JP2012512892A - クプレドキシンを用いて癌を防止する組成物及び方法 - Google Patents

クプレドキシンを用いて癌を防止する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract


本発明は、細胞毒性化合物の優先的移入によって癌細胞を死滅させるかその成長を阻害するための方法及び材料を開示する。細胞毒性化合物の優先的移入は、アズリンのｐ１８及びｐ２８切断型等のクプレドキシンに由来するタンパク質形質導入ドメインを使用することで達成される。

Description

関連出願
本願は、２００７年１２月１４日付で提出された米国特許出願第６１／０１３，７０９号の優先権を主張する２００８年１２月１５日付で提出された米国特許出願第１２／３１４，７０３号の一部係属出願である２００８年１２月１８日付で提出された米国特許出願第１２／３３８，４８０号の一部係属出願であり、米国特許法第１１９条及び１２０条に基づきその優先権を主張するものであり；２００７年２月８日付で提出された米国特許出願第６０／９００，０９８号の優先権を主張する２００８年２月８日付で提出された１２／０２８，６８３号の一部係属出願であり；２００５年７月１９日付で提出された米国特許出願第６０／７００，２９７号の優先権を主張する２００６年７月１９日付で提出された特許出願第１１／４８８，６９３号の一部係属出願であり；２００４年１０月７日付で提出された米国仮特許出願第６０／６１６，７８２号、及び２００５年５月１３日付で提出された米国仮特許出願第６０／６８０，５００号の優先権を主張する２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号の一部係属出願である。
技術分野
本発明は、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を含む組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物において前悪性病変の発達、究極的には癌の発達を阻害するための化学予防剤としての、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物の使用に関する。
癌の化学予防では、発癌から浸潤性の癌への進行を逆行、抑制、又は防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する天然、合成、又は生物化学的薬剤を使用する。高リスク集団の癌の防止における最近の臨床試験から、化学予防療法が高リスク患者のための現実的な処置であることが示唆されている。化学予防療法は、多源的な場の発癌（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｆｉｅｌｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び多段階発癌という概念に基づく。場の発癌では、組織の場全体が一般的な発癌物質に曝されることで、組織でびまん性の上皮傷害及び変異細胞のクローン増殖が起こる。場全体におけるこれらの遺伝的変異は、場で１又は複数の前悪性病変又は悪性病変が発達する可能性を高める。これらの遺伝的変化及び表現型の変化の段階的な蓄積における多段階発癌。多段階発癌の１又は複数のステップを止めることで癌の発達が阻止又は防止される（非特許文献１参照）。
マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）アッセイを用いて、ホルモンで誘発される乳腺の構造的分化及びＤＭＢＡで誘発される腺中の前新生物過形成胞巣状小結節様病変の発達の両方に対する潜在的化学予防剤の阻害効果を評価することができる。若い未交尾動物の乳腺は、インスリン（Ｉ）＋プロラクチン（Ｐ）＋アルドステロン（Ａ）存在下で６日間インキュベートすると成熟した腺に分化し得る。これらの腺は妊娠マウスから得られる腺と形態的に類似している。アルドステロンはエストロゲン（Ｅ）＋プロゲステロン（Ｐｇ）で代用することができる。培地にヒドロコルチゾン（Ｈ）を含めると、乳腺の機能的分化が刺激される（非特許文献２及び３）。したがって、この培養系で観察されるホルモン誘発性の構造的及び機能的分化は、動物の種々の生理学的段階で観察されるホルモンへの応答を模倣している。
ＭＭＯＣでは、マウスは癌形成前に顕著な前新生物段階を示す。そのような前新生物病変は、Ｃ３Ｈマウスにおいてマウス乳腺癌ウイルスにより誘発されるか、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＤＭＢＡにより誘発される。腺を増殖期の３日目と４日目の間に２μｇ／ｍｌのＤＭＢＡに曝し、その後、インスリンのみを含む培地中で２〜３週間腺を退行させると、乳房胞巣状病変（ｍａｍｍａｒｙ ａｌｖｅｏｌａｒ ｌｅｓｉｏｎ：ＭＡＬ）が形成される（非特許文献４及び５）。更に、ＤＭＢＡ誘発乳房病変を含む腺から調製した上皮細胞を同系の宿主に移植すると、乳腺癌が発達する（非特許文献６）。病理学的には、これらの腫瘍は、同じ株のマウスにＤＭＢＡを投与した時にインビボで観察されるものと同様のものである（上記文献）。
ＭＭＯＣにおけるＤＭＢＡ誘発乳房病変形成は、レチノイド等の種々のクラスの化学予防剤で阻害することができる。これらの化学予防剤には、天然産物に由来する化学予防剤、例えばブラシニン及びレスベラトロール、チオール類、抗酸化剤、オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤、例えばＯＦＭＯ及びデグエリン、プロスタグランジン合成の阻害剤、Ｃａ調整剤等が含まれる（非特許文献７〜９）。これらの研究は、この臓器培養系が乳癌の発達に対する化合物の有効性を決定する固有のモデルになることを明確に示している。これらの結果はそのような化合物をインビボで投与した場合得られる阻害と密接に関連すると予想することができる。
ＭＭＯＣは乳管病変（ｍａｍｍａｒｙ ｄｕｃｔａｌ ｌｅｓｉｏｎ：ＭＤＬ）の形成も誘発することができる。ＭＤＬは、アルドステロン及びヒドロコルチゾンの代わりにエストロゲン及びプロゲステロンを培地に含めることで誘発することができる。卵巣ステロイド存在下での胞巣状構造は非常に小さいが、組織病理切片中に乳管内病変が観察される（非特許文献１０）。卵巣ホルモン依存的ＥＲ＋乳癌に選択的に作用するタモキシフェン等の抗エストロゲン薬はＭＤＬ形成を阻害したがＭＡＬ形成は阻害しなかった。したがって、従来のＭＡＬ誘発プロトコールに加えてこの改変培養モデルを現在ＭＡＬ及びＭＯＬの両方に対する化学予防剤の効果を評価するために使用することができる。
哺乳動物細胞中へのタンパク質の移入（ｅｎｔｒｙ）は多くの場合、一般的に「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤと呼ばれるタンパク質の小セグメントにより行われる。このセグメントは、そのようなタンパク質の哺乳動物細胞中への輸送を促進するための、外来タンパク質に付けたシグナルとして用いることができる。例えば、ヒト線維芽細胞ＨＳ６８又はマウスリンパ球性白血病Ｌ１２１０細胞中で潜在的抗腫瘍薬としてＤＮＡ切断性のメタロポルフィリンの取込みを促進するために、両親媒性ペプチドが用いられる。（非特許文献１１）。
膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）又は細胞送達ベクター（ＣＤＶ）と呼ばれるペプチド、例えばペネトラチン、トランスポータン、Ｔａｔ（アミノ酸４７〜５７又は４８〜６０）、及びモデル両親媒性ペプチドＭＡＰは、短く、両親媒性であり、陽イオン性である、ペプチド及びペプチド誘導体であり、通常、複数のリジン残基及びアルギニン残基を含む（非特許文献１２）。これらは、遺伝子治療における細胞毒性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等の種々のカーゴの潜在的な輸送剤又は送達媒体として及び囮ペプチドとして大きな注目を集めている小分子のクラスを形成する（非特許文献１３〜１９）。
Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ， ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ５４：１５０−１８０（２００４） Ｍｅｈｔａ ａｎｄ Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ８０：５０１（１９７５） Ｍｅｈｔａ ａｎｄ Ｍｏｏｎ， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ３００， ３００（Ｂａｓｉｌ Ａ Ｓｔｏｌｌ ｅｄ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ １９８６） Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０：７０−７４（２００２） Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９：１９−２４（１９９７） Ｔｅｌａｎｇ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ ７６：５８８６−５８９０（１９７９） Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：２１８−２２０（１９９７） Ｍｅｈｔａ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３６：１２７５−１２８２（２０００） Ｍｅｔｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９：２１２−２１９（１９９７） Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９３：１１０３−１１０６（２００１） Ｃｈａｌｏｉｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １２：６９１−７００（２００１） Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｐ． Ｍ．， Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ， ２７：７５５−７９５（２００７） Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５１５：１０１−１０９（２００１） Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ２１：９９−１０３（２０００） Ｇｕｓａｒｏｖａ， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １１７：９９−１１１（２００７） Ｍｅｌｎｉｃｋ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ， ３５：８０２−８０６（２００７） Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ， １９：７４４−７５４（２００２） Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ， ８：１２６２−１２７３（２００６） Ｃａｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ６：８１３−８２３（２００２）
本発明は、細胞に選択的に移入して哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物であり得るペプチドを含む組成物及び方法に関する。
本発明は更に、癌細胞を細胞毒性クプレドキシン接触させることで癌細胞を死滅させることを含む方法であって、細胞毒性クプレドキシンが１又は複数のエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入し、細胞毒性クプレドキシンが配列番号２のＣ末端のアミノ酸の１又は複数を含むアズリンの切断型である、方法に関する。いくつかの実施形態では、アズリンの切断型は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する。別の実施形態では、アズリンの切断型は配列番号２を含む。更に別の実施形態では、アズリンの切断型は配列番号２からなる。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンはカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に優先的に移入する。別の実施形態では、癌細胞中への細胞毒性クプレドキシンの移入はゴルジ装置に仲介される。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、癌細胞の状態に関係なく癌細胞の細胞膜に接触できるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び／又は受容体に接触する。いくつかの実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸のそれぞれを含み得る。別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸の１又は複数を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、これらのアミノ酸は、配列番号１の位置と同様又は相同な細胞毒性クプレドキシン内の位置に位置し得る。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
本発明は更に、癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に移入することができ、癌細胞を死滅させることができ、配列番号２のＣ末端アミノ酸を含む、単離されたペプチドに関する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び／又は受容体に接触する。いくつかの実施形態では、癌細胞中への単離されたペプチドの移入はゴルジ装置により仲介される。別の実施形態では、単離されたペプチドは、緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する。別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号２からなる。更に別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号２のＣ末端アミノ酸からなる。例えば、単離されたペプチドは、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
本発明はまた、癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に移入することができ、癌細胞を死滅させることができ、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に見られるアミノ酸の１又は複数を含む、単離されたペプチドに関する。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む。これらの実施形態では、これらのアミノ酸は、配列番号１の位置と同様又は相同な単離されたペプチド内の位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び／又は受容体に接触する。
本発明は更に、上記の単離されたペプチドの１又は複数を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は更に、薬学的に許容されるキャリアを含む。別の実施形態では、薬学的に許容されるキャリアは静脈内投与に適している。
本発明は更に、治療有効量の本発明の医薬組成物の１又は複数を哺乳動物患者に投与することで患者を処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。別の実施形態では、患者は、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。別の実施形態では、癌は、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌から選択される。別の実施形態では、患者は少なくとも１つの高リスク特性を有する。別の実施形態では、患者は前悪性病変を有する。別の実施形態では、患者は癌又は前悪性病変の治療歴を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される。具体的な実施形態では、投与形態は静脈内注射による。
本発明は更に、バイアル中に本発明の医薬組成物の１又は複数を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは更に、活性組成物を患者に投与するための装置を含む。
本発明は更に、カーゴ化合物及び本発明の単離されたペプチドの１又は複数を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドはカーゴ化合物に連結されている。具体的な一実施形態では、カーゴ化合物はタモキシフェンである。別の実施形態では、カーゴ化合物はタンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、及び薬物からなる群から選択される。別の実施形態では、カーゴ化合物は検出可能な物質である。例えば、カーゴ化合物は、Ｘ腺ＣＴにより検出可能なＸ腺造影剤、ＭＲＩにより検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤、又は超音波造影剤であり得、超音波により検出される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容されるキャリアを更に含む。
本発明はまた、前述したようにカーゴ化合物及び上記単離されたペプチドの１又は複数を含む医薬組成物に細胞を接触させることでカーゴ化合物を細胞中に送達することを含む方法に関する。
本発明の上記及びその他の態様、利点、及び特徴は添付の図面及び以下の特定の実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
配列の簡単な説明
配列番号１：緑膿菌由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ）
配列番号２：ｐ２８（緑膿菌のアズリン残基５０〜７７）のアミノ酸配列（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号３：フォルミジウム・ラミノスム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｌａｍｉｎｏｓｕｍ）由来のプラストシアニンのアミノ酸配列（Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ）
配列番号４：鉄酸化細菌由来のラスチシアニンのアミノ酸配列（Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ）
配列番号５：アクロモバクター・サイクロクラステス由来のシュードアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ）
配列番号６：アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）
配列番号７：アクロモバクター・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＩ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｓｐ． ｄｅｎｉｔｒｉｆｌｃａｎｓ Ｉ）由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ）
配列番号８：気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ）
配列番号９：メチロモナスｓｐ．Ｊ由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ）
配列番号１０：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｚ２４９１由来のアズリンのアミノ酸配列（Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ）
配列番号１１：シュードモナス・フルオレッセン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ）由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ）
配列番号１２：シュードモナス・クロロラフィス由来のアズリンのアミノ酸配列（Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ）
配列番号１３：ピアス病菌９ａ５ｃ由来のアズリンのアミノ酸配列（Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）
配列番号１４：キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）由来のステラシアニンのアミノ酸配列（Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ）
配列番号１５：クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来のオーラシアニンＡのアミノ酸配列（Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ）
配列番号１６：クロロフレクサス・アウランティアカス由来のオーラシアニンＢのアミノ酸配列（Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ）
配列番号１７：キュウリ由来のキュウリ塩基性タンパク質のアミノ酸配列（Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ）
配列番号１８：淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）Ｆ６２由来のＬａｚのアミノ酸配列（Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ）
配列番号１９：腸炎ビブリオ由来のアズリンのアミノ酸配列（Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ）
配列番号２０：クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢのアミノ酸５７〜８９のアミノ酸配列（Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ）
配列番号２１：シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）のアズリンのアミノ酸５１〜７７のアミノ酸配列（Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号２２：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬａｚのアミノ酸８９〜１１５のアミノ酸配列（Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号２３：腸炎ビブリオのアズリンのアミノ酸５２〜７８のアミノ酸配列（Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号２４：気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）のアズリンのアミノ酸５１〜７７のアミノ酸配列（Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ）
配列番号２５：ｐ１８（緑膿菌アズリン残基５０〜６７）のアミノ酸配列（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ）
配列番号２６：緑膿菌のアズリンのアミノ酸３６〜８８のアミノ酸配列（Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ）
配列番号２７：緑膿菌のアズリンのアミノ酸３６〜７７のアミノ酸配列（Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号２８：緑膿菌のアズリンのアミノ酸３６〜８９のアミノ酸配列（Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）
配列番号２９：緑膿菌のアズリンのアミノ酸３６〜１２８のアミノ酸配列（Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｉｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ）
配列番号３０：緑膿菌のアズリンのアミノ酸５３〜７０のアミノ酸配列（Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ）
配列番号３１：緑膿菌のアズリンのアミノ酸５３〜６４のアミノ酸配列（Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ）
配列番号３２：アミノ酸配列ＤＧＸＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ
配列番号３３：アミノ酸配列ＤＧＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ
配列番号３４：ｐ１８ｂ（緑膿菌アズリン残基６０〜７７）のアミノ酸配列（Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号３５：ｐ２８のＣ末端１２アミノ酸（緑膿菌アズリン残基６６〜７７：ｐ１２）の配列（Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号３６：ｐ２８のＣ末端１０アミノ酸（緑膿菌アズリン残基６８〜７７）の配列（Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号３７：ｐ２８のＣ末端１１アミノ酸（緑膿菌アズリン残基６７〜７７）の配列（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）
配列番号３８はアズリン切断型ｐ２８のバリアントのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号３９はアズリン切断型ｐ２８のバリアントのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号４０はアズリン切断型ｐ２８のバリアントのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号４１は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）。
配列番号４２は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（アセチル化−Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ−アミド化）。
配列番号４３はヘキサペプチドのアミノ酸配列である（Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ）。
配列番号４４はヘキサペプチドのアミノ酸配列である（Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ）。
配列番号４５はヘキサペプチドのアミノ酸配列である（Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ）。
配列番号４６は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ）。
配列番号４７は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号４８は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号４９は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５０は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５１は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５２は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５３は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５４は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５５は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５６は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５７は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５８は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号５９は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６０は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６１は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６２は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６３は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６４は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６５は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６６は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６７は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６８は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号６９は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７０は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７１は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７２は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７３は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７４は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７５は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ）。
配列番号７６は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｘ１ Ｓｅｒ Ｘ２ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｘ６ Ａｓｐ Ｘ７ Ｘ８ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｘ９）。
配列番号７７は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である（Ｘ１ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｘ２ Ｘ３ Ａｓｐ Ｘ４ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｘ８ Ｓｅｒ Ｘ９）。
配列番号７８はｐＵＣ１９−ａｚｕのプライマーである（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣ ＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣ ＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴ ＣＡＴＧＧＧＣ−３’）。
配列番号７９はｐＵＣ１９−ａｚｕのプライマーである（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣ ＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＧ ＧＴＣＡＧＧＧ−３’）。
配列番号８０はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜５０のプライマーである（５’−ＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴ ＧＧＧＴＡＣＴＧＴＧ ＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣ ＧＡＣＡＴＧＣＡＧ−３’）。
配列番号８１はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜５０のプライマーである（５’−ＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧ ＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣ ＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡ ＧＴＴＧＴＧＧＣＣ−３’）。
配列番号８２はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７のプライマーである（５’−ＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣ ＧＡＣＧＡＣＴＧＡＣ ＧＴＧＴＣＡＴＣＧＣ ＣＣＡＣＡＣＣ−３’）。
配列番号８３はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７のプライマーである（５’−ＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧ ＡＴＧＡＣＡＣＧＴＣ ＡＧＴＣＧＴＣＧＧＧ ＣＴＴＣＡＧＧ−３’）
配列番号８４はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９のプライマーである（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴ ＣＧＧＣＴＣＧＴＧＡ ＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴ ＣＧＧＴＧＡＣＣ−３’）
配列番号８５はｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９のプライマーである（５’−ＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧ ＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣ ＡＣＧＡＧＣＣＧＡＴ ＣＡＧＣＴＴＧＧ−３’）。
配列番号８６はａｚｕ５０〜７７のプライマーである（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧ ＣＣＧＡＣＡＴＧＣＡ ＧＧＧ−３’）。
配列番号８７はａｚｕ６７〜７７のプライマーである（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣ ＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡ ＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴ ＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’）。
配列番号８８はリバースプライマーである（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣ ＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧ ＧＧＴＣＡＧＧＧ−３’）。
配列番号８９はｐＧＳＴ−ａｚｕ−５０〜６６のプライマーである（５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧ ＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴ ＧＧＡＣＡＡＧＧＡＴ ＴＡＣＣ−３’）。
配列番号９０はｐＧＳＴ−ａｚｕ−５０〜６６のプライマーである（５’−ＧＧＴＡＡＴＣＣＴＴ ＧＴＣＣＡ ＧＴＣＡＧ ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＣ ＣＧＴＣ−３’）。
配列番号９１はフォワードプライマーである（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣ ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡ ＡＧＧＧＣＧ−３’）。
配列番号９２はリバースプライマーである（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴ ＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣ ＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’）。
配列番号９３はｐＧＳＴ−ａｚｕ５０〜７７のプライマーである（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣ ＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧ ＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡ ＧＧＧ−３’）。
配列番号９４はｐＧＳＴ−ａｚｕ５０〜７７のプライマーである（５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣ ＡＧＴＣＧＴＣＧＧＧ ＣＴＴＣＡＧＧＴＡＡ ＴＣ Ｃ−３’）。
配列番号９５はポリアルギニン、すなわちＡｒｇ８のアミノ酸配列である（Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ）。
配列番号９５はｐ１８の一部分のアミノ酸配列である（Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ）。
ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図１Ａは、ＤＭＢＡ処置した腺における胞巣状病変の代表的写真及びＤＭＢＡと化学予防剤で処置した腺との比較を示す図である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図１Ｂ〜１Ｆは、胞巣状病変の発達に対するｐ２８の効果の代表的写真である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図１Ｂ〜１Ｆは、胞巣状病変の発達に対するｐ２８の効果の代表的写真である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図１Ｂ〜１Ｆは、胞巣状病変の発達に対するｐ２８の効果の代表的写真である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図１Ｂ〜１Ｆは、胞巣状病変の発達に対するｐ２８の効果の代表的写真である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。 ｐ２８及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。 ＤＭＢＡ誘発乳腺胞巣状病変に対するｐ２８の有効性を示すグラフである。 腺管病変の代表的切片及びｐ２８の効果を示す写真である。 ＤＭＢＡ誘発腺管病変に対するｐ２８の効果を示すグラフである。 ｗｔアズリン中のαヘリックス及びｗｔアズリン５０〜７７タンパク質形質導入ドメイン中のαヘリックスの局在を示すダイアグラムである。プロリン残基によるアズリン５０〜７７ドメイン中の３個のアミノ酸の置換を示す。 （Ａ）ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質の構築を示すダイアグラムである。ｇｓｔ遺伝子の３’末端にｇｆｐ遺伝子を導入し（ＧＳＴ−ＧＦＰを得るため）、次いで、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質が生成されるようにフレームを合わせてｇｆｐ遺伝子の３’末端にａｚｕ５０〜７７断片をライゲーションさせた。細胞可溶化物からＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７を単一の融合タンパク質として精製した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クーマシーブルー染色（６（Ｂ）及び抗アズリン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した（６（Ｃ））。 ＧＳＴ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＧＳＴ−ＧＦＰ−アズリン融合タンパク質の内部移行のカイネティクス研究を示すダイアグラムである。種々の濃度のＧＳＴ−ＧＦＰ（１０（ａ））又はＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７（１０（ｂ））を用いて３７℃で１時間処置したＪ７７４細胞における緑色蛍光をアッセイした。フローサイトメトリーにより１万個の細胞を分析した。（ｃ）ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７の内部移行の時間依存性。Ｊ７７４細胞を２００μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７と３７℃で記載の時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。 （Ａ）前述のＧＳＴ−ＧＦＰ融合体と同様にＧＳＴに融合させた外毒素ＡドメインＩＩＩ（アミノ酸４０５〜６１３）及びドメインＩｂの一部（アミノ酸３８１〜４０４）（ＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ）を示すダイアグラムである。次いで、ＰＣＲを用いてａｚｕ５０〜７７断片をＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩのカルボキシル末端にライゲーションさせた（ＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７）。（Ｂ）融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂカラムゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてサイズを決定した。（Ｃ）ＰＥＤＩＩＩを介した細胞毒性により決定されるＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２癌細胞及び正常線維芽（ＦＢＴ）細胞におけるＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質の作用を示すダイアグラムである。記載されている種々の濃度のＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ及びＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７をＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２及びＦＢＴ細胞と２４時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイによって細胞生存率を求めた。 ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２癌細胞及びＦＢＴ細胞に対するＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ラスチシアニン融合タンパク質のＰＥＤＩＩＩを介した細胞毒性を示すダイアグラムである。記載されている種々の濃度のＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ及びＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７をＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２及びＦＢＴ細胞と２４時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイによって細胞生存率を求めた。 多様な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドｐ１８及びｐ２８の透過を示す写真である。（Ａ）３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８又はｐ１８の透過を示す写真である。陽イオン性Ａｒｇ８（配列番号９５）を対照として用いた。（Ｂ）同じ細胞株中への３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８又はｐ１８の透過のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。（Ｃ）正常細胞の蛍光に対する増加倍率を示すグラフである。４つのメラノーマ細胞株へのｐ２８又はｐ１８の移入を同様に観察した結果、正常細胞からの蛍光に比べて数倍の増加が示された。 癌細胞及び正常細胞中へのａｚｕ６０〜７７（ｐ１８ｂ）及びａｚｕ６６〜７７（ｐ１２）の移入を示す写真である。細胞をａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８ｂ（Ａ）及びｐ１２（Ｂ）と３７℃で２時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で画像を記録した。 アズリン及びそのペプチドの細胞膜毒性を示すグラフである。（Ａ）３７℃で種々の濃度のｐ２８、ｐ１８、及びアズリンに１０分間暴露したＵＩＳＯＭｅｌ−２細胞のＬＤＨ漏出アッセイ。標準可溶化バッファー（ｃｙｔｏｔｏｘ−ｏｎｅ試薬）を正の対照として含めた。暴露後の蛍光の変化をλｅｘ５６０ｎｍ及びλｅｍ５９０ｎｍで測定した。溶解バッファーを１００％ＬＤＨ放出と定義した。データは正の対照の蛍光に対する％を表す。データは平均値±ＳＥＭで表す。（Ｂ）ｐ２８、ｐ１８、及びアズリンとインキュベートしたヒト赤血球からのヘモグロビン漏出。ヒト赤血球をペプチドと３７℃で３０分間インキュベートし、５４０ｎｍの吸光度を測定した。０．１％トリトンＸ−１００後のヘモグロビンの放出を１００％のヘモグロビン放出と定義した。データは３回の測定の平均値±ＳＥＭを表す。 ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８及びｐ１８の温度依存的且つ競合的な内部移行を示す写真である。２０１１ＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（Ａ）及びｐ１８（Ｂ）の透過を種々の温度での共焦点顕微鏡法によって評価した。（Ｃ）及び（Ｄ）非標識ペプチド（２００倍過剰量）存在化／非存在下における３７℃で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（Ｃ）又はｐ１８（Ｄ）の移入の共焦点分析を示す図である。 （Ａ）ヘパリン硫酸（１００μｇ／ｍｌ）の存在下／非存在下において３７℃で１時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への２８、ｐ１８（２０μＭ）、及びＡｒｇ８（配列番号９５）（１０μＭ）の移入の共焦点分析を示す写真である。 （Ｂ）阻害剤存在下におけるｐ２８又はｐ１８の移入のサイトメトリー分析を示すグラフである。阻害剤非存在下における細胞蛍光強度（対照）を１００％とみなした。 （Ｃ）阻害剤存在下における線維芽細胞中へのｐ２８及びｐ１８の移入のＦＲＣＳ分析を示すグラフである。 （Ｄ）ｐ１８及びｐ２８とカベオリンＩの共局在を示す写真である（パネル１）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８又はｐ２８（２０μＭ）又は培地と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を固定し、抗カベオリン１免疫染色用に処理した。３７℃で２時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８又はｐ２８（２０μＭ）の移入の抗ゴルジン９７抗体による共焦点分析（パネル２）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中におけるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたアズリン、ｐ２８、及びｐ１８（赤色）とｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル３）及びＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル４）の共局在。細胞は２０μＭのアズリン、ｐ２８、ｐ１８、又は培地のみと３７℃でインキュベートした。９０分インキュベートした後、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ／ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒプローブを添加して細胞を３０分間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。アズリン、ｐ２８、又はｐ１８の共局在は黄色蛍光として見られる。 種々の濃度のアズリン、ｐ２８、又はｐ１８と３７℃で７２時間インキュベートしたＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を示すグラフである；ＭＴＴ（Ａ）、直接細胞計数（Ｂ）。対照ウェル中の細胞生存率（ＭＴＴ）又は細胞数を１００％とみなした。データは平均値±ＳＥＭを表す。 細胞をタンパク質及び／又はバッファーで処置した後に共焦点顕微鏡で撮影した、細胞による化合物の取込みを示す写真である。（Ａ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファーで２時間前処置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚを３７℃で３０分間添加した。（Ｂ）次いで、ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｃ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞の別の群を、１０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファーで２時間前処置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、１０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚを３７℃で３０分間添加した。（Ｄ）次いで、ＬＮ−２２９細胞を１０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び１０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｅ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｆ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｈ．８で３７℃にて３０分間処置した。（Ｇ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−タンパク質で３７℃にて３０分間処置した。（Ｈ）ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−タンパク質で３７℃にて３０分間処置した。 細胞へのペプチドの結合及び移入を示すグラフ及びチャートを示す図である。（Ａ）ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２又は線維芽細胞（３×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８を氷上で１０、５０、１００、１５０、２５０、３００、及び４００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間を添加することで反応を開始させた。細胞をフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ペプチド濃度（μＭ）に速度（ＭＦＩ／秒）をプロットすることでＫｍ及びＶｍａｘを計算した。（Ｃ）ペプチドの結合及び移入の決定には、Ｍｅｌ２全細胞（５０，０００細胞／ｍｌ）を用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ２８又はアズリンの存在下／非存在下で種々の濃度の（０〜１７５ｎＭ）放射性標識アズリンと３７℃で３０分間インキュベートし、γ線計数器を用いて細胞ペレットに残った放射活性を計測した。１２５Ｉアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン又はｐ２８存在下の放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を求め、スキャッチャード・プロットを作製した。 ６０μモル濃度のｐ２８色素複合体２５０μＬを注射した後及び対照のＰＢＳを注射した後、（Ａ）２４時間目に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ２８色素複合体２５０μＬを注射した後及び対照のＰＢＳを注射した後、（Ｂ）４８時間目に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 （Ｃ）濃度２００μＭのｐ２８を注射した２４時間後及び４８時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８を注射した（Ａ）１７時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８を注射した（Ｂ）２４時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８を注射した（Ｃ）４６時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｃ）は、ｐ１８を注射した４６時間後に撮影した心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び脳を含むマウス臓器の写真も示す。 （Ａ）ｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を６０μモル濃度で注射した１２時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）ｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した１２時間後に撮影した、マウスの脳を含むマウス臓器の写真である。 （Ａ）尾静脈に６００μＭ濃度のｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した４０時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−６腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。ｐ１８で処置した動物は５０万個の細胞を注入したものであり、ａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した動物は百万個の細胞を注入したものである。（Ｂ）濃度６００μＭのｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した４０時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 濃度６０μＭのｐ２８、ｐ１８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭのｐ２８、ｐ１８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２４時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 メラノーマＭＥＬ−２３を有するマウスに濃度６０μＭのｐ２８及びｐ１８色素ペプチド複合体を注射した４８時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 ＭＥＬ−２３腫瘍及び臓器を有するマウスに濃度６０μＭのｐ２８を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 濃度６０μＭのｐ２８及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 濃度６０μＭのｐ１８を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真。 濃度２４０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）による高投与量処置の１０時間後及び２４時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真である。 濃度２４０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）による高投与量処置の２８時間後に撮影したＭＣＦ−７腫瘍及び臓器を有するマウスの側面写真及び背面写真である。濃度２４０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）による高投与量処置の２８時間後に撮影したＭＣＦ−７を有するマウスの臓器の写真も示す。 濃度２４０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）による高投与量処置の５０時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ＨＣＴ−１１６腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 （Ａ）ＨＣＴ−１１６腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。（Ｂ）尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２１時間後に撮影したＨＣＴ−１１６腫瘍を有するマウスの側面写真である。 （Ａ）尾静脈に百万個の細胞を注射した４７日後に濃度１２０μＭのｐ２８を注射した２４時間後のＨＣＴ−１１６を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）尾静脈に百万個の細胞を注射した４７日後に濃度１２０μＭ濃度のｐ２８を注射した４時間後のＨＣＴ−１１６を有するマウスから得られたマウス臓器の写真である。 濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２４時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）並びに濃度６０６０μＭのａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）濃度１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）並びに濃度６０μＭのａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した後のＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものであり、脳へのｐ１８及びｐ２８の取込みの差を示している。 濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した１６時間後に撮影した、ドキソルビシン及びｐ２８の実験中のＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ２８及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ２８及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものである。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものである。 尾静脈を介して処置した肺転移を有するＨＴ−１０８０マウスの写真である。（Ａ）３ｍｇ／ｋｇ ドキソルビシンＩＰ、３回処置；（Ｂ）５ｍｇ／ｋｇ ＩＰ ｐ２８、毎日処置；（Ｃ）ＰＢＳ対照、ＰＢＳ ＩＰ、毎日処置；（Ｄ）１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ ｐ２８、毎日処置；（Ｅ）２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ、毎日処置。 （Ａ）１×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）し、処置された全マウスが肺転移を有する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８を尾静脈に注射した２４時間後及び２６時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。動物６９８２は撮影時には死亡していた。 （Ｂ）１×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８を尾静脈に注射した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。動物６９８２は撮影時には死亡していた。 １×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８を尾静脈に注射した２６時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。 Ｂａｌｂ−Ｃペプチド実験において濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した１２時間後に撮影したマウスの臓器（Ａ）及びマウスの背面（Ｂ）の写真である。 Ｂａｌｂ−Ｃペプチド実験において濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２４時間後に撮影したマウスの臓器（Ａ）及びマウスの側面（Ｂ）の写真である。 濃度６０μＭのｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）を尾静脈に注射した１６時間後の（５０万個の細胞を尾静脈に注射された）ＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 ｐ１８及びｐ２８で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 ｐ１８及びｐ２８で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 ｐ２８、ｐ１８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）で処置した２４時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した３時間後のＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真並びにＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ｃ）濃度６０μＭのｐ１８、ｐ２８、及びａｒｇ−８（配列番号９５）を注射した２４時間後のＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）マウス脳及び（Ｂ）マウス臓器へのｐ１８及びｐ２８の取込みを示す図である）。 ５０万個の細胞を尾静脈にＩ．Ｖ．注射（４４日後）した実験において、濃度２４μＭのｐ１８及びａｒｇ−８（配列番号９５）を尾静脈に注射した１２０時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 ｐ１８で処置した１６８時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 細胞注射４１日後にａｒｇ−８（配列番号９５）及びｐ１８を注射した７２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 ａｒｇ−８（配列番号９５）及びｐ１８の注射後に撮影したマウスの背面写真である。 ａｒｇ−８及びｐ１８を注射した３、２４，及び４８時間後に撮影したマウスの側面写真及び前面写真である。 ｐ２８によるヒト乳癌細胞の成長阻害を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（０〜２００μＭ）と３７℃で２４、４８、及び７２時間インキュベートした。細胞計数（Ａ）及びＭＴＴアッセイ（Ｂ）。ドキソルビシン（１０μＭ）を正の対照として用いた。対照のウェルの細胞数又は生存率を１００％とみなした。データは対照±ＳＥＭの平均％を表す。＊ｐ＜０．０５。 ｐ２８によるヒト乳癌細胞の成長阻害を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（０〜２００μＭ）と３７℃で２４、４８、及び７２時間インキュベートした。細胞計数（Ａ）及びＭＴＴアッセイ（Ｂ）。ドキソルビシン（１０μＭ）を正の対照として用いた。対照のウェルの細胞数又は生存率を１００％とみなした。データは対照±ＳＥＭの平均％を表す。＊ｐ＜０．０５。 （Ｃ）ｐ２８によるＭＣＦ−７異種移植片の成長阻害。１群当たり最低１０頭のマウスを、１０、１４、２１、及び２５日目に１５μｍｏｌ／ｋｇのパクリタキセル（ｉ．ｐ）で処置するか、５又は１０ｍｇ／ｋｇのｐ２８（ｉ．ｐ．）で３０日間毎日処置した。バーは平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。 （Ａ）及び（Ｂ）はｐ２８による乳癌細胞の透過及び細胞周期のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞（Ａ）及びＭＤＤ２細胞（Ｂ）をｐ２８（５０μＭ）で４８時間及び７２時間処置した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、Ｙａｍａｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １０１：４７７０−４７７５（２００４）に記載されているようにフローサイトメトリーで分析した。Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、及びｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシス）期の細胞の割合を示す。（Ｃ）は、カバースリップ上でフェノールレッドを含まないＭＥＭ中で一晩培養し、２０μＭのｐ２８又は１０μＭの陽イオン性（正の対照）ペプチド、オクタアルギニン（Ａｒｇ８）（配列番号９５）を用いて３７℃で２時間処置したＭＣＦ−７細胞及びＭＤＤ２細胞を示す写真を含む。赤色−Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５６８標識ｐ２８。青色−ＤＡＰＩ（核）。 ｐ２８とｐ５３の相互作用を示す図である。（Ａ）〜（Ｄ）は、ｐ５３及びｐ２８の細胞内レベルを示す写真である。（Ａ）ｐ２８とインキュベートした後のＭＣＦ−７細胞中の経時的ｐ５３レベル。処置直前のｐ５３レベルに対する増加率（％）（０時間を１００％とする）。（Ｂ）ＧＳＴ−ｐ２８とｐ５３の複合体形成を示すＧＳＴプルダウンアッセイ。左から順に、ＧＳＴ−ｐ２８（１０及び２０μｇ／反応）、ＧＳＴ−ＭＤＭ２、及びＧＳＴ単独。抗ｐ５３抗体を用いたイムノブロッティング（ＩＢ）によりｐ５３を検出した。（Ｃ）モル濃度過剰のｐ２８存在下でＧＳＴ−ＭＤＭ２はｐ５３をプルダウンした（上）。３種類の異なる抗ｐ５３抗体、Ｐａｂ１８０１（３２〜７９アミノ酸）、ａｂ２４３３（２７７〜２９６アミノ酸）、及びＰａｂ１８０２（３０６〜３９３アミノ酸）はｐ２８の存在下でＧＳＴ−ｐ５３不動化ビーズと反応した。抗ｐ２８抗体を用いたＩＢによりｐ２８を検出した（下）。（Ｄ）ｐ２８によるＧＳＴ−ｐ５３への結合に対する、モル濃度過剰のｐ２８断片ｐ１２、ｐ１８、及びｐ１８ｂによる競合。結合相対量（ｐ２８単独を１００％として表した）。Ｍ：ｐ２８マーカー。（Ｅ）ｐ２８又はアズリンに暴露した後のＭＣＦ−７核抽出物中におけるｐ５３とＤＮＡの結合を示すグラフである。Ｈ２Ｏ２処置したＭＣＦ−７細胞の核抽出物を内部標準とした。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を用いてｐ５３−オリゴヌクレオチド複合体を定量した。データは３回の実験の平均値±ＳＥＭで表す。 ｐ２８によるサイクリン（ＣＤＫ及びＣＤＫＩ）カスケードの誘導を示す写真である。ＭＣＦ−７細胞（Ａ）及びＭＤＤ２細胞（Ｂ）をｐ２８（５０μＭ）に２４、４８、及び７２時間暴露し、イムノブロッティングによりタンパク質レベルを求めた。ｐ２１（Ｃ）及びサイクリンＢ１（Ｄ）の細胞内局在及び相対レベル。ＭＣＦ−７細胞をカバースリップ上でｐ２８と７２時間培養した。ｐ２１及びサイクリンＢを対応する特異的抗体で染色した。（Ｅ）抗ｐ−ｃｄｃ２抗体（カリフォルニア州のサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を用いてリン酸化ｃｄｃ２を評価した。全ての結果はアクチンを内部標準として標準化した。 タンパク質構造を示す写真である。Ａ）αヘリックス構造を有するアズリン切断型；Ｂ）７０ｎｓシミュレーションの結果；Ｃ）シミュレーションされたＣα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。 タンパク質構造を示す写真である。Ａ）αヘリックス構造を有するアズリン切断型；Ｂ）７０ｎｓシミュレーションの結果；Ｃ）シミュレーションされたＣα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。 タンパク質構造を示す写真である。Ａ）αヘリックス構造を有するアズリン切断型；Ｂ）７０ｎｓシミュレーションの結果；Ｃ）シミュレーションされたＣα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。
本明細書において、「細胞」という用語は、「単一細胞」と特に記載のない限り、単数及び複数を含む。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義で使用されている。これらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。また、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語はまた、限定されるものではないがグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化等の修飾も含む。ポリペプチドは常に完全な直鎖とは限らないと理解される。例えば、ポリペプチドはユビキチン化によって分岐されていてもよく、典型的には天然のプロセシング及び天然には起こらない人為的操作により生じるイベント等の翻訳後のイベントの結果、環状であってもよい（分岐はあってもなくてもよい）。環状、分岐、及び分岐環状のポリペプチドは、翻訳でない天然のプロセス及び完全に合成的な方法によっても合成され得る。
本明細書において、「薬理活性」という用語は、生体系への薬物又はその他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は有益であることもあり（治療的）、有害であることもある（毒性）。純粋な化学物質又は混合物は、天然（植物、動物、又はミネラル）起源であってもよく、合成化合物であってもよい。
本明細書において、「前悪性（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ）」という用語は、前癌性（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ）、すなわち制御されていない異常な細胞分裂の前を意味する。
本明細書において、「病変」という用語は異常な組織領域を意味する。
本明細書において、「病的状態（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させ、種々の因子（例えば栄養失調、工業災害、又は気候）、特定の感染体（例えば、虫、寄生原虫、細菌、又はウイルス）、その生物に固有の欠陥（例えば遺伝的異常）、又はこれらの因子の組合せに対する応答である、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
本明細書において、「状態」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させる、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
本明細書において、「罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という用語は、病的状態の症状を現在示していること、観察可能な症状を伴わずに病的状態を有していること、病的状態からの回復中であること、又は病的状態から回復したことを含む。
本明細書において、「化学予防（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、癌の発達又は再発のリスク低減、防止、抑制、回復、又は遅延のための、生物学的なものであっても化学的なものであってもよい薬物、ビタミン、又はその他の天然若しくは合成の薬剤の使用である。
本明細書において、「細胞毒性」という用語は、細胞に対して毒性である性質を指す。例えば、「細胞毒性クプレドキシン」とは、癌細胞等の細胞に毒性であるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、又は構造的等価物である。
本明細書において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、処置される状態に関連する状態又は症状の進行又は重症度を防止、低減、停止、又は逆転させることを含む。したがって、「処置」という用語は、適切な医学的、治療的、及び／又は防止的投与を含む。癌等の状態の発達を防止又は緩和することも処置に含まれ得る。
本明細書において、「細胞成長を阻害する」という用語は、細胞分裂及び／又は細胞増殖を鈍化又は停止させることを意味する。この用語には、細胞発達の阻害又は細胞死の増加も含まれる。
「治療有効量」とは、処置されている対象の特定の状態の発達の防止、低減、停止、若しくは逆転又はその状態に存在する症状の一部又は完全な軽減に有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
本明細書において、「実質的に純粋な」という用語は、本発明のタンパク質又はその他の細胞産物を修飾して用いる場合、例えば、成長培地又は細胞内容物から他のタンパク質及び／又は他の化合物が実質的に含まれない又は混ざっていない形態で単離されたタンパク質を意味する。「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約７５％の量の因子を指し、すなわち「７５％実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約８５％の化合物を指し、すなわち少なくとも「８５％実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約９５％の化合物を指し、すなわち少なくとも「９５％実質的に純粋」であることを指す。「実質的に純粋な」という用語は、例えば合成反応の試薬及び副産物から合成タンパク質を単離した場合に本発明の合成されたタンパク質又は化合物を修飾しても使用され得る。
本明細書において、本発明のペプチド又は化合物に言及する場合の「医薬品グレード（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）」という用語は、自然の状態で見られる場合に材料に通常付随する成分（例えば合成試薬及び副産物）から実質的に又は本質的に単離されており、医薬品としての使用の障害となる成分から実質的又は本質的に単離されている、ペプチド又は化合物である。例えば、「医薬品グレード」のペプチドは如何なる発癌物質からも単離されている。場合によっては、「医薬品グレード」という用語は、組成物を患者への静脈内投与に不適切にする如何なる物質からも実質的に又は本質的に単離されたペプチド又は化合物を指定するために、「静脈内用医薬品グレード」のように、意図する投与方法によって修飾され得る。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、ＳＤＳ等の界面活性剤及びアジド等の抗菌剤から単離されているものであり得る。
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という用語は、自然の状態で材料に通常不随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明に係る単離ペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ ｓｉｔｕの状況でペプチドに通常会合している材料を含まない。ポリペプチドの「単離された」領域とは、その領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、又はその各断片は、限定されるものではないが、ヌクレオチドシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発、並びに核酸断片を得るため及びタンパク質又はタンパク質断片を実質的に純粋な量で得るための発現ベクターへのクローニング等の当業者による操作が可能なように、そのインビボ環境から実質的に取り出されたものである。
本明細書において、ペプチドに関して、「バリアント」という用語は、野生型ポリペチドと比べて置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸を有し得るアミノ酸配列バリアントを指す。バリアントは野生型ペプチドの切断型であってもよい。「欠失」とは、ポリペプチド内からの１又は複数のアミノ酸の除去であり、「切断」は、ポリペプチドの一方又は両方の末端からの１又は複数のアミノ酸の除去である。したがって、バリアントペプチドはポリペプチドをコードする遺伝子を操作することで作製され得る。バリアントは、ポリペプチドの薬理活性の少なくとも一部を変化させずにポリペプチドの基本的な組成又は特徴を変化させることで作製され得る。例えば、アズリンの「バリアント」は、前悪性哺乳動物細胞の発達を阻害する能力を保持する変異アズリンであり得る。場合によっては、バリアントペプチドは、ε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基等の非天然アミノ酸で合成される（Ｇｈａｄｉｒｉ ＆ Ｆｅｒｎｈｏｌｚ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １１２：９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて２０個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１５個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて６個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて５個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて３個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。別の実施形態では、バリアントは本明細書に開示されている方法及び技術を用いて作製される。
本明細書において、「アミノ酸」という用語は、任意の天然又は非天然又は合成のアミノ酸残基を含む、アミノ酸部分、すなわち、１、２、３、又はそれ以上の炭素原子、典型的には１個の（α）炭素原子、で直接連結された少なくとも１つのカルボキシル残基と少なくとも１つのアミノ残基とを含む任意の部分を意味する。
本明細書において、ペプチドに関して、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、対象のペプチドに由来するペプチドを指す。誘導は、ペプチドの基本的活性の一部が保持されるようなペプチドの化学的修飾を含む。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳動物細胞において血管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないがペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、若しくはグリコシル化、又は本明細書に開示のその他の方法及び技術が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、ポリペプチド又はその断片と、限定されるものではないが、例えば別のペプチド、薬物分子、又はその他の治療薬剤若しくは医薬品又は検出可能なプローブ等の化学物質との融合体であってもよい。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ポリペプチドと候補配列を整列させた時に候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ポリペプチド中のアミノ酸残基の割合と定義される。％アミノ酸同一性を決定するには、配列を整列させ、必要に応じて最大の％配列同一性を得るためにギャップを導入する。保存的置換は配列同一性の一部とみなさない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント手順は当業者に周知である。多くの場合、ペプチド配列の整列にはＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアが用いられる。特定の実施形態では、Ｂｌａｓｔｐ（メリーランド州ベセスダの国立バイオテクノロジー情報センターから利用可能）を、ｌｏｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ、ｅｘｐｅｃｔ １０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、及びｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １のデフォルトのパラメータで用いる。
アミノ酸配列を整列させる場合、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ａが所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して、特定の％アミノ酸配列同一性を有するとも表現できる）は、
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ＊１００
（式中、
Ｘは、配列整列用のプログラム又はアルゴリズムによるＡ及びＢの整列により同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、
Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の合計数である）として計算することができる。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくない。長い配列を短い配列と比較する場合、短い方の配列を「Ｂ」の配列とする。例えば、切断型ペプチドを対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、切断型ペプチドを「Ｂ」の配列とする。
概略
いくつかの実施形態では、本発明は、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物と、哺乳動物において癌の発達を防止する方法とを提供する。別の実施形態では、本発明は、癌細胞等の哺乳動物細胞に優先的に移入する、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物を提供する。別の実施形態は、哺乳動物における癌の発達又は癌の再発を防止する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を提供する。特定の実施形態は、緑膿菌のアズリン、アズリンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を含む組成物並びに患者、特に一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者を処置するためのその使用を提供する。
本発明の別の実施形態は、癌細胞を直接及び／又は優先的に透過する方法を含む。本発明の別の実施形態は、癌及び正常細胞を直接及び／又は優先的に透過してその中で化学予防効果を発揮する方法を含む。別の実施形態は、治療化合物を癌細胞に優先的に送達する方法を提供する。最後に、本発明は、前悪性病変を誘発する前又は後に細胞をクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物に接触させて前悪性及び／又は悪性細胞の発達を観察することにより哺乳動物の細胞、組織、及び動物体内における癌の発達を研究する方法を提供する。更に別の実施形態は本明細書中の開示から明らかであろう。
細胞への優先的移入
以前から、緑膿菌により産生される酸化還元タンパク質であるクプレドキシンのアズリンは、正常な細胞には移入しないがＪ７７４肺癌細胞に選択的に移入してアポトーシスを誘導することが知られていた（Ｚａｂｏｒｉｎａ ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：２５２１−２５３０（２０００））。アズリンはヒトメラノーマＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２又はヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に選択的に移入してこれを死滅させることもできる（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９９：１４０９８−１４１０３（２００２）；Ｐｕｎｊ ｅｔ ａｌ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−２３７８（２００４））。緑膿菌のアズリンは、Ｊ７７４マウス細網細胞肉腫細胞に優先的に移入し、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３と複合体を形成してこれを安定化し、ｐ５３の細胞内濃度を上昇させ、アポトーシスを誘導する（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：７０５４−７０６２（２００２））。アズリン分子の種々のドメインの詳細な研究により、アミノ酸５０〜７７（ｐ２８）（配列番号２）が内部移行及びその後のアポトーシス活性に必須なタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有することが示された（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ７：１４１８−１４３１（２００５)。
現在、アズリン及びｐ２８、ｐ１８等のアズリンに由来するペプチドは化学予防特性を有することが知られている。現在、アズリン及びその誘導体ｐ２８は、マウス乳腺臓器培養において、前悪性・前新生物性病変の形成を防止することが知られている。マウス乳腺臓器培養モデルでは、５０μｇ／ｍｌのアズリンが胞巣状病変の形成を６７％阻害することが分かっている。同様に、２５μｇ／ｍｌのｐ２８も胞巣状病変の形成を６７％阻害することが分かっている（実施例１参照）。更に、５０μｇ／ｍｌのアズリンは腺管病変の形成を７９％阻害し、２５μｇ／ｍｌのｐ２８は腺管病変の形成を７１％阻害することが分かっている（実施例１参照）。共焦点顕微鏡法及びＦＡＣにより、アズリン及びｐ２８が正常なマウス乳腺上皮細胞（ＭＭ３ＭＧ）及び乳癌細胞（４Ｔ１）に移入することが示されている。ｐ２８は、温度、時間、及び濃度に依存して、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にも移入し、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングされたＨＵＶＥＣの毛細管形成を用量依存的に阻害した。共焦点顕微鏡法及びＦＡＣはまた、ヒトメラノーマ細胞株（Ｍｅｌ−２、７、２９）、乳腺細胞株（ＭＣＦ−７）、卵巣細胞株（ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓細胞株（ＣＡＰＡＮ−２）、膠芽腫細胞株（ＬＮ−２２９）、アストロサイトーマ細胞株（ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１）、前立腺細胞株（ＬＮ−ＣＡＰ）、及び腎臓細胞株（ＡＣＨＮ−ＣＲＬ１６１１）にｐ１８が選択的に移入することも示した。更に、メラノーマ腫瘍を異種移植した胸腺欠損マウスにおいて赤外色素（λｅｍ８００ｎｍ）標識ｐ１８をイメージングしたところ、原発性皮下腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ ｓ．ｃ． ｔｕｍｏｒ）で選択的に取り込まれること及び正常な臓器及び組織に蓄積せず遠隔臓器に転移することが明確に示された。したがって、現在、アズリン及びアズリンのバリアントが前悪性・前新生物性病変の形成阻害、したがって、癌、特に哺乳動物患者の乳癌の発達を阻害するために使用され得ることが知られている。
放射線療法、化学療法等の標準的な癌の処置方法では、癌細胞のＤＮＡに損傷を与える。正常なＤＮＡ損傷への細胞応答には、ＤＮＡ修復の活性化、細胞周期の停止、及び致死が含まれる（Ｈａｌｌ， Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ， Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ，１９８８）。例えば、ＤＮＡ二本鎖の破壊を誘導すると、欠失、二動原体染色体、環、及び分裂後期のブリッジを含む致死的な染色体異常が生じる（Ｈａｌｌ， Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ， Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ，１９９４）。本発明のペプチドは腫瘍及び種々の癌細胞に選択的に取り込まれるため、これらのペプチド（例えば一実施形態ではｐ１８）は、腫瘍及び癌細胞中に材料を導入するための非ウイルスベクターとして使用され得る。例えば、本発明のペプチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を癌細胞に導入することで腫瘍又は癌細胞に治療的ＤＮＡ又はＲＮＡ断片処置を提供するために使用され得る。
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、その構造的特徴、陽イオン残基、又は両親媒性αヘリックスに基づいて２つのグループを形成する。ただし、両方のクラスに分類されるものもある。一般的に、陽イオン性ペプチドは、負に帯電した表面糖タンパク質に結合することで原核種及び真核種の細胞膜と最初に相互作用し、幅広い正常細胞株及び悪性細胞株への効率的な移入を促進している（Ｋｏｎｄｅｊｅｗｓｋｉ， Ｌ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：６７−７４（２００２）；Ｆｕｃｈｓ， Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｒａｉｎｅｓ， Ｒ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４３：２４３８−２４４４（２００４））。陽イオンペプチドがＨＳに結合することは、それらがＨＳへのそれらの親和性が高い（Ｋｄ−１０９ｎＭ）ことと一致し、この値は以下の実施例中でアズリン、ｐ１８、及びｐ２８に対して報告されているよりも十分高い（Ｔｒａｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７９５７−７９６１（１９８７））。
アズリン及びそれに由来するペプチド（例えばｐ２８及びｐ１８）は、癌細胞に優先的に移入して細胞分裂抑制及び細胞毒性メカニズムを介してその増殖を阻害するという固有の特性を有する。酸化還元タンパク質は、通常、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）又は抗増殖剤に分類されない。アズリン、ｐ２８、及びｐ１８の移入は陽イオン性ＣＰＰの移入とは別個のものであると考えられる。両親媒性アズリン断片ｐ１８及びｐ２８は、アズリンの５４〜６７アミノ酸のαヘリックス構造及び部分的βシート構造を含む。多様な組織起源の癌の進行及び転移の変化にインテグリン及びカドヘリンを含む複数の細胞表面受容体の異常なＮ−グリコシル化が関連していることから、アズリン、ｐ１８、及びｐ２８の透過初期段階におけるまだ知られていないＮ−グリコシル化細胞表面タンパク質の役割が示唆されている（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ， Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：１２０−１２４（２００４）；Ｓｅａｌｅｓ， Ｅ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：４６４５−４６５２（２００５））。
エンドサイトーシス成分の細胞透過を補助する陽イオン性ＣＰＰの温度依存的移入がアズリン及びアズリンのアミノ酸断片５０〜７７（ｐ２８）の移入に反映されている（Ｙａｍａｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７：１４１８−１４３１（２００５））。正常細胞及び悪性細胞へのアズリンのアミノ酸５０〜６７（ｐ１８）の移入はｐ２８よりも速いようである。ｐ１８の方がＫｍが低く、Ｖｍａｘが高いことから、アズリンのアミノ酸５０〜６７はリン脂質膜と会合した時にアズリンの実際のＰＴＤにより近い両親媒性構造を形成することが示唆される。しかし、エネルギー依存的エンドサイトーシスプロセス及びポアに関連するプロセスがこれらのペプチドが利用可能な唯一の移入メカニズムではなさそうである。例えば、陽イオン性ペプチドの移入を阻害し且つ代謝及び膜電位を阻害する、アジ化ナトリウム及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤）は、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞又は線維芽細胞へのｐ１８又はｐ２８の移入を阻害しなかった（図１４Ｂ、Ｃ）。このことは、いずれのペプチドも直接細胞膜を透過し得ることを示している。
他の陽イオン性ＣＰＰの細胞透過に推定される経路、すなわちマクロピノサイトーシス、後期エンドソームへの分配又はアクチンフィラメント若しくは微小管に沿ったリソソームへの分配、及び特定の細胞周期段階での透過、とは異なる透過経路をアズリン由来ペプチドは通常使用している。なぜなら、これらの経路のそれぞれの阻害剤単独では効果がなかったからである（図１４Ｂ、Ｃ）。ｐ１８、ｐ２８、及びアズリンは、ダイナミン非依存性のクラスリン依存性キャリアを介した様式で、形質膜を透過して、カベオラに結合した後期エンドソーム、リソソーム、及びゴルジに達する（Ｋｉｒｋｈａｍ， Ｍ． ａｎｄ Ｐａｒｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７４６：３４９−３６３（２００５））。ノコダゾールによる透過の顕著な阻害と、アクチンフィラメントを破壊するサイトカラシンＤによる阻害の相対的欠如は、カベオラを介した移入を示している（上記文献）。この移入経路は、不可欠な細胞表面成分及び一見異なる分子、すなわちデキストラン及び様々な病原体又はその生産物によるものが説明されており、これらは古典的エンドサイトーシス経路を回避するためにカベオラも利用する。β−メチルシクロデキストラン、フィリピン、又はナイスタチンを用いて形質膜からコレステロールを除去することで、膜成分を隔てる液体プラットフォームを提供し且つ膜を区分する形質膜ドメインである脂質ラフトを破壊すると、ｐ１８及びｐ２８のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞及び線維芽細胞中への透過が有意に阻害され（それぞれ５０％及び約６０％；それぞれ３５％及び４２％）、このことはかなりの割合（約６０％）のｐ１８及びｐ２８がカベオラを介して形質膜を透過することを示している。カベオラは、シグナル伝達の制御因子として機能するカベオリンに特有のタンパク質（カベオリン−１、−２、又は−３）の存在により規定される形質膜の脂質ラフト陥入部の５０〜１００ｎｍのオメガ型サブセットである。
