JP2012519660A

JP2012519660A - フィブリノーゲン４２０及びその活性ドメインの新規用途

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Publication number: JP2012519660A
Application number: JP2011552309A
Authority: JP
Inventors: 永章 ▲羅▼; ▲華▼▲東▼ 唐; 彦付
Original assignee: ツィンファユニバーシティ
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2012-08-30
Anticipated expiration: 2030-03-05
Also published as: US9145452B2; EP2404613B1; EP2404613A4; CN101822823B; CN101822823A; US20120165510A1; EP2404613A1; JP5951257B2; WO2010099703A1; US20140087441A1

Abstract

本発明は、フィブリノーゲン４２０及びその活性ドメイン（アルファＥＣドメイン）の新規用途を開示する。個々のアルファＥＣドメインタンパク質は、フィブリノーゲン４２０と同一又は類似の機能を有する。フィブリノーゲン４２０及びその活性ドメインは、タンパク質凝集の阻害、タンパク質のリフォールディングの補助、タンパク質コンフォメーション病を予防及び／又は治療することができる医薬の製造、品質管理における変性タンパク質の検出、及びタンパク質の変性からの保護において広く用いることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、フィブリノーゲン４２０及びその活性ドメインの新規用途に関する。

凝固因子Ｉとしても知られているフィブリノーゲンは、血液凝固プロセスにおいて重要なタンパク質である。フィブリノーゲンの分子量は、３４０，０００ダルトンであり、ジスルフィド結合によって結合されて二量体を形成する２つのサブユニットから構成される。各サブユニットは、それぞれ、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖と呼ばれる３本の絡み合ったポリペプチド鎖からなる。凝固プロセスにおいて、フィブリノーゲンは、トロンビンによって分解されてフィブリンを生成して、不溶性フィブリンポリマーを形成する。次いで、フィブリンポリマー線維及び血小板の組成物は、固体の止血栓を形成する。また、フィブリノーゲンは、ストレスタンパク質でもあり、その血液中の含有量は、約１．５ｍｇ／ｍＬ〜４ｍｇ／ｍＬである。フィブリノーゲンの含有量は、免疫状態に関連し、これは、心血管疾患のリスクも反映している場合がある。

フィブリノーゲン４２０は、フィブリノーゲンのサブタイプであり、Ａ鎖のＣ末端の球状ドメインが、通常のフィブリノーゲンよりも伸長している。この球状ドメインの伸長は、アルファＥＣドメインと呼ばれ、Ｂ鎖、Ｃ鎖の末端における球状ドメインと高い相同性を有する。フィブリノーゲン４２０の分子量は、４２０，０００ダルトンであり、一般的な組織フィブリノーゲンの３４０，０００ダルトンとは異なる。

タンパク質ミスフォールディング病は、組織において特定のタンパク質の立体構造が変化することに起因し、その間にタンパク質が集まってアミロイドーシスを生じさせ、最終的には、アルツハイマー病及びウシ海綿状脳症等の、組織及び器官における病理学的変化を有する分類の疾患を引き起こす。これまで、これら疾患の有効な予防的処置又は治療は存在しなかった。モノクローナル抗体技術、小分子、合成ペプチド等の既存の方法は、免疫拒絶反応、汎用性が低い、重篤な副作用、及びインビボにおける半減期が短い等を含む多くの問題点を有している。

身体が刺激を受けたときに、高温、フリーラジカル、有機溶媒（例えば、エタノール）、及び他のダメージから細胞を保護する多数の熱ショックタンパク質又はシャペロンが存在する。しかし、熱ショックタンパク質は、循環系には存在しない。身体が細胞外タンパク質を保護する機構は、明らかになっていない。

本発明の目的は、フィブリノーゲン４２０及びその活性ドメインの新規用途を提供することにある。

図１は、フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質が、熱によって誘導されるクエン酸合成酵素の変性及び凝集を阻害できることを示す。図２は、アルファＥＣドメインタンパク質が、クエン酸合成酵素の化学変性及び凝集を阻害することを示す。図３は、フィブリノーゲン４２０が、熱によって誘導されるクエン酸合成酵素の変性及び不活化を阻害することを示す。図４は、アルファＥＣドメインタンパク質が、熱によって誘導されるクエン酸合成酵素の変性及び不活化を阻害することを示す。図５は、アルファＥＣドメインタンパク質が、変性しているクエン酸合成酵素タンパク質を特異的に認識することを示す。

