CN102395677A - 筛选胰岛素分泌增强剂的方法 - Google Patents

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Abstract

揭示了一种筛选胰岛素分泌加强剂的新方法以及进行该筛选的工具该工具包括编码荧光标记的Epac2的DNA，包含编码发出波长彼此不同的荧光的两种不同荧光蛋白的两种不同DNA和编码Epac2的DNA，这些DNA同框融合，和转化该DNA的细胞。还揭示了筛选胰岛素分泌增强剂的方法，该方法包括将一种候选化合物与转化有所述DNA的细胞接触，并检测该化合物是否结合Epac2。

Description

筛选胰岛素分泌增强剂的方法
技术领域
本发明涉及筛选胰岛素分泌增强剂的方法，且更具体地涉及荧光标记的Epac2基因、该基因转化的细胞和利用此类细胞筛选胰岛素分泌增强剂的方法。
背景技术
硫酰脲类(下文称作“SU剂”)广泛用作糖尿病治疗剂，己知其通过结合SU受体(SUR1)显示其效果，所述SU受体是ATP敏感性K+通道(KATP通道)的组分和调节亚基(非专利文件1-3)。KATP通道存在于胰腺β细胞的细胞膜上并通过其打开和关闭调节待分泌的胰岛素量。SU剂对所述SU受体的结合诱导胰腺β细胞表面的KATP通道关闭，这引发了细胞膜的去极化。这随之引起电压依赖性Ca2+通道打开以允许Ca2+流入细胞，从而增强胰岛素分泌。SU剂的例子包括甲苯磺丁脲，格列本脲，氯磺丙脲，格列齐特等。
多种细胞内信号参与调节胰岛素分泌机制。具体地，细胞内产生的cAMP作为非常重要的信号分子行使调节胰岛素分泌细胞的功能。已知在通过cAMP引起的胰岛素分泌的调控机制内有两类通路，为蛋白激酶A依赖性通路和独立性通路。在蛋白激酶A独立性通路中，由Epac 2介导的通路是已知的(通过cAMP直接激活交换蛋白：由cAMP激活的小G蛋白Rap1的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF))(非专利文献4-6)。cAMP直接结合激活的Epac2有Rap1鸟嘌呤核苷酸交换活性，该活性激活Rap1，从而促进胰岛素分泌。
如上所述，虽然有多种调节胰岛素分泌的机制，但对糖尿病治疗剂(包括SU剂)的作用机制尚未完全阐明。
Epac2有一个与其结构相似的同种型(Epac1)(非专利文献7)。Epac1有cAMP结合结构域，蓬乱蛋白(Dishevelled)，Egl-10，普列克底物蛋白(DEP)结构域(该结构域起着Epac1膜定位的作用)，Ras交换基序(REM)，和位于羧基末端的GEF结构域。除具有上述结构域外，与Epac1结构相似的Epac2还具有位于其氨基端的第二cAMP结合结构域和与Ras相互作用的Ras相关(RA)结构域。Epac1和Epac2都通过cAMP参与胞内信号传输。
为了监测细胞内的通过cAMP的信号传输，已开发了作为荧光共振能量转移(FRET)传感器的融合蛋白，该蛋白监测Epac1在活细胞内的活化，在所述蛋白内部分或全长Epac1夹在发出不同颜色荧光的两种其他蛋白之间，即青色和黄色荧光蛋白(非专利文献8-10)。
“FRET”是这么一种现象，当彼此接近的两种(供体)染料分子之一，如荧光蛋白，被有一定波长的光(激发光)辐照以激发该染料分子时，激发能量通过电子之间的共振被转移到接近的另一个染料分子(受体)上。根据这一现象，通过由供体吸收的光能，所述受体发出一定波长的光(荧光)。因此，所述FRET技术是一种检测由FRET引发的荧光变化的方法。
当用青色荧光蛋白(发出波长较短的荧光)的激发光(波长：约440nm)照射由青色和黄色荧光蛋白和夹在它们之间的部分或全长Epac1(荧光标记Epac1)组成的融合蛋白时，该蛋白被激发，并利用部分所述激发能量发生FRET，黄色荧光蛋白也被激发并发出波长为535nm的荧光。另一方面，所述青色荧光蛋白的部分激发能量不引发FRET，但该青色荧光蛋白发出波长为480nm的荧光。因此，由所述荧光标记的Epac1发出的两种不同波长的荧光的强度比率(535nm波长的荧光强度/480nm波长的荧光强度)取决于该分子内青色和黄色荧光蛋白的构象和之间的距离。因此，当由于一些修饰或与别的分子结合导致上述分子构象变化时，所述比例也发生相应的变化。由于荧光标记的Epac1的高级结构发生变化(如当cAMP结合该分子时)，通过FRET技术对该变化的检测能够检测cAMP分子是否与Epac1结合。因此，当用波长440nm的光照射荧光标记的Epac1时，通过检测利用FRET技术发出的荧光强度的变化，可以检测通过Epac1的信号传输是否存在。
虽然如上所述已知在FRET技术中用Epac1作为传感器(FRET传感器)来测量信号传输的方法，但尚不知利用全长Epac2作为FRET传感器的方法。
已知Epac2通过cAMP依赖性、蛋白激酶A(PKA)独立性通路介导胰岛素分泌(非专利文件11和12)。Epac2最初鉴定为与SUR1(KATP通道的调节亚基)相互作用的分子(cAMP-GEF II)(非专利文献13)。
已知SUR1是SU剂的靶分子。SU剂和SUR1的结合一方面引起KATP通道关闭，另一方面使电压依赖性Ca2+通道打开，并且这就通过使Ca2+内流入β细胞来增加胰岛素分泌(非专利文件2)。对缺乏Kir6.2基因(KATP通道亚基)的小鼠和缺乏SUR1基因的小鼠的研究证明所述KATP通道的关闭是SU剂提高胰岛素分泌的先决条件(非专利文件14-16)。因此认为SU剂是通过KATP通道表现出作为糖尿病治疗药物的药理学作用。
最近，Kir6.2或SUR1中的突变已证实会导致新生儿糖尿病和由KATP通道功能受损引起的各种症状(非专利文献17)。当胰岛素注射改为口服高剂量SU剂时，发现许多此类患者的血糖控制得到改善(非专利文献18)。
此外，有临床报告称在SU剂中，格列齐特对患有新生儿糖尿病的患者没有效果，而格列本脲改善此类患者的血糖控制(非专利文件19)。这一发现表明SU剂的作用机制并不统一。因此，了解SU剂的作用机制为新生儿糖尿病患者提供适当的治疗是很关键的。此外，澄清未知的作用机制是重要的，因为它会为开发具有不同背景因素的糖尿病患者的医学治疗新途径以及开发此类治疗的新疗剂提供线索和方法。
