JP2012514986A - 細胞におけるタンパク質の発現を増大させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(b)5’UTRのGC含量を80%よりも大きく変化させること、および
(c)3’UTRのGC含量を80%よりも大きく、かつその長さを80%未満に変化させること
はない。
表2および表3は、引き起こすことのできる変化を示す。これらの改変は、所与の生物におけるそれらのコドンバイアス(コドン使用頻度)に基づきタンパク質発現のためにコドンを最適化するために使用されるコドン使用頻度表(比較のために表1参照)と全く別であることに留意することが重要である。本方法は、コドン使用頻度に基づいてではなく、RNase Lの切断部位/ターゲット(UUおよびUAジヌクレオチド)数を減少させるためにコドンを変化させることを対象とする。さらに、本発明による方法は、「生物依存的」ではなく、UUおよび/またはUAジヌクレオチドの数/頻度は、対応するアミノ酸配列が変更されないままである限り(表2および3参照)、任意の生物由来の任意の遺伝子(核酸配列)において減少させることができる。さらに、UUおよび/またはUAジヌクレオチド数の減少は、また、所望の生物についての古典的コドン使用頻度最適化(例えば表1参照)と組み合わせることができ、可能性があることには、いっそうさらなる発現増大を招く。
1. 表2によりコドンを変化させる。
2. 代替コドンが1個を超えて存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンを使用する(随意)。
3. 表3により、一緒になってUUまたはUAジヌクレオチドを形成するジ−トリプレット(NNU UNN、NNU ANN)の最初のコドンを変化させる。
4. 1個を超える代替コドンが存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンまたは発現が最強のコドンを使用する(随意、表4および5参照)。
5. 古典的コドン使用頻度最適化(ホスト細胞生物、または高発現遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンの一覧に基づく)を、所望により、そして好ましくはUUおよびUA減少の前に行うことができる。
イントロンにおけるUUおよび/またはUAジヌクレオチドを減少させるための工程:
1. UU/UAジヌクレオチドにおける2個のヌクレオチドのうち1個または2個を変異または欠失させる:UUまたはUAをUC、UG、GA、CA、またはTAにする。または1個のヌクレオチドを挿入する。
2. イントロンの全GC含量は、80%を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの80%未満に変化させるべきではない。
3. エクソンのスプライス供与部位および受容部位ならびにブランチポイントを含めたエクソン−イントロン境界部を変化させてはならない。スプライスアクセプター部位からブランチポイント終末にわたるCT−リッチ領域を破壊することを避ける。
5’UTRにおけるUUおよび/またはUAジヌクレオチドを減少させる工程:
1. UUまたはUAをUC、UG、GA、CA、またはTAに変異させる。
2. 5’UTRの全GC含量は、80%を超えるべきではない。
3. コンテクスト配列はコザックなどの翻訳強化配列を有することがあるため、開始コドンATG近くのコンテクスト配列を避ける。
3’UTRにおけるUUおよび/またはUAジヌクレオチドを減少させる工程:
1. UU/UAジヌクレオチドにおける2個のヌクレオチドのうち1個または2個を変異または欠失させる:すなわちUUまたはUAからUC、UG、GA、CA、またはTAにする。または、1個のヌクレオチドを挿入する。
2. 3’UTRの全GC含量は80%を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの80%未満に変化させるべきではない。
3. AAUAAAまたはAUUAAAなどのポリAシグナルを変化させてはならず、ポリアデニル化に使用される任意の必要または補助配列エレメントが認められる場合は、それを変更することを避ける。
1. 変異:NUUNまたはNUANからNUSNへ(SはGまたはCであり、Nは任意のヌクレオチドである)
2. 挿入:NUUNまたはNUANからNUSUNまたはNUSAへ(SはGまたはCであり、Nは任意のヌクレオチドである)
3. 欠失:NUUNからNUSへ(SはGまたはCであり、Nは任意のヌクレオチドである)
4. 欠失:NUANからNANまたはNUSへ(SはGまたはCであり、Nは任意のヌクレオチドである)
/=スプライシング部位
下線=コンセンサス機能的部位
太字の下線付き斜体=ブランチポイント
.=欠失
下線=突然変異
太字の下線付き=ポリAシグナル
配列番号:8: 野生型の強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)
MONTASTREA CAVERNOSA由来野生型GFP配列
MONSTER−OM:UU/UAジヌクレオチド数を減少させることによる改変型の配列番号:10
CLAVULARIA種 − 野生型配列
CLAVULARIA種−OM:改変(UU/UA減少)
ホタルルシフェラーゼ+:野生型配列:
LUC+DU(SuperLuciferase):(UU/UA減少型)
ホタルLUC2ルシフェラーゼ野生型:
LUC2OM:LUC2改変SuperLuciferase2(UU/UA減少型)
Puntellina Plumate(GFP)野生型:
Puntellina Plumate(GFP):改変配列(UU/UA減少型)
Discosoma野生型配列由来赤色蛍光タンパク質
赤色蛍光タンパク質の改変配列
B型肝炎表面抗原野生型、adrB型肝炎ウイルス株:
HBSAGOM:B型肝炎表面抗原改変配列:
HBSAGM:HBSAGOM: B型肝炎表面抗原改変配列2
IFN−α、ヒト
IFN−αOM:改変配列
CSF3Mコロニー刺激因子野生型配列、ヒト:
CSF3Mコロニー刺激因子改変配列:
MODC野生型配列(マウスオルニチンデカルボキシラーゼ)
MODC改変配列:
不安定化および改変されたレポーター配列の例:
配列番号:31
MONTASTRAEA CAVERNOSA
Clavulariidae Clavularia−OM:改変
ホタルLUC+DU(SuperLuciferase):
ホタルLUC2OM:LUC2改変SuperLuciferase2
Puntellina Plumate GFP:改変配列
赤色蛍光タンパク質の改変配列