本発明者らによる研究において、フィブリノーゲン４２０が、分子シャペロン活性及び広範囲に使用できる非特異的保護効果を有することが示された。フィブリノーゲン４２０は、内因性タンパク質であるので、体内で速やかに分解されず、免疫拒絶を引き起こさない。フィブリノーゲン４２０は、変性タンパク質の適切なリフォールディング、並びにタンパク質の立体構造及び機能の安定化を促進することができる。したがって、タンパク質のリフォールディング、品質管理における変性タンパク質試験、及びタンパク質の変性防止等において広く用いることができる。記載されるタンパク質は、組換えタンパク質であっても、天然タンパク質であってもよい。

フィブリノーゲン４２０は、アルファＥＣドメインを含み、個々のアルファＥＣドメインタンパク質が、インタクトなフィブリノーゲン４２０と同一又は類似の機能を有する。アルファＥＣドメインのアミノ酸配列を配列番号１に示す。フィブリノーゲン４２０は、特に、ヒトフィブリノーゲン４２０であってもよい。

フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインは、使用するためのタンパク質試薬に調製することができる。記載されるタンパク質試薬は、少なくともフィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質を含み、前記タンパク質試薬は、他の溶媒及び添加剤を含んでいてもよい。他のタンパク質対フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質の比が２５：１〜１：１００である場合、特に、１：１である場合、良好な結果が得られると予測される。最良の比は、特定の用途の要件に依存する。

また、本発明は、フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質が、変性タンパク質の凝集を阻害し、その上タンパク質の活性を保護できることを示す。したがって、本発明は、タンパク質の立体構造に関連する疾患を治療するための医薬として用いることができる。

ここで、タンパク質ミスフォールディング病を治療するための医薬は、活性成分としてフィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質を含む。記載される治療用タンパク質は、発熱、タバコ、アルコール、酸素のフリーラジカル、及び他の有害物質によって引き起こされるタンパク質の変性等の様々なタンパク質変性疾患を治療するために用いることができる。

タンパク質ミスフォールディング病を治療するための医薬は、活性成分としてフィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質を含む。

本発明では、フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質は、タンパク質のアンフォールディングプロセスを支配（ｃａｐｔｕｒｅ）することができる。タンパク質の正確なリフォールディングを補助するか、又はタンパク質を折り畳まれた状態に維持することにより、フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質は、タンパク質の凝集を防ぎ、且つタンパク質の活性及び機能を安定化させることができる。したがって、フィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質は、タンパク質の抗変性能を高めることができるので、インビトロにおいてタンパク質安定化剤として用いることができる。

ここで、記載されるタンパク質安定化剤は、活性成分としてフィブリノーゲン４２０又はアルファＥＣドメインタンパク質を含む。記載されるタンパク質安定化剤は、容易に集まって凝集体を形成するタンパク質の沈殿を阻害することができる。また、タンパク質安定化剤は、クエン酸合成酵素、ルシフェラーゼ、インスリン、及び他の酵素活性を安定化させる等、酵素活性を保護することができる。

実施例１：フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質は、クエン酸合成酵素の変性凝集を抑制する
ａ．フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質の調製
フィブリノーゲン４２０の調製は、血液又は臍帯血からフィブリノーゲン混合物を精製することから始め、その後、フィブリノーゲンを更に精製することができる。詳細は、以下の通りである：

（１）フィブリノーゲン混合物の調製：先ず、プロテアーゼ阻害剤を新鮮血又は臍帯血に添加し、次いで、４℃、２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清から黄色の血漿を得る。次いで、撹拌しながらグリシン乾燥粉末を前記血漿に添加して、グリシンを完全に溶解させ、グリシンの最終濃度を２．１Ｍにする。５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、白色の綿状沈殿物が得られる。前記沈殿物を、血漿の原体積の１／３の体積であるバッファ（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４溶液）に溶解させ、溶解した体積が血漿の原体積の１／１０になるまでこの工程を繰り返す。等体積の水を添加して、希釈する。次いで、希釈溶液を２℃〜５℃で６時間静置し、遠心分離後に沈殿物を除去し、等体積の０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液を上清に添加し、次いで、最終濃度８％エタノール（体積比）になるように９５％エタノールを添加し、温度を−３℃に維持しながら、完全に沈殿させ、５，０００ｒｐｍで遠心分離した後の沈殿物を次のフィブリノーゲン４２０精製工程の原料として用いる。