引用文献列表
非专利文献
NPL 1：Seino S.，(1999)Annu.Rev.Physio1.61，337-62
NPL 2：Henquin J.C.，(2000)Diabetes 49，1751-60
NPL 3：Proks P.等，(2002)Diabetes 51，S368-76
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NPL 13：Ozaki N.等，(2000)Nat.Cell.Biol.2，805-811
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NPL 15：Seghers V.等，(2000)J.Biol.Chem.275，9270-7
NPL 16：Shiota C.等，(2002)J.Biol.Chem.277，37176-83
NPL 17：Hattersley A.T.等，(2005)Diabetes 54，2503-13
NPL 18：Pearson E.R.等，(2006)N.Engl.J.Med.355，467-77
NPL 19：Koster J.C.，(2008)J.Clin.Endocrinol.Metab.93，1054-61
发明内容
技术问题
在上述背景下，本发明的一个目的是提供筛选靶向Epac2的新胰岛素分泌加强剂的方法，该方法利用与两种荧光蛋白融合的Epac2作为传感器。本发明的另一个目的是提供筛选包括SU剂在内的已知抗糖尿病药物的方法以获知他们如何正确使用，该方法基于它们与Epac2的结合。
解决问题的方案
本发明人发现已知靶向SUR1分子的SU剂的新作用机制，在所述机制内SU剂通过结合Epac2行使作用。本发明基于上述发现并通过进一步研究完成。
因此本发明提供了如下项。
1.一种编码荧光标记的Epac2的DNA，包含编码发出波长彼此不同的荧光的两种不同荧光蛋白的两种不同DNA和编码Epac2的DNA，这些DNA同框融合。
2.如1所述的DNA，其中所述两种不同荧光蛋白是青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
3.如上述2所述的DNA，其中编码所述青色荧光蛋白的DNA和编码所述黄色荧光蛋白的DNA分别与编码Epac2的DNA的5′-和3′-末端融合。
4.如上述2或3所述的DNA，其中所述青色荧光蛋白是ECFP且所述黄色荧光蛋白是EYFP。
5.一种表达载体，其包含如上述1-4中一项所述的掺入DNA。
6.如上述5所述的表达载体，其中所述表达载体用于哺乳动物细胞。
7.一种细胞，其是携带有如上述5或6所述的表达载体的转化体。
8.如上述7所述的细胞，其中所述细胞是哺乳细胞。
9.如上述8所述的细胞，其中所述细胞不表达SUR1基因。
10.如上述9所述的细胞，其中所述细胞是COS细胞。
11.一种荧光标记的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和与之融合的两种不同的荧光蛋白，其中所述两种不同的荧光蛋白发出彼此波长不同的荧光。
12.一种荧光标记的Epac2，其是融合蛋白，包含两种不同的荧光蛋白和Epac2，其中所述融合蛋白在如上述7-10中任一所述的细胞内表达。
13.一种筛选胰岛素分泌增强剂的方法，该方法包括步骤：提供胰岛素分泌增强剂的候选化合物，使各候选化合物与如上述7-10之一所述的细胞接触，在所述候选化合物与所述细胞接触前后用所述两种不同荧光蛋白中的短波长荧光蛋白的激发光照射所述细胞以测量所述细胞中包含在荧光标记的Epac2内的所述两种不同荧光蛋白各自发出的荧光强度，检测所述候选化合物与所述细胞接触前后的所述两种不同荧光之间强度比率的变化，和筛选引起变化的候选化合物作为胰岛素分泌增强剂。
14.一种筛选胰岛素分泌增强剂的方法，该方法包括步骤：提供胰岛素分泌增强剂的候选化合物，使各候选化合物与如上述11或12所述的荧光标记Epac2接触，在所述候选化合物与所述Epac2接触前后用所述两种不同荧光蛋白中的短波长荧光蛋白的激发光照射所述Epac2以测量包含在所述荧光标记的Epac2内的所述两种不同荧光蛋白各自发出的荧光强度，检测与所述候选化合物接触前后的所述两种不同荧光之间的强度比率的变化，和筛选引起变化的候选化合物作为胰岛素分泌增强剂。
发明的有益效果
本发明能够筛选靶向Epac2的胰岛素分泌增强剂。由于目前没有已知的靶向Epac2的胰岛素分泌增强剂，本发明可用于筛选通过新作用机制工作的抗糖尿病药物。考虑到糖尿病的产生机制没有完全了解，且有患者耐受当前的医疗治疗，本发明的方法是有意义的。
附图简要说明
[图1]图1是野生型小鼠Epac2表达载体的载体图，pFLAG-Epac2。
[图2]图2是突变型小鼠Epac2表达载体的载体图，pFLAG-Epac2 G114EG244D。
[图3]图3a是pFLAT-CMV-2的载体图，图3b是其多克隆位点的核苷酸序列。
[图4]图4显示载体pECFP-C1的基因图和其多克隆位点的核苷酸序列。
[图5]图5显示载体pEYFP-N1的基因图和其多克隆位点的核苷酸序列。
[图6]图6是荧光标记的小鼠Epac2和荧光标记的突变型小鼠的Epac2的二级结构示意图：ECFP：青色荧光蛋白，EYFP：黄色荧光蛋白，A和B：cAMP结合结构域，DEP：[蓬乱蛋白，Egl-10，普列克底物蛋白结构域，REM：Ras交换基序，RA：Ras相关结构域，GEF：GEF结构域。
[图7]图7显示用FRET技术对8-溴-cAMP存在下的COS-1细胞内荧光标记的小鼠Epac2的动态分析。纵轴表示R/R0值，横轴表示加入8-溴-cAMP后的时间流逝。数据分别表示(a)荧光标记的小鼠Epac2，和(b)荧光标记的突变型小鼠Epac2。