ブレフェルジンＡはゴルジ装置を破壊し、ｐ１８の蓄積を阻害する。したがって、この経路及びゴルジ装置もｐ１８及びｐ２８の移入及び細胞内輸送に利用されている。カベオラを介したｐ１８及びｐ２８の細胞透過は、Ｎ−グリコシル化阻害剤がＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞への細胞移入を約６０％低下させ、線維芽細胞への細胞移入をそれぞれ２５％及び３５％低下させるという証拠と一致している。ｐ１８及びｐ２８の移入のパーセンタイルの差は癌細胞と正常細胞におけるＮ−グリコシル化膜構造の数及びこのメカニズムを介したｐ２８及びｐ１８の相対的移入経路に関連している（図１４Ｂ、Ｃ）。
アズリン、ｐ２８、及びｐ１８は全て、多くの他の潜在的抗癌ペプチドよりも高い親和性及び高い容量で癌細胞に結合する。結合後、このタンパク質／受容体複合体はカベオラ中に局在し、内部移行し、最終的に（カベオソームを介して）ゴルジ、ＥＲ、及び核に移行する。カベオラを介した移入に加えて、カイネティクス解析はｐ２８及びｐ１８が非クラスリン・カベオラ介在性プロセスによる形質膜透過も示している。例えばインターロイキン２受容体及び特定のグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定タンパクの構成的内部移行メカニズムとして、クラスリン及びカベオリン非依存性経路が存在する（Ｌａｍａｚｅ， Ｃ， ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７：６６１−６７１（２００１）；Ｓａｂｈａｒａｎｊａｋ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ， ２：４１１−４２３（２００２））。病原体は細胞に侵入するためにクラスリン及びカベオリン非依存性エンドサイトーシスも利用しており、これは、マウスポリオーマウイルスの場合のように単独であってもよく、インフルエンザウイルスの場合のように従来の経路と併用されることもある（Ｅｗｅｒｓ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１５１１０−１５１１５（２００５）；Ｓｉｅｃｚｋａｒｓｋｉ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｇ．Ｒ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７６：１０４５５−１０４６４（２００２））。癌細胞で正常細胞よりもカベオリン−１の発現が増加していることが癌細胞中にアズリン、ｐ２８、及びｐ１８が優先的に移入するための唯一の基礎ではないと思われる。線維芽細胞及び複数のその他の正常細胞もその表面にかなりの数のカベオラを有する。
実施例１８〜２４は、ｐ１８（アズリンのアミノ酸５０〜６７）及びｐ２８（アズリンのアミノ酸５０〜７７）が、エンドサイトーシス経路、カベオソームに向かう経路、及びカベオソーム非依存経路により癌細胞を優先的に透過することを示している。ｐ１８及びｐ２８の細胞透過は、癌細胞への選択性において現在の全てのＣＰＰに対して特徴的である。驚くべきことに、ｐ２８のＣ末端１０〜１２アミノ酸（配列番号３５、３６、及び３７）は、細胞周期阻害及びアポトーシス活性／細胞毒性に主に関与するドメインを含んでいる。更に、この同じドメインは、細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に最も接触し易く、したがって、移入しやすい；特に、アズリンのアミノ酸６９、７０、７５、７６、及び８５は細胞膜との接触を提供する。ペプチド鎖中の同じ位置又はアズリンのアミノ酸６９、７０、７５、７６、及び８５と同様若しくは同等なペプチド鎖中の位置に同じアミノ酸又は同様な構造のアミノ酸を有するペプチドは、特定の細胞膜残基に接触して細胞に移入する同じ又は同様な活性を有するはずである。内部移行した後、ｐ２８は最初に細胞分裂停止メカニズムを介して癌細胞の増殖を阻害する。したがって、ｐ１８及びｐ２８はそれぞれ、ヒト癌細胞へのアズリンの優先的移入並びにヒト癌細胞上でのアズリンの抗増殖活性及び細胞毒性活性がかなり高いことの原因である。
ｐ１８及びｐ２８は、癌細胞に移入することに加え、実施例３１に開示の方法を用いて得られた図１６〜５３に示すように、腫瘍及び哺乳動物の臓器に移入することができる。驚くべきことに、ｐ１８及びｐ２８は、例えば図２０Ａ、２０Ｂ、２１Ｂ、２３、２４、２８、３０、３１Ａ、３２Ｂ、３３、３４Ｂ、３５Ａ〜Ｂ、３７Ａ〜Ｃ、３８Ａ〜Ｃ、４０Ａ、４２Ａ、４３Ａ、４５Ａ〜Ｄ、４６、４７Ｂ、４８Ａ〜Ｂ、及び５０に示されるように、血液脳関門を透過して哺乳動物の脳に移入することもできる。
本発明のペプチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片等のその他の分子又は化合物を哺乳動物の癌細胞に導入するために使用することができる。以下に、非限定的な例示的技術及び／又は連結された分子の哺乳動物癌細胞中への移入を容易化する本発明のペプチド（例えば一実施形態ではｐ１８）を用いて導入できる特定のＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片を記載する。例えば、細胞に優先的に移入し得る本発明の化合物は、遺伝子治療、ＲＮＡｉアプローチ、造血遺伝子導入、相同組換え、リボザイム技術、アンチセンス技術、腫瘍免疫療法及び腫瘍抑制因子、探索医療、アンチジーン治療（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、及びリボザイム）、アポトーシス、免疫学及び免疫療法、ＤＮＡの合成及び修復と共に使用され得る。
遺伝子治療では、腫瘍抑制因子又はアポトーシス誘導因子等の異種遺伝子をその遺伝子の発現に適した条件下で癌細胞に導入する。発現した遺伝子産物は、腫瘍細胞の成長を鈍化させるか、その転移能を阻害するか、それを完全に死滅させることにより、腫瘍細胞に有益な効果を与える。歴史的に、癌遺伝子治療の臨床的有効性は、１）腫瘍内での治療遺伝子発現の制御の欠如及び２）腫瘍へのベクターの選択的ターゲティング、により限定されてきた。本発明の化合物は腫瘍細胞の選択的ターゲティングに取り組む。更に、遺伝子発現を制御するための複数の戦略が提唱されている。戦略の１つは、治療遺伝子を制御するプロモーターが腫瘍選択的転写因子により活性化される転写ターゲティング（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）である。例としては、乳癌におけるＭＵＣ−１プロモーター及び結腸癌におけるＣＥＡプロモーターの使用が含まれる（Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ， ”Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＭＵＣ１ ａｎｔｉｇｅｎ，” Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０６（６）： ７６３−７７１， ２０００；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，” Ｊ Ｍｅｄ． Ｓｃｉ， ４８（３）：７９−８９， １９９９）。
アンチセンス技術は、選択された遺伝子によって発現されるｍＲＮＡに全体的に相補的な核酸分子の細胞への導入に基づく。アンチセンス分子は、典型的には、ｍＲＮＡ分子の翻訳を抑制し、その遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を妨げる。アンチセンス技術の改変例では、遺伝子のＤＮＡにアンチセンス分子が結合して三重らせんを形成することで選択された遺伝子の転写が妨げられ得る。本発明に従って使用することができる特定のアンチセンス薬物の１つはＧ３１３９（オブリメルセンとしても知られる；マサチューセッツ州レキシントンのゲンタ社（ＧＥＮＴＡ， Ｉｎｃ．）製）である。使用できる別の特定のアンチセンス分子はＧ４４６０（ニュージャージー州バークレーハイツのゲンタ社が製造しているｃ−ｍｙｂアンチセンスとしても知られる）である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく分子も本発明のペプチドに付加することができる。ＲＮＡｉは通常、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）、又は同様な特徴を有するその他の核酸分子により仲介される。これらの核酸分子は、ダイサー、ドローシャ等の細胞酵素によりプロセシング又は切断されて小片にされる。次いで、より小さい核酸分子断片が、ｍＲＮＡの分解を仲介するタンパク質複合体（ＲＩＳＣ複合体）によって取り込まれ得る。ＲＩＳＣ複合体は、取り込んだ核酸分子と相補的塩基対を形成するｍＲＮＡを分解する。このようにしてｍＲＮＡが特異的に破壊されることで、コードされているタンパク質の合成が防止される。
リボザイム技術は、標的ＲＮＡ分子に結合して選択的切断を触媒するＲＮＡ分子を発現する核酸分子の細胞への導入に基づく。標的ＲＮＡ分子は通常ｍＲＮＡ分子であるが、例えばレトロウイルスＲＮＡ分子であることもある。
２つの遺伝子不活化（各アレルに１つの不活化）を必要とする相同組換えによる標的遺伝子欠失も本発明と用いることができる戦略である。
本発明の化合物につなげて送達される特定の治療は、癌の発達に必須なタンパク質の発現を制御できる癌特異的転写複合体（ＣＳＴＣ）を標的にしてもよい。例えば、ＣＳＴＣを標的にした癌治療に関する教示は、参照により本願に援用する米国特許出願第２００８／００２７００２号を参照されたい。
クプレドキシン類は構造類似性の程度が高いため、アズリン以外のクプレドキシン及びその切断型も非エンドサイトーシス経路及びエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入することができ、更に哺乳動物の前悪性病変形成を阻害することができると考えられる。そのようなクプレドキシンは、例えば細菌又は植物に見られ得る。複数のクプレドキシンが緑膿菌のアズリンと同様な薬理活性を有することが知られている。例えば、鉄酸化細菌のラスチシアニン（配列番号４）もマクロファージに移入してアポトーシスを誘導することができる（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ３：１１８２−１１８７（２００４）；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ． Ｍｉｃｒｏ． ７：１４１８−１４３１（２００５）。フォルミジウム・ラミノスム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｌａｍｉｎｏｓｕｍ）のプラストシアニン（配列番号３）及びアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン（配列番号５）もマクロファージに対して細胞毒性である（２００６年２月２３日に公開された米国特許公開第２００６００４０２６９号）。したがって、他のクプレドキシンも本発明の組成物及び方法に使用され得ると考えられる。更に、哺乳動物の癌形成を阻害する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物も本発明の組成物及び方法に使用され得る。これらのバリアント及び誘導体としては、限定されるものではないが、クプレドキシンの切断型、アミノ酸の保存的置換、及び本明細書に記載のタンパク質修飾、例えば、限定されるものではないがＰＥＧ化及びαヘリックスの全炭化水素安定化（ａｌｌ−ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｂｌｉｎｇ）等が含まれ得る。
ｐ５３を介した化学予防
アズリンのアミノ酸５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）とｐ５３の相互作用を研究し、後述する実施例２６〜３０に記載した。本明細書に開示しているように、ｐ２８はヒト乳癌細胞を透過し、抗増殖効果を発揮する。これは、ストレスに応答して機能的に活性になり細胞周期の停止又は細胞死を引き起こす腫瘍抑制因子タンパク質であるｐ５３に仲介される。一連のＧＳＴプルダウンアッセイ、グリセロール勾配遠心、微小熱量測定実験、単一分子力分光法、及びコンピュータモデリングを用いた実験は、アズリンがｐ５３のＮ末端又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかの内部に結合してその細胞内レベルを上昇させることを示している。本明細書の実施例２６〜３０及び図５４〜５７に開示の結果から、ｐ２８が結合する部位はｐ５３のＮ末端及びＤＮＡ結合ドメインであるアミノ酸１〜１７、２４〜３１、８０〜２７６、又は２９７〜３０５内に限定される。
ｐ５３へのアズリン結合ドメインがアズリンのＭｅｔ４４及びＭｅｔ６４により示される疎水性パッチを含むという示唆が、疎水性パッチを破壊した変異体（変異アズリンＭ４４ＫＭ６４Ｅ）がｗｔアズリンよりもヒトメラノーマ（Ｍｅｌ−２）細胞への細胞毒性が低いことから裏付けられた。このことは、アズリン分子のｐ５３結合ドメインが疎水性パッチ周辺であることを示している。最近のドッキングシミュレーション研究により、変異複合体では野生型アズリンと比べて約７５ｋＪ／ｍｏｌの相互作用自由エネルギーの顕著な消失が示されており、このことも、Ｍｅｔ４４及びＭｅｔ６４残基周辺のアズリンの疎水性パッチがｐ５３との相互作用に重要であることを示している。Ｍｅｔ６４残基がｐ２８のｐ５３結合部位内に存在すること（ｐ２８のアミノ酸１５）、競合アッセイ、変異体実験、及びドッキング実験は、これがｐ５３に結合するアズリンのドメインであることを明確に示している。
腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３は、細胞周期進行の阻害剤である２１ｋＤａタンパク質ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１を含む多くの遺伝子の転写制御因子として作用する主に核に存在するタンパク質である。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８で処理すると、ｐ５３のレベルが上昇し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性（特にそれぞれＧ１及びＧ２／Ｍ期の細胞周期進行を制御するｃｄｃ２及びＣＤＫ２）の強力な阻害剤であるｐ２１の細胞内レベルが高くなる。Ｇ２／Ｍ期の進行では、ｃｄｃ２キナーゼ及びＣＤＫ２キナーゼがそれぞれサイクリンＢ及びサイクリンＡと会合して主に活性化される。ＣＤＫ阻害剤ｐ２１はＧ２／Ｍ停止細胞中でサイクリンＡと効率的に会合するが、同じ条件下でサイクリンＢ１はｐ２１と会合せず、サイクリンＢ１のレベルは連続的に上昇する。これは、ＭＣＦ−７細胞でｐ２８により誘導されるＧ２／Ｍでの停止がＣＤＫ２及びサイクリンＡの阻害に関連していることを示している（図５７Ａ）。
ＭＣＦ−７細胞においてｐ２８により誘導されるｐ２１の増加は、Ｃｉｐ／Ｋｉｐ ＣＤＫＩファミリーの別の一員であるｐ２７の時間依存的な増加も伴う。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８は最近、ｐ５３を導入するとルシフェラーゼアッセイにより測定されるｐ２１及びｐ２７の両方のプロモーター活性が上昇することを実証した（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＭＬＳ），２００８）。更に、ｐ２１及びｐ２７のプロモーターのｐ５３ＤＮＡ結合活性はｐ５３誘導因子プロゲステロンにより活性化され、このことは、ｐ２１だけでなくｐ２７もｐ５３により転写制御されることを意味する。総合すると、データは、ｐ２８によるｐ５３レベルの増加が、その後、ｐ２１及びｐ２７をアップレギュレートし、それによって、ＭＣＦ−７細胞において細胞内のＣＤＫ２レベル及びサイクリンＡレベルの顕著な低下及びＧ２／Ｍでの細胞周期停止が誘導されることを示している（図５７Ａ）。サイクリンＢ１とｐ２１の間では会合がない又は非効率的であるという報告から、ｐ２８暴露後のサイクリンＢ／ｃｄｃ２活性の上昇が、ｐ２８により誘導されるｐ２１の増加と同様なパターンを反映している可能性が示唆される。ｐ２８暴露後にサイクリンＢ１の細胞内レベル上昇に伴いリン酸化ｃｄｃ２（不活性型）が増加することから、ｃｄｃ２−サイクリンＢ複合体の増加がｃｄｃ２リン酸化の増加に反映されていることが示唆される。高レベルの細胞質サイクリンＢ１を伴うＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞での同様なＧ２での停止が、公知の微小管破壊剤であり且つｐ２１の転写翻訳活性化因子であるノコダゾールで誘導される。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、及び酪酸ナトリウム（ＳＢ）等の分化誘導物質は、口腔扁平上皮癌細胞において同様な成長阻害及びＧ１停止現象を生じ、この現象はＧ１期の細胞周期調節タンパク質であるＣＤＫ６、ｐ２１、及びｐ２７の誘導並びにＧ２期の細胞周期調節タンパク質であるＣＤＫ２の阻害に関連する。ｐ２８はＭＤＤ２細胞でｐ２１を増加させず、これらの細胞にはｐ２７が存在しないようであるため、ＣＤＫ２及びサイクリンＡのレベルは有意に変化せず（図５７Ｂ）、細胞周期の阻害も起こらなかった。ヒト細胞におけるｃｄｃ２活性の主要な制御因子であるＣＤＫ２とサイクリンＡの複合体の減少がｐ２８で誘導されることでＧ１及びＧ２／Ｍでの停止が引き起こされていることの更なる証拠は、ＣＤＫ２−サイクリンＡ複合体を不活性化してＧ２／Ｍで細胞周期を停止させるサイクリンＡのＲＮＡｉをＨｅＬａ細胞に導入した後に起こるＧ２の遅れである。
ｐ２１、ｐ２７等のＣｉｐ／Ｋｉｐファミリータンパク質はサイクリンＡ依存性ＣＤＫ２の強力な阻害剤であるが、これらはサイクリンＤ依存性キナーゼの正の制御因子としても作用する。Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリータンパク質はＣＤＫ４及びＣＤＫ６を安定化する。ＣＤＫ４は、乳房、神経膠腫、肉腫、子宮頸癌等の幅広い腫瘍で増幅及び過剰発現され、一方、ＣＤＫ６遺伝子は、扁平細胞癌、神経膠腫、リンパ腫瘍等の特定の種類の悪性腫瘍で増幅される。ＣＤＫ６の初期レベル又は制御レベルはＣＤＫ４よりも低いが、ｐ２８に曝したＭＣＦ−７細胞ではＣＤＫ４レベルは連続的に上昇しないがＣＤＫ６レベルは連続的に上昇する。ここでも、ｐ２８に応答してｐ５３及びｐ２１が増加しなかったＭＤＤ２細胞中ではＣＤＫ４及びＣＤＫ６は何ら変化しなかった（図５７Ｂ）。Ｉｎｋ４グループであるＣＤＫＩのｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、及びｐ１９Ｉｎｋ４ｄは、Ｇ１での細胞周期進行を制御するＣＤＫ４及びＣＤＫ６に特異的に会合してこれを阻害する。ＭＣＦ−７細胞中ではｐ１６Ｉｎｋ４ａ遺伝子がホモで欠失しているので、Ｉｎｋ４ ＣＤＫＩタンパク質はＣＤＫ４よりもＣＤＫ６に対して少ない阻害効果を示すと考えられ、これは、実質的に安定なＣＤＫ４レベル存在下においてＣＤＫ６で観察されるＣＤＫ６の増加の理論的根拠となる。
総合すると、これらの結果は、ｐ２８がｐ５３に結合してｐ５３レベルが上昇し、これがその後ｐ２１及びｐ２７によるＣＤＫ２−サイクリンＡ複合体の不活性化を介して抗増殖活性を増幅し、インビトロでＭＣＦ−７乳癌細胞においてＧ２／Ｍ細胞周期停止及び胸腺欠損マウスにおけるＭＣＦ−７異種移植片の成長阻害を引き起こすことを示している。
本発明の組成物
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の態様では、本発明は更に、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３５、配列番号３６、又は配列番号３７等のｐ２８（配列番号２）のＣ末端を含む。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸の１又は複数を含む。
本発明のいくつかの実施形態は更に、癌細胞に優先的に移入するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、カベオラ介在性経路及びゴルジ介在性経路を含むエンドサイトーシス経路により細胞に優先的に移入してその中で化学予防効果を有するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号３５、配列番号３６、又は配列番号３７等のｐ２８のＣ末端を含む又はからなる。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸の１又は複数を含む。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは単離されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは実質的に純粋であるか医薬品グレードである。別の実施形態では、ペプチドは、ペプチドを含む又はから本質的になる組成物中にある。別の特定の実施形態では、ペプチドは非抗原性であり、哺乳動物において、より具体的にはヒトにおいて、免疫応答を惹起しない。いくつかの実施形態では、ペプチドは全長クプレドキシンより短く、クプレドキシンの薬理活性の一部を保持している。具体的には、いくつかの実施形態では、ペプチドはマウス乳腺臓器培養において前悪性病変の発達を阻害する能力を保持し得る。別の実施形態では、ペプチドは、例えばカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して、細胞に直接且つ優先的に移入する能力を保持している。別の実施形態では、ペプチドは、細胞に直接且つ優先的に移入してその中で化学予防効果を発揮する能力を保持している。
別の態様では、本発明は、癌細胞に優先的に移入できるクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物である少なくとも１つのペプチドを含む、特に医薬組成物中の組成物も提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の投与形態用に設計され、投与形態としては、例えば経口、腹腔内、又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、水和していてもよく、（例えば凍結乾燥により）乾燥されていて、後で水和されてもよい。そのような組成物は、水以外の溶媒中、例えば限定されるものではないがアルコール中にあってもよい。
本発明の特定の実施形態はまた、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び／又は腫瘍に優先的に移入するクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、又は構造的等価物であるペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３５又は配列番号３６等のｐ２８のＣ末端である。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号２５で表されるｐ１８である。いくつかの実施形態では、ペプチドはｐ１８のバリアント、誘導体、又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、組成物はＤＮＡ又はＲＮＡに結合したｐ１８である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは送達後に治療効果を発揮する。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号２で表されるｐ２８である。いくつかの実施形態では、ペプチドはｐ２８のバリアント、誘導体、又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、組成物はＤＮＡ又はＲＮＡに結合したｐ２８である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは送達後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン類は構想的相同性が高いので、クプレドキシン類はアズリン及びｐ２８と同じ化学予防特性を有すると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、又はＬａｚであるが、これらに限定されるものではない。特に特定の実施形態では、アズリンは、緑膿菌、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アクロモバクター・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＩ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｓｐ． ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｉ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、メチロモナスｓｐ．（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、ウルバ・ペルツシス（Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に由来する。一実施形態では、アズリンは緑膿菌に由来する。別の特定の実施形態では、クプレドキシンは配列番号１及び３〜１９のアミノ酸配列を含む。
本発明の態様は、野生型クプレドキシンと比べてアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されているアミノ酸配列バリアントであるペプチドを含む。本発明のバリアントは野生型クプレドキシンの切断型であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、全長野生型ポリペプチドよりも短いクプレドキシンの領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、約１０残基超、約１５残基超、又は約２０残基超の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１００残基以下、約５０残基以下、約４０残基以下、約３０残基以下、又は約２０残基以下の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、ペプチド、より具体的には本発明のペプチドに関して配列番号１及び３〜１９に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアントは緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）、アズリン残基５０〜６７（ｐ１８、配列番号２５）、又はアズリン残基３６〜８８（配列番号２６）を含む。別の実施形態では、クプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（配列番号２）、アズリン残基５０〜６７（配列番号２５）、又はアズリン残基３６〜８８（配列番号２６）からなる。別の特定の実施形態では、バリアントは、アズリン以外のクプレドキシンの同等な残基からなる。また、アズリン残基５０〜７７（配列番号２）又はアズリン残基３６〜８８（配列番号２６）と同様な薬理活性を有するように他のクプレドキシンバリアントを設計することもできると考えられる。そのためには、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いて対象のクプレドキシンアミノ酸配列を緑膿菌アズリン配列と整列させ、緑膿菌アズリンアミノ酸配列上の関連する残基を特定し、対象のクプレドキシン配列上の対応する残基を見出すことで、同等なペプチドを設計する。
本発明の一実施形態では、クプレドキシンバリアントはクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの少なくともアミノ酸５７〜８９（配列番号２０）を含む。別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸５０〜６７（配列番号２５）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントはシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）のアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７を含む（配列番号２１）。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは髄膜炎菌のＬａｚの少なくともアミノ酸８９〜１１５（配列番号２２）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸５２〜７８（配列番号２３）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２４）を含む。
バリアントには、天然ではない合成アミノ酸できたペプチドも含まれ得る。例えば、非天然アミノ酸をバリアントペプチドに組み込んで血流中での組成物の半減期を延長又は最適化してもよい。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないがＤ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（例えばＦｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（８）：５８３６−４０（２００１）；Ｐａｐｏ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４（１６）：５７７９−８６（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６（ｌ）：１６９−７６，（１９８７））；異常アミノ酸を含むペプチド（例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ６３（２）：６９−８４（２００４））、オレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｐｌｉｎｇ）（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４））、及びε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基を含むペプチドが含まれる。
別の実施形態では、本発明のペプチドはクプレドキシンの誘導体である。クプレドキシンの誘導体とは、ペプチドが基本的な活性の一部を保持したままでいるようなペプチドの化学的修飾物である。例えば、アズリンの「誘導体」は、エンドサイトーシス経路又は非エンドサイトーシス経路を介して細胞に優先的に移入する能力及び哺乳動物の細胞、組織、又は動物体において前悪性病変の発達を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないが、ペプチドの、炭化水素安定化（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｂｌｉｎｇ）、アミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、及びグリコシル化、及び本明細書に開示されているその他の方法が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と、限定されるものではないが例えば別のペプチド、薬物分子又はその他の治療薬若しくは医薬品、又は検出可能なプローブ等の化学物質との融合体であってもよい。関心のある誘導体としては、例えば、限定されるものではないが、環状ペプチド（例えばＭｏｎｋ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＤｒｕｇｓ １９（４）：２６１−７８（２００５）；ＤｅＦｒｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ６３（５）：４０９−１９（２００４））、Ｎ末端及びＣ末端の修飾（例えばＬａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｍｅｄ． １３（５）：２７５−８（１９９０））、並びにオレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４））等の当業者に周知の複数の方法により本発明のペプチド及び組成物の血流中の半減期を延長又は最適化することができる化学的修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、例えば、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を低減する方法、ペプチドのアミド分解を低減する方法、酸化を低減する方法、免疫原性を低減する方法、及び／又はペプチドの構造的安定性を増加させる方法等の方法を用いて変化され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、癌細胞に優先的に移入して且つ／又はその中で細胞毒作用を発揮する能力を高める方法を用いて修飾され得る。１つの修飾クプレドキシン由来ペプチド中で本明細書に記載の修飾の２つ以上が組み合わされてもよく、本明細書に記載の１又は複数の修飾と当業者に周知の薬物動態特性を向上させるその他の修飾とが組み合わされてもよいと考えられる。そのようなバリアント及び誘導体を設計するための多くの方法が当該技術分野で周知である。
生体内変換
ペプチドの薬物動態特性を向上させるアプローチの１つは、生体内変換を受けにくいクプレドキシン由来ペプチドのバリアント及び誘導体を作製することである。生体内変換は、ペプチドの薬理活性を低下させ且つ患者の体から除去される速度を速め得る。これを達成するための方法の１つは、最も生体内変換されやすいアミノ酸及び／又はアミノ酸配列を決定し、それらのアミノ酸をその特定の変換プロセスを受けないアミノ酸で置換することである。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、非天然アミノ酸又は修飾アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、特定の非天然アミノ酸を導入することでクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させる。そのような導入は、部位特異的であってもよく、インビボでの特定の生化学的修飾を回避するようになされてもよい。例示的な非天然アミノ酸としては、ｂ−アミノ酸（例えば、ｂ３及びｂ２）、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、Ｐｒｏ及びＰｙｒの誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換Ｐｈｅ及びＴｙｒ誘導体、直鎖コアアミノ酸（Ｌｉｎｅａｒ Ｃｏｒｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、及びジアミノ酸が含まれる。そのような非天然アミノ酸は、ペプチドの部位特異的修飾、リボソーム翻訳、又は化学合成によってペプチドに導入され得る。これらの方法のそれぞれがクプレドキシン由来ペプチドの合成に適用され得る。
例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非天然クプレドキシンバリアントを作製するための非天然アミノ酸構成要素と野生型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を使用することで合成され得る（Ｈａｒｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２（１０）：ｅ９７２（２００７）；Ｍｉｒａｎｄａ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２９：１３１５３−１３１５９（２００７）参照）。リボソーム翻訳を用いてペプチドに導入することができる非天然アミノ酸の多様性はリボソーム翻訳装置の特異性によって限定される。側鎖及び骨格のアナログを含む、ＡＡＲＳの基質となる９０を超える非天然構成要素が明らかにされている（Ｈａｒｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２（１０）：ｅ９７２（２００７））。５０を超える非天然アミノ酸が、全て酵素による翻訳系を用いてペプチド中に高効率で導入され得、最大１３個までの異なる非天然アミノ酸がペプチドに含まれ得る（Ｈａｒｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２（１０）：ｅ９７２（２００７））。いくつかの実施形態では、そのようなアミノ酸がクプレドキシン由来ペプチドに組み込まれ得る。
クプレドキシン又はシトクロムｃ５５１又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を化学的に修飾する方法の１つは、例えば疎水性Ｎ末端修飾、全タンパク質−ポリマーコンジュゲート化学物質の合成、コードされているアミノ酸及びコードされていないアミノ酸の突然変異誘発、ペプチド骨格の操作、並びに部位特異的ポリマー付加による、薬学的活性の向上した抗ＨＩＶ小タンパク質ＣＣＬ−５（ＲＡＮＴＥＳ）の設計でとられるステップに従うことであり得る。抗ＨＩＶタンパク質は、ポリマー置換基が種々の位置に付加されたＣＣＬ−５アナログに天然及び非天然アミノ酸残基を導入することで設計することができる。ポリマー修飾ＣＣＬ−５誘導体のインビトロ抗ＨＩＶ活性がＣＣＲ−５シグナル伝達に関連しており、ペプチドへの変化がＣＣＲ−５活性を破壊しないであろうことが研究により示されている（その開示の全体を本明細書に援用するＭｉｒａｎｄａ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２９：１３１５３−１３１５９（２００７））。
その他の修飾としては、光学活性α−アミノ酸の使用が含まれ得る。光学活性αアミノ酸及びその誘導体は、医薬品中、農薬中、及びキラル配位子として、その使用が広がっている。特に、キラルなグリシン及びアラニン同等物は重要な役割を果たす。α−アミノ酸を構築するための少なくとも１つの立体選択戦略が提唱されており、これは予め決定した立体化学のエナンチオピュアなα−アミノ酸を可能にする（その開示を参照により本明細書に援用する、２００８年９月１１日にインターネット上で公開された（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．で公開予定の）Ｌｕ， ｅｔ ａｌ． ”Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｃ ｉｍｉｎｏｌａｃｔｏｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ α−Ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓ− ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ”）。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、光学活性α−アミノ酸を用いて鏡像異性的濃縮反復法（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）ことで合成され得る。
加水分解は通常、アスパラギン酸を含むペプチドで問題になる。アスパラギン酸は脱水されて環状イミド中間体を形成し易く、これにより、アスパラギン酸が潜在的に不活性なイソアスパラギン酸アナログに変換され、最終的にペプチド鎖が切断される。例えば、ペプチド配列中にアスパラギン酸−プロリンが存在すると、酸の触媒により環状イミド中間体が形成されることでペプチド鎖が切断され得る。同様に、ペプチド配列中にアスパラギン酸−グリシンが存在すると、環状中間体が元々のアスパラギン酸形態（無害）又はイソアスパラギン酸アナログのいずれかへと加水分解され得る。最終的に、全ての形態のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸アナログに完全に変換され得る。セリンとの同様な配列も、脱水され、ペプチド鎖を切断し得る環状イミド中間体を形成し得る。ペプチドの切断は、ペプチドの血中濃度半減期の短縮及び特定の薬理活性の低下を招き得る。
クプレドキシン由来ペプチドの配列中のアスパラギン及び／又はセリンをその他のアミノ酸で置換することで、ペプチドの血中濃度半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の改善された薬物動態特性を有するペプチドが得られると考えられる。想定されるバリアントの１つでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはグルタミン酸残基で置換されていてよい。別の想定されるバリアントでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のセリン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはスレオニン残基で置換されていてよい。クプレドキシン由来ペプチドのいくつかのバリアントでは、１又は複数のアスパラギン残基及び１又は複数のセリン残基が置換されている。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされている。別の実施形態では、非保存的置換がなされている。
アミノ酸残基の脱アミド化は生体内変換の中でも特に問題である。この塩基触媒反応はしばしばアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシンを含む配列中で起こり、上記のアスパラギン酸−グリシン配列と同様なメカニズムによる。アスパラギン−グリシン配列の脱アミド化は環状イミド中間体を形成し、これはその後加水分解されてアスパラギン酸又はアスパラギンのイソアスパラギン酸アナログを形成する。更に、環状イミド中間体は、アスパラギンのＤ−アスパラギン酸又はＤ−イソスパラギン酸アナログへのラセミ化を招き得、これらは全てペプチドを不活性型にし得る。
クプレドキシンペプチド中の脱アミド化はクプレドキシンのアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシン配列のグリシン、アスパラギン、及び／又はグルタミンを別のアミノ酸で置換することで防止され、ペプチドの血中濃度半減期の長期化及び薬理活性の比活性の上昇等の薬物動態特性が改善されたペプチドを生じると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基がスレオニン残基又はアラニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基が別のアミノ酸で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５８及び／若しくは６３のグリシン又は他のクプレドキシンの同等なグリシンがアラニン又はスレオニンで置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５９のメチオニン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの同等なメチオニン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基６３のグリシン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの同等なグリシン残基がスレオニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは以下の配列を含む。下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌ｐ２８配列中に置換により導入されている。
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＶＶＴＤＴＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３８）
アミノ酸の可逆的又は不可逆的酸化も、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性及び／又は血中濃度半減期を低減させ得るという問題を引き起こし得る別の生体内変換プロセスである。システイン及びメチオニン残基が可逆的酸化を受ける主な残基である。システインの酸化は、チオールがより容易に脱プロトン化されて鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を容易に形成する、より高いｐＨで促進される。これらのジスルフィド結合は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）ヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）で処理することでインビトロで容易に逆転することができる。メチオニンは化学的経路及び光化学的経路の両方によって酸化されてメチオニンスホキシドを形成し、更にメチオニンスルホンになる。これらはどちらもほとんど逆転させることができない。
クプレドキシン由来ペプチド中の酸化はメチオニン及び／又はシステイン残基を別の残基で置換することで防ぐことができると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のメチオニン及び／又はシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、メチオニン残基がロイシン又はバリン残基で置換される。別の具体的な実施形態では緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５６及び６４のメチオニンの１又は複数又は他のクプレドキシン由来ペプチドの同等なメチオニン残基がロイシン又はバリンで置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明のクプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌のｐ２８配列中に置換により導入されている）。
ＬＳＴＡＡＤＬＱＧＶＶＴＤＧＬＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３９）
又は
ＬＳＴＡＡＤＶＱＧＶＶＴＤＧＶＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４０）．
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性（例えば細胞に優先的に移入する能力）、血中濃度半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてジケトピペラジン及びピログルタミン酸の形成が挙げられる。ジケトピペラジン形成は通常、グリシンがＮ末端から３位以内にある場合、より具体的にはプロリン又はグリシンが１位又は２位以内にある場合に起こる。この反応は、第２及び第３のアミノ酸の間のアミドカルボニル上のＮ末端窒素の求核攻撃を含み、これにより、最初の２つのアミノ酸が切断されてジケトピペラジンが形成される。一方、ピログルタミン酸形成は、Ｎ末端にグルタミンがある場合にはほとんど避けられないと考えられている。これは、Ｎ末端窒素がグルタミンの側鎖カルボニル炭素を攻撃して脱アミノ化されたピログルタマイルペプチドアナログが形成される、同様な反応である。この変換はＮ末端にアスパラギンを含むペプチドでも起こるが、頻度はかなり低くなる。