（２）フィブリノーゲン４２０の精製：工程（１）で得られたフィブリノーゲン沈殿物を０．３Ｍの塩化ナトリウム溶液に溶解させ、ｐＨ８．６である０．００５Ｍのトリス−リン酸バッファ（リン酸ラジカルに基づいて計算したモル濃度）を用いて透析を行う。クロマトグラフィーカラムとしてＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０アニオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる。０．００５Ｍのトリス−リン酸バッファから開始して０．２Ｍのトリス−リン酸バッファ（ｐＨ６．０）に急速に推移させるｐＨ段階溶出を用いてサンプルを溶出させ、次いで、０．２Ｍのトリス−リン酸バッファ（ｐＨ６．０）を維持して、カラム体積の１２倍量を溶出させ、最後に、０．５Ｍのトリス−リン酸バッファ（ｐＨ４．２）までの直線勾配を用いてカラム体積の１２倍量を溶出させる。フィブリノーゲン４２０は、直線溶出の最後の工程で得られる。１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）を用いて透析を行った後、タンパク質を保存することができる。

アルファＥＣドメインタンパク質は、以下のように得られる：

アルファＥＣドメインタンパク質のリフォールディング及び精製：ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリをＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いる。プライマーは、以下の通りである：
５−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣ−３’
５−ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＡＧＧＧＧＣＣ−３’
ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位がプライマーに組み込まれている。ＰＣＲ増幅のアニーリング温度は、５５℃である。同じ２つの制限酵素部位を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、αＥＣフラグメントをｐＥＴ−３０ａ発現ベクター（ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．）に連結させる。大腸菌のコンピーテントセルＢＬ２１／ＤＥ３（ＢｅｉｊｉｎｇＤｉｎｇＧｕｏＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙ）を組換え発現ベクターで形質転換した後、組換え細菌を得る。モノクローナル組換え細菌を１０ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン１００μｇ／ｍＬ）に取り、一晩培養する。次いで、１ＬのＬＢ培地（カナマイシン１００μｇ／ｍＬ）に移す。菌液の濁度のＯＤ_６００が０．８程度に達するまで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して４時間誘導し、遠心分離によって細菌を回収する。細菌を破壊した後、封入体タンパク質を回収する。溶解している封入体タンパク質を復元し、次いで、アニオン交換カラムによって精製する。サンプルローディングバッファは、以下の通りである：８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及びｐＨ８．０、３０ｍＭのＢＭＥ。１ＭのＮａＣｌをローディングバッファに添加したものが溶出バッファである。直線勾配溶出を用いて、段階毎に溶出ピークを回収する。電気泳動によってタンパク質の純度を検出する。純度が８０％超である成分を選択して、リフォールディング実験を行う。リフォールディングするとき、８Ｍの尿素を含有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）を用いてタンパク質濃度を０．２ｍｇ／ｍＬ未満に調整し、次いで、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの塩化カルシウム（ｐＨ８．０）を用いて透析を行う。少なくとも４時間間隔で透析液を交換し、少なくとも２回リフォールディング溶液を交換し、一晩十分に透析する。最後に、精製タンパク質を回収するために２０ｍＭのトリス−ＨＣｌローディングバッファを用いて透析を行う。精製にはアニオン交換カラムを用いる。カラムに添加する前に、サンプルを遠心分離するか、孔径０．２２ミクロンの膜で濾過すべきである。直線勾配の塩イオンを用い、段階毎にタンパク質のピークを回収する。オキシドゲル電気泳動によって純度を検出する。

ｂ．フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質は、クエン酸合成酵素の熱変性凝集を阻害する
クエン酸合成酵素は、ＴＣＡ回路において重要な酵素であるが、その熱安定性は低い。４３℃の温度で変性し、凝集し、沈殿する。クエン酸合成酵素の凝集プロセスは、光散乱の変化により調べることができる。方法は、以下の通りである：