[图8]图8显示SU剂对采用FRET技术动态分析MIN6细胞内荧光标记小鼠Epac2的影响。纵轴表示R/R0值，横轴表示加入SU剂后的时间流逝。分别加入(a)甲苯磺丁脲和(b)格列本脲作为SU剂。
[图9]图9显示SU剂对采用FRET技术动态分析COS-1细胞内荧光标记的小鼠Epac2的影响。纵轴表示R/R0值，横轴表示加入SU剂后的时间流逝。分别加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙酰苯磺酰环己脲，(e)格列甲嗪，(f)格列齐特，和(g)那格列奈作为SU剂。
[图10]图10显示氚标记的格列本脲结合小鼠Epac2的竞争特性。(a)黑色圆圈：总结合，空心圆圈：100μM未标记格列本脲存在下的结合。纵轴表示结合的氚标记的格列本脲的放射活性(DPM)，横轴表示氚标记的格列本脲的加入量。(b)空心圆圈：未标记的格列本脲，黑色圆圈：甲苯磺丁脲，空心三角形：8-溴-cAMP。纵轴表示结合的氚标记的格列本脲的比例，横轴表示竞争化合物的加入量(-log M)。
[图11]图11显示MIN6细胞中SU剂诱导的Rap1活化情况。在各图中，上部分表示GTP结合的Rap1的量，下部分表示Rap1总量。分别加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙酰苯磺酰环己脲，(e)格列甲嗪，和(f)格列齐特。
[图12]图12显示在Epac2缺失胰腺β细胞内的SU剂所致的Rap 1活化情况。图中的标记分别代表：TLB：甲苯磺丁脲，CLP：氯磺丙脲，ACT：乙酰苯磺酰环己脲，GLP：格列甲嗪，和GLB：格列本脲。数据来自(a)Epac2缺失胰腺β细胞，和(b)表达导入的小鼠Epac2的Epac2缺失胰腺β细胞。
[图13]图13分别显示野生型小鼠(空心柱)和Epac2缺失小鼠(黑色柱)的胰腺β细胞分泌的胰岛素量。分别加入(a)葡萄糖或KCl，(b)甲苯磺丁脲，(c)格列本脲，和(d)格列齐特。
[图14]图14显示野生型小鼠(WT)和Epac2缺失小鼠(Epac2KO)的血清胰岛素浓度和血糖浓度。空心柱和空心圆圈表示野生型小鼠的数据，黑色柱和黑色圆圈表示Epac2缺失小鼠的数据。(a)葡萄糖单独给予，或(b)葡萄糖和甲苯磺丁脲一起给予。
实施方式说明
在本发明中，当简单地描述“Epac2”时，表示哺乳动物Epac2，具体的指小鼠和人Epac2，且尤其指野生型Epac2。小鼠野生型Epac2的cDNA序列示为SEQ ID NO：1，其氨基酸序列示为SEQ ID NO：2。人野生型Epac2的cDNA序列示为SEQ ID NO：3，氨基酸序列示为SEQ ID NO：4。人Epac2cDNA可通过公知的方法获得(非专利文献5)。
小鼠和人的野生型Epac2的氨基酸序列都由1011个氨基酸残基组成，它们彼此仅有25个氨基酸不同。且在所述不同的氨基酸中的每五个中，所述不同限于相似氨基酸对之间(一个酸性氨基酸，一个碱性氨基酸，两个支链氨基酸和一个羧基氨基酸)。因此，它们之间的同源性很高，即不低于98％。这一高同源性有力证明了它们在结构和功能上基本等同。同时，在本发明中，当简单地描述“Epac2”时，不仅包括自然产生的全长Epac2，还包括那些包含部分Epac2氨基酸序列的肽，该部分序列包括其cAMP结合结构域，蓬乱蛋白，Egl-10，普列克底物蛋白(DEP)结构域(该结构域起着膜定位的作用)，Ras交换基序(REM)结构域，位于羧基末端的GEF结构域，位于氨基末端的cAMP结合结构域，和与Ras相互作用的Ras相关(RA)结构域。
本发明中，“荧光标记的Epac2”指包含Epac2和与前者融合的两种不同荧光蛋白的蛋白质。虽然只要融合到Epac2的荧光蛋白组合可引起FRET，这两种不同的荧光蛋白的任意组合都可融合到Epac2上，但优选青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的组合，更优选ECFP(增强型青色荧光蛋白)和EYFP(增强型黄色荧光蛋白)的组合。
当采用的荧光蛋白组合由青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白组成时，虽然只要形成的融合蛋白能引起FRET，这些蛋白各自可融合到Epac2的N末端或其C末端上，但优选青色荧光蛋白融合到N-末端上，且黄色荧光蛋白融合到C-末端上。
本发明中，术语“FRET技术”指将荧光标记的Epac2产生的变化检测为通过FRET发出的荧光变化的方法。在本发明中，术语“荧光”还指荧光标记的Epac2通过FRET发出的荧光。
尽管只要掺入载体的荧光标记的Epac2能表达，各种表达载体就可用在本发明中而没有任何具体的限制，但优选用于哺乳动物的表达载体。术语“用于哺乳动物细胞”表示所述载体能够作为表达载体在哺乳动物细胞内起作用。
只要在细胞被本发明表达载体转化时，荧光标记的Epac2能在所述细胞中表达，对于本发明所用细胞没有具体的限制，并且所述细胞可能是包括大肠杆菌(E.coli)的原核细胞或真核细胞如酵母或哺乳动物细胞。
当本发明使用哺乳动物细胞时，对于细胞源自的物种没有具体限制，优选使用源自人、猿、小鼠或大鼠的细胞。此外，对可用的细胞种类没有具体的限制，且可使用那些细胞如成纤维细胞、肾源细胞、上皮细胞和胰腺β细胞，还可使用任何正常细胞、癌化细胞、细胞系和原代细胞培养物。
而且，本发明使用的哺乳动物细胞可以是那些表达KATP通道的细胞例如源自胰腺β细胞的MIN6细胞或是那些不表达KATP通道的细胞例如COS细胞如COS-1细胞。然而，在要避免SUR1和荧光标记的Epac2之间任何相互作用的影响的情况下，优选不表达KATP通道的细胞。术语“不表达KATP通道的细胞”不仅包括那些根本不表达KATP通道的细胞，还包括那些表达KATP通道但仅表达量很小以至于不能对用FRET技术获取的测量值产生影响的细胞。
