍光標識マウスEpac2発現COS-1細胞)をcAMPの類似体である8-Bromo-cAMPを1mMまたは10mM含む緩衝液中で6分間 FRET法で観察したところ,R/R0値の濃度依存的な低下が認められた(図7a)。R/R0値の低下は,8-Bromo-cAMPの蛍光標識マウスEpac2への結合により,蛍光標識マウスEpac2の立体構造が変化し,その結果FRETが変化したことによると考えられた。一方,cAMP結合部位を破壊した変異体蛍光標識マウスEpac2発現ベクターで形質転換させたCOS-1細胞を同様にして観察した場合には,R/R0値は変化しなかった(図7b)。これは,変異体蛍光標識マウスEpac2には8-Bromo-cAMPが結合できないので変異体蛍光標識マウスEpac2の立体構造が変化せず,FRETが変化しなかったためと考えられた。また,8-Bromo-cAMPを添加せずに培養した場合は,いずれの場合もR/R0値に変化はなかった(図7a,図7b)。
蛍光標識マウスEpac2発現ベクターで形質転換させたMIN6細胞を,SU剤であるトルブタミドまたはグリベンクラミドの存在下でFRET法により観察したところ,R/R0値の濃度依存的な低下が認められた(図8)。SU剤はKATPチャネルの構成因子のSUR1に結合してその機能が発揮することが知られていることから,ここで観察されたR/R0値の変化は,SUR1を介した間接的な影響によるものである可能性を否定できなかった。
そこで,SUR1を発現しない蛍光標識マウスEpac2発現COS-1細胞を各種SU剤存在下でFRET法で観察したところ,トルブタミド,グリベンクラミド,クロルプロパミド,アセトヘキサミド,グリピジドの存在下で,R/R0値の低下が認められた(図9a〜e)。これらの結果は,これらのSU剤がSUR1を介さずに直接Epac2に作用してその高次構造を変化させることを示唆した。このことはEpac2がSU剤の標的であるとは全く予想されていなかったことから,まさに驚くべきことである。一方,SU剤の中でも,グリクラジド,ナテグリニドの存在下では,R/R0値の変化は観察されなかった。このことは,これらの薬剤は直接Epac2に作用してその高次構造を変化させることがないことを示唆している(図9f〜g)。以上の結果は,Epac2がインスリン分泌に関わるシグナル伝達物質であることから,SU剤には,その作用機序にEpac2を介するものとそうでないものがあることを示唆するものである。
Epac2はGEF活性を有し,Rap1をGTPとの結合によりGTP結合型Rap1とすることによってRap1を活性化する。この反応はβ細胞におけるインスリン分泌のためのシグナル伝達の一部を構成する。そこで,β細胞由来のMIN6細胞を用いて,Rap1がSU剤によって活性化されるか否かについて調べた。Rap1の活性化は,GTP-RAP1プルダウンアッセイ法を用いてGTP結合型Rap1を定量することにより測定した。陽性コントロールとして,Rap1活性化物質の8-Bromo-cAMPとTPAを用いた。
膵島を用いたインスリン分泌実験により,Epac2を介したインスリン分泌へのSU剤の影響を調べた。まず,野生型マウスとEpac2欠損マウスから得られた膵島を,グルコースで刺激し,分泌されるインスリン量を測定した。その結果,両者間でインスリンの分泌量に有意な差は認められなかった(図13a)。KClで刺激した場合も同様であった(図13a)。次に,野生型マウスとEpac2欠損マウスから得られた膵島を,FRET法でR/R0値を低下させた(100 μM)トルブタミドまたは(10nM)グリベンクラミドで刺激し,同様に分泌されるインスリン量を測定した。その結果,これらの薬剤で刺激した場合,野生型マウスの膵島と比較して,Epac2欠損マウスの膵島でインスリンの分泌量が著しい低値を示した(図13b,c)。一方,FRET法でR/R0値に変化を与えなかった(10nM)グリクラジドでは,両者間で有意な差はなかった(図13d)。これらの結果は,FRET法でR/R0値を低下させるSU剤の完全な薬効の発揮には,Epac2を介した経路が必要であることを示した。