クプレドキシン由来ペプチドでのジケトピペラジン及びピログルタミン酸形成は、ペプチドの末端から１、２、又は３位のグリシン、Ｎ末端から３位のプロリン、又はＮ末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換することで低減されると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から１、２、又は３位のグリシンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、グリシン残基がスレオニン又はアラニン残基で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から３位のプロリンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、プロリンがアラニン残基で置換される。別の実施形態では、Ｎ末端のアスパラギンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、アスパラギン残基がグルタミン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血中濃度半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてラセミ化が挙げられる。この用語はアミノ酸又はペプチドのキラル整合性の全体的消失を指して緩く使用される。ラセミ化では、アミノ酸の一方のエナンチオマー（通常Ｌ型）がＬ型及びＤ型のエナンチオマーの１：１混合物に塩基触媒変換される。一般的にペプチドの安定性を高める方法の１つは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型（Ｄ異性体）ペプチドを作製することである。ペプチド構造の二重変換は、多くの場合、側鎖の表面トポロジーを損なわず、生物学的活性ペプチドを安定化するために広範に使用されてきた（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ２：０１８６−０１９３（２００４））。Ｌ−アミノ酸ペプチドだけでなくＤ−アミノ酸置換Ｔａｔも細胞中に内部移行する（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：５８３６−５８４０（２００１）；Ｈｕｑ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５１７２−５１７７（１９９９））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がそのアミノ酸のＤアイソマーで置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸残基全てがそれらの残基のＤ異性体で置換される。一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシン由来ペプチドのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ（Ｄ−異性体）型である。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
ＤＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＭＧＤＴＶＶＧＱＭＤＡＡＴＳＬ（配列番号４１）
である。
生体内変換による分解からクプレドキシン由来ペプチドを保護するその他の方法にＮアセチル化及びＣアミド化がある。これらの誘導体は、ペプチドを分解から保護し得、クプレドキシン由来ペプチドに天然タンパク質中のアルファアミノ基及びカルボキシル基の電荷状態をより正確に模倣させ得る。Ｎアセチル化及び／又はＣアミド化を有するペプチドは市販の業者から供給され得る。本発明の一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端がアセチル化され得る。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＣ末端がアミド化され得る。特定の一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
アセチル化−ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ−アミド化（配列番号４２）
である。
環化は、本明細書に記載するクプレドキシンを含む治療用ペプチドに有益であり得る更なる様式の生体内変換である。環化は、治療用ペプチドを安定化させることで、より長期の保存、より少ない投与量での投与、より少ない頻度での投与を可能にし得る。環化はペプチドをペプチダーゼ及びプロテアーゼによる分解から保護することが示されている。環化は化学的になされてもよく、酵素的になされてもよい。化学的環化は位置特異性及び立体特異性がないことがあり、環化ではなく多量体化が起こることがあり、複雑な多段階プロセスが必要になることがあるため、酵素的環化が一般的に化学的環化よりも問題が少ない。実際、タンパク質分解酵素に対してチオエーテル環化はジスルフィド結合よりも保護的且つ安定であることが示されている。
ランチビオティック−（メチル）ランチオニン−含有細菌ペプチド中における酵素的環化が示されている（例えば、Ｒ． Ｒｉｎｋ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｔｈａｔ Ｃａｎ Ｂｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｌａｎｔｉｂｉｏｉｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ４４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８８７３−８２（２００５）；Ｒ． Ｒｉｎｋ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｈｙｄｒｏａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ” ７３：６ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １７９２−９６（２００７）；Ｒ． Ｒｉｎｋ， ｅｔ ａｌ．， ”ＮｉｓＣ， ｔｈｅ Ｃｙｌｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｎｉｓｉｎ， Ｃａｎ Ｃａｔａｌｙｚｅ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｎｏｎｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ” ４６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３１７９−８９（２００７））（これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ランチビオティックはグラム陽性細菌により産生され、その成長を阻害する。ランチビオティック中では、酵素を介したセリン及びスレオニン残基の脱水によりデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンが生じ、次いで、脱水されたセリン及びスレオニン残基にシステインが酵素的に結合されてチオエーテル環化物が形成される。天然のランチビオティックは、最大１９残基離れた残基間でチオエーテル結合を介したそのような結合を有する。チオエーテル環形成はリーダーペプチドに依存する。環化の位置は、シクラーゼを介した位置特異的且つ立体特異的な閉環並びに脱水可能なセリン及びスレオニン残基の位置に依存する。
特徴が最も解析されているランチビオティックは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）により産生される５員環ペプチド抗生物質であるナイシンである。ナイシンは、４個のメチルランチオニン、１個のランチオニン、２個のデヒドロアラニン、１個のデヒドロブチリン、及び２６個の非修飾アミノ酸で構成される。ナイシンの５個のチオエーテルブリッジは、セリン及びスレオニンに由来するデヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基にシステイン残基が付加されることで形成される。ナイシンは、膜結合タンパク質酵素複合体により翻訳後に導入されるチオエーテル含有アミノ酸を含む。この酵素複合体は、輸送体ＮｉｓＴ、セリン及びスレオニンのデヒドラターゼＮｉｓＢ、及びシクラーゼＮｉｓＣを含む。ＮｉｓＢはセリン残基及びスレオニン残基を脱水してそれらをそれぞれデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンに変換する。その後、形成されたデヒドロ残基へのエナンチオ選択的なシステインの結合をＮｉｓＣが触媒する。ＮｉｓＴは修飾プレナイシンの搬出を促進する。ＮｉｓＰという別の酵素がプレナイシンからナイシンリーダーペプチドを切断する。
シクラーゼＮｉｓＣは十分に特徴が解析されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｃｙｌｃｌａｓｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｎｉｓｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ３１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １４６４−６７（２００６））（その全体を参照により本明細書に援用する）。
ランチビオティックにおける環化の分析から、環化し易いペプチドのアミノ酸配列及び特徴が特定された。ＮｉｓＢ酵素は特定のアミノ酸が隣接する場合にセリン及びスレオニン残基をより頻繁に脱水することが示されている。セリン残基及びスレオニン残基に疎水性の非芳香族残基が近接するランチビオティックプロペプチドで環化がより多く起こることが示されている。修飾されたシステイン隣接残基は通常、修飾されたスレオニン及びセリン隣接残基よりも疎水性が低い。ヘキサペプチドＶＳＰＰＡＲ（配列番号４３）、ＹＴＰＰＡＬ（配列番号４４）、及びＦＳＦＦＡＦ（配列番号４５）等の例外も見つかっている。これらのヘキサペプチドは、３位又は４位にプロリンが存在するか両側に隣接するフェニルアラニンを有することで脱水が阻止され得ることを示唆している。環は通常、脱水残基がＣ末端側に位置するシステインに結合されることで形成される。しかし、脱水残基がＮ末端側に位置するシステインに結合されることでも環が形成され得る。
ナイシンを脱水及び輸送する酵素はナイシンに特異的でなく、実際、非ナイシンペプチド（及び非ランチビオティックペプチド）の修飾に使用され得ることも示されている。ＮｉｓＢは、ランチビオティックリーダーペプチドにヒトペプチドホルモン等のペプチドがＮ末端融合された時に、そのようなペプチド中のセリン残基及びスレオニン残基を脱水することが示されている。非ランチビオティックペプチド上でも同様な環形成特性が適用される。すなわち、脱水の程度は、脱水可能なセリン残基及びスレオニン残基に隣接する領域のアミノ酸の内容により調節することができる。セリン及びスレオニンの周辺に疎水性隣接残基（例えばアラニン及びバリン）が存在すると、完全な脱水が可能になり、チオエーテル環形成が促進された。Ｎ末端アスパラギン及びＣ末端隣接アルギニンは脱水を防止した。プロリン残基及びフェニルアラニン残基の存在が脱水に好ましくないことも示されている。一般的に、親水性隣接残基が存在するとセリン残基及びスレオニン残基の脱水が防止された。疎水性隣接残基は脱水に好ましく、親水性隣接残基は脱水に好ましくない。実験により、脱水が起こる場合、セリン及びスレオニンの隣接残基の平均疎水性は正であり、Ｎ末端側で０．４０、Ｃ末端側で０．１３であることが示された。また、脱水されないセリン及びスレオニンに隣接する残基の平均疎水性は負であり、Ｎ末端側で−０．３６、Ｃ末端側で−１．０３である。脱水は、一連の隣接するスレオニン残基の存在により制限されず、ナイシンリーダーペプチドと脱水される残基の間の距離にも制限されない。
ＮｉｓＣは天然のランチビオティックとは無関連のペプチド中でチオエーテル環の位置特異的形成を触媒することが示されている。一般的に、そのようなペプチドはナイシンリーダーペプチドに融合されなければならない。場合によっては、例えばデヒドロアラニンが２個のアミノ酸によってシステインから隔てられた場合、チオエーテル環は自然発生的に形成され得る。自然発生的環化と異なり、ＮｉｓＣが触媒する環化は脱水されたプレナイシンに立体特異的である。その結果、ナイシン中のメチルランチオニン及びランチオニンはＤＬ形態になる。非ランチビオティック中の環化も立体特異的であると考えられている。
これらの原理は、クプレドキシン並びにそのバリアント及び切断型を含む本明細書に記載の化合物にも適用することができる。
チオエーテルブリッジ
天然には、ランチビオティックの酵素で誘導されるチオエーテルブリッジはブリッジ下に最大１９個のアミノ酸を有するように形成される。ブリッジ下に２〜４個のアミノ酸を有するチオエーテルブリッジは多数存在する。
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、構造中にチオエーテルブリッジを導入することで修飾され得る。例えばアズリン切断型ｐ２８（配列番号２）がこの方法を用いて修飾され得る。ソフトウェアパッケージＧＲＯＭＡＣＳ（ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ）を用いた拡張分子動力学シミュレーション（７０ｎｓ）は、３７℃において、６〜１６位までのｐ２８のアルファヘリックス領域が不安定であり、ペプチドがベータシータ形態をとりやすいことを示唆している（図５８Ａ及びＢ）。このことと、ｐ５３との相互作用に関与すると推定される分子部分が溶媒に曝されたままであることから、ｐ２８ペプチドのこの領域にチオエーテルブリッジを導入しても機能性に影響しないことが示唆される。
ｐ２８のアミノ酸配列は配列番号２（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ）である。ｐ１８として知られるアミノ酸配列は配列番号２５（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ）である。配列ＳＧＬＤＫＤ（配列番号９６）がｐ５３と相互作用し得る。チオエーテルブリッジはＮ側のＳｅｒ／ＴｈｒとＣ側のＣｙｓの間で形成され得る。このセリン／スレオニンは脱水され、その後、システインに結合される。スレオニンがセリンよりも容易に脱水されるため好ましい。一般的に、スレオニンに隣接する疎水性残基（少なくとも１つ）は脱水の程度を高くするため好ましい。隣接残基である負に帯電したアミノ酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸は、脱水に強い悪影響を与える。通常、親水性隣接残基、特にグリシンは、脱水に好ましくない。Ｃｙｓの前は帯電した親水性残基、特にグルタミン酸／アスパラギン酸になる傾向がわずかにある。チオエーテル環のサイズによっては、環を形成するアミノ酸の嵩高さが重要になる。
一実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＴＰＧＣ（配列番号４６）である。ｐ２８の２５位と２８位の間でチオエーテルブリッジが形成され、カルボキシエチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｉｄａｓｅ）に対して完全に保護される。２、３、及び２５位が脱水されるが、移入配列及びｐ５３との相互作用に関与すると思われる配列はチオエーテル環の導入により変化しない。したがって、ペプチド活性は変化しないと考えられる。スレオニンは２個の疎水性アミノ酸の間にあるので、特定の基準に従ってデヒドラターゼＮｉｓＢによって完全に脱水されると予想される（Ｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５参照）。同じ基準により、特にシステインの前にアスパラギン酸が位置するため、シクラーゼＮｉｓＣによる２５位及び２８位を含む環化も予測される。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＤＣＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４７）であり、３位と７位の間にチオエーテルブリッジが形成される。３位と７位の間の環はナイシンの環Ａと同様に２位のスレオニンを利用する。６位のアスパラギン酸は環化に好ましい。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＣＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４８）であり、２位のスレオニンがチオエーテルブリッジの形成に利用される。
別の実施形態では、上記段落に記載した切断型アズリン中のチオエーテル環の２つ以上が１つのペプチド中に組み合わされる。
別の実施形態では、多くの切断型アズリン配列を作製し、１個のランチオニン環及び硫黄ブリッジ下の２〜３個の更なるアミノ酸を有するペプチドを分析することでスレオニン環についてスクリーニングしてもよい。これには以下の配列の１つ又は組合せが含まれ得る。
ＬＳＴＡＣＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４９）
ＬＳＴＡＡＴＭＱＣＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５０）
ＬＳＴＡＡＴＭＱＧＣＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５１）
ＬＳＴＡＡＮＴＱＧＣＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５２）
ＬＳＴＡＡＮＴＱＧＶＣＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５３）
ＬＳＴＡＡＤＭＴＡＶＣＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５４）
ＬＳＴＡＡＤＭＴＡＶＶＣＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５５）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＴＶＶＣＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５６）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＴＶＶＴＣＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５７）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＴＶＴＣＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５８）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＴＶＴＤＣＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５９）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＴＡＤＣＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６０）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＴＡＤＧＣＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６１）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＮＧＣＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６２）
実用的アプローチは、このような配列を大量に遺伝的に作製し、修飾の程度及び生成レベルに基づいて選択して精製することである。
別の実施形態では、チオエーテルブリッジはｐ２８（配列番号２）の１２位のスレオニンとペプチドのＣ末端の間に形成される。１３位のＣαと２８位のアスパラギン酸の距離は１７．５２オングストロームであり得、これは１．５ナノメートルよりも大きく、ペプチド構造の大きな変化が示唆される（図５８Ｃ）。
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＡＴＭＧＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６３）であり、１４位から４．３８オングストロームの距離の２位にチオエーテルブリッジを有する。１３位のアスパラギン酸のアラニンへの変異は１４位のスレオニンの脱水に好ましい。１６位のアラニンのグリシンへの変異は１７位のセリンの脱水を完全に妨げ、環化を促進する。
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＬＴＡＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６４）であり、１５位から５．８３オングストロームの距離の２０位にチオエーテルブリッジを有する。この場合、１４位のグリシンのロイシンへの変異は１５位のスレオニンの脱水に好ましい。
三次構造の安定化
クプレドキシン由来ペプチドの三次構造の安定性は、とりわけ薬理活性、血中濃度半減期、及び／又は免疫原性を含む薬物動態のほとんどの面に影響を与える（Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５２：２０２−２０８（２００３）；Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ ２３：１２４３８−１２４４３（２００１）参照）。ペプチドのヘリックスはしばしばランダムコイルになり、プロテアーゼの攻撃をより受けやすくなり、細胞膜を十分に透過しないことがある（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２：５８９１−５８９２（２０００））。したがって、ペプチドの全体的構造を安定化する方法の一つはペプチドのαヘリックス構造を安定化することである。ヘリックス形成に関与する分子内水素結合は極性アミド骨格の露出を減らすことで輸送ペプチドの膜透過の障壁を低減するため、関連する薬理活性が増加し、プロテアーゼ切断に対するペプチドの抵抗性が高まる（上記文献）。緑膿菌アズリン（配列番号１）は残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０にαヘリックスを有する。
αヘリックスを安定化する方法の１つは、αヘリックス中のグリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸等のヘリックス破壊性アミノ酸残基又はアラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、若しくはアルギニン等のヘリックスに対して中性のアミノ酸残基を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン等のヘリックス形成性残基又は例えばαアミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）等のヘリックスに好ましいアミノ酸残基置換体で置換することである（その開示を参照により本明細書に援用するＭｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５１， ２７５８−２７６５（２００８）参照）。１又は複数のグリシン、プロリン、セリン、及び／又はアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に置換することでクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックスが安定化されることも予期される。具体的な実施形態では、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及び／又はアルギニン残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、Ａｉｂ、及び／又はメチオニン残基で置換される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｌ． １１：２１（２００５）参照）。別の具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中の１又は複数のセリン残基又はグルタミン残基が置換され得る。更に別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０中のセリン及び／若しくはグルタミン残基又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５７のグルタミン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６１のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６３のグリシン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２、５７、６１、又は６３の１又は複数のスレオニン、グルタミン、又はグリシン残基あるいは別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌ｐ２８配列中に置換により導入されている）。
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６５）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６６）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６７）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６８）；
ＬＳＷＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６９）；
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７０）；
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７１）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７２）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７３）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７４）；
又は
ＬＳＷＡＡＤＭＷＧＶＶＷＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号７５）。別の実施形態では、他のクプレドキシン由来ペプチド中の対応するアミノ酸がトリプトファンで置換される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、πスタッキング可能な非天然アミノ酸残基を使用する。例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｔａｂｏｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５：１１７１１−１１７４３（１９９９））では、ペプチドのαヘリックス領域中に種々のスペーシングのε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基対が置換により導入されている。全体の結果は、ｉ，（ｉ＋４）のスペーシングが配置の安定化に最も効率的であることを示していた。水の割合を最大９０％まで増加させると、ペプチド中のヘリックス含有量が増加した。同じｉ，（ｉ＋４）のスペーシングのε−アシル−Ｌｙｓ残基対は安定化効果を示さなかった。このことは、安定化の大部分がπ−π相互作用によるものであることを示している。一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、リジン残基がε−（３，５−
ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基で置換されるように修飾され得る。具体的な実施形態では、リジン残基がｉ，（ｉ＋４）のスペーシングのε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓにより置換され得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間の静電相互作用を利用する。ペプチド中にＨｉｓ−Ｃｙｓ又はＨｉｓ−Ｈｉｓ残基対をｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入した場合、Ｃｕ、Ｚｎ、又はＣｄイオンを添加するとペプチドは約５０％ヘリックスから約９０％ヘリックスに変化した。ルテニウム（Ｒｕ）塩をＨｉｓ−Ｈｉｓペプチドに添加した場合、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）である置換不活性複合体（ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｉｎｅｒｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成され、ヘリックスの安定性が改善された（Ｇｈａｄｉｒｉ ａｎｄ Ｆｅｒｎｈｏｌｚ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２， ９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）を含み得る。いくつかの実施形態では、１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中にｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入され得る。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中にｉ，（ｉ＋４）配置の１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が置換により導入され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは更にＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、及び／又はＲｕイオンを含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間でのジスルフィド結合を形成する。ペプチド配列中の隔てられた残基間の正式な共有結合によってヘリックス構造を安定化することも可能である。一般的に用いられる天然の方法はジスルフィド結合の利用である（Ｐｉｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．， ４６：４７１−４７９（１９９５）。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に１又は複数のシステイン残基対が置換により導入されている。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に１又は複数のシステイン残基が置換により導入される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、側鎖のラクタムブリッジを利用する。ラクタムとは、アミノ酸の環化により形成され得る環状アミドである。側鎖と側鎖のブリッジは、種々のペプチド及びペプチドアナログ、例えば両親媒性又はモデルαヘリックスペプチド、オキシトシンアンタゴニスト、メラノプトロピン（ｍｅｌａｎｏｐｔｒｏｐｉｎ）アナログ、グルカゴン、及びＳＤＦ−１ペプチドアナログにおける束縛にうまく利用されてきた。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−Ｉ）は、ヘリックスに好ましい特定の条件下で徐々にヘリックス構造をとり、ラクタムブリッジを用いて安定化することができる（Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５１， ２７５８−２７６５（２００８））。これらのラクタムブリッジは、サイズ、安定性の効果（ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、及び結合親和性が異なり得る（上記文献）。そのような修飾は、血漿中での化合物の安定性を向上させた（上記文献）。環化部位間のスペース及び残基の選択によっては、ターン構造又はヘリックス構造の誘導及び安定化にラクタムブリッジを用いることができる。いくつかの実施形態では、近傍のアミノ酸間にラクタムブリッジ（例えばｉからｉ＋４へのグルタミン酸−リジンの束縛）を有する１又は複数のクプレドキシン又はバリアントアナログが作製される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはαヘリックス含有量を高くするためにそのような修飾を含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法は、全て炭素による架橋法（ａｌｌ−ｃａｒｂｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）である。全炭化水素架橋法はヘリックス構造の安定化、プロテアーゼ抵抗性、及び細胞透過性を強化することが証明されている（Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０５， １４６６−１４７０（２００４））。α，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーをペプチドに導入する。ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全て炭化水素による「ステープル」が生成してヘリックスが架橋される（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２２， ５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．の上記文献）。非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーは、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記文献）及びＷｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｉｍ（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １１３：９２７６−９２８６（１９９１））に記載されている方法により合成することができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは全炭化水素ステープルにより安定化される。特定の実施形態では、天然のアミノ酸に対応するα，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの１又は複数対がクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に置換により導入される。別の実施形態では、天然アミノ酸に対応するα、α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザー１又は複数対が緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に置換により導入される。
いくつかの実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
Ｘ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号７６）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）
を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
Ｘ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号７６）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）
からなり得る。
別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
Ｘ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号７７）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、及びＸ９はＬ又はアミド化−Ｌである）
を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
Ｘ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号７７）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、及びＸ９はＬ又はアミド化−Ｌである）
からなり得る。興味深い具体的なペプチドを表３に示す。
ＰＥＧ化
ＰＥＧと治療及び診断に重要な薬物との共有結合は、インビボでの薬物の血中濃度半減期を長期化し且つ／又はそれらの免疫原性及び抗原性を低減させた（Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２：２１４−２２１（２００３））。例えば、ＰＥＧ結合は、とりわけ、インターロイキン（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５０６４（１９８８）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ３３：４４７（１９９５））、インターフェロン（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６：１５７（１９９０））、カタラーゼ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：３５８２（１９７７））、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３１：２５（１９８３））、及びアデノシンデアミナーゼ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：２９３（１９８１））等の多くの治療タンパク質の薬物動態特性を向上させた。ＦＤＡは、食品、化粧品、並びに注射可能な製剤、局所製剤、直腸用製剤、及び経鼻製剤を含む医薬品における賦形剤又は基材としてのＰＥＧの使用を承認している。ＰＥＧはほとんど毒性を示さず、体からそのまま、（ＰＥＧ＜３０ｋＤａは）腎臓により又は（ＰＥＧ＞２０ｋＤａは）便中に排除される。ＰＥＧは水溶性が高い。
治療ペプチドのＰＥＧ化は、腎臓の限外ろ過を少なくすることで患者の血流中におけるペプチドの寿命を延長するために用いられ得、これにより、身体からの薬物の排除が減少する。電荷の遮蔽は腎臓透過に影響を与え得る。帯電遮蔽は、タンパク質のイオン化可能な官能基、すなわちアミン又はカルボキシルの、パラムケミカル（ｐａｒａｍｃｈｅｍｉｃａｌ）な修飾により生じ得る。特に、タンパク質−ＰＥＧ誘導体を製造するための最も一般的な手法では、タンパク質のアミノ基をアミドに変換して正電荷を失わせ、これにより、タンパク質の限外濾過を変化させることができる。腎臓の限外濾過は中性又は陽性の巨大分子よりもゆっくりと陰イオン性巨大分子を除去することがわかっているので、アミノ基にＰＥＧをコンジュゲートすると血流中でのＰＥＧ化ペプチドの永続性が延びると予想される。
分子サイズ及び球状（ｇｌｏｂｕｌａｒ）限外ろ過も治療ペプチドの腎臓限外ろ過に影響を与え得る。腎臓で天然球状タンパク質を除去するための分子量のカットオフは約７０ｋＤａであると考えられ、これは血清アルブミンの分子量に近い。したがって、分子量が７０ｋＤａを超えるタンパク質は、肝臓への取込み、免疫系によるタンパク質の消化及び切断等の腎臓限外ろ過以外の経路によって主に体から排除される。したがって、ＰＥＧ化により治療ペプチドのサイズを大きくすることで患者の血流からのそのペプチドの腎臓限外ろ過を低減することができる。
更に、治療ペプチドのＰＥＧ化は、ペプチドの免疫原性を低下させ得、また、タンパク質分解酵素、食細胞、及び治療ペプチドとの直接接触を必要とするその他の因子からペプチドを保護し得る。分岐ＰＥＧの傘様構造は特に、接近するタンパク質分解酵素、抗体、食細胞等に対して直鎖状のＰＥＧよりも保護効果が高いことが判明している（Ｃａｌｉｃｅｔｉ ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５：１２６１−１２７７８（２００３））。
いくつかの実施形態では、本発明のクプレドキシン由来ペプチドは、システイン分子に共有結合された１又は複数のＰＥＧ分子を有するように修飾されている。共有結合は、ＰＥＧ分子からクプレドキシン由来ペプチドへの直接の共有結合でなくてもよく、互いに共有結合した及び／又はクプレドキシン由来ペプチドに共有結合した、１又は複数のリンカー分子に共有結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは部位特異的ＰＥＧ化を有する。具体的な実施形態では、ＰＥＧ分子は緑膿菌アズリン（配列番号１）のシステイン残基３、２６、及び／又は１１２に共有結合されていてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のシステイン残基が置換導入なされ、ＰＥＧ化される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドをＰＥＧ化する方法は、とりわけ、ＮＨＳ、還元的アニメ化、マリミド、又はエポキシドであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、若しくはチロシン、又はＮ末端アミノ基若しくはＣ末端カルボン酸上でＰＥＧ化されていてもよい。更に具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１若しくは複数のリジン又はＮ末端アミノ基でＰＥＧ化されていてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、又はチロシン残基が置換により導入なされ、ＰＥＧ化される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のアミノ基でＰＥＧ化されてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ランダムに非部位特異的にＰＥＧ化されてよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ＰＥＧベースポリマーの平均分子量が約２００〜約１００，０００ダルトン、約２，０００〜約２０，０００ダルトン、又は約２，０００〜約５，０００ダルトンであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、分岐ＰＥＧ、特に約５０ｋＤａの分枝ＰＥＧ分子である１又は複数のＰＥＧ分子を含み得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数の直鎖状ＰＥＧ分子、特に約５ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ分子を含み得る。
別の実施形態では、ペプチドは、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）に特異的に結合して癌細胞中に内部移行する１３マーの環状オリゴペプチドＰｅｐ４２とのコンジュゲートであるクプレドキシン、又はそのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体である。クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体は、その開示全体を本明細書に援用するＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｃｅｌｌ− ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｉｃ ＧＲＰ７８ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８：１６３２−１６３６（２００８）に開示されている合成法に従いＰｅｐ４２とコンジュゲートされ得る。
別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの構造的等価物である。クプレドキシンとその他のタンパク質の間の有意な構造的相同性を決定する研究の例としては、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １：８２−９２（２００１））が含まれる。具体的には、クプレドキシンと構造的等価物の間の有意な構造的相同性はＶＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され得る（Ｇｉｂｒａｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：３７７−３８５（１９９６）；Ｍａｄｅｊ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２３：３５６−３６９０（１９９５））。具体的な実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の構造比較から得られるＶＡＳＴのｐ値は約１０−３未満、約１０−５未満、又は約１０−７未満であり得る。別の実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の有意な構造的相同性はＤＡＬＩアルゴリズムを用いて決定され得る（Ｈｏｌｍ ＆ Ｓａｎｄｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３３：１２３−１３８（１９９３））。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のＤＡＬＩのＺスコアは少なくとも約３．５、少なくとも約７．０、又は少なくとも約１０．０である。
本発明の組成物のペプチドはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び／又は構造的等価物の２つ以上であってもよいと考えられる。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化したアズリンの切断型、すなわち切断型及び誘導体の両方であってもよい。一実施形態では、本発明のペプチドはα，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーを用いて合成され、その後、ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全炭化水素「ステープル」が形成される（Ｓｃｈａｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４））。更に、アズリンの構造的等価物であるペプチドを他のペプチドに融合させて構造的等価物及び誘導体の両方であるペプチドを作製してもよい。これらの例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は銅に結合してもよく、しなくてもよい。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は緑膿菌アズリン（特にｐ２８）の薬理活性の一部を有する。特定の実施形態では、クプレドキシン及びクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に、限定されるものではないが乳腺細胞における前悪性病変の発達を阻害防止し得る。本発明はまた、哺乳動物の前悪性病変、特に、限定されるものではないがメラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸部癌の細胞の発達を阻害する能力を有し得るクプレドキシン及びクプレドキシンのバリアント、誘導体、構造的等価物も提供する。癌細胞の発達の阻害とは、対照処置と比べて統計的に有意な前悪性病変の発達のあらゆる低減、又は増加速度の低下である。
クプレドキシンはエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入することができ、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に乳房細胞、より具体的にはマウス乳腺細胞における前悪性病変の発達及び最終的には癌の発達を阻害することができることが現在知られているので、現在、この活性を保持しているクプレドキシンのバリアント及び誘導体を設計することが可能である。そのようなバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、例えば、クプレドキシンク並びにプレドキシン由来ペプチドの種々のバリアント、誘導体、及び構造的等価物の「ライブラリー」を作製し、次いで、それぞれについて実施例１の例示的方法のような当該技術分野で公知の多数の方法の１つを用いて優先的移入及び／又は化学予防活性、特にマウス乳腺臓器培養における優先的移入及び／又は化学予防活性を試験することで作製することができる。得られた化学予防活性及び／又は細胞に優先的に移入する能力を有するクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は本発明の方法においてアズリン又はｐ２８の代わりに又はそれに加えて使用することができると考えられる。
いくつかの特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）において７，１２−ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）で誘発される前悪性病変の発達を非処置の対照と比べて統計的に有意に防止し得る。この活性についてのペプチドの試験は、Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９３：１１０３−１１０６（２００１））及びＭｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９：１９−２４（１９９７）に記載されているように又は実施例１に記載されているようにＭＭＯＣモデル系を用いて行うことができる。癌の発達が阻害されているかどうかを決定するその他の方法は当該技術分野で周知であり、それらを用いてもよい。