本发明的筛选胰岛素分泌增强剂的方法可通过以下方式进行：观察表达荧光标记Epac2的细胞与试剂接触之后、或之前和之后FRET技术产生的荧光变化。如果所述荧光标记的Epac2由Epac2和与之融合的青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白组成，则可用作FRET技术的激发光波长为435-445nm，优选440nm。且在这种情况下发出的荧光的波长为475-485nm和530-540nm，特别是480nm和535nm。
进一步，在本发明的筛选胰岛素分泌增强剂的方法中，可使用表达荧光标记的Epac2的细胞匀浆以及完全或部分纯化自该匀浆的荧光标记的Epac2。
对于可被本发明筛选的胰岛素分泌增强剂没有具体的限制，只要它们能直接或间接通过Epac2增加胰岛素分泌，且它们包括治疗1型和2型糖尿病的试剂。所述术语“直接通过Epac2”作用指试剂通过直接结合Epac2起作用，且术语“间接通过Epac2”作用指胰岛素分泌增强剂通过它对Epac2相关分子的作用引起信号传输(如通过所述信号传输通路的Epac2上游蛋白如Rab3起作用，或通过结合Epac2的分子起作用)，尽管所述试剂本身并不直接结合Epac2。
因此本发明可用于筛选通过Epac2起作用的胰岛素分泌增强剂。反过来，这意味着本发明可用于从包括已知的抗糖尿病药物的胰岛素筛选增强剂中筛选不通过Epac2起作用的试剂。
进一步，本发明可用于筛选用于缺乏KATP通路的糖尿病患者的治疗剂或评估它们的药理学效果。本文所述术语“缺乏KATP通路的糖尿病患者”指那些遗传性缺乏KATP通路的糖尿病患者且包括具有该遗传特性的新生儿糖尿病患者。本文待筛选或评估药理学效果的治疗剂包括例如SU剂。本发明揭示了一些SU剂通过Epac2表现其药理学活性，而其他的则不通过Epac2。那些预期在治疗缺乏KATP通路的糖尿病患者中起作用的SU剂，是那些通过Epac2表现其药理学活性的SU剂，此类试剂可用本发明筛选和评估它们的效果。
实施例
参照实施例对本发明进行进一步详细的描述。然而，这并不意味着本发明受所述实施例限制。具体地，虽然下述实施例是在小鼠Epac2上，但如上所述小鼠Epac2和人Epac2都由1011氨基酸组成且它们之间的同源性不低于98％的事实强有力地证明它们在结构和功能上基本等同。因此，下述实施例在小鼠Epac2上获得的所有结果在基本等同的人Epac2上也必然有效。同时，所有动物实验依照神户大学医学院伦理委员会(Ethics Committee，School of Medicine，Kobe University)的指南进行。
试剂：
格列本脲购自ALEXIS公司(美国圣地亚哥市)。甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰环己脲、格列甲嗪、那格列奈和12-O-十四烷酰基-佛波醇-13-乙酸盐(TPA)购自西格玛(SIGMA)公司(美国圣路易斯市)。格列齐特购自LKT实验室(美国圣保罗市)。氚标记的格列本脲购自帕金埃尔默(PerknElmer)公司(美国沃森姆市)。
动物：
缺乏Epac2的小鼠用文献Shibasaki T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104，19333-9(2007)中所述技术制备。在所有动物实验中用野生型小鼠(C57BL/6)作为对照组。
缺乏Epac2的胰腺β细胞。
缺乏Epac2的胰腺β细胞按照文献Shibasaki T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA104，19333-9(2007)中公开的技术获得，所述细胞分离自Epac2缺乏的小鼠和IT6小鼠交配后繁殖的小鼠，其中SV40大T抗体在人胰岛素基因启动子控制下表达。制备IT6小鼠的方法如文献Miyazaki J，等Endocrinology，127，126-132(1990)所述。进一步，MIN6细胞通过日本专利申请公开号2002-125661中所述技术制备。
小鼠Epac2表达载体：
所用的野生型小鼠Epac2表达载体(pFLAG-Epac2：图1)和突变型小鼠表达载体(pFLAG-Epac2 G114E G422D：图2)如文献Ozaki N.等(2000)Nat.Cell.Biol.2，805-811所述(非专利文献13)。在野生型小鼠Epac2cDNA(SEQ IDNO：1)中，除了终止密码子(tag)外的前14个碱基和后12个碱基是PCR中使用的引物序列。
用于构建pFLAG-Epac2和pFLAG-Epac2 G114E G422D的pFLAT-CMV-2的载体图示于图3a，且其全长DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：5，其多克隆位点的核苷酸序列分别示于图3b和SEQ ID NO：6。在表达载体pFLAG-Epac2和pFLAG-Epac2 G114E G422D中，Epac2基因插入到pFLAT-CMV-2载体的EcoRI位点。
进一步，上述所用的小鼠突变型Epac2的cDNA序列示为SEQ ID NO：7，且其氨基酸序列示为SEQ ID NO：8。
构建青色和黄色荧光标记的小鼠Epac2表达载体-步骤1：
使用上述小鼠Epac2表达载体pFLAG-Epac2作为模板，用引物BglII-Epac2(5′-agatctatggtcgctgcgca-3′，SEQ ID NO：9)和引物Epac2-EcoRI(5′-gaattctggccttcgagg-3′：SEQ ID NO：10)进行PCR反应以扩增小鼠Epac2的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，68℃：2分钟)，30个循环(94℃：30秒，50℃：30秒，68℃：3分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。如此扩增的小鼠野生型Epac2cDNA(上述SEQ ID NO：1)用BglII和EcoRI酶切，之后插入到已用BglII和EcoRI酶切的青色荧光蛋白(ECFP)表达载体pECFP-C1(图4，克隆泰克公司(Clontech))中，其多克隆位点的DNA序列示于SEQ ID NO：11。所获的这个载体命名为pECFP-小鼠Epac2表达载体。分别地，青色荧光蛋白(ECFP)的cDNA序列示于SEQ ID NO：12，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：13。