励起光、放射モノクロメータを５００ｎｍに、スリット幅を２．５ｎｍに調整した蛍光分析機器ＦＬ４５００（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ）で光散乱のプロセスを検出する。クエン酸合成酵素を４０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ溶液に溶解させ、最終濃度を０．１５μＭにする。同時に、実験群１に０．１５μＭのフィブリノーゲン４２０を添加し、実験群２に０．１５μＭのアルファＥＣドメインタンパク質を添加し、対照群１に等体積のＨＥＰＥＳバッファ溶液を添加し、対照群２に等体積の１．２μＭのウシ血清アルブミンを添加する。サンプルを４３℃の水浴に入れ、光散乱シグナルを検出する。この実験を３回繰り返す。

図１に示す光散乱シグナルの検出結果は、２００秒間の加熱工程中に、対照群１及び２のクエン酸合成酵素が凝集し始め、光散乱シグナルの強度が高まることを示す。しかし、実験群１及び２のクエン酸合成酵素の凝集は、明らかに少ない。実験群２の阻害効果は、実験群１よりも大きい。更に、０．１５μＭのアルファＥＣドメインタンパク質は、熱変性及び凝集プロセス中、等モルのクエン酸合成酵素を略完全に阻害することができる。

図１において、（○）は、対照群１を表し、（△）は、対照群２を表し、（◇）は、実験群１を表し、（□）は、実験群２を表す。

ｃ．フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質は、クエン酸合成酵素の化学変性凝集を阻害する
クエン酸合成酵素は、塩酸グアニジン及び還元剤条件下（６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのＤＴＴ、室温で２時間インキュベート）で完全に変性し、それを４０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファで最終濃度０．１５μＭに希釈した。同時に、実験群１に０．３μＭのアルファＥＣドメインタンパク質を添加し、実験群２に０．６μＭのアルファＥＣドメインタンパク質を添加し、対照群１に等体積のＨＥＰＥＳバッファを添加し、対照群２に等体積の１．２μＭのウシ血清アルブミンを添加した。次いで、蛍光分析機器ＦＬ４５００（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ）で各サンプルの光散乱シグナルを検出し、この実験を３回繰り返した。励起波長及び発光波長は５００ｎｍ、スリット幅は２．５ｎｍであった。

図２に示される光散乱シグナルの検出結果は、対照群と比べて、実験群における凝集プロセスが著しく変化することを示す。０．３μＭのアルファＥＣは、凝集プロセスを劇的に阻害し、一方、０．６μＭのアルファＥＣは、凝集を略完全に阻害する。

図２において、（○）は、対照群１を表し、（●）は、対照群２を表し、（△）は、実験群１を表し、（□）は、０．６μＭのアルファＥＣの添加を表す。

実施例２：フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質は、クエン酸合成酵素（ＣＳ）の活性を保護する
フィブリノーゲン４２０及びアルファＥＣドメインタンパク質の、熱変性によるＣＳ不活化阻害実験の方法は、以下の通りである：
４０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ溶液にクエン酸合成酵素を溶解させ、最終濃度を０．０７５μＭにする。同時に、実験群１に０．０７５μＭのフィブリノーゲン４２０を添加し、実験群２に０．１５μＭのフィブリノーゲン４２０を添加し、実験群３に０．０７５μＭのアルファＥＣドメインタンパク質を添加し、実験群４に０．１５μＭのアルファＥＣドメインタンパク質を添加し、対照群に等体積のＨＥＰＥＳバッファ溶液を添加する。サンプルを４３℃の水浴に入れ、クエン酸合成酵素の活性の変化を検出し始める。加熱前のクエン酸合成酵素の活性を１００％と定義する。

クエン酸合成酵素の活性を検出する方法は、以下の通りである：
ＴＥバッファ溶液９３０μＬ（５０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１０ｍＭのオキサロ酢酸１０μＬ、１０ｍＭのＤＴＮＢ１０μＬ、５ｍＭのアセチル−ＣｏＡ３０μＬ）。上記溶液を混合し、２０μＬのクエン酸合成酵素を含有する溶液に速やかに添加し、４１２ｎｍの波長における紫外線吸収の動的変化を検出する。吸収度の変化の直線性曲線勾配は、酵素活性を表す。

