JP2012519660A - フィブリノーゲン420及びその活性ドメインの新規用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a.フィブリノーゲン420及びアルファECドメインタンパク質の調製
フィブリノーゲン420の調製は、血液又は臍帯血からフィブリノーゲン混合物を精製することから始め、その後、フィブリノーゲンを更に精製することができる。詳細は、以下の通りである:
5−GGAATTCCATATGGACTGTGATGATGTCCTCC−3’
5−ACCGCTCGAGCTATTGGGTCACAAGGGGCC−3’
NdeI及びXhoIの制限酵素部位がプライマーに組み込まれている。PCR増幅のアニーリング温度は、55℃である。同じ2つの制限酵素部位を制限酵素NdeI及びXhoIで切断した後、αECフラグメントをpET−30a発現ベクター(Novagen Inc.)に連結させる。大腸菌のコンピーテントセルBL21/DE3(Beijing DingGuo Biotechnology Company)を組換え発現ベクターで形質転換した後、組換え細菌を得る。モノクローナル組換え細菌を10mLのLB培地(カナマイシン100μg/mL)に取り、一晩培養する。次いで、1LのLB培地(カナマイシン100μg/mL)に移す。菌液の濁度のOD600が0.8程度に達するまで、0.5mMのIPTGを添加して4時間誘導し、遠心分離によって細菌を回収する。細菌を破壊した後、封入体タンパク質を回収する。溶解している封入体タンパク質を復元し、次いで、アニオン交換カラムによって精製する。サンプルローディングバッファは、以下の通りである:8Mの尿素、20mMのトリス−HCl及びpH8.0、30mMのBME。1MのNaClをローディングバッファに添加したものが溶出バッファである。直線勾配溶出を用いて、段階毎に溶出ピークを回収する。電気泳動によってタンパク質の純度を検出する。純度が80%超である成分を選択して、リフォールディング実験を行う。リフォールディングするとき、8Mの尿素を含有する20mMのトリス−HClバッファ(pH8.0)を用いてタンパク質濃度を0.2mg/mL未満に調整し、次いで、20mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、1mMの塩化カルシウム(pH8.0)を用いて透析を行う。少なくとも4時間間隔で透析液を交換し、少なくとも2回リフォールディング溶液を交換し、一晩十分に透析する。最後に、精製タンパク質を回収するために20mMのトリス−HClローディングバッファを用いて透析を行う。精製にはアニオン交換カラムを用いる。カラムに添加する前に、サンプルを遠心分離するか、孔径0.22ミクロンの膜で濾過すべきである。直線勾配の塩イオンを用い、段階毎にタンパク質のピークを回収する。オキシドゲル電気泳動によって純度を検出する。
クエン酸合成酵素は、TCA回路において重要な酵素であるが、その熱安定性は低い。43℃の温度で変性し、凝集し、沈殿する。クエン酸合成酵素の凝集プロセスは、光散乱の変化により調べることができる。方法は、以下の通りである:
クエン酸合成酵素は、塩酸グアニジン及び還元剤条件下(6Mの塩酸グアニジン、10mMのDTT、室温で2時間インキュベート)で完全に変性し、それを40mMのHEPESバッファで最終濃度0.15μMに希釈した。同時に、実験群1に0.3μMのアルファECドメインタンパク質を添加し、実験群2に0.6μMのアルファECドメインタンパク質を添加し、対照群1に等体積のHEPESバッファを添加し、対照群2に等体積の1.2μMのウシ血清アルブミンを添加した。次いで、蛍光分析機器FL4500(Hitachi,Ltd)で各サンプルの光散乱シグナルを検出し、この実験を3回繰り返した。励起波長及び発光波長は500nm、スリット幅は2.5nmであった。
フィブリノーゲン420及びアルファECドメインタンパク質の、熱変性によるCS不活化阻害実験の方法は、以下の通りである:
40mMのHEPESバッファ溶液にクエン酸合成酵素を溶解させ、最終濃度を0.075μMにする。同時に、実験群1に0.075μMのフィブリノーゲン420を添加し、実験群2に0.15μMのフィブリノーゲン420を添加し、実験群3に0.075μMのアルファECドメインタンパク質を添加し、実験群4に0.15μMのアルファECドメインタンパク質を添加し、対照群に等体積のHEPESバッファ溶液を添加する。サンプルを43℃の水浴に入れ、クエン酸合成酵素の活性の変化を検出し始める。加熱前のクエン酸合成酵素の活性を100%と定義する。
TEバッファ溶液930μL(50mMのトリス、2mMのEDTA、pH8.0)、10mMのオキサロ酢酸10μL、10mMのDTNB10μL、5mMのアセチル−CoA30μL)。上記溶液を混合し、20μLのクエン酸合成酵素を含有する溶液に速やかに添加し、412nmの波長における紫外線吸収の動的変化を検出する。吸収度の変化の直線性曲線勾配は、酵素活性を表す。
クエン酸合成酵素及びアルファECドメインタンパク質を43℃で一緒にインキュベートする。5分間又は10分間加熱した後、クエン酸合成酵素及びアルファECドメインタンパク質の抗体を上清に添加して、免疫共沈降法を実施する。対照群では、クエン酸合成酵素及びアルファECドメインタンパク質を室温で一緒にインキュベートし、クエン酸合成酵素及びアルファECドメインタンパク質の抗体を上清に添加して、免疫共沈降法を実施する。
Claims (8)
- タンパク質凝集を阻害するか又は変性タンパク質をリフォールディングさせることを特徴とする以下のa)又はb)のタンパク質の用途;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - a)又はb)に記載のタンパク質と変性タンパク質とのモル比が、25:1〜1:100である請求項1に記載の用途。
- タンパク質ミスフォールディング病の予防及び治療の少なくともいずれかを行うことができる医薬の調製における以下のa)又はb)のタンパク質の用途;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - タンパク質コンフォメーション病の予防及び/又は治療の少なくともいずれかを行うための医薬であって、その活性成分が、以下のa)又はb)のタンパク質であることを特徴とする医薬;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - タンパク質の変性を防ぐことを特徴とする以下のa)又はb)のタンパク質の用途;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - タンパク質変性疾患を治療するための医薬であって、その活性成分が以下のa)又はb)のタンパク質であることを特徴とする医薬;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - 活性成分が以下のa)又はb)のタンパク質であることを特徴とするタンパク質安定化剤;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。 - タンパク質産物の品質管理及び検出における以下のa)又はb)のタンパク質の用途;
a)アミノ酸配列が、配列表の配列番号1である;
b)フィブリノーゲン420、好ましくは、ヒトフィブリノーゲン420である。
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