构建青色和黄色荧光标记的小鼠Epac2表达载体-步骤2：
使用黄色荧光蛋白表达载体pEYFP-N1(图5，克隆泰克公司)作为模板(该载体多克隆位点的DNA序列示于SEQ ID NO：14)，用引物GFP-fw(5′-atggtgagcaagggcg-3′：SEQ ID NO：15)和引物GFP-rv(5′-cttgtacagctcgtccat-3′：SEQ IDNO：16)进行PCR以扩增黄色荧光蛋白EYFP的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，72℃：1分钟)，30个循环(94℃：30秒，52℃：30秒，68℃：1分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。使用通过PCR获得的EYFP的cDNA作为模板，用引物EcoRI-EYFP(5′-gaattcatggtgagcaagg-3′：17)和引物EYFP-EcoRI(5′-gaattccttgtacagctcgt-3′：SEQ ID NO：18)进行PCR以扩增加上一个EcoRI位点的EYFP cDNA。黄色荧光蛋白(EYFP)的cDNA序列示于SEQID NO：19，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：20。在所述cDNA中，除了终止密码子“tag”外的前端13个碱基和最后14个碱基是引物序列。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，72℃：1分钟)，30个循环(94℃：30秒，52℃：30秒，68℃：1分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。所述扩增的加入EcoRI位点的EYFP cDNA用EcoRI酶切并插入到已用EcoRI酶切的前述pECFP-小鼠Epac2表达载体中。所获的载体用作荧光标记的小鼠Epac2表达载体。
构建突变型荧光标记的小鼠Epac2表达载体-步骤1：
使用前述突变型小鼠Epac2表达载体(pFLAG-Epac2 G114E G422D)作为模板，用引物BglII-Epac2(前述的5′-agatctatggtcgctgcgca-3′，SEQ ID NO：9)和引物Epac2-EcoRI(前述的5′-gaattctggccttcgagg-3′：SEQ ID NO：10)进行PCR反应以扩增突变型小鼠Epac2cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，68℃：2分钟)，30个循环(94℃：30秒，50℃：30秒，68℃：3分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。所述扩增的突变型小鼠Epac2cDNA用BglII和EcoRI酶切，之后插入到pECFP-C1载体中(克隆泰克公司)。所获的这个载体命名为突变型pECFP-小鼠Epac2表达载体。
构建突变型荧光标记的小鼠Epac2表达载体-步骤2：
使用所述pEYFP-N1载体(克隆泰克公司)作为模板，用引物GFP-fw(前述的5′-atggtgagcaagggcg-3′：SEQ ID NO：15)和引物GFP-rv(5′-cttgtacagctcgtccat-3′：SEQ ID NO：16)进行PCR以扩增所述黄色荧光蛋白EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，72℃：1分钟)，30个循环(94℃：30秒，52℃：30秒，68℃：1分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。然后使用通过PCR获得的EYFP cDNA作为模板，用引物EcoRI-EYFP(前述的5′-gaattcatggtgagcaagg-3′：SEQ ID NO：17)和引物EYFP-EcoRI(前述的5′-gaattccttgtacagctcgt-3′：SEQ ID NO：18)进行PCR以扩增加入EcoRI位点的EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10个循环(95℃：30秒，55℃：30秒，72℃：1分钟)，30个循环(94℃：30秒，52℃：30秒，68℃：1分钟)和之后的最终反应(68℃：5分钟)组成。所述扩增的加入EcoRI位点的EYFP cDNA用EcoRI酶切并插入到已用EcoRI酶切的所述突变型pECFP-小鼠Epac2表达载体中。所获的这个载体命名为荧光标记的突变型小鼠Epac2表达载体。
图6是荧光标记的小鼠Epac2和荧光标记的突变型小鼠的Epac2的二级结构示意图。
细胞培养和转化：
在5％CO2下将MIN6和COS-1细胞培养物导入包含10％热灭活胎牛血清的杜尔伯科改良伊勾培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)中。用FuGENE6转染试剂(罗氏分子生物化学公司，瑞士巴塞尔)进行所述细胞的转化。
通过FRET技术对荧光标记的小鼠Epac2的观察和动态分析：