(1)改変EGFP配列は、遺伝子合成会社によってカスタム合成され、隣接するSalIおよびBamHI部位を有するようにpUC19ベクター中に供給した。0.1μg/ml BSAを含有する緩衝液中に10ユニットのSalIで、10μgのベクターを37℃で1時間消化させ、続いてBamHI緩衝液中のBamHIで37℃でさらに1時間消化させた。消化されたDNAをフェノール−クロロホルム法を用いて抽出し、続いてエタノール沈殿を行った。CMVプロモーターおよびBHG 3’UTRを有する発現ベクターを同じ制限酵素(SalIおよびXbaI)で消化しておいたものにに合成EGFP−コード領域をライゲーションし、フェノール−クロロホルム抽出によって精製し、続いてエタノール沈澱を行った。発現ベクターへのEGFP−DNAのクローニングは、以下のライゲーション反応を用いて行った:消化されたベクターDNA 30μgを消化されたEGFP−DNA 90μgと共に、T4 DNAリガーゼを含有する反応液10μl中で混合した。ライゲーション産物を使用して、DH5αコンピテントE. coli細胞をトランスフォーメーションし、続いて結果として得られたコロニーを細菌培養培地中でエクスパンションさせた。Qiagenプラスミド精製キット(Qiagen, Germany)を使用してリコンビナントDNAを抽出した。挿入物を有するベクターのサイズは、ゲル電気泳動を用いて検証した。野生型DNAを有するベクターに加えて、UU/UA減少型改変コード領域を有する、結果として得られた発現ベクターを機能的実験に使用して、コードされたタンパク質の発現を確認した。10% FBSおよび抗生物質(Invitrogen)を補充したDMEM培地中で標準培養条件(37℃、5% CO2)でHEK293細胞を成長させた。96ウェルプレートのウェル1個あたり2.5×104個の細胞に、EGFPのUU/UA減少型改変コード領域を有するベクターまたは野生型EGFP−DNAを有するベクター100ngをトランスフェクションした。Lipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して無血清培地中でトランスフェクションを5時間行い、続いて培地を血清補充培地に置換した。約24または48時間後に、プレートをイメージングし、BDハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
Claims (21)
- タンパク質の核酸配列におけるRNase Lの切断部位数を減少させる工程を含む、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法。
- RNase Lの切断部位数が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、さらに好ましくは少なくとも50%減少される、請求項1記載の方法。
- 切断部位が、UUおよび/またはUAジヌクレオチドである、請求項1または2記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列のコード領域における該数を減少させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 核酸配列におけるRNase Lの切断部位数を減少させる工程が、タンパク質のアミノ酸配列を変更せずに行われる、請求項4記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程において、UUおよび/またはUAジヌクレオチドを含むコドンが、UUおよび/またはUAジヌクレオチドを含まず、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される、請求項5記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程において、該隣接コドン対の少なくとも一つのコドンが、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換され、UUおよび/またはUAジヌクレオチドを含む隣接コドン対がもはやUUおよび/またはUAジヌクレオチドを含まない、請求項5記載の方法。
- 代替コドンが、細胞において、好ましくは真核細胞において、より頻繁に使用されるコドンである、請求項6または7記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列の非コード領域における該数を減少させる、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 非コード領域が、5’UTR、3’UTR、またはイントロンである、請求項9記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程が、ヌクレオチドの突然変異、欠失、または挿入によって行われる、請求項9または10記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程の前に、コドン最適化の工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- RNase Lの切断部位数を減少させる工程の後に、細胞内に、好ましくは真核細胞内に、発現活性PCR産物の形のまたは発現ベクターに含まれる、タンパク質の核酸配列をトランスフェクションする工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 細胞において、好ましくは真核細胞において発現活性PCR産物または発現ベクターからタンパク質を翻訳させる工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
- タンパク質が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびGPCRを含む群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- RNase Lの切断部位数が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、さらに好ましくは少なくとも50%減少している、核酸配列。
- レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびGPCRを含む群より選択されるタンパク質の核酸配列である、請求項16記載の核酸配列。
- 配列番号:2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、23、24、26、28、30〜36より選択される配列を有する、請求項16記載の核酸配列。
- 請求項16〜18のいずれか記載の核酸配列を含む、発現活性PCR産物または発現ベクター。
- 請求項19記載の発現活性PCR産物または発現ベクターを有する任意の生物のホスト細胞。
- レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびGPCRを含む群より選択される、請求項14記載の方法によって産生されたタンパク質。
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