いくつかの特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物はＭＭＯＣモデルにおいて乳腺胞巣状病変（ＭＡＬ）の発達を非処置の対照と比べて統計的に有意に阻害する。いくつかの具体的な実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、ＭＭＯＣモデルにおける乳管病変（ＭＤＬ）の発達を非処理対照と比べて統計的に有意に阻害する。これらの活性についてのペプチドの試験は、実施例１に記載されているように、ＤＭＢＡにより前悪性病変の形成が誘発されるＭＭＯＣモデル系を用いて行うことができる。ＭＭＯＣモデル系における前悪性病変の発達の評価は、実施例１に記載されているように、形態計測学的分析又は組織病理学的分析によって決定され得る。
いくつかの特定の実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び／又は腫瘍に優先的に移入することができる。いくつかの実施形態では、バリアントはｐ１８の誘導体又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び／又は腫瘍に選択的に移入してＤＮＡ又はＲＮＡを送達することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは送達後に治療効果を発揮する。いくつかの実施形態では、バリアントはｐ２８の誘導体又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び／又は腫瘍に選択的に移入してＤＮＡ又はＲＮＡを送達するができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは送達後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン
これらの小さいブルー銅タンパク質（クプレドキシン）は、細菌の電子伝達鎖に関与するか機能が未知の電子伝達タンパク質（１０〜２０ｋＤａ）である。銅イオンは単独でタンパク質基質に結合される。銅周辺の２個のヒスチジンリガンド及び１個のシステインリガンドへの特別な歪んだ三角形平面配置により、金属部位の非常に特異な電子特性及び強い青色が生じる。複数のクプレドキシンは中〜高分解能の結晶学的解析がなされている。
クプレドキシンは一般的に配列相同性は低いが構造相同性は高い（Ｇｏｕｇｈ ＆ Ｃｌｏｔｈｉａ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２：９１７−９２５（２００４）；Ｄｅ Ｒｉｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１４３９−１４５４（２０００））。例えば、アズリンのアミノ酸配列同一性は、オーラシアニンＢのアミノ酸配列に３１％、ラスチシアニンのアミノ酸配列に１６．３％、プラストシアニンのアミノ酸配列に２０．３％、シュードアズリンのアミノ酸配列に１７．３％である（表１を参照）。しかし、これらのタンパク質の構造類似性はより顕著である。アズリンとオーラシアニンＢの構造を比較したＶＡＳＴのｐ値は１０−７．４、アズリンとラスチシアニンでは１０−５、アズリンとプラストシアニンでは１０−５．６、アズリンとシュードアズリンでは１０−４．１である。
全てのクプレドキシンは８本鎖のギリシャキーβ−バレル（ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ）又はベータ−サンドイッチフォールドを有し、高度に保存された部位構造を有する（Ｄｅ Ｒｉｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１４３９−１４５４（２０００））。メチオニン、ロイシン等の多くの長鎖脂肪族残基の存在により、顕著な疎水性パッチがアズリン、アミシアニン、ラン藻プラストシアニン、キュウリ塩基性タンパク質の銅部位周辺に存在し、それよりは低い程度でシュードアズリン及び真核プラストシアニンの銅部位周辺に存在する（上記文献）。疎水性パッチは、ステラシアニン及びラスチシアニンの銅部位にもこれより低い程度で見られるが、これらは異なる特徴を有する（上記文献）。
Figure 2012512892
１整列させた長さ：２つの構造間で重なる同等なＣ−アルファ原子対の数、すなわち、３Ｄでの重ね合わせを計算するために使用された残基の数。
２ｐ値：ＶＡＳＴのｐ値は、比較の有意性の尺度であり、確率で表される。例えば、ｐ値が０．００１であれば、全く偶然にこの質のマッチを見る見込みは１０００分の１である。ＶＡＳＴのｐ値は、ＭＭＤＢデータベース中に５００個の独立した無関係の種類のドメインがあると仮定して多重比較の影響について調整されている。したがって、示されているｐ値は各ドメイン対をペアワイズ比較して５００で割ったｐ値に相当する。
３スコア：ＶＡＳＴ構造類似性スコア。この数は、重ねられた二次構造要素の数及びその重ね合わせの質に関連する。ＶＡＳＴスコアが高いほど類似性が高い。
４ＲＭＳＤ：オングストロームで表した２乗平均平方根重ね合わせ残差。この数字は、同等なＣ−アルファ炭素間の平均平方距離の平方根として、２つの構造の最適な重ね合わせ後に計算される。ＲＭＳＤ値は構造アラインメントの程度に応じて大きくなり、ＲＭＳＤを全体的な構造類似性の記述に用いる場合はこのサイズを考慮に入れなければならない。
５卵成熟におけるエフリンアンタゴニストであることが示されている線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）主要精子タンパク質（Ｋｕｗａｂａｒａ， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １７：１５５−１６１（２００３））。
アズリン
アズリンは、特定の細菌の電子伝達に関与するクプレドキシンファミリーに属する１２８アミノ酸残基の銅含有タンパク質である。アズリンには、緑膿菌（ＰＡ）由来のもの（配列番号１）、Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来のもの、及びＡ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ由来のものが含まれる（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１５：８５９−８７１（２００２））。アズリン間のアミノ酸配列同一性は６０〜９０％で変動し、これらのタンパク質は強い構造的相同性を示した。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフを有する特徴的なβサンドイッチを有し、単一の銅原子が常にタンパク質の同じ領域に配置される。更に、アズリンは、銅部位を囲む本質的に中性の疎水性パッチを有する（上記文献）。
プラストシアニン
プラストシアニンは、１分子当たり１個の銅分子を含み、酸化型が青色である、ラン藻、藻類、及び植物の可溶性タンパク質である。これらは、葉緑体中で生じ、そこで電子キャリアとして機能する。１９７８年にポプラのプラストシアニンの構造が決定されてから、藻類（セネデスムス属、エンテロモルファ属、クラミドモナス属）及び植物（フレンチビーン）のプラストシアニンの構造が結晶学的方法又はＮＭＲ法により決定され、ポプラの構造は１．３３Åの解像度まで解明された。配列番号３は、好熱性ラン藻のフォルミジウム・ラミノスム由来のプラストシアニンのアミノ酸配列を示している。別の関心のあるプラストシアニンはウルバ・ペルツシスのものである。
藻類と維管束植物のプラストシアニン間では、配列が相違している（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質間で６２％の配列同一性）にも関わらず、三次元構造は保存されている（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質のＣアルファ位において０．７６Åのｒｍｓ偏差）。構造的特徴としては、８本鎖逆平行ベータバレルの一端における歪んだ四面体銅結合部位、顕著な負のパッチ、及び平坦な疎水性表面が含まれる。銅部位は、電子伝達機能に最適化されており、負及び疎水性のパッチが生理学的反応相手の認識に関与すると提唱されている。化学修飾、架橋、及び部位特異的突然変異誘発実験により、シトクロムｆとの結合相互作用における負及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニンに関わる２つの機能的に大きな電子伝達系路のモデルが確認された。推定電子伝達系路の１つは比較的短く（約４Å）、疎水性パッチ中に溶媒露出銅リガンドＨｉｓ−８７を含み、もう一方の経路はそれより長く（約１２〜１５Å）、負のパッチ中にほぼ保存された残基Ｔｙｒ−８３が関与する（Ｒｅｄｉｎｂｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍｅｍｂｒ． ２６：４９−６６（１９９４））。
ラスチシアニン
ラスチシアニンは、チオバチルス属（今はアシドチオバチルス属と呼ばれる）から得られたブルー銅含有単鎖ポリペプチドである。鉄酸化細菌由来の非常に安定で非常に酸化性のクプレドキシンラスチシアニン（配列番号４）の酸化型のＸ線結晶構造が多波長異常回折により決定され、１．９Åの解像度まで解明されている。ラスチシアニンは、６本鎖及び７本鎖のβシートで構成されるコアベータサンドイッチフォールドから構成される。他のクプレドキシン同様、銅イオンが、歪んだ四面体形に配置された４個の保存残基（Ｈｉｓ８５、Ｃｙｓ１３８、Ｈｉｓ１４３、Ｍｅｔ１４８）のクラスターにより配位されている（Ｗａｌｔｅｒ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：７３０−５１（１９９６））。
シュードアズリン
シュードアズリンはブルー銅含有単鎖ポリペプチドのファミリーである。アクロモバクター・サイクロクラステス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｅｓ）から得られたシュードアズリンのアミノ酸配列を配列番号５に示す。シュードアズリンのＸ線構造分析から、シュードアズリンはアズリンと配列相同性は低いが同様な構造を有することが示された。シュードアズリンとアズリンの全体的構造の主な違いは２つである。シュードアズリンはアズリンよりも長いカルボキシ末端を有し、これは２個のアルファヘリックスからなる。ペプチド中央の領域で、アズリンは短いαヘリックスを含むフラップを形成する伸張されたループを含むが、これがシュードアズリンでは短くなっている。銅部位における唯一の主な違いはＭＥＴ側鎖のコンホメーション及びＭｅｔ−Ｓ銅結合長であり、Ｍｅｔ−Ｓ銅結合長はシュードアズリンでアズリンよりも有意に短い。
フィトシアニン
フィトシアニンとして特定可能なタンパク質には、限定されるものではないが、キュウリ塩基性タンパク質、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン（ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐｅｅｌｉｎｇ ｃｕｐｒｅｄｏｘｉｎ）、エンドウ豆の鞘（ｐｅａ ｐｏｄｓ）の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質が含まれる。キュウリ塩基性タンパク質及びエンドウ豆の鞘タンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンで置換されている。
オーラシアニン
好熱性緑色滑走光合成細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）からオーラシアニンＡ、オーラシアニンＢ−１、及びオーラシアニンＢ−２と命名された３つの小さなブルー銅タンパク質が単離されている。２個のＢ型は糖タンパク質であり、互いにほとんど同じ特性を有するが、Ａ型とは異なる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、見かけのノマー分子質量が１４（Ａ）、１８（Ｂ−２）、及び２２（Ｂ−１）ｋＤａであることが示された。
オーラシアニンＡのアミノ酸配列が決定され、オーラシアニンＡは１３９残基のポリペプチドであることが示された（Ｖａｎ Ｄｒｅｉｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８：９４７−９５７（１９９９））。公知の小さな銅タンパク質プラストシアニン及びアズリン同様、Ｈｉｓ５８、Ｃｙｓ１２３、Ｈｉｓ１２８、及びＭｅｔ１３２が、それらが進化上保存されている金属リガンドであるとした場合に予想される通りの間隔で配置されている。二次構造予測も、オーラシアニンが緑膿菌のアズリン及びポプラの葉のプラストシアニンと同様な一般的なベータバレル構造を有することを示している。しかし、オーラシアニンは、両方の小さな銅タンパク質配列クラスの配列特徴を有しているようである。アズリンのコンセンサス配列との全体的類似性はプラストシアニンのコンセンサス配列との全体的類似性とほぼ同じであり、３０．５％である。オーラシアニンのＮ末端配列領域１〜１８にはグリシン及びヒドロキシアミノ酸が顕著に多い（上記文献）（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Ａである配列番号１５を参照されたい（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号ＡＡＭ１２８７４））。
オーラシアニンＢ分子は標準的なクプレドキシンフォールドを有する。クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの結晶構造が研究されている（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３０６：４７−６７（２００１））。追加的Ｎ末端鎖を除き、この分子は細菌のクプレドキシン、アズリンと非常に類似している。他のクプレドキシンにおけるのと同様、ポリペプチドの鎖４上にＣｕリガンドの１つが存在し、他の３つは鎖７及び鎖８の間の大きなループに沿って存在する。Ｃｕ部位の形状は後者の３つのリガンド間のアミノ酸間隔を用いて説明される。結晶解析されたオーラシアニンＢのＣｕ結合ドメインはおそらく、複数の他の膜結合電子伝達タンパク質において知られているテザーと有意な配列同一性を示すＮ末端テイルによって細胞質膜のペリプラスム側に繋ぎ止められている。Ｂ型のアミノ酸配列はＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：６５３１−６５４０（１９９２）に記載されている（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Ｂである配列番号１６を参照されたい（（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号１ＱＨＱＡ））。
ステラシアニン
ステラシアニンは、植物クプレドキシンの広範なファミリーであるフィトシアニンのサブクラスである。ステラシアニンの例示的配列を配列番号１４として本明細書に含める。セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）の根から得られたステラシアニンであるウメシアニン（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２７：１５８−１６６（２００５））及びキュウリステラシアニン（Ｈａｒｔ ｅｌ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：２１７５−２１８３（１９９６））の結晶構造も公知である。このタンパク質の全体的フォールドは他のフィトシアニンと同様である。エフリンＢ２タンパク質外部ドメインの三次構造はステラシアニンと有意な類似性を有する（Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １：８３−９２（２００１））。ステラシアニンの例示的アミノ酸配列は全米バイオテクノロジー情報センタータンパク質データバンクのアクセッション番号１ＪＥＲに見られる（配列番号１４）。
キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的アミノ酸配列を配列番号１７として本明細書に含める。タイプ１ブルー銅タンパク質であるキュウリ塩基性タンパク質（ＣＢＰ）の結晶構造は１．８Åの解像度で解明されている。この分子は、ギリシャキーベータバレル構造を有する点で他のブルー銅タンパク質と似ているが、バレルが一方の側で開いており、「ベータサンドイッチ」又は「ベータタコス（ｂｅｔａ−ｔａｃｏ）」と記述する方が近い（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：６８６−７０５（１９９６））。エフリンＢ２タンパク質外部ドメインの三次構造はキュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似性を有する（５０α炭素に関してｒｍｓ偏差１．５Å）（Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １：８３−９２（２００１））。
Ｃｕ原子は、結合長がＣｕ−Ｎ（Ｈｉｓ３９）＝１．９３Ａ、Ｃｕ−Ｓ（Ｃｙｓ７９）＝２．１６Ａ、Ｃｕ−Ｎ（Ｈｉｓ８４）＝１．９５Ａ、Ｃｕ−Ｓ（Ｍｅｔ８９）＝２．６１Ａである通常のブルー銅ＮＮＳＳ配位を有する。ジスルフィド結合（Ｃｙｓ５２）−Ｓ−Ｓ−（Ｃｙｓ８５）が分子構造の安定化に重要な役割を果たしているようである。ポリペプチドのフォールドは、ブルー銅タンパク質（フィトシアニン）サブファミリー及びＣＢＰと配列同一性が高い非金属タンパク質であるブタクサアレルゲンＲａ３に典型的なものである。現在フィトシアニンとして特定可能なタンパク質はＣＢＰ、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン、エンドウ豆の鞘の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質である。ＣＢＰ及びエンドウ豆の鞘のタンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンに置換されている。キュウリ塩基性タンパク質の例示的配列はＮＣＢＩタンパク質データバンクのアクセッション番号２ＣＢＰに見られる（配列番号１７）。
使用方法
本発明は、他の点では健康な患者の悪性病変を防止する方法であって、前述したクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物である少なくとも１つのペプチドを患者に投与することを含む方法を提供する。化学防止療法は、発癌に関与するプロセスを遮断することで癌の発達が妨げられるという仮説に基づく。クプレドキシン緑膿菌アズリン及び切断型アズリンペプチドｐ２８は、現在、前悪性病変の初期の形成を阻害するか存在している前悪性病変を死滅させるかその成長を阻害することによって前悪性病変の発達を阻害することが知られている。
したがって、前悪性病変の発達を阻害する能力を有する前述のクプレドキシン又はそのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物をその他の点では健康な患者の防止的化学療法に使用することができると考えられる。そのようなその他の点では健康な患者は、いくつかの実施形態では、一般集団よりも癌を発達させるリスクが大きい患者である。本発明の組成物を用いた処置により防止され得る癌としては、限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒトであり得る。別の実施形態では、患者はヒトでない。
本発明は更に、癌細胞に優先的に移入する組成物及び方法を含む。クプレドキシン、特にアズリン誘導体ｐ１８及びｐ２８は現在、ゴルジ装置が仲介し得るカベオラ介在性エンドサイトーシスを含む本明細書に記載の特定のメカニズムを介して癌細胞に移入することが知られている。したがって、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、癌細胞に移入してこれを死滅させるために使用することができ、細胞膜を横切るカーゴの輸送にも使用することができると考えられる。
本発明は更に、発癌物質による誘発の前又は後に哺乳動物細胞をクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物と接触させて細胞の発達を観察することを含む、癌の発達を研究する方法を含む。いくつかの実施形態では、細胞はマウス乳腺細胞であり、別の実施形態では、細胞は、哺乳動物において悪性になり得るその他の細胞である。
一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者としては、高リスク特性を有する患者、前悪性病変を有する患者、及び初期癌の治療歴を有する又は前悪性病変の根治的処置を施された患者である（Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ， ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ５４：１５０−１８０（２００４）参照）。高リスク特性は、患者の行動的要因、遺伝的要因、環境的要因、又は生理的要因であり得る。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする行動的要因には、限定されるものではないが、喫煙、食事、飲酒、ホルモン置換療法、高い肥満度指数、未産、ビンロウジ（ｂｅｔａｌ ｎｕｔ）の使用、口腔洗浄薬の頻繁な使用、ヒトパピローマウイルスへの暴露、小児期の及び慢性的な日光への暴露、若年齢での初性交、複数の性的パートナー、及び経口避妊薬の使用が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする遺伝的要因には、限定されるものではないが、癌の家族歴、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の遺伝子保有状態、乳房新生物の前病歴、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）、赤毛又はブロンド毛及び皮膚が色白の表現型、色素性乾皮症、及び民族性が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする環境特性としては、限定されるものではないが、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロマート、ヒ素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ［ａ］ピレン、放射線、及びゴム由来の芳香族アミンへの暴露、又は塗料への職業的暴露が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくするその他の種々の要因としては、限定されるものではないが、気道閉塞による慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染症、住血吸虫症、高齢、及び免疫不全状態が含まれる。
更に、癌を発達させるリスクの高い患者は、特定の種類の癌について開発された種々のリスクモデルを用いて決定され得る。例えば、乳癌に罹りやすい患者は、とりわけ、ゲイル（Ｇａｉｌ）リスクモデル又はクラウス（Ｃｌａｕｓ）モデルを用いて決定され得る（Ｇａｉｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８１：１８７９−１８８６（１９８９）；Ｃｕｚｉｃｋ， Ｂｒｅａｓｔ １２：４０５−４１１（２００３）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５１：７０３−７１４（２０００）参照）。
前悪性病変を有する患者は一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。患者が前悪性病変を有するかどうかは当業者に周知の多くの方法で決定され得る。前悪性病変起源の中間体マーカー又はバイオマーカーを患者の体内で測定して患者が前悪性病変を有するかどうかを決定してもよい。大部分の癌患者において、腫瘍細胞及び隣接する組織学的に正常な組織で染色体異常が生じている。染色体異常の進行は前悪性病変から浸潤癌への表現型の進行と並行する（Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：５１３３−５１３９（１９９５））。したがって、癌に関連する染色体異常を患者の前悪性病変を検出するための中間体マーカーとして用いることもできる。癌に伴う一般的な染色体異常には、限定されるものではないが、３ｐ（ＦＨＩＴ等）、９ｐ（ｐ１６ＩＮＫ４、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、及びｐ１９ＡＲＦでは９ｐ２１）、１７ｐ（ｐ５３遺伝子等では１７ｐ１３）及び１３ｑ（網膜芽細胞腫遺伝子Ｒｂ等には１３ｑ１４）等の腫瘍抑制因子遺伝子における対立遺伝子の欠失又はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）が含まれる。３ｐ及び９ｐにおける欠失は喫煙及び肺癌の初期段階に関係している（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９：８５７−８６２（１９９７））。３ｐ、５ｑ、８ｐ、１７ｐ、及び１８ｑに影響を与える欠失は上皮癌において一般的な変化である（Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ．， ＣＡ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ５４：１５３ （２００４）参照）。癌に関連するその他の染色体変異として、癌遺伝子を活性化するものが含まれる。その存在を中間体マーカーとして使用することができる癌遺伝子には、限定されるものではないが、Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、上皮増殖因子、ｅｒｂ−Ｂ２、及びサイクリンＥ、Ｄ１、及びＢ１が含まれる（上記文献のｐ１５４参照）。
その他の中間体マーカーとしては、前悪性細胞及び癌細胞においてアップレギュレートされる遺伝子産物を挙げることができる。前悪性細胞においてアップレギュレートされ得る遺伝子には、限定されるものではないが、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２、テロメラーゼが含まれる。癌細胞及び一部の前悪性細胞のその他のバイオマーカーには、限定されるものではないが、ｐ５３、上皮増殖因子受容体（ＧＦＲ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＲＡＳ、ＣＯＸ−２、Ｋｉ−６７、ＤＮＡ異数性、ＤＮＡポリメラーゼ−α、ＥＲ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｅ−カドヘリン、ＲＡＲβ、ｈＴＥＲＴ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＦＨＩＴ（３ｐ１４）、Ｂｃｌ−２、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＨＰＶ感染、ＬＯＨ ９ｐ２１、ＬＯＨ １７ｐ、ｐ−ＡＫＴ、ｈｎＲＮＰ Ａ２／Ｂ１、ＲＡＦ、Ｍｙｃ、ｃ−ＫＩＴ、サイクリンＤ１、Ｅ、及びＢ１、ＩＧＦ１、ｂｃｌ−２、ｐ１６、ＬＯＨ ３ｐ２１．３、ＬＯＨ ３ｐ２５、ＬＯＨ ９ｐ２１、ＬＯＨ １７ｐ１３、ＬＯＨ １３ｑ、ＬＯＨ ８ｐ、ｈＭＳＨ２、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＪＶ１８、ＢＡＸ、ＰＳＡ、ＧＳＴＰ１、ＮＦ−κＢ、ＡＰ１、Ｄ３Ｓ２、ＨＰＶ感染、ＬＯＨ ３ｐ１４、ＬＯＨ ４ｑ、ＬＯＨ ５ｐ、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、ＢＴＫ ＴＲＡＫ（ワシントン州レドモンドのアリデックス社（Ａｌｉｄｅｘ， Ｉｎｃ）製）、尿路マトリックスタンパク質２２、フィブリン分解産物、自己分泌型細胞運動刺激因子（ａｕｔｏｄｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＢＣＬＡ−４、サイトケラチン２０、ヒアルロン酸、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＢＣＡ、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、及び組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）が含まれる（上記文献のｐ１５５〜１５７参照）。
初期癌を治療された患者又は前悪性病変の根治的処置を施された患者も一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。続発性原発腫瘍（Ｓｅｃｏｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ）とは、癌の病歴を有する人における新たな原発性癌を意味する。続発性原発腫瘍は、頭頸部癌における主な死亡原因である（上記文献のｐ１５０）。続発性原発腫瘍と転移は前者が新規なものであるのに対し後者は既に存在する腫瘍を起源とするという点では異なる。乳、頭頸部、及び皮膚の癌又は前悪性病変の治療歴を有する患者は続発性原発腫瘍を発達させるリスクが特に高い。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物は、当業者に周知の多くの経路及び多くの投与計画により患者に投与することができる。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、又は吸入により投与される。組成物は、癌を発達させるリスクのある患者内の部位にペプチドを送達する任意の手段によって患者に投与され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物は静脈内投与される。
一実施形態では、方法は、患者にクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物の１単位投与量及び別の化学予防薬を含む組成物の１単位投与量を、任意の順番で、又はほぼ同時に、又は他方の投与からほぼ所定の時間以内に、例えば他方の薬物を投与した約１〜約６０分後若しくは他方の薬物を投与した約１〜約１２時間後に、共投与することを含み得る。関心のある化学予防薬としては、限定されるものではないが、タモキシフェン、アロマターゼ阻害薬、例えばレトロゾール及びアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））；レチノイド、例えばＮ−［４−ヒドロキシフェニル］レチンアミド（４−ＨＰＲ、フェンレチニド）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアスピリン及びスリンダク；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害薬）、デフルオロメチルオルニチング（ＤＦＭＯ）、ウルソデオキシコール酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ阻害薬、ＥＫＩ−７８５（ＥＧＦＲ阻害薬）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ受容体に対する抗体）、セツキシマブ（ＥＧＦＲに対する抗体）、レチノール、例えばビタミンＡ、ベータ−カロテン、１３−シスレチノイン酸、イソトレチノイン、及びパルミチン酸レチニル；α−トコフェロール、インターフェロン、腫瘍退縮アデノウイルスｄｌ１５２０（ＯＮＹＸ−０１５）、ゲフィチニブ、エトレチナート、フィナステリド、インドール−３−カルビノール、リスベラトロール、クロロゲン酸、ラロキシフェン、及びオルチプラズが含まれる。
癌細胞及び腫瘍への化合物の移入を促進する組成物
本発明は、細胞中にカーゴ化合物を送達するための方法及び材料に関する。本発明に係るカーゴ化合物の送達は好適な輸送ポリペプチドを用いて達成される。本発明の一実施形態では、カーゴ化合物が輸送ポリペプチドに連結される。好適な輸送ペプチドとしては、クプレドキシン又は「クプレドキシン移入ドメイン」を含むクプレドキシンの断片が含まれる。「クプレドキシン移入ドメイン」という用語は、哺乳動物の癌細胞中にクプレドキシンが移入するために必要なアミノ配列を含むクプレドキシンの断片を意味する。本発明により送達されるカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖；ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びアンチセンス核酸を含む核酸；色素、蛍光及び放射活性タグ、微粒子又はナノ粒子、毒素、無機及び有機分子、小分子、並びに薬物（例えば化学予防薬）が含まれる。いくつかの実施形態では、薬物及び毒素は腫瘍細胞を死滅させる。
本発明の一実施形態では、クプレドキシンは、緑膿菌のアズリン（配列番号１）等のアズリンである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンは、とりわけ、プラストシアニン、ラスチシアニン、又はシュードアズリンである。具体的な実施形態では、アズリンはとりわけ、緑膿菌、シュードモナス・シリンゲ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌、腸炎ビブリオ、又は気管支敗血症菌に由来する。
一実施形態では、カーゴ化合物は、癌細胞等の細胞の細胞周期進行を停止又は遅延させるために送達される。そのような癌細胞としては、例えば、とりわけ、骨肉腫細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、軟組織肉腫細胞、又は乳癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、又は前立腺癌細胞を挙げることができる。例えば、カーゴ化合物は、とりわけ、細胞周期調節タンパク質、例えばｐ５３；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、例えばｐ１６、ｐ２１、又はｐ２７；自殺タンパク質、例えばチミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼ；サイトカイン又はその他の免疫調節タンパク質、例えばインターロイキン１、インターロイキン２、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；又は毒素、例えば緑膿菌の外毒素Ａであり得る。別の実施形態では、上記のクラスの化合物の１つの生物学的活性断片が送達される。別の実施形態では、カーゴ化合物は標的組織の画像を生成するために送達される。例えば、標的組織は癌であってよく、カーゴ化合物は、Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、及び超音波による検出のための画像を生成するために一般的に使用されるものであってよい。これらの実施形態では、カーゴ化合物は、ガンマ線放出性又は陽電子放出性のラジオアイソトープ、磁気共鳴画像法の造影剤、Ｘ線造影剤、又は超音波造影剤である。
本発明は更に、哺乳動物の癌細胞にＤＮＡ又はＲＮＡを選択的に導入する方法を含む。そのような実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡがカーゴ化合物である。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合されたｐ１８又はｐ２８を提供すること及び化合物を哺乳動物の体に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは遺伝子又は遺伝子断片である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは哺乳動物の細胞中に導入された後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン移入ドメイン
本発明は、癌細胞にペプチドを優先的に移入させ、連結されたカーゴを哺乳動物の非癌細胞ではなく癌細胞に輸送することを可能にする、タンパク質形質導入ドメインを提供する。クプレドキシンタンパク質がタンパク質形質導入ドメインであるクプレドキシン移入ドメインを含み、これが、連結されたカーゴの哺乳動物の癌細胞への移入を促進することを見出した。いくつかの実施形態では、連結されたカーゴの癌細胞への選択的輸送を促進するためにクプレドキシンタンパク質全体が使用され得る。別の実施形態では、連結されたカーゴの癌細胞への輸送にクプレドキシンの一部が使用され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、全長野生型タンパク質よりも短いクプレドキシン領域からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンの約１０残基超、約１５残基超、又は約２０残基超からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンの約５０残基以下、約４０残基以下、又は約３０残基以下からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％である。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインはアズリン移入ドメインである。本発明の一実施形態では、アズリン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸５０〜７７（ｐ２８；配列番号２）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸３６〜７７（配列番号２７）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸３６〜８９（配列番号２８）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸３６〜１２８（配列番号２９）を含む。
本発明の更に別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸５０〜６７（ｐ１８；配列番号２５）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸５３〜７０（配列番号３０）を含む。本発明の更に別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸５３〜６４（配列番号３１）を含む。
本明細書に記載の実施例、特に実施例１９は、ｐ１８（アミノ酸５０〜６７）に存在しないｐ２８のＣ末端領域が細胞膜上の特定の残基に接触して細胞へのアクセスを可能にしているであろうことを示している。したがって、本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、ｐ２８の少なくともアミノ酸６６〜７７（配列番号３５）を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、ｐ２８の少なくともアミノ酸６８〜７７（配列番号３６）を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、ｐ２８の少なくともアミノ酸６７〜７７（配列番号３７）を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、配列番号２の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸の１又は複数を含む。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、配列番号２のアミノ酸６９、７０、７５、７６、及び８５を含む。
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリン以外のクプレドキシンに由来する移入ドメインである。種々の実施形態においてクプレドキシン移入ドメインは、ラン藻フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン（配列番号３）；鉄酸化細菌のラスチシアニン（配列番号４）；アクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン（配列番号５）、シュードモナス・シリンゲのアズリン（配列番号２１）；髄膜炎菌のアズリン（配列番号１０）；腸炎ビブリオのアズリン（配列番号８）、又はクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニン（配列番号１５及び１６）の断片であり得る。
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの少なくともアミノ酸５７〜８９（配列番号２０）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、シュードモナス・シリンゲのアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２１）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、髄膜炎菌のＬａｚの少なくともアミノ酸８９〜１１５（配列番号２２）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸５２〜７８（配列番号２３）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２４）を含む。
クプレドキシン移入ドメインの修飾
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを化学的に修飾するか遺伝的に変化させて、細胞中に優先的に移入し且つ／又はカーゴ化合物を輸送する能力を保持しているバリアントを作製する。例えば、実施例１４は、５４、６１、及び７０位にプロリン残基を導入された緑膿菌アズリンがＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に移入する能力を保持していることを示している。
別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、保存されたアミノ酸配列ＤＧＸＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ（配列番号３２）又はＤＧＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ（配列番号３３）（式中、Ｄはアスパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｋはリジン、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む（実施例１７参照）。
クプレドキシン移入ドメインのバリアントは標準的な技術で合成され得る。誘導体は、天然化合物から直接又は修飾若しくは部分的置換によって形成されるアミノ酸配列である。アナログは、天然化合物と同一ではないが同様な構造を有し、特定の要素又は側鎖に関して天然化合物と異なるアミノ酸配列である。アナログは、合成されてもよく、異なる進化起源のものであってもよい。
誘導体又はアナログが修飾アミノ酸を含む場合、バリアントは、全長であっても全長でなくてもよい。クプレドキシン移入ドメインのバリアントとしては、限定されるものではないが、クプレドキシン移入ドメインに、同じ長さのアミノ酸配列の全体の同一性又は相同性アルゴリズムにより整列された配列と比較した時の同一性が少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の実質的に相同な領域を含む分子が含まれる。
別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントは、緑膿菌アズリン残基５０〜７７（ｐ２８；配列番号２）に対して有意な構造類似性を有する。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントは、膿菌アズリン残基５０〜６７（ｐ１８；配列番号２５）に対して有意な構造類似性を有する。クプレドキシンと他のタンパク質の間に有意な構造的相同性があるかを決定する研究例としては、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ． （Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １：８２−９２（２００１））が含まれる。具体的には、クプレドキシン移入ドメインと緑膿菌アズリン残基５０〜７７（配列番号２）の間の有意な構造的相同性は、ＶＡＳＴアルゴリズム（Ｇｉｂｒａｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：３７７−３８５（１９９６）；Ｍａｄｅｊ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２３：３５６−３６９０（１９９５））を用いて決定される。具体的な実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントと緑膿菌アズリン残基５０〜７７（配列番号２）との構造比較のＶＡＳＴ ｐ値は約１０−３未満、約１０−５未満、又は約１０−７である。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントと緑膿菌アズリン残基５０〜７７（配列番号２）の間の有意な構造的相同性は、ＤＡＬＩアルゴリズム（Ｈｏｌｍ ＆ Ｓａｎｄｅｒ， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３３：１２３−１３８（１９９３））により決定することができる。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のＤＡＬＩのＺスコアは少なくとも約３．５、少なくとも約７．０、又は少なくとも約１０．０である。
クプレドキシン移入ドメインへの修飾は、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発、並びに本明細書に開示されている方法及び技術等の当該技術分野で公知の方法を用いてなされ得る。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２３７：１−７（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−５０（１９８７））、カセット変異導入、制限部位選択的変異導入法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ ３４：３１５−２３（１９８５））、又はその他の公知の技術をクローニングしたＤＮＡに行うことでクプレドキシン移入ドメインバリアント核酸を作製してもよい。更に、クプレドキシン移入ドメインに対する構造類似性を有する移入ドメインをコードするヌクレオチドが当該技術分野で周知の方法で合成され得る。更に、野生型又はバリアントのクプレドキシン移入ドメインであるタンパク質分子が当該技術分野で周知の方法で合成され得る。
クプレドキシン移入ドメイン及びカーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメイン複合体をコードする核酸
別の態様では、本発明は、カーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、カーゴ化合物がタンパク質又はペプチドである、核酸分子を提供する。本発明に係る核酸分子は、当該技術分野で公知の技術を組み合わせて作製することができる。例えば、クプレドキシン移入ドメインの核酸配列及びカーゴ化合物の核酸配列は化学合成又はクローニングによって別々に作製され得る。次いで、リガーゼを用いて核酸配列を順番通りにライゲーションさせて目的の核酸分子が得られる。
クプレドキシン移入ドメインを用いてカーゴ化合物を送達する方法
多数のアルギニンリッチペプチドが哺乳動物細胞膜を通って移動してそのような細胞内にタンパク質カーゴタンパク質を運搬することが知られている（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：２４３７−４３（２００２））。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の短いアルギニンリッチな１１アミノ酸（アミノ酸４７〜５７）セグメントは哺乳動物細胞中へのカーゴタンパク質の輸送を可能にする（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， ＳＲ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：２９０−９５（２０００））。アルファヘリックス含有量を増やし、アルギニン残基の配置を最適化した合成移入ドメインは、タンパク質形質導入ドメインとしてより高い潜在力を有することが示されている（Ｈｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：４７４−７７（２００１））。比較すると、緑膿菌アズリンは１つのアルギニン残基を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞へのカーゴ化合物の移入を促進するクプレドキシン断片、例えばｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の使用を含む。そのような断片は、細胞への移入に必要な断片を特定する任意の方法によって決定され得る。そのような方法の１つでは、クプレドキシン断片をマーカー物質に連結し、クプレドキシン断片が細胞に移入するかどうかを試験する。そのような方法を用いて前述の好適なクプレドキシン断片が特定され得る。