测量前两天，用荧光标记的小鼠Epac2表达载体转化所述细胞并培养。测量前一天，将所述细胞转移到直径25mm的玻璃培养皿上继续培养。转化后约48小时，用HEPES-KRB缓冲液替代培养基(HEPES缓冲液包含133.4mMNaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、2.5mM CaCl2、5.0mMNaHCO3、2.8mM葡萄糖和0.2％BSA(pH 7.4))。通过装有UPlanSApo物镜(100倍油镜/1.40NA)的共聚焦显微镜(FV1000，奥林巴斯公司(OlympusCorporation))观察所述细胞，将所述物镜焦点设置在细胞上，并用波长440nm的激发光照射，使用440nm LD激光器(FV5-LDPSU，奥林巴斯公司)，功率0.5％。如此激发的荧光标记小鼠Epac2所发出的荧光通过两个荧光滤片480DF30(用于480nm光)和535DF25(用于535nm光)观察，作为每5秒的荧光双重图像用于所述发出荧光的动态分析。每次测量中在首次计算535nm与480nm的荧光强度的比率R后(535nm强度/480nm强度的比率)，所述动态分析的结果用所述比率除以初始值R0导出的值表示，即R/R0。所有观察在室温下进行。
硫酰脲类结合实验：
用小鼠Epac2表达载体转化COS 1细胞。转化两天后，用缓冲液(20mMHEPES，包含119mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，5.0mM NaHCO3，(pH 7.4))清洗所述细胞两次并将其以2.5-5.2x105细胞/400μl的浓度悬浮于同一缓冲液中。所述细胞再分成每管400μl，在加入氚标记的格列本脲后室温静置1小时。同时加入未标记的格列本脲或甲苯磺丁脲等，与氚标记的格列本脲竞争。破裂COS-1细胞，且在细胞内结合到蛋白上的氚标记的格列本脲通过真空过滤被吸收到沃特曼GF/C膜上(沃特曼(Whatman)公司，英国梅德斯通市)。用冰冷却的相同缓冲液清洗所述膜四次，然后在液体闪烁计数器上测量放射活性。
GTP-RAP1牵出实验：
按照文献Shibasaki T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104，19333-9(2007)所述的方法进行GTP-RAP1牵出实验。即，预先在HEPES-KRB缓冲液中静置30分钟的MIN6细胞在包含感兴趣的试剂和2.8mM葡萄糖的HEPES-KRB缓冲液中继续培养15分钟。然后破裂上述细胞，在所获细胞裂解物中加入结合有GST-Ra1GDS-RID的谷胱甘肽树脂(西格玛公司)。4℃孵育90分钟后，离心分离所述树脂，用HEPES-KRB缓冲液清洗数次，并进行SDS-PAGE凝胶电泳。所述SDS-PAGE凝胶电泳后，进行Western印迹以将蛋白转移到PVDF膜上，并且用抗Rap1抗体(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，美国)检测转移到所述膜上的Rap1。
胰岛素分泌实验：
小鼠胰腺β细胞分离自野生型小鼠(C57BL/6)或Epac2缺陷小鼠并培养两天。所述小鼠胰腺β细胞在含2.8mM葡萄糖的HEPES-KRB缓冲液中静置30分钟。然后以每孔包含5个相似大小的胰岛的方式将所述细胞分配到92孔板上，并在包含感兴趣的试剂和2.8mM葡萄糖的100μl HEPES-KRB缓冲液中培养15分钟。用胰岛素实验试剂盒(医学生物学实验室有限公司(MedicalBiological Laboratories Co.Ltd.))测量释放入上述培养基中的和细胞中的胰岛素量。分泌的胰岛素量用细胞中的胰岛素量标准化。
口服葡萄糖耐受测试：
禁食16小时的小鼠单独口服给予1.5g/kg体重的葡萄糖或1.5g/kg体重的葡萄糖加上100mg/kg体重的甲苯磺丁脲。在预定时间提取外周血样本，并用ELISA试剂盒(莫林纳加(Morinaga)公司制造)和安特森III(Antsense III)糖分析仪(拜尔医药有限公司Bayer Yakuhin，Ltd.)分别测量血清胰岛素浓度和血糖浓度。
用FRET技术观察荧光标记的小鼠Epac2的三维结构变化
当转化有荧光标记小鼠Epac2表达载体的所述COS-1细胞(表达荧光标记小鼠Epac2的COS-1细胞)在包含有1mM或10mM 8-溴-cAMP(cAMP类似物)的缓冲液中用FRET技术进行6分钟测量时，观察到R/R0值有浓度依赖性的降低(图7a)。认为R/R0值的所述降低是FRET改变的结果，所述改变是荧光标记小鼠Epac2与8-溴-cAMP的结合导致其三维结构的改变引起的。另一方面，当用同样的方法测量转化有荧光标记突变型小鼠Epac2表达载体(其cAMP结合位点被破坏)的所述COS-1细胞时，没有观察到R/R0值的降低(图7b)。认为这是由于8-溴-cAMP不能结合到所述突变型荧光标记的小鼠Epac2上，没有造成所述突变型荧光标记的小鼠Epac2的三维结构发生变化，这就没有导致FRET的变化。此外，在没有加入8-溴-cAMP作培养时，上述两种情况下都没有观察到R/R0的变化(图7a、7b)。
这些结果证明由8-溴-cAMP与之结合造成的荧光标记的小鼠Epac2的高级结构的变化可通过所述FRET技术在细胞中观察到。因此，cAMP和Epac2的结合是通过Epac2的信号传导的步骤之一，用表达荧光标记的小鼠Epac2的细胞可随着时间观察到所述结合步骤。
SU剂和荧光标记的小鼠Epac2的结合：
当有SU剂(甲苯磺丁脲或格列甲嗪)存在下，用FRET技术测量转化有荧光标记小鼠Epac2表达载体的MIN6细胞时，观察到R/R0值有浓度依赖性的降低。因为已知所述SU剂通过与SUR1(KATP通道的组分)结合表现其功能，所以不排除这里观察到的所述R/R0值的降低可能是SUR1的间接效应。