配列番号3は,ヒト野生型Epac2
配列番号5は,pFLAT-CMV-2の全長DNA
配列番号6は,pFLAT-CMV-2のマルチクローニングサイト,
配列番号7は,マウス変異型Epac2 (Epac2 G114E G422D)
配列番号9は,プライマーBglII-Epac2
配列番号10は,プライマーEpac2-EcoRI
配列番号11は,pECFP-C1のマルチクローニングサイト
配列番号12は,ECFP
配列番号13は,合成構築物
配列番号14は,pEYFP-N1のマルチクローニングサイト
配列番号15は,プライマーGFP-fw
配列番号16は,プライマーGFP-rv
配列番号17は,プライマーEcoRI-EYFP
配列番号18は,プライマーEYFP-EcoRI
配列番号19は, EYFP
配列番号20は,合成構築物
Claims (14)
- 互いに異なる波長の蛍光を発する2種の異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする2種の異なるDNAと,Epac2をコードするDNAとをイン・フレームで融合させてなる,蛍光標識Epac2をコードするDNA。
- 該2種の異なる蛍光タンパク質がシアン蛍光タンパク質及びイエロー蛍光タンパク質である,請求項1のDNA。
- 該シアン蛍光タンパク質をコードするDNAと該イエロー蛍光タンパク質をコードするDNAを,Epac2をコードするDNAの,それぞれ5’末端側及び3’末端側に融合させてなるものである,請求項2のDNA。
- 該シアン蛍光タンパク質がECFPであり該イエロー蛍光タンパク質がEYFPである,請求項2又は3のDNA。
- 請求項1ないし4の何れかのDNAが組み込まれてなる発現ベクター。
- 哺乳動物細胞用である,請求項5の発現ベクター。
- 請求項5または6の発現ベクターを保持する形質転換体である細胞。
- 哺乳動物細胞である,請求項7の細胞。
- SUR1遺伝子を発現しないことを特徴とする,請求項8の哺乳動物細胞。
- COS細胞である,請求項9の哺乳動物細胞。
- Epac2とこれに融合させた2種の異なる蛍光タンパク質とを含んでなる融合タンパク質である蛍光標識Epac2であって,該2種の異なる蛍光タンパク質が互いに異なる波長の蛍光を発するものである,蛍光標識Epac2。
- 請求項7ないし10の何れかの細胞内で該発現ベクターにより産生させることにより得られる,該2種の異なる蛍光タンパク質とEpac2とを含んでなる融合タンパク質である,蛍光標識Epac2。
- インスリン分泌増強剤の候補物質を準備し,請求項7ないし10の何れかの細胞に該候補物質の各々を接触させ,該候補物質との接触の前後において該細胞に該2種の異なる蛍光タンパク質のうち短波長側の蛍光タンパク質に対する励起光を照射して,該細胞内の該蛍光標識Epac2に含まれる該2種の異なる蛍光タンパク質から発せられた蛍光の強度をそれぞれ測定し,該細胞との該候補物質の接触の前対後での該2種の異なる蛍光の強度比における変化を検出し,変化を生じさせた候補物資をインスリン分泌増強剤として選択することを含んでなる,インスリン分泌増強剤のスクリーニング方法。
- インスリン分泌増強剤の候補物質を準備し,請求項11又は12の蛍光標識Epac2に該候補物質の各々を接触させ,該候補物質との接触の前後において該2種の異なる蛍光タンパク質のうち短波長側の蛍光タンパク質に対する励起光を照射して該蛍光標識Epac2に含まれる該2種の異なる蛍光タンパク質から発せられた蛍光の強度をそれぞれ測定し,該候補物質との接触の前対後での該2種の異なる蛍光の強度比における変化を検出し,変化を生じさせた候補物質をインスリン分泌増強剤として選択することを含んでなる,インスリン分泌増強剤のスクリーニング方法。
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