図６及び７に示すクエン酸合成酵素活性の測定結果は、経時的に、対照群のクエン酸合成酵素の活性は速やかに低下するが、全ての実験群では活性の低下速度を有効に減速させ得ることを示す。

図３において、（○）は、対照群を表し、（△）は、実験群１を表し、（□）は、実験群２を表す。図４において、（○）は、対照群を表し、（△）は、実験群３を表し、（□）は、実験群４を表す。

実施例３：アルファＥＣドメインタンパク質は、クエン酸合成酵素を特異的に認識する
クエン酸合成酵素及びアルファＥＣドメインタンパク質を４３℃で一緒にインキュベートする。５分間又は１０分間加熱した後、クエン酸合成酵素及びアルファＥＣドメインタンパク質の抗体を上清に添加して、免疫共沈降法を実施する。対照群では、クエン酸合成酵素及びアルファＥＣドメインタンパク質を室温で一緒にインキュベートし、クエン酸合成酵素及びアルファＥＣドメインタンパク質の抗体を上清に添加して、免疫共沈降法を実施する。

図５に示す結果は、クエン酸合成酵素の抗体を添加した後、変性クエン酸合成酵素は、沈殿することができ、また、アルファＥＣドメインタンパク質も同時に沈殿できることを示す。アルファＥＣドメインタンパク質の抗体を添加した後、アルファＥＣドメインタンパク質及びクエン酸合成酵素の両方が沈殿することができる。上記結果は、加熱後、クエン酸合成酵素及びアルファＥＣドメインタンパク質は複合体を形成することができ、その結果、一方のタンパク質の抗体が他のタンパク質を同時に沈殿させることをできることを示す。対照群では、免疫共沈降は生じない。結果は、アルファＥＣドメインタンパク質は、熱変性したクエン酸合成酵素を特異的に認識し、結合することができる。

図５において、上図は、クエン酸合成酵素の免疫共沈降である。電気泳動後にアルファＥＣドメインタンパク質の抗体で検出する。レーン１は、ポジティブコントロールである。レーン２は、室温で１０分間インキュベートした後の免疫共沈降を示す。レーン３及びレーン４は、それぞれ、４３℃で５分間及び１０分間加熱した後の免疫共沈降を表す。下図は、電気泳動後にクエン酸合成酵素の抗体で検出した、アルファＥＣドメインタンパク質の抗体による免疫共沈降である。レーン１は、ポジティブコントロールである。レーン２は、室温で１０分間インキュベートした後の免疫共沈降を示す。レーン３及び４は、それぞれ、４３℃で５分間及び１０分間インキュベートした後の免疫共沈降を示す。図において、「ＣＳ」は、クエン酸合成酵素を示し、「アルファＥＣ」は、アルファＥＣドメインタンパク質を表す。

Claims

タンパク質凝集を阻害するか又は変性タンパク質をリフォールディングさせることを特徴とする以下のａ）又はｂ）のタンパク質の用途；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
ａ）又はｂ）に記載のタンパク質と変性タンパク質とのモル比が、２５：１〜１：１００である請求項１に記載の用途。
タンパク質ミスフォールディング病の予防及び治療の少なくともいずれかを行うことができる医薬の調製における以下のａ）又はｂ）のタンパク質の用途；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
タンパク質コンフォメーション病の予防及び／又は治療の少なくともいずれかを行うための医薬であって、その活性成分が、以下のａ）又はｂ）のタンパク質であることを特徴とする医薬；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
タンパク質の変性を防ぐことを特徴とする以下のａ）又はｂ）のタンパク質の用途；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
タンパク質変性疾患を治療するための医薬であって、その活性成分が以下のａ）又はｂ）のタンパク質であることを特徴とする医薬；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
活性成分が以下のａ）又はｂ）のタンパク質であることを特徴とするタンパク質安定化剤；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。
タンパク質産物の品質管理及び検出における以下のａ）又はｂ）のタンパク質の用途；
ａ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号１である；
ｂ）フィブリノーゲン４２０、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン４２０である。