因此，在有一种不同的SU剂存在下，用FRET技术测量表达荧光标记小鼠Epac2而不表达SUR1的COS-1细胞，并且该测量显示有甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰环己脲和格列甲嗪存在下观察到R/R0降低(图9a-e)。该结果说明这些SU剂不是通过SUR1作用而是直接作用在Epac2上以改变其高级结构。这是令人意外的，因为从未预期Epac2是SU剂的靶标。另一方面，有格列齐特和那格列奈存在下没有观察到R/R0值的变化，尽管它们也是SU剂。这说明这些试剂不是直接作用在Epac2上造成其高级结构变化的(图9f-g)。因为Epac2是在胰岛素分泌中起作用的信号传输器，所以上述结果说明SU剂可因其作用机制而有不同组，一种通过Epac2起作用和另一种不是。
之后，为了验证SU剂是否直接与Epac2结合，用氚标记的格列本脲进行硫酰脲类结合测试。所述转化有小鼠Epac2表达载体的COS-1细胞在浓度为1-40nM的氚标记的格列本脲存在下培养，之后破裂所述细胞以测量结合到COS-1的胞内因子上的氚标记格列本脲的放射活性。与浓度为100μM的非放射性标记的格列本脲共存培养时，氚标记的格列本脲的非特异性结合量即为所测的放射活性。结果显示，氚标记的格列本脲的特异性结合量以浓度依赖性方式增加(图10a)。另一方面，在正常COS-1细胞中观察到非特异性结合(数据未显示)。这些结果表明格列本脲与Epac2特异结合。
接下来，转化有小鼠Epac2表达载体的COS-1细胞在未标记的格列本脲(GLB)、甲苯磺丁脲(TLB)或8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)和10nM氚标记的格列本脲共存下培养以使它们竞争结合Epac2。结果显示，非标记的格列本脲的IC50为25nM，甲苯磺丁脲的IC50为240μM，且8-溴-cAMP几乎没有观察到竞争性(图10b)。这些结果说明格列本脲对Epac2的亲和力比甲苯磺丁脲高。此外，它们还说明Epac2分子上的格列本脲结合位点与cAMP结合位点没有重叠。
这些结果表明用FRET技术，利用荧光标记的Epac2作为传感器有可能观察到试剂(包括SU剂)是否结合Epac2。
Epac2参与SU剂激活Rap1：
Epac2有GEF活性且通过将Rap1与GTP结合使其转换为GTP结合的Rap1而激活Rap1。所述反应组成β细胞中胰岛素分泌的信号传输的一部分。因此，用源于β细胞的MIN6细胞检测Rap1是否被SU剂激活。使用GTP-RAP1牵出实验，通过测定GTP结合的Rap1来检测Rap1的激活。使用称为Rap1激活剂化合物的8-溴-cAMP和TPA作为阳性对照。
结果显示，发现甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰环己脲和格列甲嗪在MIN6细胞中以浓度依赖性的方式提高GTP结合的Rap1含量，即激活了Rap1(图11a-e)。然而，虽然格列本脲直到浓度为100nM都提高GTP结合的Rap1含量，但它在更高的浓度没有提高作用(图11b)。另一方面，没有发现格列齐特在MIN6细胞中对GTP结合的Rap1的含量有影响，即未激活Rap1(图11)。
全部激活Rap1的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰环己脲和格列甲嗪是用FRET技术观察到R/R0值降低的SU剂，而没有激活Rap1的格列齐特是没有观察到R/R0值降低的SU剂。这些结果表明SU剂对Rap1的激活通过SU剂结合Epac2进行。
然后，用Epac2缺乏的胰腺β细胞检测Rap1是否被SU剂激活。使用GTP-RAP1牵出实验，通过测定GTP结合的Rap1的含量来检测Rap1的激活。用已知可激活Rap1的8-溴-cAMP和TPA作为阳性对照。
结果显示，在MIN6细胞中发现激活Rap1的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰环己脲和格列甲嗪在上述Epac2缺乏的胰腺β细胞中没有激活Rap1(图12a)。然而，当在用小鼠Epac2表达载体转化Epac2缺乏的胰腺β细胞后进行相似的实验，发现所有上述试剂激活Rap1(图12b)。这些结果说明所述SU剂是通过Epac2激活Rap1的。另一方面，即使在小鼠Epac2表达载体转化的Epac2缺乏的胰腺β细胞中，用FRET技术检测到对R/R0值没有影响的那格列奈也没有激活Rap1(数据未显示)。
这些结果表明使用荧光标记的Epac2作为传感器，采用FRET技术观察到结合Epac2的上述试剂通过Epac2激活Rap1。即，所述结果表明使用荧光标记的Epac2作为传感器的FRET技术可用于筛选通过Epac2激活Rap 1的试剂。
SU剂通过Epac2对胰岛素分泌的影响：
利用胰岛，在胰岛素分泌试验中测量SU剂通过Epac2对胰岛素分泌的影响。首先，用葡萄糖刺激获自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰岛，并测量胰岛素分泌量。结果显示，二者之间的胰岛素分泌没有发现显著不同(图13a)。用KCl进行刺激后的结果一样(图13a)。然后，用FRET技术中检测能降低R/R0值的甲苯磺丁脲(100nM)或格列本脲(10nM)刺激获自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰岛，并用同样的方法测量胰岛素分泌量。结果显示，这些试剂刺激后，Epac2缺乏小鼠的胰岛与野生型小鼠的胰岛相比表现出明显较低的胰岛素分泌(图13b，c)。另一方面，用FRET技术中未检测到R/R0值变化的格列齐特的两组之间没有发现明显不同(图13d)。这些结果表明通过Epac2的通路对于采用FRET技术测定到R/R0值降低的那些SU剂表现其全部药理学效果是必须的。
为了检测通过Epac2的SU剂的体内效果，依照口服葡萄糖耐受测试，在口服给予葡萄糖后测量甲苯磺丁脲对血清胰岛素和血糖浓度的影响。首先，对野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠单独给予葡萄糖，并测量其血清胰岛素和血糖浓度，其结果显示两组间没有显著差异(图14a)。接下来，葡萄糖和甲苯磺丁脲一起给予，并用同样的方法进行测量。结果显示与野生型小鼠相比，Epac2缺乏小鼠的血清胰岛素浓度较低(图14b)。同时，与所述血清胰岛素浓度相对应，Epac2缺乏小鼠的血糖浓度高于野生型小鼠(图14b)。