本発明の種々の実施形態で、カーゴ化合物は、クプレドキシン又はその断片、例えば、緑膿菌のアズリン（配列番号１）；ラン藻フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン（配列番号３）；鉄酸化細菌のラスチシアニン（配列番号４）；又はアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン（配列番号５）、シュードモナス・シリンゲのアズリンの断片（配列番号２１）、髄膜炎菌のアズリン（配列番号１０）、腸炎ビブリオのアズリン（配列番号１９）、気管支敗血症菌のアズリン（配列番号８）、クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＡ及びＢ（配列番号１５及び１６）、とりわけ、アズリン及びアズリン様タンパク質に付加されている。別の実施形態では、カーゴは、ｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）、又は配列番号３５〜３７のいずれか等のクプレドキシン移入ドメインに連結されている。
本発明の種々の実施形態で、クプレドキシン移入ドメインはインビトロ、エクスビボ、又はインビボでカーゴ化合物を細胞内に送達する。例えば、送達は、ｐａｐスメアのようにクプレドキシン移入ドメインとカーゴ化合物の複合体を細胞培養に添加することによってインビトロで達成され得る。あるいは、送達は、患者から採った試料、例えば血液、組織、又は骨髄に複合体を添加し、処置済試料を患者に戻すことで、エクスビボで達成され得る。送達は、患者に複合体を直接投与することでも達成され得る。本発明の方法は、治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）、診断、又は研究を目的に用いられ得る。本発明により送達されるカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、アンチセンス核酸を含む核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、有機分子、無機分子、小分子、及び薬物が含まれる。
一実施形態では、検出可能な物質、例えば、蛍光物質、例えば緑色蛍光タンパク質；発光物質；酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ；又は放射性標識若しくはビオチン化したタンパク質を送達して検出可能な表現型を細胞に付与する。同様に、蛍光物質等の検出可能な物質で標識された微粒子又はナノ粒子を送達することができる。好適なナノ粒子の一例は、参照により明示的に本明細書に援用する２００２年５月７日に付与された米国特許第６，３８３，５００号に記載されている。多くのそのような検出可能な物質が当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、カーゴ化合物は、Ｘ線コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、超音波画像法、又は放射性核種シンチグラフィーに適した検出可能な物質である。これらの実施形態では、カーゴ化合物は診断目的で患者に投与される。Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ、及び超音波により得られる画像を強めるためにカーゴ化合物として造影剤が投与される。クプレドキシン移入ドメインにより腫瘍組織にターゲティングされる放射性核種カーゴ化合物の投与を放射性核種シンチグラフィーに用いることができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、カーゴ化合物と共に又はカーゴ化合物なしで、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含み得る。別の実施形態では、カーゴ化合物は、ガンマ線放射性又は陽電子放射性のラジオアイソトープ、磁気共鳴画像法の造影剤、Ｘ線造影剤、又は超音波造影剤である。
カーゴ化合物としての使用に適した超音波造影剤には、限定されるものではないが、標的部分とマイクロバブルの間に必要に応じて連結部分Ｌｎを更に含む生体適合性気体のマイクロバブル、液体キャリア、及び界面活性剤マイクロスフェア（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）が含まれる。この文脈において、液体キャリアという用語は水溶液を意味し、界面活性剤という用語は、溶液の界面張力を低下させる任意の両親媒性材料を意味する。界面活性剤マイクロスフェアの形成に適した界面活性剤の一覧は、参照により明示的に本明細書に援用する欧州特許第０７２７２２５（Ａ２）号に開示されている。界面活性剤マイクロスフェアという用語は、ナノスフェア、リポソーム、小胞等を含む。生体適合性気体は、空気又はフルオロカーボン、例えばエコー輝度に差を生じさせることで超音波画像法においてコントラストを生じさせるＣ３〜Ｃ５パーフルオロアルカンであり得る。気体は、マイクロスフェアに含有されるかカプセル化され、これにクプレドキシン移入ドメインが（必要に応じて連結基を介して）結合している。この結合は、共有結合、イオン性結合、又はファンデルワールス力によるものであり得る。そのような造影剤の具体例としては、複数の腫瘍新血管系受容体結合性のペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣薬を有する脂質カプセル化パーフルオロカーボンが含まれる。
カーゴ化合物としての使用に適したＸ線造影剤としては、限定されるものではないが、１又は複数のＸ線を吸収する又は原子番号が２０以上の「重」原子が含まれ、これらは必要に応じてクプレドキシン移入ドメインとＸ線吸収原子の間に更に連結部分Ｌｎを含んでもよい。Ｘ線造影剤に使用されることが多い重原子はヨウ素である。近年、金属キレートを含むＸ線造影剤（例えば米国特許第５，４１７，９５９号）及び複数の金属イオンを含むポリキレートを含むＸ線造影剤（例えば米国特許第５，６７９，８１０号）が開示された。更に最近では、Ｘ線造影剤として多核クラスター錯体（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）が開示されている（例えば、米国特許第５，８０４，１６１号、国際公開第９１／１４４６０号、及び同第９２／１７２１５号）。
カーゴ化合物としての使用に適したＭＲＩ造影剤としては、限定されるものではないが、１又は複数の常磁性金属イオンが含まれ、これは、クプレドキシン移入ドメインと常磁性金属イオンの間に必要に応じて連結部分Ｌｎを更に含んでもよい。この常磁性金属イオンは、金属錯体又は金属酸化物粒子の形態で存在する。米国特許第５，４１２，１４８号及び同第５，７６０，１９１号にＭＲＩ造影剤に使用するための常磁性金属イオンのキレーターの例が記載されている。米国特許第５，８０１，２２８号、同第５，５６７，４１１号、及び同第５，２８１，７０４号には、ＭＲＩ造影剤に使用するための２種以上の常磁性金属イオンを錯体化するのに有用なポリキレート剤（ｐｏｌｙｃｈｅｌａｎｔ）の例が記載されている。米国特許第５，５２０，９０４号には、ＭＲＩ造影剤として使用するための常磁性金属イオンを含む微粒子組成物が記載されている。
別の実施形態では、カーゴ化合物は癌細胞等の細胞中で細胞周期進行を停止又は遅延させるために送達される。そのような癌細胞としては、例えば、骨肉腫細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、軟組織肉腫細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、又は前立腺癌細胞を挙げることができる。例えば、カーゴ化合物としては、細胞周期調節タンパク質、例えばｐ５３；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、例えばｐ１６、ｐ２１、又はｐ２７；自殺タンパク質、例えばチミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼ；サイトカイン又はその他の免疫調節タンパク質、例えばインターロイキン１、インターロイキン２、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；又は毒素、例えば緑膿菌の外毒素Ａを挙げることができる。別の実施形態では、上記クラスの化合物の１つの生物学的活性断片が送達される。
更に別の実施形態では、カーゴ化合物は核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は上記クラスの化合物の１つをコードする。更に別の実施形態では、カーゴ化合物は癌の処置に使用される薬物である。そのような薬物としては、例えば、５−フルオロウラシル；インターフェロンα；メトトレキサート；タモキシフェン；及びビンクリンスチンが含まれる。上記の例は説明のためにだけ提供するものであり、他にも多数のこのような化合物が当業者に公知である。別の実施形態では、核酸は遺伝子治療に有用である。
癌の処置に適したカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、エチレンイミン、及びトリアゼン；代謝拮抗薬、例えば葉酸拮抗薬、プリンアナログ、及びピリミジンアナログ；抗生物質、例えばアントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、及びプリカマイシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；５アルファレダクターゼ阻害剤；１７ベータヒドロキシステロイド脱水素酵素３型の阻害剤；ホルモン剤、例えばグルココルチコイド、エストロゲン／抗エストロゲン薬、アンドロゲン／抗アンドロゲン薬、プロゲスチン、及び黄体ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド；微小管破壊剤、例えばエクチナサイジン又はそのアナログ及び誘導体；微小管安定化剤、例えばタキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））、及びそのアナログ、並びにエポチロン、例えばエポチロンＡ〜Ｆ及びそのアナログ；植物由来産物、例えばビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン；及びトピオソメラーゼ阻害剤；プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；及び種々の薬剤、例えばヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、白金配位錯体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；並びに抗癌剤及び細胞毒性薬剤として使用されるその他の薬剤、例えば生体応答修飾物質、成長因子；免疫調節剤及びモノクローナル抗体が含まれる。
これらのクラスの抗癌剤及び細胞毒性薬剤の代表例としては、限定されるものではないが、塩酸メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、ダカルバジン、メトトレキサート、チオグアニン、メルカプトプリン、フルダラビン、ペンタスタチン（ｐｅｎｔａｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン、シタラビン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、サフラシン、サフラマイシン、キノカルシン（ｑｕｉｎｏｃａｒｃｉｎ）、ディスコデルモリド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、タモキシフェン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、ブセレリン、ロイプロリド、プテリジン、ダイネース（ｄｉｙｎｅｓｅｓ）、レバミソール、アフラコン（ａｆｌａｃｏｎ）、インターフェロン、インターロイキン、アルデスロイキン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、リツキシマブ、ＢＣＧ、トレチノイン、塩酸イリノテカン、ベタメトゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、塩酸ゲムシタビン、アルトレタミン、及びトポテカ（ｔｏｐｏｔｅｃａ）、及びその任意のアナログ又は誘導体が含まれる。
これらのクラスの好ましい一員としては、限定されるものではないがパクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、マイトマイシンＣ、エクチナサイジン７４３、又はポフィロマイシン（ｐｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド、リン酸エトポシド、又はテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、及びロイロシンが含まれる。
カーゴ化合物として有用な抗癌剤及びその他の細胞毒性薬剤の例としては以下のものが含まれる：ドイツ特許第４１３８０４２．８号、国際公開第９７／１９０８６号、同第９８／２２４６１号、同第９８／２５９２９号、同第９８／３８１９２号、同第９９／０１１２４号、同第９９／０２２２４号、同第９９／０２５１４号、同第９９／０３８４８号、同第９９／０７６９２号、同第９９／２７８９０号、同第９９／２８３２４号、同第９９／４３６５３号、同第９９／５４３３０号、同第９９／５４３１８号、同第９９／５４３１９号、同第９９／６５９１３号、同第９９／６７２５２号、同第９９／６７２５３号、及び同第００／００４８５号に記載されているようなエポチロン誘導体；国際公開第９９／２４４１６号に記載されているようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（米国特許第６，０４０，３２１号も参照）；並びに国際公開第９７／３０９９２号及び同第９８／５４９６６号に記載されているようなプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；及び米国特許第６，０１１，０２９号に一般的及び具体的に記載されているような剤（この米国特許の化合物は、ＡＲ調節剤、ＥＲ調節剤等の任意のＮＨＲ調節剤（限定されるものではないが、本発明のものも含まれる）、ＬＨＲＨ調節剤、又は去勢手術と共に、特に癌の処置において使用することができる）。
上記のその他の治療薬は、本発明の化合物と共にカーゴ化合物として使用する際、例えば米医薬品便覧（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ））に記載されている量で又は当業者に決定されるように使用され得る。
クプレドキシン移入ドメインを含む医薬組成物
クプレドキシン移入ドメインを含む又はからなる医薬組成物及びカーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメインの複合体を含む医薬組成物を任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。複合体は、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、調合物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤することを可能にする。好適な補形剤としては、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。
そのような組成物は、例えば、細胞型の検出若しくは画像化又は細胞死に関連する状態の処置若しくはその防止に使用され得る。組成物は、細胞死への抵抗性に関連する状態を防止又は処置するために十分な量で投与され得る。本明細書において、「細胞死への抵抗性に関連する状態」という用語は、思慮分別のある熟練の外科医又は臨床医に決定される同様な種類の正常な細胞と比べて少なくとも細胞の寿命が長い傾向を特徴とする疾患、状態、又は疾病を意味する。通常、宿主生物はヒト又は動物等の哺乳動物である。
クプレドキシン移入ドメインを含む組成物の投与
クプレドキシン移入ドメインを含む組成物は、任意の好適な経路、例えば、経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、膣内、経尿道、経鼻、局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓすなわちｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）又は非経口（例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内投与）によって投与され得る。組成物及びその医薬製剤は意図する目的を達成するために有効な任意の量で投与され得る。細胞死への抵抗性に関連する状態を処置するために投与される場合、組成物は治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、処置対象の発達を防止するかその既存の症状を軽減するのに有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
適切な用量は、当然ながら、例えば使用するクプレドキシン移入ドメインを含む化合物、宿主、投与形態、並びに処置又は診断されている状態の性質及び重症度によって異なる。しかし、本発明の方法の一実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物の１日用量（ｄａｉｌｙ ｄｏｓａｇｅ）が約０．００１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の時にヒトにおいて十分な処置結果が得られることが示されている。一実施形態では、ヒトの処置に指定される１日用量は、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物約０．７〜約１４００ｍｇであり得、これは例えば１日１回、週１回、月１回、及び／又は連続投与により、適宜投与される。１日投与量（ｄａｉｌｙ ｄｏｓｅ）は、１日当たり１〜１２回の個別の用量であってもよい。あるいは、投与量を、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、以下同様に１日単位で最大３１日に１回投与してもよい。投薬は、錠剤、パッチ、ｉ．ｖ．投与等を含む任意の適用可能な投与形態を用いた連続投与、間欠投与、又は単回投与であり得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。具体的な実施形態では、投与量レベルは約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約４５ｍｇ／ｋｇ／日、又は約５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
クプレドキシン移入ドメインを含む化合物を患者に導入する方法は、いくつかの実施形態では、癌の処置に知られる他の薬物との同時投与である。そのような方法は当該技術分野で周知である。具体的な実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物は、癌を処置する他の薬物を含む又はそれと組み合わされたカクテル又は共投与の一部である。そのような薬物には、例えば本明細書に記載したものが含まれ、具体的には５−フルオロウラシル；インターフェロンα；メトトレキサート；タモキシフェン；及びビンクリンスチンが含まれる。上記の例は説明のためだけに提供するものであり、他にも同様な化合物が多数当業者に公知である。
クプレドキシン移入ドメイン又は移入ドメインとカーゴ化合物を組み合わせた融合タンパク質をコードする核酸分子をベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，３２８，４７０号（１９９４年、米国））又は定位注射（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ｖｏｌ．９１， ｐｐ３０５４−５７（１９９４））により対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤を含んでもよく、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター（例えばレトロウイルスベクター）が無傷（ｉｎｔａｃｔ）で産生される場合、医薬製剤は遺伝子送達系を生成する１又は複数の細胞を含み得る。
一態様では、組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで複合体が作製されるようにＤＮＡとして送達される。一実施形態では、ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−４９（１９９３）に記載されているように、また、Ｃｏｈｅｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９ １６９１−９２（１９９３）に概括されているように、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」である。ネイキッドＤＮＡの取込みは、細胞中に効率的に輸送されるキャリア（例えば生分解性ビーズ）上にＤＮＡをコーティングすることで促進され得る。そのような方法では、ＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系、及びウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれかに含まれ得る。そのような発現系にＤＮＡを組み込む技術は当業者に周知である（例えば、国際公開第９０／１１０９２号、同第９３／２４６４０号、同第９３／１７７０６号、及び米国特許第５，７３６，５２４号参照）。
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは２つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、ＤＮＡを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須でない領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来ＤＮＡはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター（例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム）は、組成物のＤＮＡ等の外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクターでは、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。組成物ポリヌクレオチドを誘導可能なプロモーターに作動可能に連結することで、ｗｔアズリン移入ドメイン組成物ポリペプチド又は断片の発現を制御することができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：４８７−５１１（１９９０））及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導可能なプロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）も予期される。
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。通常、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
クプレドキシン移入ドメイン−カーゴ化合物複合体を含むキット
別の態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の１又は複数を含むキットを提供する：（１）カーゴ化合物に連結されているか単独であるクプレドキシン移入ドメイン（ｐ１８若しくはｐ２８等）を含む試薬；（２）薬学的に許容されるアジュバント又は補形剤を含む試薬、（３）シリンジ等の、投与のための手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）；（４）投与の指示書。同じ容器中に要素（１）〜（４）の２つ以上が見られる実施形態も予期される。
クプレドキシン、クプレドキシン移入ドメイン、クプレドキシン移入ドメイン−カーゴ化合物複合体、又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む医薬組成物
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む医薬組成物は任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。実質的に純粋な又は医薬品グレードのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に調合物を製剤することを可能にする。好適なキャリア又は補形剤には、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤は保存剤を実質的に含まない。別の実施形態では、医薬製剤は少なくとも１つの保存剤を含んでもよい。医薬品の剤形に関する一般的方法論はＡｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ（１９９９））に記載されている。
本発明に使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、注射（例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）、吸入、局所投与、坐剤、経皮パッチ、又は経口等の種々の方法で投与され得る。薬物送達系に関する一般的情報は上記のＡｎｓｅｌ ｅｔ ａｌに記載されている。いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、とりわけ、皮下及び静脈内投与用に注射剤として製剤して直接使用することができる。注射可能な製剤は、特に、化学予防療法に適した患者の処置への使用に都合がよいことがある。クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、ポリプロピレングリコール等の保護剤又は同様なコーティング剤と混合した後に経口摂取することもできる。
投与が注射によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、水溶液、特に生理学的に適合性のあるバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー等の中に処方され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、使用前に好適なビヒクル（例えば発熱性物質を含まない滅菌水）と構築されるための粉末形態であってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドにより刺激される免疫応答を亢進するアジュバント又は任意のその他の物質を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドへの免疫応答を阻害する物質を含む。
投与が静脈内輸液によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の投与に用いられる静脈内輸液は、クリスタロイド又はコロイドで構成され得る。本明細書において、クリスタロイドは無機塩又はその他の水溶性分子の水溶液である。本明細書において、コロイドはゼラチン等のより大きな不溶性分子を含む。静脈内輸液は無菌であり得る。
静脈内投与に使用され得るクリスタロイド液としては、限定されるものではないが、表２に示されるように、通常の食塩水（濃度０．９％の塩化ナトリウム溶液）、乳酸リンゲル又はリンゲル液、及びＤ５Ｗとも呼ばれる５％デキストロース水溶液が含まれ得る。
Figure 2012512892
 ＊乳酸リンゲル液は２８ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸、４ｍｍｏｌ／ＬのＫ＋、及び３ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋を更に含む。
投与が吸入によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、又はその他の好適な気体等の好適な噴射剤を用いて加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることで用量単位が決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吹き付け器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのカプセル及び薬包（例えばゼラチン）は、タンパク質とラクトース又はでんぷん等の好適な粉末基材との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
投与が局所投与によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、当該技術分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁液等として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、投与は経皮パッチによる。投与が坐剤によるものである場合（例えば直腸内又は腟内）、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の組成物は、従来の坐剤基剤を含む組成物に製剤化されてもよい。
投与が経口によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて容易に製剤化され得る。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等の固体キャリアを用いてもよく、そのようなキャリアは、クプレドキシン及びそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物を、処置する対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤化することを可能にする。例えば散剤、カプセル剤、錠剤等の経口用固体製剤のための好適な補形剤としては、糖、セルロース標品、造粒剤、結合剤等の充填剤が含まれる。
当該技術分野で周知のその他の従来のキャリアとして、細菌莢膜性多糖類、デキストラン、又は遺伝子操作されたベクター等の多価キャリアも含まれる。更に、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む徐放性製剤は、長期間にわたるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の放出を可能し、徐放性製剤がない場合にはクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物が治療効果を引き出す又は高める前に対象の系から除去され且つ／又は例えばプロテアーゼ及び単純な加水分解により分解される。
本発明のペプチドの血流中における半減期は当業者に周知の複数の方法により延長又は最適化することができる。本発明のペプチドバリアントには、限定されるものではないが、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体内の前悪性病変の発達を阻害するペプチドの活性を維持しつつ、血流中でその安定性、比活性、寿命を高め得及び／又はクプレドキシンの免疫原性を低下させ得る種々のバリアントが含まれ得る。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を低減するもの、ペプチドの脱アミド化を低減するもの、酸化を低減するもの、免疫原性を低減するもの、ペプチドの構造的安定性を強化するもの、又はペプチドのサイズを大きくするものが含まれる。そのようなペプチドには、環状ペプチド（Ｍｏｎｋ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＤｒｕｇｓ １９（４）：２６１−７８（２００５）；ＤｅＦｒｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ６３（５）：４０９−１９（２００４））参照）、Ｄ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｆｅｂ ２３；２７６（８）：５８３６−４０（２００１）；Ｐａｐｏ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４（１６）：５７７９−８６（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６（ｌ）：１６９−７６（１９８７）参照）；異常アミノ酸を含むペプチド（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ６３（２）：６９−８４（２００４）参照）、Ｎ末端及びＣ末端の修飾（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｍｅｄ． １３（５）：２７５−８（１９９０）参照）、炭化水素ステープリング（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４）参照）、及びＰＥＧ化も含まれる。
種々の実施形態において、医薬組成物は、キャリア及び補形剤（限定されるものではないが、バッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は保存剤が含まれる）、水、油、食塩水、デキストロース及びグリセロールの水溶液；生理学的条件に近づけるために必要なその他の薬学的に許容される補助剤物質、例えば緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等を含む。当業者に公知の任意の好適なキャリアを本発明の組成物の投与に使用できるが、キャリアの種類は投与形態によって異なることが理解されよう。化合物は、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化してもよい。生分解性マイクロスフェアも本発明の医薬組成物のキャリアとして使用され得る。好適な生分解性マイクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号、同第５，０７５，１０９号、同第５，９２８，６４７号、同第５，８１１，１２８号、同第５，８２０，８８３号、同第５，８５３，７６３号、同第５，８１４，３４４号、及び同第５，９４２，２５２号に開示されている。
医薬組成物は従来の周知の滅菌技術で滅菌されてよく、あるいは滅菌ろ過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま又は凍結乾燥されてパーケージ化され得、凍結乾燥標品は投与前に無菌溶液と混合される。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の投与
ｐ１８又はｐ２８等のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、医薬組成物として投与製剤化され得、任意の好適な経路、例えば経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、腟内、経尿道、経鼻、局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓすなわちｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、又は非経口（例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内）、又は硝子体内投与（ｖｉｔｒｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により投与され得る。その医薬製剤は、その意図する目的の達成に有効な任意の量で投与され得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は通常、約０．０１〜２０ｍｇ／日／ｋｇ体重である。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む化合物は、単独又は他の活性薬剤及び／若しくはカーゴ化合物との組合せで、癌の防止に有用である。適切な用量は、当然ながら、例えば使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物、宿主、投与形態、並びに潜在的な癌の性質及び重症度によって変わる。しかし、一般的に、１日用量が約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の時にヒトにおいて満足な結果を得られることが示される。ヒトにおいて指定される１日用量は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物約０．７〜約１４００ｍｇであり、これは、例えば１日１回、週１回、月１回、及び／又は連続投与によって、適宜投与される。１日投与量は、１日当たり１〜１２回の個別の用量にしてもよい。あるいは、投与量は、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、以下同様に１日単位で最大３１日以上に１回投与してもよい。あるいは、投与は、パッチ、ｉ．ｖ．投与等を用いた連続投与であってもよい。
正確な処方、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して主治医が決定する。投薬の量及び間隔は、カーゴ化合物を有する又は有さない活性なクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の治療効果を維持するのに十分な血漿濃度が得られるように個別に調節され得る。通常、所望のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、意図する投与経路及び標準的な薬学的実務に即して選択された薬学的キャリアとの混合物の形態で投与される。
一態様では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物はＤＮＡとして送達され、その結果、ｉｎ ｓｉｔｕでポリペプチドを生じる。一実施形態では、ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９（１９９３））に記載されておりＣｏｈｅｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２（１９９３））に概括されているように「ネイキッド」である。ネイキッドＤＮＡの取込みは、生分解性ビーズ等のキャリア上にＤＮＡをコーティングした後細胞中に効率的に輸送させることで増加し得る。そのような方法では、ＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系、及びウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれに含まれてもよい。そのような発現系にＤＮＡを取り込ませるための技術は当業者に周知である（例えば、国際公開第９０／１１０９２号、同第９３／２４６４０号、同第９３／１７７０６号、及び米国特許第５，７３６，５２４号参照）。
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは２つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、外来ＤＮＡを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須な領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来ＤＮＡはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター（例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム）は、クプレドキシンＤＮＡ等の外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクター中では、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡが高度に転写されるように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。クプレドキシン並びにそのバリアント及び誘導体ポリペプチドを誘導可能なプロモーターに作動可能に連結することで、特定の因子に応答するクプレドキシン並びにそのバリアント及び誘導体の発現を制御することができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：４８７−５１１（１９９０））及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導可能なプロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、その他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）も予期される。更に、本発明のペプチド（例えば一実施形態ではｐ１８）は、治療化合物を癌細胞又は腫瘍に選択的に送達するベクターとして使用され得る。
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。ベクターは通常、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含むキット
一態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の１又は複数を含む治療法（ｒｅｇｉｍｅｎ）又はキットを提供する：（１）少なくとも１つのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む薬理活性組成物；（２）更なる化学予防薬；（３）シリンジ、ネブライザー等の、生物学的活性組成物を患者に投与する装置。
キットを提供する場合、適切であれば、組成物の種々の成分は別個の容器にパッケージ化され、使用直前に混合されてもよい。そのように成分を別個にパッケージ化することで、活性成分の機能を失うことなく長期間の保存が可能になり得る。
キットに含められる試薬は、種々の成分の寿命が維持され且つ容器の材料による吸着又は変化が起こらない任意の種類の容器に入れて提供され得る。例えば、密封されたガラス製アンプルに、凍結乾燥したクプレドキシン並びにそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物又はバッファーを窒素等の中性の非反応性気体下でパッケージ化して含めてもよい。アンプルは、任意の好適な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボナート、ポリスチレン等、セラミック、金属、又は同様な試薬を保持するために通常使用される任意のその他の材料からなり得る。好適な容器のその他の例としては、アンプルと同様な物質で作製され得る単純なボトル、並びに裏地がアルミニウム又は合金等のホイルである内部を含み得る包み（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）が含まれる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は無菌アクセスポートを有し得、例えば皮下注射針で孔を開けることができるストッパーを有するボトルである。その他の容器は、容易に除去可能な膜で隔てられた２つのコンパートメントを有し得、この膜を除去することで成分を混合することができる。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム等であり得る。
キットに指示書を付けてもよい。指示は、紙等の基体に印刷されてもよく且つ／又は電子読取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、フラッシュメモリー素子等として提供されてもよい。詳細な指示は物理的にキットに付属されなくてもよく、その代わりに、キットのメーカー又は供給業者が指定するインターネットウェブサイトに使用者を導いてもよく、又は電子メールで提供されてもよい。
クプレドキシン、クプレドキシン移入ドメイン並びにそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物の修飾
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物を化学的に修飾するか遺伝子操作して前述したバリアント及び誘導体を作製してもよい。そのようなバリアント及び誘導体は標準的な技術により合成され得る。クプレドキシン移入ドメインも同様に修飾され得る。
クプレドキシンの天然のアレルバリアントに加えて、前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシンの能力を大きく変化させることなくコードされるクプレドキシンのアミノ酸配列に変化を生じさせるような変異をクプレドキシンのコード配列中に入れることでも変化を導入することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、薬理活性を変えることなくクプレドキシンの野生型配列から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基はそのような薬理活性に必要なものである。例えばクプレドキシン間で保存されているアミノ酸残基は特に変化を受けにくく、したがって、「必須」であると予想される。
ポリペプチドの薬理活性を変化させない保存的置換を行うことができるアミノ酸は当該技術分野で周知である。有用な保存的置換を表３の「好ましい置換」に示す。１つのクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置換する保存的置換は、置換が化合物の薬理活性を顕著に変化させない限り、本発明の範囲内である。
Figure 2012512892
（１）βシート又はαヘリックスコンホメーション等のポリペプチド骨格の構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖の嵩、に影響を与える非保存的置換は薬理活性を変化させ得る。残基は、表４に示すように一般的な側鎖特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換ではこれらのクラスの１つのメンバーが別のクラスに交換される。置換は保存的置換部位、より具体的には非保存部位に導入され得る。
Figure 2012512892
バリアントポリペプチドは、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２３７：１−７（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−３５０（１９８７））、カセット変異導入、制限部位選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５））、又はその他の公知の技術をクローニングしたＤＮＡに対して用いてクプレドキシンバリアントＤＮＡを作製することができる。
クプレドキシンの公知の変異を用いて本発明の方法で使用するバリアントクプレドキシンを作製することもできる。例えば、アズリンのＣ１１２Ｄ変異体及びＭ４４ＫＭ６４Ｅ変異体は天然アズリンとは異なる細胞毒性及び成長停止活性を有することが知られており、そのような変化した活性は本発明の処置方法において有用であり得る。
以下の具体的な実施例を参照することで本発明を更に深く理解することができる。実施例は説明のみを目的として記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況から示唆され得る又は適切であり得る形態の変更及び均等物の置換も予期される。本明細書中では具体的な用語を使用するが、そのような用語は説明的であることを意図しており、限定することを目的としたものではない。前述したような本発明の修正例及び変更例をその精神及び範囲から逸脱することなく作製することができる。
ＭＭＯＣモデルにおけるＤＭＢＡ誘発乳腺病変に対するペプチドｐ２８の効果
マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）モデルを用いることで、ＤＭＢＡに応答した乳腺胞巣状病変（ＭＡＬ）又は乳管病変（ＭＤＬ）の発達に対する潜在的な化学予防剤の有効性を評価することができる。ＤＭＢＡは適切なインキュベーション条件下で培地中のホルモン環境に応じてＭＡＬ又はＭＤＬを形成する（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０：７０−７４（２００２）；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９３：１１０３−１１０６（２００１））。培養中にエストロゲン及びプロゲステロンで処置された腺では腺管病変が発達したが、アルドステロン及びヒドロコルチゾンで処置された線ではエストロゲン及びプロゲステロンに非依存性の胞巣状病変が形成された。発癌物質又は化学予防剤に暴露されなかった乳腺は、成長促進ホルモンの非存在下で構造的に退行し、３日目と４日目の間に２４時間ＤＭＢＡで処置すると、ホルモンの枯渇によって引き起こされる構造の退行が防止された。これは、線が正常なホルモン応答性を失って発達過程が変化したためであると推測される。形質転換細胞を同系マウスに移植して乳腺腺癌を発生させることで、これらの抑制されない領域の前悪性・前新生物性の性質が証明された。
胸部の乳腺対を各Ｂａｌｂ／ｃマウスから無菌的に切り出し、線を複数の群に分けた。培地中で４種類に希釈したｐ２８の効果を評価した。被験薬剤を用いずに発癌物質で処置した線を化学予防剤非存在下での発生率を決定するための尺度とした。更に化学予防の正の対照となる対照を含めた。アズリンを濃度５０μｇ／ｍｌで培地に含めた。胞巣状病変（ＭＡＬ）では、染色された腺（全ての病変を含む腺）を病変の発生について評価した（所定の処置群における腺の合計数と比較）。腺管病変（ＭＤＬ）でも同様のプロトコールを採用したが、以下の方法のセクションに記載するように、ホルモンの組合せが胞巣状病変と腺管病変では異なる。腺をホルマリンで固定した後、病理組織診断に用いた。切片をエオシン及びヘマトキセレンで染色し、顕微鏡下で評価した。ここでは対照と処置群の間で腺管病変が何倍異なるかを比較する。
臓器培養手順
研究に用いる実験動物は、マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から入手した３〜４週齢の若い未交尾のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスである。１μｇのエストラジオール−１７β＋１ｍｇのプロゲステロンを９日にわたって毎日マウスに皮下注射した。ステロイドで前処置しなかった動物はインビトロでホルモンに応答しないため、この処置は必須である。この培養全体の手順は詳細に記載されている（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：２１８−２２０（１９９７）；Ｍｅｈｔａ， Ｅｕ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３６：１２７５−１２８２（２０００）；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９：２１２−２１９（１９９７）；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９３：１１０３−１１０６（２００１））。
簡潔には、頸椎脱臼によりマウスを殺し、絹のラフト上で胸部の乳腺対を切り出し、無血清Ｗａｙｍｏｕｔｈ ＭＢ７５２／１培地中で１０日間インキュベートした（５腺／５ｍｌ／シャーレ）。乳腺胞巣状病変（ＭＡＬ）を誘発するためのプロトコールでは、グルタミン、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン１００ユニット／ｍｌ培地）、及び成長促進ホルモン（培地１ｍｌ当たり、５μｇのインスリン（Ｉ）、５μｇのプロラクチン（Ｐ）、１μｇのアルドステロン（Ａ）、及び１μｇのヒドロコルチゾン（Ｈ））を培地に添加した。腺管病変（ＭＤＬ）の誘発では、培地に５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌのＰ、０．００１μｇ／ｍｌのエストラジオール１７β、及び１μｇ／ｍｌのプロゲステロン（Ｐｇ）を含めた（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９３：１１０３−１１０６（２００１））。３日目と４日目の間に発癌物質ＤＭＢＡ（２μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。本実験では、ＤＭＢＡを終濃度４ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶かし、５０μｇのＩを１００ｍｌの培地に添加して終濃度を２μｇ／ｍｌにした。対照のシャーレには溶媒としてＤＭＳＯを含めた。
４日目に、腺を新鮮な培地ですすぎ、ＤＭＢＡを含まない新鮮な培地の入った新しいシャーレに移すことで培地からＤＭＢＡを除去した。１０日間インキュベートした後、Ｉ（５μｇ／ｍｌ）だけを含む培地中に腺を更に１４日間維持した。培養期間全体を通して、腺は９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２環境下で３７℃に維持した。増殖促進期の最初の１０日間、培地に化学予防剤を含めた。被験ペプチドｐ２８を１２．５〜１００μｇ／ｍｌの４種類の濃度で評価した。培地中の５０μｇ／ｍｌのアズリンを評価した。ペプチドは使用前に滅菌水に溶かしてろ過した。培地は週に３回（月曜、水曜、金曜）交換した。暴露の最後に、腺をホルマリンで固定した。結果はカイ二乗分析及びフィッシャー直接検定で解析した。
ＭＡＬの形態計測解析
ＭＡＬを検査するために、腺をアルムカーミン（ａｌｕｍ ｃａｒｍｉｎｅ）で染色し、病変が存在するかどうかを評価した。乳腺病変の有無、各腺における病変の重症度、及び薬剤の毒性について腺にスコアを付けた。腺をキシレン中に保存し、解剖顕微鏡下で、乳腺病変の有無、発生率、重症度について各腺を評価した。乳腺病変について正又は負のスコアを乳腺に与え、その群中の腺の総数に対する病変を示す腺の割合として発生率を求めた。化学予防剤を用いた処置による管の拡大又は乳腺構造の崩壊を毒作用と見なした。発生率についてデータを統計解析し、潜在的化学予防剤の有効性を決定した。
図１Ａに、ＤＭＢＡで処置した腺における胞巣状病変の代表的写真及びＤＭＢＡと化学予防剤で処置した腺との比較を示す。胞巣状病変の発達に対するｐ２８の効果を図１Ｂ〜１Ｆに示し、図２にまとめた。ペプチドｐ２８は濃度２５μｇ／ｍｌでＭＡＬ形成を６７％阻害した。濃度を更に１００μｇ／ｍｌに上げてもペプチドの効果は高まらなかった。このペプチドとアズリンの比較から、ｐ２８はＭＡＬの発達に対してアズリン同じくらい効果的であることが示された。濃度５０μｇ／ｍｌのアズリンは６７％の阻害であった。統計解析から、ｐ２８の効果は１２．５μｇ／ｍｌ超でＤＭＢＡ対照と比べて統計的に有意であることが示された（ｐ＜０．０１、フィッシャー直接検定；カイ二乗分析）。
ＭＤＬの組織病理学的評価
ＭＤＬについて、腺を組織病理学的に評価した。腺を５ミクロンの切片に縦方向に切片化し、エオシン・ヘマトキセリンで染色した。各腺の縦断切片を複数のフィールドに分類し、それぞれのフィールドを腺管病変について評価した（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９３：１１０３−１１０６（２００１））。簡潔には、顕微鏡下で腺全体を評価した。小さい腺は大きい腺に比べて総フィールドが少ない。したがって、各腺でフィールドの数は異なる。多くの場合、管を横切る切片の数も腺によって大きく異なり、そのため、群によって数が異なる。管の過形成又は異形を含むフィールドを決定し、評価されたフィールドの総数を各腺で比較した。過形成又は異形と極度に閉塞した腺は区別しなかった。これらの組織学的パターンを含む全てのフィールドを病変に対して正とみなした。重症度について処置群を対照と比較し、阻害率を算出した。
図３に代表的腺管病変を示す。ＤＭＢＡは、過形成、異形から管の完全閉塞まで、さまざまな腺管病変を誘発する。腺管病変／管切片の総数の割合を決定した。ここでも、濃度１２．５μｇ／ｍｌのｐ２８はＭＤＬ形成を１５％だけ抑制した。しかし、２５μｇ／ｍｌでは、５０μｇ／ｍｌのアズリンに匹敵する有意な病変阻害を示した。濃度１２．５μｇ／ｍｌ超のｐ２８の効果は統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、フィッシャー直接検定）。これらの結果を図４にまとめた。化学予防剤の効果はしばしばＭＡＬとＭＤＬで異なり得る。例えば、タモキシフェンはＭＤＬの発達は阻害するがＭＡＬの発達は阻害しない。アズリン及びｐ２８がエストロゲン及びプロゲステロンに依存性の腺管病変並びに非依存性の胞巣状病変の両方を阻害するということは興味深い。
この例は、ｐ２８及びアズリンの両方が乳組織における前癌性病変の発達を防止し得ることを示している。したがって、ｐ２８及びアズリンは哺乳動物患者中で化学予防剤として使用され得る。
遺伝子送達用の潜在的ベクターとしてのクプレドキシン及び誘導体ペプチドの癌細胞選択的透過
クプレドキシンファミリーのタンパク質の一員であり緑膿菌から単離されたアズリンは、癌細胞に移入し、ｐ５３を介したアポトーシスをインビトロ及びインビボで誘導する。潜在的な遺伝子送達用ベクターとしての陽イオン性及び陰イオン性のクプレドキシン及び由来ペプチドの透過の選択性を評価した。以下のクプレドキシンを試験した：アズリン（１４ｋＤａ、ｐＩ５．７）、ラスチシアニン（１７ｋＤａ、ｐＩ８．０）、及びプラストシアニン（１１ｋＤａ、ｐＩ５．４）。その結果、アズリンの透過が最も選択的であることが示された。
アズリン（ａｚｕ）の２５アミノ酸（ａ．ａ．）断片を合成し、種々の癌細胞及び組織学的に対応する正常細胞への透過を評価した。共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による分析により、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８（８００Ｄａ）で標識された１８アミノ酸（１．７ｋＤａ、ａｚｕ５０〜６７）断片（ｐ１８）がヒトメラノーマ（Ｍｅｌ−２、７、２９）、乳房（ＭＣＦ−７）、卵巣（ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（ＣＡＰＡＮ−２）、膠芽腫（ＬＮ−２２９）、アストロサイトーマ（ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１）、前立腺（ＬＮ−ＣＡＰ）、及び腎臓（ＡＣＨＮ−ＣＲＬ１６１１）の細胞株を選択的に透過するが、それらのそれぞれの対照は透過しないことが示された。ＬＤＨの放出及び溶血アッセイから、ｐ１８は、透過中に癌細胞膜構造を破壊せず、ヒト赤血球の溶血を生じることが示された。このことは、ｐ１８が膜構造を破壊せずにヒト癌細胞を透過することを示唆している。Ｍｅｌ−２細胞を、細胞内部移行の特異的阻害剤（サイトカラシンＤ：アクチン重合化の阻害；タキソール：微小管脱重合化の阻害；クロルプロマジン：クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害；アジ化ナトリウム：代謝阻害；又はスタウロスポリン：細胞周期阻害）で前処理してもｐ１８の透過にほとんど影響はなかった。しかし、Ｍｅｌ−２細胞をナイスタチン（カベオラ形成阻害剤）及びブレフェルジンＡ（ゴルジ装置破壊剤）と一緒にインキュベートするとｐ１８の透過が有意に阻害されたことから、エンドサイトーシスプロセスが、一部、ｐ１８の透過に関与していることが示唆される。異種移植されたメラノーマ腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおいて赤外色素（λｅｍ＝８００ｎｍ）で標識されたｐ１８をイメージングした結果、正常な臓器及び組織に蓄積されず、原発性ｓ．ｃ．腫瘍への選択的取込み及び遠隔臓器転移が明確に示された。したがって、本発明のペプチド（例えば一実施形態ではｐ１８）は、遺伝子（すなわち任意のＤＮＡ／ＲＮＡ断片）治療用の非ウイルスベクターとして大きな有用性を有するようである。
プラスミド構築
較正ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、融合グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−切断型ｗｔアズリン（ａｚｕ）誘導体を発現するプラスミドを構築した。図５は種々の切断型ｗｔアズリンコンストラクトの模式図である。ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜１２８の場合、増幅されたＰＣＲ断片を市販のＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸＳＸ（０８８５５、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャムバイオサイエンス社製）のＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲｌ部位に挿入した。この断片を、ｐＵＣ１９−ａｚｕを鋳型とし、プライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＧＡ ＡＧＡ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＧＣ−３’（配列番号７８）及び５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧ−３’（配列番号７９）（追加的に挿入されたＢａｍＨｌ部位及びＥｃｏＲＩ部位にそれぞれ下線を引いた）を用いて増幅した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（９２０３７、カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製）を用いて終止コドンを導入することでａｚｕ遺伝子のカルボキシル末端切断を累加的に行った。
ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜５０、ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７、及びｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９の場合、それぞれＳｅｒ５１、Ｓｅｒ７８、及びＧｌｙ９０に終止コドンを導入した。ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜１２８を有するプラスミドを鋳型ＤＮＡとして用いた。部位特異的突然変異誘発に用いたこれら３組のオリゴヌクレオチドを以下に示す。ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜５０では、５’−ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＣＡＧ−３’（配列番号８０）及び５’−ＣＴＧ ＣＡＴ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ−３’（配列番号８１）。ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７では、５’−ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＧＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＣＡ ＣＡＣ Ｃ−３’（配列番号８２）及び５’−ＧＧＴ ＧＴＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＣＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＡＧ Ｇ−３’（配列番号８３）。ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９では、５’−ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＣＧ ＧＣＴ ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＧＡＡＧＧ ＡＣＴ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣ−３’（配列番号８４）及び５’−ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＧＴＣ ＣＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡ ＣＧＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧ−３’（配列番号８５）。プラスミドｐＧＳＴ−ａｚｕ５０〜７７及びｐＧＳＴ−ａｚｕ６７〜７７を、ｐＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７を鋳型ＤＮＡとして用いたＰＣＲにより作製した。
増幅されたＰＣＲ断片ａｚｕ５０〜７７及びａｚｕ６７〜７７は、フォワードプライマーに５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＡＣＡ ＴＧＣ ＡＧＧ Ｇ−３’（配列番号８６）及び５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＧＧ ＡＴＴ ＡＣＣ ＴＧＡ ＡＧＣ ＣＣＧ−３’（配列番号８７）（追加で導入したＢａｍＨＩ部位を下線で表す）を用いて得られた。どちらもリバースプライマーには５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧ−３’を使用した（配列番号８８）。
ｇｓｔ−ａｚｕ５０〜７７を有するプラスミドを用いて、以下のオリゴヌクレオチドでＧｌｙ６７に終止コドンを導入することでｐＧＳＴ−５０〜６６を作製した：５’−ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＴＡＣ Ｃ −３’（配列番号８９）及び５’−ＧＧＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＧＴＣ−３’（配列番号９０）。緑色蛍光タンパク質をコードする緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｇｆｐ）もＰＣＲで増幅した。使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーは、各オリゴヌクレオチドの５’末端にＢａｍＨｌ部位及びＥｃｏＲＩ部位を含む、５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＣＡ ＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号９１）及び５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣ ＣＴＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ Ｇ−３’（配列番号９２）である。得られたＰＣＲ断片をｐＧＥＸＳＸベクター中にライゲーションして、ｐＧＳＴ−ＧＦＰを作製した。ｇｓｔ−ｇｆｐ−ａｚｕ５０〜７７を有するプラスミドＤＮＡの作製には、ｐＧＳＴａｚｕ５０〜７７を鋳型とし、プライマー５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＡＴＧＣＡ ＧＧＧ−３’（配列番号９３）及び５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＴＣ Ｃ−３’（配列番号９４）（それぞれ導入したＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位を下線で示す）を用いたＰＣＲによってａｚｕ−５０〜７７遺伝子を増幅させた。精製ａｚｕ５０〜７７断片をｐＧＳＴ−ＧＦＰのＸｈｏｌ及びＮｏｔｌの唯一の制限酵素部位に導入した。
タンパク質の精製
ｗｔアズリン及びＭ４４ＫＭ６４Ｅ変異体アズリンを作製し、参照により本明細書に援用するＹａｍａｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ．１０１， ｐｐ．４７７０−７５（２００４）及び同時係属中の米国特許出願１０／７２０，６０３号に記載されているように精製した。簡潔には、Ｋｕｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ｖｏｌ．３９４， ｐｐ８７−９０（１９９６）に記載されている方法に従ったＰＣＲによりｗｔアズリン遺伝子を増幅した。ＰＣＲは緑膿菌株ＰＡＯ１のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて行った。
増幅されてＨｉｎｄｌｌｌ及びＰｓｔｌで消化された５４５ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９の対応する部位に挿入し、アズリン遺伝子がｌａｃプロモーターの下流に位置するようにすることで、発現プラスミドｐＵＣ１９−ａｚｕＡを作製した。大腸菌ＪＭ１０９をアズリン遺伝子発現のための宿主株として用いた。組換え大腸菌株を、５０μｇｍｌ−１のアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ；及び０．５ｍＭのＣｕＳＯ４を含む２ＹＴ培地中で１６時間、３７℃で培養し、アズリンを産生させた。
Ｍ４４ＫＭ６４Ｅ変異体アズリンを作製するために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製）を用いてアズリン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行った。変異はＤＮＡシークエンシングで確認した。
アシディチオバジルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｄｉｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）のクプレドキシンであるラスチシアニンをコードするｒｕｓ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ９ａ）は日本、千葉の財団法人電力中央研究所のＫａｚｕｈｉｋｏ Ｓａｓａｋｉ博士から寄贈された。
Ｓａｓａｋｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．６７， ｐｐ．１０３９−４７（２００３）の方法を若干改変して用い、ｒｕｓ遺伝子を乗せた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）からラスチシアニンを単離した。簡潔には、ベータ−アラニンバッファー（ｐＨ４．０）及びＴＳＫ−ゲルＣＭ−６５０カラム（１８９３６、ペンシルベニア州モンゴメリービルのトーソー・バイオサイエンス社（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＬＬＣ）製）の代わりに酢酸バッファー（ｐＨ４．０）及びＣＭ−セファロース（６３１７８、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社製）を使用した。２つの別の精製クプレドキシン、フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン及びアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリンはそれぞれ、英国ケンブリッジ大学のＤｒ． Ｂｅａｔｒｉｘ Ｇ． Ｓｃｈｌａｒｂ−Ｒｉｄｌｅｙ及び英国ニューカッスルアポンタイン大学のＤｒ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅｎｎｉｓｏｎからの寄贈である。
全ての組換えＧＳＴ融合誘導体を以下のように精製した：大腸菌ＢＬ２１を宿主株として使用した。Ｌブロス中で初期対数増殖期に０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、グルタチオンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー及びセファデックス７５ゲルろ過カラムとＰＢＳ（０８８５５、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、細胞抽出物からＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標；９７４０２、オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）製）で標識された精製タンパク質、ｗｔアズリン、及びＧＳＴ誘導体、又はその他のバリアントをメーカーの取扱説明書に従って単離した。結合しなかった遊離の蛍光化学物質はゲルろ過カラムで除去した。
細胞培養
その内容を参照により本明細書に援用するＹａｍａｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ｖｏｌ．７０， ｐｐ．７０５４−６２（２００２）；Ｇｏｔｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ｖｏｌ．４７， ｐｐ．５４９−５９（２００３）；及びＹａｍａｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ｖｏｌ．９９， ｐｐ．１４０９８−１０３（２００２）に記載されているように、Ｊ７７４及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（米国メリーランド州フレデリックのフレデリック癌研究開発センター（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手可能）を培養した。ヒト正常線維芽細胞（シカゴのイリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）の外科腫瘍学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）の保存培養コレクション（ｓｔｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））を、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのＭＥＭ必須アミノ酸を含み１０％熱失活ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたイーグル塩とＭＥＭ培地で培養した。Ｐｕｎｊ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−７８（２００４）に記載されているようにＭＣＦ−７及びＭＯＦ−１０Ｆ細胞を培養した。
Ｊ７７４、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、及び線維芽細胞の共培養並びに共焦点顕微鏡法
Ｊ７７４、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、及び線維芽細胞を個別のカバースリップ上で培養した。一晩インキュベートした後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、３種類全ての細胞株を、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８がコンジュゲートされたｗｔアズリン２００μｇ／ｍｌを含む培養皿に入れた。次いで、細胞を５％ＣＯ２下にて３７℃で０．５又は３．５時間インキュベートした。
顕微鏡試料を調製するために、３７℃で一晩、細胞をカバースリップ上で培養した。タンパク質処置する前に培養細胞を３７℃又は４℃に２時間置いた。予め温めた３７℃の新鮮な培地又は氷冷した４℃の新鮮な培地を赤色蛍光（ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８で標識された）クプレドキシン又はＧＳＴ融合誘導体と混合し、細胞とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃でメタノールを用いて５分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、核を染色するための１．５μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ、カリフォルニア州バーリンゲームのベクター社製）を含む封入剤を添加した後、共焦点顕微鏡で画像を撮った。
Ｊ７７４細胞中へのクプレドキシンの移入
ｗｔアズリン、その変異体バリアントＭ４４ＫＭ６４Ｅ、プラストシアニン、シュードアズリン、及びラスチシアニンを実施例６と同様にＪ７７４細胞とインキュベートし、共焦点顕微鏡を用いて細胞を調べた。これらの実験では、クプレドキシンを赤色の蛍光を放たせるためのＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８とコンジュゲートし、２００μｇ／ｍｌの濃度で３７℃にて１時間、Ｊ７７４細胞とインキュベートした。また、別の実験で、野生型のアズリン及びラスチシアニンを約６〜７μＭの濃度で３７℃にて１時間、Ｊ７７４細胞とインキュベートした。核をＤＡＰＩで青色に染色した。これらのタンパク質のない対照も維持した。全ての場合で、Ｊ７７４細胞の細胞質ゾル中へのクプレドキシンの移入が見られた。同様の実験で、オーラシアニンＡ及びＢはＭＣＦ７癌細胞に優先的に移入し、対照の非癌細胞には移入しなかった。
種々の細胞型へのｗｔアズリン及びラスチシアニンの移入
ｗｔアズリンは、ＭＣＦ−７細胞と比べてＭＣＦ−１０Ｆ細胞への細胞毒性活性が低い（Ｐｕｎｊ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−２３７８（２００４））。Ｊ７７４、腹腔マクロファージ、肥満細胞、ヒト乳癌ＭＣＦ−７、及びヒト正常上皮ＭＣＦ−１０Ｆ細胞（シカゴにあるイリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）の外科腫瘍学部の保存培養コレクション）を実施例５と同様に処置して調べ、ｗｔアズリンがこれらの細胞に移入できるかどうかを試験した。
ｗｔアズリンは４５ｍｍのインキュベーション中にＪ７７４細胞中に内部移行した。しかし、腹腔マクロファージ又は肥満細胞中へのｗｔアズリンの内部移行は非常に非効率的であった。６時間のインキュベーション後も、これらの細胞への移入は非常に限定的であった。同様に、ｗｔアズリンは乳癌ＭＣＦ−７細胞に効率的に移入したが、正常乳腺ＭＣＦ−１０Ｆ細胞中への移入速度は非常に低かった。
Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲートアズリンはＵＩＳＯＭｅｌ−２及びＭＣＦ−７癌細胞には効率的に移入したが、正常乳腺ＭＣＦ１０Ａ１細胞には移入しなかった。しかし、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲートラスチシアニンは、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２及びＭＣＦ−７癌細胞だけでなく正常ＭＣＦ１０Ａ１細胞にも移入した。細胞質ゾル中に一様にラスチシアニンが分布されている癌細胞中とは異なり、ＭＣＦ１０Ａ１細胞中ではラスチシアニンの多くが核を囲む核膜腔中に隔離されていた。
ｗｔアズリン介在性の細胞毒性及び成長阻害
種々の細胞へのｗｔアズリンの移入の特異性を更に評価するために、３７℃で３０分間又は３．５時間インキュベートしている間のＪ７７４、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、及び正常線維芽細胞中へのＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒコンジュゲートｗｔアズリンの移入を調べた。ｗｔアズリンは３０ｍｍではＪ７７４及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への急速な移入が見られたが、この期間中に線維芽細胞の細胞質ゾル中に見られたｗｔアズリンは極微量であった。３．５時間インキュベーション後、線維芽細胞中では少量のｗｔアズリンだけが確認された。
その内容を参照により本明細書に援用するＹａｍａｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７０：７０５４−６２（２００２）， Ｇｏｔｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７：５４９−５９（２００３）、及び２００３年１１月２４日付で提出された同時係属中の米国特許出願第１０／７２０，６０３号に記載されているように、ｗｔアズリンの細胞毒性を測定するための３（４，５ジメチルチアゾール−２−イル−２，５テトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）アッセイを行った。図１（ｂ）は、２４時間インキュベーション中にＪ７７４及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞でのみ有意なｗｔアズリン介在性の細胞毒性が観察されたことを示している。
Ｍ４４ＫＭ６４Ｅ変異体アズリンはＪ７７４細胞中でアポトーシス誘導活性をほとんど示さなかったが、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＧ１期からＳ期への細胞周期進行を有意に阻害した（約９５％）。細胞周期進行は、その内容を参照により本明細書に援用するＨｉｒａｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ．１０１：６４２７−３２（２００４）及びＹａｍａｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１：４７７０−７５（２００４）に記載されているようにフローサイトメトリーを用いて分析した。図１（ａ）は、線維芽細胞を５００μｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌのＭ４４ＫＭ６４Ｅ変異体アズリンで処置した時に、細胞周期進行の阻害の程度が約２０％であったことを示している。
線維芽細胞及びＭＣＦ−１０Ｆ細胞へのｗｔアズリンの微量注入
Ｐｕｎｊ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−７８（２００４）に記載されている方法を用いてｗｔアズリンを線維芽細胞及びＭＣＦ−１０Ｆ細胞に微量注入した。核ＤＮＡの凝縮及び断片化につながるアポトーシスの誘導について細胞を調べた。有意な核ＤＮＡ（ＤＡＰＩで青色に標識されている）の凝縮及び断片化は、微量注入された単一細胞中においてｗｔアズリンと５時間インキュベートした後には観察されたが、アズリンとの３０分間のインキュベーション中には観察されなかった。
３７℃におけるｗｔアズリン融合誘導体の内部移行
実施例１と同様にＮ末端及びＣ末端の両方が切断されたｗｔアズリンの一連のＧＳＴ融合体を作製し、精製した（図２（ａ）及び２（ｂ））。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８をコンジュゲートしたｗｔアズリン、ＧＳＴ、及びＧＳＴ−ａｚｕ融合誘導体を用いて、３７℃で１時間のインキュベーション中におけるＪ７７４細胞中への内部移行を実施例５に記載の方法を用いて調べた。核はＤＡＰＩで染色した。
ｗｔアズリンは内部移行したが、ＧＳＴは細胞周辺に残り、内部移行しなかった。ＧＳＴ−ａｚｕ３６〜１２８及びＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９は、ＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７同様、内部移行した。しかし、更なる切断型から、ＧＳＴ−ａｚｕ５０〜７７は内部移行するが、ＧＳＴ−ａｚｕ３６〜５０は非常に非効率的であり表面上で凝集塊を形成するようであることが示された。
４℃におけるアズリン融合誘導体の内部移行
４℃でインキュベートしたＪ７７４細胞中へのｗｔアズリン及びＧＳＴ−ａｚｕ融合誘導体の内部移行を調べた。４℃では、１時間のインキュベーション中におけるＪ７７４細胞中へのｗｔアズリンの内部移行が極度に損なわれた。ＧＳＴ−ａｚｕ３６〜１２８及びＧＳＴ−ａｚｕ３６〜８９でも同様に損なわれた。更に短いＧＳＴ−ａｚｕ３６〜７７、ＧＳＴ−ａｚｕ５０〜７７、ＧＳＴ−ａｚｕ５０〜６６、及びＧＳＴ−ａｚｕ６７〜７７も４℃での内部移行が極度に損なわれていた。
Ｊ７７４及びメラノーマＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞におけるＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質のエネルギー依存的内部移行
ＧＳＴをＧＦＰと融合させてＧＳＴ−ＧＦＰ融合誘導体を作製した。更に、ａｚｕ５０〜７７をＧＳＴ−ＧＦＰ（Ｍｒ５３ｋＤａ）融合タンパク質に融合させた（図６（ａ））。精製したＧＳＴ、ＧＳＴ−ＧＦＰ、及びＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合誘導体の移動度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた（図６（ｂ））。検出にはクーマシーブルー染色及び抗アズリン抗体を用いたウェスタンブロッティング（図６（ｃ））を用いた。
種々の濃度のＧＳＴ−ＧＦＰで処置したＪ７７４細胞のフローサイトメトリー法による測定から、このタンパク質がＪ７７４細胞に結合することが示された。種々の濃度のＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質で処置したＪ７７４細胞をフローサイトメトリーで分離すると、ＧＳＴ−ＧＦＰのみよりも蛍光が有意に減少していた（図７）。哺乳動物細胞中にＧＦＰが内部移行すると蛍光が消失することが知られている。この蛍光の減少はＪ７７４細胞を２００μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質で処置して３７℃で更に長い時間インキュベートした時にも見られた。
ＧＳＴ−ＧＦＰ及びＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７の結合及び内部移行の特徴に何らかの差があるかどうかを調べるために、Ｊ７７４及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の両方をＧＳＴ−ＧＦＰ及びＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７と一緒に３７℃及び４℃でインキュベートした。共焦点顕微鏡を用いて緑色蛍光を観察した。Ｊ７７４細胞では、ＧＳＴ−ＧＦＰ融合タンパク質は３７℃及び４℃のいずれにおいても表面に結合し、内部移行しなかった。一方、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７は３７℃では内部移行したが４℃では内部移行しなかった。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞では、ＧＳＴ−ＧＦＰ融合タンパク質は３７℃及び４℃の両方で表面に維持されていた。一方、Ｊ７７４細胞同様、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質は３７℃では内部移行したが４℃では内部移行しなかった。
細胞膜の透過及びエンドサイトーシスメカニズムによる哺乳動物細胞中へのＷｔアズリンの移入
ｗｔアズリンの移入が受容体介在性エンドサイトーシスのみに依存して移入する場合、移入は、ミトコンドリアのエネルギー生産の脱共役剤であるプロトノフォアカルボニルシアニドｍ−クロロフルニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）でブロックされるか、非標識のアズリン又は受容体をブロックするその他のクプレドキシンとプレインキュベートすることでブロックされる。Ｊ７７４及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を、１０倍過剰濃度のクプレドキシンと４℃で２時間インキュベートし、細胞を十分に洗浄してクプレドキシンを除去し、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８コンジュゲートアズリンと３７℃で１時間インキュベートした。クプレドキシンで処置しなかった細胞と同程度の内部移行アズリンが存在した。受容体介在性エンドサイトーシスの公知の阻害剤であり細胞マイクロフィラメントネットワークを破壊するサイトカラシンＤ（６３１９５、ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社から入手可能）及びゴルジ装置を破壊して古典的な小胞介在性の分泌を阻害することが知られているブレフェルジンＡ（６３１９５、ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社から入手可能）の影響も試験した。濃度２０ｐＭのＣＣＣＰ及び０．２５〜０．５ｐＭのサイトカラシンＤはＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのアズリンの取込みを有意に減少させた。一方、ブレフェルジンＡは有意な影響を与えなかった。
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７融合誘導体の移入
Ｈｗａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ４８：１２９−３６（１９８７）；Ｒｅｉｔｅｒ， Ｙ． ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ， Ｉ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：５１３−２０（１９９８）に記載されているように緑膿菌外毒素ＡドメインＩＩＩ（ＰＥＤＩＩＩ）のＧＳＴ融合体を構築した。このＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ融合誘導体は外毒素Ａのアミノ酸３８１〜６１３を含む。ＰＥＤＩＩＩは、真核細胞中でＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を有し且つ真核生物の伸長因子２を阻害することにより真核細胞中で細胞タンパク質合成を阻害することが知られている。
ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７の場合と同様にＰＣＲを用いてａｚｕ５０〜７７配列をＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した（図８（ａ））。これら２種類の融合タンパク質（ＧＳＴＰＥＤＩＩＩ及びＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７）をグルタチオンセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーにより５２ｋＤａ及び５４ｋＤａのタンパク質として精製した（図８（ｂ））。次いで、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２及び正常線維芽（ＦＢＴ）細胞を種々の濃度のこれらのタンパク質と３７℃で２４時間インキュベートし、実施例９に記載したようにＭＴＴアッセイにより細胞死の程度を求めた。
ＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩは低い細胞毒性しか示さなかったが、ＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質は、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への効率的移入による高い細胞毒性を有していた（図８（ｃ））。一方、これらの融合タンパク質は線維芽細胞に対する細胞毒性レベルは低かった。
ｗｔアズリンのαヘリックスの不安定化はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への内部移行に実質的に影響を与えない
αヘリックスがアズリンの移入に関与するかどうかを調べるために、ｗｔアズリンの５４、６１、及び７０位に３個のヘリックス不安定化プロリン残基を導入し（図６）、全長Ａ５４ＰＴ６１ＰＫ７０Ｐ変異体アズリンのＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞への移入を調べた。これらの位置の単一突然変異体及び二重突然変異体も構築し、移入について試験した。Ａ５４ＰＴ６１ＰＫ７０Ｐ変異体アズリンは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製）を用いたアズリン遺伝子の部位特異的突然変異誘発により作製した。
これらの変異体を２００μｇ／ｍｌでＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞と３７℃で１時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。全ての場合において、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８コンジュゲート変異体アズリンはＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中に移入した。同様に、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７融合タンパク質及びその三重Ａ５４ＰＴ６１ＰＫ７０Ｐａｚｕ変異体バリアントのＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への移入を調べたが、有意な差は観察されなかった。
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ラスチシアニン融合誘導体の移入
緑膿菌外毒素ＡドメインＩＩＩ（ＰＥＤＩＩＩ）のＧＳＴ融合体を実施例１５と同様に作製した。ＧＳＴ−ＧＦＰ−ａｚｕ５０〜７７の場合と同様にＰＣＲを用いて、全長ラスチシアニン配列をＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した。融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーにより精製した。次いで、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２及びＦＢＴ細胞を種々の濃度の融合タンパク質と３７℃で２４時間インキュベートし、実施例７に記載したようにＭＴＴアッセイを用いて細胞死の程度を測定した。
ＧＳＴ−ＰＥＤＩＩＩ−ラスチシアニン融合タンパク質はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に対して高い細胞毒性を示した（図９）。一方、この融合タンパク質はＦＢＴ細胞に対しては低いレベルの細胞毒性しか示さなかった。
ヒト細胞株中へのｐ１８及びｐ２８の移入
細胞培養及び細胞株：ヒトの癌及び非癌（不死化及び非不死化）細胞株をＡＴＣＣから入手した［肺癌（Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３腺癌）、正常肺（ＣＣＤ−１３Ｌｕ）、前立腺癌（ＤＵ１４５及びＬＮ−ＣＡＰ）、正常前立腺（ＣＲＬ１１６１１）、乳癌（ＭＣＦ−７）、正常乳房（ＭＣＦ−１０Ａ）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、正常結腸（ＣＣＤ３３Ｃｏ）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、及び卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ３腺癌）］。皮膚から単離した正常線維芽細胞を樹立した。正常卵巣細胞（ＨＯＳＥ６−３）はＤｒ．Ｓ．Ｗ．Ｔｓａｏ（香港大学）から寄贈された。メラノーマ系統（ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、２３、２９）を樹立及び特徴解析した。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２を除く全ての細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ジョージア州ローレンスビルのアトランタバイオロジカル社（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）製）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ−Ｅ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２又は空気中で培養した。
増殖アッセイ／細胞成長：メラノーマ細胞を１２×１０３細胞／ウェルの密度で平底２４ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種（４複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ））した。２４時間後、培地を交換し、新鮮なｐ１８、ｐ２８、アズリン、又はペプチドを含まない同様な体積の培地（８複製）を７２時間毎日添加した。次いで、細胞をベックマンコールター（Ｚ１コールター粒子カウンター）で計数した。値は４つの複製の平均値±ＳＤを表す。