上述结果表明通过Epac2的SU剂也在体内表现出效果，且激活Epac2/Rap1信号传输通路对于某些SU剂(包括甲苯磺丁脲)完全表现其效果是必须的。进一步发现，因为通过Epac2激活Rap1的试剂可采用以荧光标记的Epac2作为传感器的FRET技术进行筛选，所以可用相同的方法筛选通过Epac2增强胰岛素分泌的试剂。例如，因为可用作治疗缺乏KATP通路的糖尿病患者的药剂的SU剂局限于激活Epac2/Rap1信号传输通路的那些试剂，所以可用本方法筛选此类试剂。相反，也可筛选不能激活Epac2/Rap1信号传输通路的试剂。
工业实用性
本发明可用作筛选应用于糖尿病患者的胰岛素分泌增强剂的材料，也可用作所述筛选的方法。
序列表自由文字
SEQ ID NO：1＝小鼠野生型Epac2
SEQ ID NO：3＝人野生型Epac2
SEQ ID NO：5＝pFLAT-CMV-2全长DNA
SEQ ID NO：6＝多克隆位点，pFLAT-CMV-2
SEQ ID NO：7＝小鼠突变型Epac2(Epac2 G114E G422D)
SEQ ID NO：9＝引物BglII-Epac2
SEQ ID NO：10＝引物Epac2-EcoRI
SEQ ID NO：11＝多克隆位点，pECFP-C1
SEQ ID NO：12＝ECFP
SEQ ID NO：13＝合成的构建体
SEQ ID NO：14＝多克隆位点，pEYFP-N1
SEQ ID NO：15＝引物GFP-fw
SEQ ID NO：16＝引物GFP-rv
SEQ ID NO：17＝引物EcoRI-EYFP
SEQ ID NO：18＝引物EYFP-EcoRI
SEQ ID NO：19＝EYFP
SEQ ID NO：20＝合成的构建体
Figure IPA00001447141800011
Figure IPA00001447141800021
Figure IPA00001447141800031
Figure IPA00001447141800041
Figure IPA00001447141800061
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Figure IPA00001447141800271
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Figure IPA00001447141800311
Figure IPA00001447141800321

Claims (14)

1.一种编码荧光标记的Epac2的DNA，包含编码发出波长彼此不同的荧光的两种不同荧光蛋白的两种不同DNA和编码Epac2的DNA，这些DNA同框融合。
2.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述两种不同荧光蛋白是青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
3.如权利要求2所述的DNA，其特征在于，编码所述青色荧光蛋白的DNA和编码所述黄色荧光蛋白的DNA分别与编码Epac2的DNA的5′-和3′-末端融合。
4.如权利要求2或3所述的DNA，其特征在于，所述青色荧光蛋白是ECFP且所述黄色荧光蛋白是EYFP。
5.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1-4所述的掺入DNA。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体用于哺乳动物细胞。
7.一种细胞，其特征在于，所述细胞是携带有如权利要求5或6所述的表达载体的转化体。
8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞是哺乳细胞。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞不表达SUR1基因。
10.如权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述细胞是COS细胞。
11.一种荧光标记的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和与之融合的两种不同的荧光蛋白，其中，所述两种不同的荧光蛋白发出彼此波长不同的荧光。
12.一种荧光标记的Epac2，其是融合蛋白，包含两种不同的的荧光蛋白和Epac2，其中，所述融合蛋白在如权利要求7-10中任一所述的细胞内表达。
13.一种筛选胰岛素分泌增强剂的方法，所述方法包括以下步骤：提供胰岛素分泌增强剂的候选化合物，使各候选化合物与如权利要求7-10之一所述的细胞接触，在所述候选化合物与所述细胞接触前后用所述两种不同荧光蛋白中的短波长荧光蛋白的激发光照射所述细胞以测量所述细胞中包含在荧光标记的Epac2内的所述两种不同荧光蛋白各自发出的荧光强度，检测所述候选化合物与所述细胞接触前后的所述两种不同荧光之间强度比率的变化，和筛选引起变化的候选化合物作为胰岛素分泌增强剂。
14.一种筛选胰岛素分泌增强剂的方法，所述方法包括以下步骤：提供胰岛素分泌增强剂的候选化合物，使各候选化合物与如权利要求11或12所述的荧光标记Epac2接触，在所述候选化合物与所述Epac2接触前后用所述两种不同荧光蛋白中的短波长荧光蛋白的激发光照射所述Epac2以测量包含在所述荧光标记Epac2内的所述两种不同荧光蛋白各自发出的荧光强度，检测与所述候选化合物接触前后的所述两种不同荧光之间强度比率的变化，和筛选引起变化的候选化合物作为胰岛素分泌增强剂。
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