ＭＩＴＴアッセイ：メラノーマ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種し、２４時間付着させた。次いで、新たに調製したペプチド（１０μｌ）又は培養培地を各ウェルに添加した。２４時間後、培地を交換し、ｐ１８、ｐ２８、又はアズリンを毎日添加した。７２時間インキュベートした後、１０μｌのＭＴＴ試薬（メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）製）を各ウェルに添加し、試料をＲＴ／ｓｉｇで３時間インキュベートし、界面活性剤１００μｌを各ウェルに添加し、更に３７℃で３時間試料をインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー（カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社製）で吸光度を測定し、非処置対照と比較した処置細胞の５７０ｎｍの吸光度変化率を決定した。値は平均値±−ＳＤを表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントｔ検定により決定した。
ペプチド合成：ｐ１８（Ｌｅｕ５０〜Ｇｌｙ６７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ（配列番号２５））、ｐ２８（Ｌｅｕ５０〜Ａｓｐ７７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号２））、ｐ１８ｂ（Ｖａｌ６０〜Ａｓｐ７７：ＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３４））、ＭＡＰ、マストパラン−７、及びポリアルギニン（Ａｒｇ８）（配列番号９５）を含む全てのアズリン由来ペプチドはＣ Ｓ Ｂｉｏ社（Ｃ Ｓ Ｂｉｏ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州メローパーク）による合成である。ペプチドは分注された凍結乾燥粉末として受け取り、気密デシケーター中に−２０℃で保存した。その後、全てのペプチドを質量分析法及び逆相ＨＰＬＣで分析し、９５％超の純度及びマスバランス（ｍａｓｓ ｂａｌａｎｃｅ）であることを確認した。
アズリンペプチドの予測モデル化：ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ｖｅｒ．６．１）を用いてアズリン由来ペプチドのＲｏｂｓｏｎの構造モデルを作製した（Ｇａｍｉｅｒ， Ｊ．， Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ， Ｄ． Ｊ．， ａｎｄ Ｒｏｂｓｏｎ， Ｂ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １２０：９７−１２０（１９７８））。ＭＡＰＡＳソフトウェアを用いて、強く膜に接触する所与のタンパク質構造を予測し、そのような接触部を最も形成し易いタンパク質表面領域を決定した（Ｓｈａｒｉｋｏｖ， Ｙ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５：１１９（２００８））。タンパク質すなわちアズリンが、膜親和性残基スコア（ＭＲＳ）＞３、膜親和性領域スコア（ＭＡＳ）＞６０％、及び膜親和性非対称係数（Ｋｍｐｈａ）＞２．５である場合、タンパク質は真の膜接触領域を有する確率が高い。
ペプチド／タンパク質標識：ペプチドを１ｍｌのＰＢＳに溶解させ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８色素（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ社製）とタンパク質：色素の比率１：２で混合し、１００μｌの重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を連続撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ｐ１２にはＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｇ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ １０００ ＭＷＣＯ、その他のものには２０００ ＭＷＣＯ（イリノイ州ロックフォードのピアース・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製）を用いて、冷ＰＢＳに対して透析することで、標識ペプチドを遊離の色素から分離した。
細胞透過／共焦点分析：細胞をガラス製のカバースリップ上に播種し、５％ＣＯ２下にて３７℃で一晩付着させた。細胞を新鮮な培地ですすぎ、予め温めた、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識アズリンペプチド（２０μＭ）若しくはＡｒｇ８（配列番号９５）（５μＭ）を含む培地中又は培地のみの中で、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで３回すすぎ、細胞を２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄し、カバースリップを、核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標））を含む培地中でマウントした。細胞の取込み及び分布を倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（ドイツ、ゲッティンゲン、カールツァイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）のモデルＬＣ５１０）下で撮影した。
ガラス製カバースリップ上で成長中の細胞をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８で標識されたアズリン又はペプチドと３７℃にて２時間インキュベートすることで、リソソーム又はミトコンドリアとペプチドの共局在を調べた。Ｍｉｔｒｏｔｒａｃｋｅｒ（ＭｉｔｒｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）又はｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ−２６、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）をインキュベーションの最後の３０分間に添加した（終濃度１μＭ）。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ中で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１μｇ／ｍｌウサギ抗ヒトゴルジン（ｇｏｌｇｉｎ）９７又は抗ヒトカベオリンＩ（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ社製）を含むＰＢＳ中で１％ＢＳＡと共にインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、カバースリップをＰＢＳで１回洗浄し、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４６８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を含むＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄した。次いで、カバースリップを核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む培地中でマウントした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８（赤色）とＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４６８（緑色）の共局在（黄色）を分析し、撮影した。
カバースリップ上のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を、１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ社製）を含むＭＥＭ−Ｅ中で３０分間プレインキュベートし、ｐ１８、ｐ２８、又はＡｒｇ８（配列番号９５）を終濃度が２０μＭになるように添加した。１時間後、カバースリップを前述のように洗浄、固定、及び分析した。
ＦＦＡＣＳによる細胞透過：細胞（１．０×１０６／５００μｌＰＢＳ）を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８で標識したｐ１８若しくはｐ２８（２０μＭ）、Ａｒｇ８（５μＭ）と又は培地のみと３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、篩に通して単一細胞懸濁液を得た。ＭｏＦｌｏ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（デンマーク、グロストルップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）のＤａｋｏ社製）λｅｘ５６８ｎｍ及びλｅｍ６０３ｎｍを用いて試料を分析し、バックグラウンドレベルに対する平均蛍光強度の倍率を計算した。結果は３つの別々の実験の平均蛍光を表す。
移入阻害剤：３７℃でフェノールレッド及び血清を含まないＭＥＭ−Ｅ中に維持したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（３×１０５／３００μｌ）を以下を含む阻害剤で前処置した：クロロプロマジン（Ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｍａｚｉｎｅ）（クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤、１０μｇ／ｍｌ、６０分間）；アミロリド（マクロピノサイトーシス阻害剤、５０μＭ、３０分間）；ナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ、３０分間）；メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ、５ｍＭ、６０分間）；フィリピン（カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤、３μｇ／ｍｌ、６０分間）；タキソール（微小管安定化剤、２０μＭ、３０分間）；スタウロスポリン（細胞周期阻害剤、２５０ｎＭ、１０分間）；アジ化ナトリウム（代謝阻害剤、１ｍＭ、６０分間）；ウアバイン（ＡＴＰａｓｅ依存性Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ阻害剤、５０ｍＭ、６０分間）；ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；ゴルジ装置破壊剤、１００μＭ、６０分間）；ワートマニン（初期エンドソーム阻害剤、１００ｎＭ、３０分間）；モネンシン（後期エンドソーム／リソソームにおける阻害、１０μＭ、６０分間）；ノコダゾール（カベオソーム形成を阻害、１０μＭ、６０分間）；サイトカラシンＤ（アクチンフィラメント及び微小管破壊剤、５μＭ、３０分間）；ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢｎＧａｌＮａｃ；Ｏ結合型グリコシル化阻害剤、３ｍＭ、４８時間）；ツニカマイシン（Ｎ結合型グリコシル化阻害剤、２０μｇ／ｍｌ、４８時間）；及びノイラミニダーゼ（タンパク質からシアル酸残基を切断、ＩＵ／ｍｌ、３０分間）。終濃度は個々の阻害剤の用量反応曲線から決定した。次いで、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８又はｐ２８（２０μＭ）を添加し、１時間インキュベートし、細胞を洗浄及び固定し、前述したようにサイトメトリー分析用に調製した。
細胞膜毒性アッセイ／ＬＤＨ漏出アッセイ：ＬＤＨ漏出アッセイをメーカーの取扱説明書（ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ、ウィスコンシン州のプロメガ社）に従い１００μｌのＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０３）を用いて行った。ペプチド／タンパク質なしの細胞を負の対照として用いた。実験は３回繰り返した（データは平均値±ＳＥＭを表す）。
溶血アッセイ：ヒト全血試料（２〜３ｍｌ）を１０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットをＰＢＳで１回、ｐＨ７．４のＨＫＲバッファーで１回洗浄した（１８）。次いで、赤血球が４％となるように細胞ペレットをＨＫＲバッファーに再懸濁し、５０μｌを、ペプチド、アズリン（５、５０、及び１００μＭ）、又は０．１％トリトンＸ−１００を含むＨＲＫバッファー９５０μｌと共に１．５ｍｌ試験管に移してＲＢＣ膜を完全に破壊した。ＭＡＰ及びマストパラン７（カリフォルニア州トランスのＢａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．社製）を正の対照とした。３７℃で３０分間回転させながらインキュベートした後、チューブを１０００×ｇで２分間遠心し、上清３００μｌを９６ウェルプレートに移し、５４０ｎｍの吸光度を記録した。
移入のカイネティクス：１．５ｍｌチューブ中のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ１８を０、１０、２０、５０、１００、１５０、及び２００μＭで５、１０、１５、及び２０秒間又はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８を１、１０、２５、５０、１００、１５０、及び２００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間氷上で添加することで、反応を開始させた。インキュベーション後、２５０μｌの反応混合液に１ｍｌの冷ＰＢＳを添加した。細胞を４℃、６００×ｇで２分間、２回遠心した。各反応液について少なくとも１０，０００個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、バックグラウンド及び相対蛍光を計算した。
アズリンの １２５ Ｉ標識及び競合アッセイ：ペプチドの結合及び移入の測定には、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（５０，０００細胞／ｍｌ）を用いた全細胞（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）アッセイを用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ１８、ｐ２８、又はアズリン存在下／非存在下で種々の濃度（０〜１７５ｎＭ）の放射性標識されたアズリンと３７℃で３０分間インキュベートし、次いで氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、細胞ペレットに残留する放射活性をγ線計数器で測定した。１２５Ｉアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン、ｐ１８、又はｐ２８存在下での放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
癌細胞中への優先的移入に関与するｐ２８のドメイン
ペプチド−ＧＳＴコンストラクトから得られた初期のデータから、アズリンのアミノ酸５０〜７７が細胞透過のＰＴＤとして定義され、これはアズリン分子を安定化するアズリンの残基５４〜６７を含むαヘリックス領域を示す構造的証拠とよく一致している。共焦点分析は最初、ｐ２８／アズリンのｐ２８及びｐ１８（図１０Ａ）がヒトメラノーマ、前立腺癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞を比較的同様な効率で透過するが、組織学的に対応する正常細胞株は同じ程度に透過しないことを示唆していた（図１０Ａ）。唯一の例外は肺線維芽細胞に由来する細胞株であるＣＣＤ１３−Ｌｕであった。陽イオン性のＡｒｇ８（配列番号９５）は素早く効率的に線維芽細胞（図１０Ａ）及び試験した全てのその他の正常細胞株に取り込まれた（データ示さず）。
これらの観察結果は、より感度の高いＦＡＣｓ解析で確認され（図１０Ｂ）、肺癌を除き、ｐ２８及びｐ１８の蛍光は対応する正常細胞株よりもそれぞれ約０．５〜６倍及び約０．５〜３倍高かった。組織学的亜種メラノーマ内でも細胞内蛍光強度に同様なパターンが観察され、ｐ１８の相対強度はｐ２８で観察された強度の約５０％であった（図１０Ｃ）。バックグランドに対する蛍光強度も、ｐ２８に曝された正常細胞及び癌細胞の組よりもｐ１８に曝された正常細胞及び癌細胞の組で一貫して低く（データ示さず）、ここでも、個々の細胞への移入はｐ１８の方が少ないことが示された。全ての場合で、癌細胞又は正常細胞中へのｐ１８及びｐ２８の移入程度は、移入に優先性の観察されなかったＡｒｇ８（配列番号９５）で観察されたよりも有意に低かった（図１０Ａ）。予測されたｐ１８のＲｏｂｓｏｎ構造（データ示さず）はＣ末端アミノ酸が部分的なβシートを形成することを示唆している。このこと及びｐ１８がｐ２８の親水性Ｃ末端１０アミノ酸（アミノ酸６８〜７７）を欠いており短いことは、アズリンの推定ＰＴＤであるｐ１８の癌細胞及び正常細胞への移入が、エンドサイトーシスプロセス又は膜受容体介在プロセスによる移入よりも非エンドサイトーシスプロセスによる移入の方が速いことを示している。ＭＡＰＡＳのデータ（ＭＲＳ ３．７４、ＭＡＳ ８７．１、Ｋｍｐｈａ ２．３７）は、アズリンのアミノ酸６９、７０、７５、７６、８５が最も膜に接触し易いことを示しており、ｐ１８（アミノ酸５０〜６７）には存在しないｐ２８のＣ末端領域が細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に接触することを示している。
同じ細胞株をアズリン６０〜７７（ｐ１８ｂ）又はｐ２８のＣ末端１２アミノ酸であるアミノ酸６６〜７７（ｐ１２）に曝すことでｐ１８及びｐ２８の優先的透過を確認した（図１１Ａ、Ｂ）。ここでは、ｐ１８及びｐ２８で観察された優先的透過は完全に消失し、ｐ１８ｂ（理論的ｐＩ ４．１３）は短いαヘリックス及び部分的βシートを有し、極端に親水性であり、これらが合わさって優先的移入が消失している可能性がある。ｐ１２（理論的ｐＩ ４．３３）はαヘリックス二次構造を欠くがやはり親水性であり、全体的な親水性が細胞透過の選択性低下への主要な要因であることが示唆される。
細胞透過は膜破壊の結果ではない
アズリン、ｐ２８、及びｐ１８の細胞透過は膜破壊によるものではない。５〜１００μＭのｐ２８、ｐ１８、又はアズリン存在下でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を用いたＬＤＨ漏出アッセイ（図１２Ａ）により、ペプチドもアズリンも形質膜の完全性を変化させて細胞に移入したのではないことが示唆された（１８）。膜破壊がないことを、両親媒性αヘリックスとして細胞膜を通過してヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化する肥満細胞脱顆粒ペプチドマストパラン７及び受容体模倣ＭＡＰに対してヒト赤血球へのアズリン、ｐ２８、及びｐ１８の溶血活性を測定することで確認した。マストパラン７は２５μＭで完全な細胞溶解を引き起こしたが、アズリン、ｐ２８、及びｐ１８は対照（ペプチドなし）と比べて溶血効果を有さなかった（図１２Ｂ）。
ｐ１８／ｐ２８の透過はエネルギー依存的且つ飽和性である
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（図１３Ａ）及びｐ１８（図１３Ｂ）の透過は温度依存性である。細胞透過及び細胞内輸送は４℃では３時間にわたり比較的ゆっくりと起こるが、２２℃及び３７℃では移入及び種々のコンパートメントを介した細胞内輸送は素早く起こり、ｐ１８及びｐ２８は暴露から２時間以内にＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の核中に存在した。２００倍過剰量の非標識ペプチド存在下で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのｐ２８（図１３Ｃ）又はｐ１８（図１３Ｄ）の透過は大きく抑制され、このことは、移入が飽和プロセスであり、特異的受容体又は細胞表面のタンパク質若しくは特定の残基が少なくとも一部初期の移入に関与していることを示唆している。
ｐ２３及びｐ１８のカイネティクス
ヒト線維芽細胞と比較したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８及びｐ１８のカイネティクスを、インキュベーション後、細胞を固定して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した時に計算した。ペプチド濃度（μＭ）と速度（ＭＦＩ／秒）をプロットするかスキャッチャード分析により、各ペプチドのＫｍ及びＶｍａｘを算出した。アズリン断片５０〜６７（ｐ１８）及び５０〜７７（ｐ２８）の癌細胞への透過（それぞれＶｍａｘ ２．４６、Ｋｍ １０１．６及びＶｍａｘ １．８７、Ｋｍ １５９．１）及び正常細胞中への透過（それぞれＶｍａｘ ２．８８、Ｋｍ １０２．１及びＶｍａｘ １．８９、Ｋｍ １６６．０）は互いに有意に異なりｐ１８が約４２％速く移入するが、正常細胞及び癌細胞中への各ペプチドの移入速度は実質的に同じである。ｐ２８に癌細胞を暴露した後の方がｐ１８の場合よりも蛍光量が増加しているのは、悪性細胞へのｐ２８の移入量の増加によるものであろう。１２５Ｉアズリン及びｐ１８は同様な親和性でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した。対称的に、より高い温度（３７℃ｖｓ４℃）でより長い時間（２０分間ｖｓ２分間）暴露した場合、ｐ１８（Ｋｄ １８分、Ｂｍａｘ ０．５１ｐｍ）又はアズリン（Ｋｄ １０ｎｍ及び０．４８ｐｍ）よりもｐ２８が有意により高い親和性でより多くＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した（Ｋｄ ２．５μｍ、Ｂｍａｘ ３．０ｐｍ）。これらの結果は、アズリン、ｐ２８、及びｐ１８は全て移入前に癌細胞及び正常細胞の表面の部位に比較的高い親和性及び容量で結合するが、移入は２種以上のメカニズムを介し得ることを示している。
ｐ１８／ｐ２８の透過にはカベオラ及びゴルジ複合体が関与する
１つのクラスとして、ｐＴａｔ、Ａｒｇ８（配列番号９５）等の陽イオン性ＣＰＰは、エンドサイトーシスの前に陰イオン性の硫酸化プロテオグリカンに最初に結合することで細胞に移入する。無血清条件下で１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ＨＳ）の存在下／非存在下でｐ２８及びｐ１８及びＡｒｇ８（配列番号９５）をＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞とインキュベートすると、細胞内のＡｒｇ８（配列番号９５）の量は有意に低下するが、ｐ２８又はｐ１８の移入は変化しない（図１４Ａ）。Ｏ結合型グリコシル化の特異的阻害剤ＢｎＧａｌＮａｃ及びシアル酸残基を切断するネルアミニダーゼ（ｎｅｒｕａｍｉｎｉｄａｓｅ）の存在下／非存在下におけるＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８及びｐ２８の透過を更に特徴解析した結果（図１４Ｂ）、透過阻害は観察されなかった。しかし、Ｎ結合型グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンは細胞膜を横切るｐ１８及びｐ２８の透過を有意に低下させた。
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８及びｐ２８の移入を、エネルギー依存的輸送機構（すなわちＡＴＰ）の阻害剤を用いて更に分析した。アジ化ナトリウム（図１４Ｂ）及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅポンプ）はどちらのペプチドの透過も有意に阻害せず、このことはこれらのペプチドの透過に非エンドサイトーシス経路が関与し得ることを示唆している。クラスリン介在性エンドサイトーシスの特異的阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）も透過に影響を与えず、マクロピノサイトーシス阻害剤であるアミロリドも影響を与えなかった（図１４Ｂ）。タキソールによる微小管の安定化も透過に影響を与えなかったが、サイトカラシンＤを用いたアクチンフィラメントの破壊及びマクロピノサイトーシスはｐ１８及びｐ２８の透過を再現可能に少し（約２０％）阻害した。アミロリドが影響を与えなかったことから、サイトカラシンＤの阻害活性はアクチンフィラメントへの影響によるものと考えられる。
スタウロスポリンで細胞周期を阻害しても透過はブロックされなかった。このことは、透過が細胞周期特異的でないことを示唆している。ｐ１８及びｐ２８の癌細胞形質膜の透過にスタウロスポリンが影響しないことから、Ｓｒｃキナーゼ／チロシンキナーゼ依存性経路が透過に関与しなかったことと、ダイナミン非依存性、したがってカベオラの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）非依存性であることも示唆される。ｐ１８及びｐ２８のどちらも、形質膜内に存在しエンドサイトーシス中間体の特定の集団内に存在するタンパク質であるフロチリン−１と共局在せず（データ示さず）、このことも、内部移行におけるフロチリン及びダイナミンの役割を否定している。一方、カベオラ輸送を阻害しコレステロール動員の阻害剤である、したがって、カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤であるノコダゾールは、透過を５０〜６５％阻害した。
次いで、初期エンドソーム形成阻害剤であるワートマニン、後期エンドソーム／リソソームを阻害するモネンシン、及びゴルジ装置破壊剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を用いてｐ１８及びｐ２８の細胞内配置を解析した。ワートマニンは、ｐ１８又はｐ２８のいずれの細胞内蓄積もブロックしなかったことから、コレラ毒素とは異なり、ｐ１８及びｐ２８の細胞内輸送にはカベオラから初期エンドソームへの経路が関与しないことが示唆された。ｐ１８及びｐ２８の細胞内輸送に初期エンドソームが関与しないことから、クラスリン介在性エンドサイトーシスもこれらのペプチドの内部移行に関与しないことが示唆される。
しかし、モネンシン（図１４Ｂ）及びＢＦＡは両方のペプチドの細胞内蓄積を低下させ、ｐ２８への阻害効果（約３０％）はｐ１８への阻害効果（約１０％）よりも大きかった（図１４Ｂ）。線維芽細胞中へのｐ２８及びｐ１８の透過はＭβＣＤ、ノコダゾール、モネンシン、及びツニカマイシンでも阻害されたが、アミロリド、アジ化ナトリウム、及びＣＰＺでは阻害されなかった（図１４Ｃ）。このことは、癌細胞及び正常細胞中への移入の少なくとも１つのメカニズムが類似しているが、癌細胞中への更なる優先的蓄積は、共通する膜の受容体又は構造体（すなわちカベオラ）の数によって変わり得ることを示している（図１４Ｄ、パネル１、２）。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８及びｐ２８はカベオリン−１及びゴルジン９７抗体と共局在した（図１４Ｄ、パネル１、２）ことから、これらのオルガネラがｐ１８及びｐ２８の細胞内輸送に関与することが確認された。興味深いことに、アズリンはミトコンドリア特異的蛍光と共局在したが、ｐ１８及びｐ２８はミトコンドリア特異的蛍光と共局在しなかった（図１４Ｄ、パネル３）。一方、ｐ２８及びアズリンはリソソームと共局在したが、ｐ１８はリソソームと共局在しなかった（図１４Ｄ、パネル４）。
ｐ２８及びｐ１８の機能的解析
アズリンは複数のヒト癌細胞株の成長をインビトロ及びインビボで阻害する。図１５Ａ及びＢに、ＭＴＴ及び細胞計数により測定したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に対するｐ１８及びｐ２８の影響をアズリン及びダカルバジン（ＤＴＩＣ）と比較して示す。暴露７２時間後、アズリンは１００μＭ及び２００μＭで細胞生存率を約１５％低下させた（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ）。ｐ２８は１００μＭ及び２００μＭで細胞生存率をそれぞれ１４％及び２２％低下させた（ｐ＜０．０５）。一方、ｐ１８は何ら影響を与えず、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２の生存を用量依存的に有意に低下させた。アズリン及びｐ２８（２００μＭ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２３細胞及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２９細胞の生存も有意に低下させた。ｐ１８はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の増殖に何ら影響しなかった。細胞の直接計数により測定されたｐ２８及びアズリンによるメラノーマ細胞増殖阻害の明らかな上昇（約３０〜３５％：ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２）は、阻害効果が何らかの遅延後のアポトーシスを伴う細胞周期のレベルに主に存在することを示唆している。ｐ１８は、癌細胞を優先的に透過するが、ｐ２８とは異なり、細胞増殖に対する阻害活性を実質的に有さない。この結果は、ｐ２８の細胞分裂阻害活性及び細胞毒性活性が配列のＣ末端１０〜１２アミノ酸にあることを示している。
細胞へのアズリン及びｐ２８の結合及び移入
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２又は線維芽細胞（３×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８を１０、５０、１００、１５０、２５０、３００、及び４００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間氷上で添加することで反応を開始させた。細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞中へのペプチドの取込みを図１７Ａのグラフに示す。ペプチド濃度（μＭ）と速度（ＭＦＩ／秒）をプロットすることでＫｍ及びＶｍａｘを算出した。これらの計算結果を図１７Ｂに示す。ペプチドの結合及び移入の測定には全Ｍｅｌ２細胞（５０，０００細胞／ｍｌ）を用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ２８又はアズリンの存在下／非存在下で種々の濃度の放射標識アズリン（０〜１７５ｎＭ）と一緒に３７℃で３０分間インキュベートし、細胞ペレットに残留した放射活性をγ腺計数器で計数した。結果を図１７Ｃに示す。１２５Ｉアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン又はｐ２８の存在下における放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
アズリン由来ペプチドを用いたｐ５３を介した癌成長阻害：材料及び方法
細胞培養
ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から入手したヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐ５３ｗｔ）、及びＤｒ．Ａｎｄｒｅｉ Ｖ． Ｇｕｄｋｏｖ（オハイオ州クリーブランドのラーナー研究所（Ｌｅｒｎｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））から寄贈されたＭＤＤ２（ｐ５３ドミナントネガティブ）を、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの必須アミノ酸を含むＭＥＭ−Ｅ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）中で培養した。
細菌培養及びアズリンの単離
大腸菌ＪＭ１０９を宿主株として用いて野生型アズリンを生産した。培養条件及びタンパク質精製工程はＹａｍａｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， ７０：７０５４−７０６２（２００２）及びＧｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ４７：５４９−４４９（２００３）に記載されている通りである。
ペプチド合成
ｐ１８（Ｌｅｕ５０〜Ｇｌｙ６７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ（配列番号２５））、ｐ２８（Ｌｅｕ５０〜Ａｓｐ７７（配列番号２）；ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ）、ｐ１８ｂ（Ｖａｌ６０〜Ａｓｐ７７（配列番号３４）：ＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ）、ｐ１２（Ｇｌｙ６６〜Ａｓｐ７７：ＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５））、及びポリアルギニン（Ａｒｇ８）（配列番号９５）を含む全てのアズリン由来ペプチドはＣＳＢｉｏ社（カリフォルニア州メンローパーク）により９５％超の純度及び質量バランスで合成された。
増殖アッセイ
細胞を１２×１０３細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）中のＭＥＭ−Ｅ中に４複製分（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）播種し、５、５０、１００、及び２００μＭのｐ２８存在下で２４、４８、及び７２時間インキュベートした。培地は毎日交換した。対照のウェルにはｐ２８を含まないＭＥＭ−Ｅを入れた（８複製分）。ドキソルビシン（１０μＭ）を正の対照として用いた（Ｚ１カウンター；カリフォルニア州フラートンのベックマンコールター社製）。値は対照の（％）を表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントｔ検定により決定した。
ＭＴＴアッセイ
ＭＣＦ−７細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種し（４複製（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ））、２４時間付着させ、新たに調製したペプチド（１０μｌ）又はＭＥＭ−Ｅを各ウェルに添加した。２４時間後、培地及びｐ１８、ｐ２８、アズリン、又はドキソルビシンを毎日添加した。インキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ試薬（メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社製）を各ウェルに添加し、試料をＲＴで３時間インキュベートし、１００μｌの界面活性剤を各ウェルに添加し、３７℃で更に３時間インキュベートした。吸光度（５７０ｎｍ）を測定し（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー；カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製）、処置した細胞における変化率を決定した。対照と処置群の間の有意性（ｐ＜０．０５）はスチューデントｔ検定により決定した。
異種移植モデル
エストラジオールで前処置（０．７２ｍｇ／ペレット、６０日間放出；フロリダ州サラソータのイノベイティブ・リサーチ社（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製）された雌の胸腺欠損マウス（ハーラン社（Ｈａｒｌａｎ）製；４〜５週齢）の右側腹部に３×１０６個のＭＣＦ−７細胞をｓ．ｃ．接種し、処置前に対照及び実験群にランダムに分けた。対照動物にはＰＢＳ／ひまし油をｉ．ｐ．投与した。パクリタキセル（１５μｍｏｌ／ｋｇ）を含むＰＢＳ／ひまし油を腫瘍細胞接種後１０、１４、２１、及び２５日目にｉ．ｐ．注射するか、ｐ２８（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を含む滅菌ＰＢＳを３０日間毎日ｉ．ｐ．注射した。腫瘍体積は週３回測定し、体重は週２回測定した。マウスの死体解剖を３１日目に行い、全ての腫瘍を回収して病理組織診断及び免疫細胞化学に用いた。対照と処置群の間の有意性（ｐ＜０．０５）はスチューデントｔ検定により決定した。
免疫細胞化学
死体解剖の２時間前にＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射した。ＢｒｄＵで標識された腫瘍細胞核を抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）を用いて特定した。圧力釜中で６分間１０ｍＭのクエン酸バッファーで処置したホルマリンで固定した５μのパラフィン切片中のｐ５３の発現を定量した。冷却したスライドを３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処置して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ブロッキング用血清で１０分間覆い、ｐ５３抗体（ＤＯ−１；カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）に室温で２時間曝した。ラット抗マウスＩｇＧ２ａを二次抗体として用いた。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製）及び３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社製）を用いてｐ５３発現細胞を特定した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。各腫瘍周辺の１０個の非重複フィールド（２５０細胞／フィールド）をｐ５３標識細胞についてスクリーニングした（４０×）。
共焦点顕微鏡法
細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でガラス製カバースリップ上に一晩播種し、新鮮な培地ですすぎ、予め温めたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識ペプチド（２０μＭ）若しくはＡｒｇ８（配列番号９５）（５μＭ）を含む培地又は単独培地中にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで３回すすぎ、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄し、核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）、ベクター・ラボラトリーズ社製）を含む培地中でマウントした。固定した細胞を、メタノール及びアセトンで透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、１：２００希釈した抗ｐ２１又はサイクリンＢ（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）とインキュベートし、サイクリンＢ１及びｐ２１の染色を調べた。二次抗体とコンジュゲートしたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８を１：１００希釈して用いた。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（モデルＬＣ５１０；ドイツ、ゲッティンゲンのカールツァイス社製）を用いて細胞取込み及び細胞内分布を調べた。
カイネティクス
ＭＣＦ−７及びＭＤＤ２細胞（３×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭ−Ｅに懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８を１、１０、２５、５０、１００、１５０、及び２００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間氷上で添加することで反応を開始させた。インキュベーション後、反応混合物に１ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、細胞を２回、４℃、６００×ｇで２分間遠心した。各時点及び濃度について少なくとも１０，０００個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、そのバックグラウンド及び相対蛍光を算出した。
細胞周期の分析
ＭＣＦ−７及びＭＤＤ２細胞を５０μＭのｐ２８と一緒に３７℃で４８時間及び７２時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、７０％エタノールを用いて−２０℃で固定した。固定細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含む５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のＰＢＳ溶液で染色した。フローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ；カリフォルニア州フラートンのベックマンコールター社製）を用いてＤＮＡ含量を測定した。各実験について最低一万個の細胞を回収した。
イムノブロッティング
ＭＣＦ−７及びＭＤＤ２細胞を５０μＭのｐ２８と一緒に０、２４、４８、及び７２時間培養し、前述（３）の方法に従って全細胞可溶化物を調製した。リン酸化ｃｄｃ２（ｐ−ｃｄｃ２）の細胞可溶化物を１０ｍＭのＮａＦ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａＶＯ４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１ｍＭのＤＴＴ 及びプロテイナーゼ阻害剤（シグマ・アルドリッチ社製）中に調製した。ｐ５３、ｐ２７、ＣＤＫ、サイクリンに対する抗体（以上はサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）、ｐ２１に対する抗体（インビトロジェン社製）をメーカーの取扱説明書に従って用いた。モノクローナルアクチン抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を用いてアクチンの発現を調べ、ＥＣＬ試薬（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）を用いてタンパク質バンドを可視化した。
抗ｐ２８抗体
ｐ２８（カリフォルニア州メンローパークのＣＳＢｉｏ社製）のＮ末端にシステインを導入し、次いで、このペプチドを、システイン残基のチオール基を介してキーホールリンペット・ヘモシアニンにコンジュゲートさせ、この複合体を皮内及び皮下で接種し、ウサギ（ニュージーランドホワイト；ミシガン州のコーヴァンス社（Ｃｏｖａｎｃｅ）製）中でｐ２８（アズリンのアミノ酸６０〜７７）の１１〜２８アミノ酸に特異的なポリクローナル抗体を産生させた。ｐ２８（０〜３μｇ／ウェル）を用いた直接ＥＬＩＳＡ法により抗体価を求めた。９６ウェルプレート（ニューヨーク州ロチェスターのＮｕｎｃ社製）を１μｇ／ウェルのｐ２８でコーティングした場合、２５℃で基質（１−Ｓｔｅｐ ＰＮＰＰ、イリノイ州ロックフォードのピアース社製）と１５分間インキュベートした後の４５０ｎｍにおける再現可能な吸光度変化０．５を得るには、１：１４０，０００の抗体希釈物で十分であった。
ＧＳＴプルダウンアッセイ
本質的にＰｕｎｊ， ｅｔ ａｌ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−２３７８（２００４）に記載されているようにＧＳＴプルダウンアッセイを用いて、ｐ５３へのｐ２８の結合をアッセイした。精製したＧＳＴ−ｐ２８（１０及び２０μｇ／反応液）、ＧＳＴ−ＭＤＭ２（２０μｇ／反応液）、及びＧＳＴ単独（２０μｇ／反応液）をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ニュージャージー州のＧＥヘルスケア社製）に結合させ、結合しなかったペプチドをＰＢＳで２回洗浄して除去した。プロテイナーゼ阻害剤カクテル（シグマ・アルドリッチ社製）を含むＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００を氷上で１５分間用いてＭＣＦ−７細胞の全細胞可溶化物を調製し、４℃、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。得られた上清をビーズと混合し、４℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄して結合しなかった細胞可溶化物を除去した後、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。膜を、スキムミルク（５％）を含むＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）及びポリクローナルｐ５３抗体（ＦＬ−３９３、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を含む５％スキムミルクと４℃でインキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、二次ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（シグマ・アルドリッチ社製）を添加し、室温（ｒ／ｔ）で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。
ｐ５３上の潜在的結合部位を以下のようにして特定した。ｐ２８の存在下（１０〜５０モル濃度分過剰）でＧＳＴプルダウンアッセイを用いてｐ５３のＭＤＭ２結合部位（アミノ酸１８〜２３）の相互作用を解析し、イムノブロッティング（ＩＢ）によりｐ５３のバンドを検出した。入手可能な最も広い範囲のｐ５３をカバーする３つの異なる抗ｐ５３抗体、Ｐａｂ１８０１（３２〜７９アミノ酸；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）、ａｂ２４３３（２７７〜２９６アミノ酸；マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ社製）、及びＰａｂ１８０２（３０６〜３９３アミノ酸；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）をそれぞれｐ２８の存在下でＧＳＴ−ｐ５３不動化ビーズと反応させた。インキュベーション後、試料をＰＢＳで２回洗浄して結合しなかったｐ２８を除去し、ネイティブＰＡＧＥ試料バッファー（Ｔｒｉ／グリセロール／ＢＰＢ）中で煮沸し、５％ネイティブＰＡＧＥにかけた。エレクトロブロッティング（０．２Ａｍｐで１時間）により試料をＰＶＤＦ膜に移し、膜をスキムミルク（５％）を含むＴＢＳＴでブロッキングし、ｐ２８に対するポリクローナル抗体（１：５０００希釈）を含む５％スキムミルクと４℃でインキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ＩｇＧ抗体（１：７０００希釈、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を添加した。ｐ２８のバンドをＥＣＬ試薬を用いて可視化した。グルタチオンセファロース４Ｂビーズ上に不動化したＧＳＴ−ｐ５３（２０μｇ／反応液）に対してｐ２８とｐ２８の断片ｐ１２、ｐ１８、及びｐ１８ｂとの間で競合アッセイを行うことでｐ２８上の結合ドメインを特定した。反応液を４℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄して結合しなかったｐ２８を除去し、次いで、ネイティブＰＡＧＥ試料バッファー（Ｔｒｉ／グリセロール／ＢＰＢ）中で煮沸し、５％ネイティブＰＡＧＥにかけた。エレクトロブロッティング（０．２Ａｍｐで１時間）によりタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ブロッキングし、ｐ２８に対するポリクローナル抗体と４℃で１６時間インキュベートした。ｐ２８のバンドをＥＣＬ試薬で可視化した。Ｇｅｌ＆Ｇｒａｐｈ Ｄｉｇｉｔｉｚｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴ（商標）（ユタ州オレム（Ｏｒｅｍ）のシルク・サイエンティフィック社（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）製）を用いてバンドの強度を決定し、特異的タンパク質／アクチンの比率を算出した。各タンパク質バンドの下に示した数字は、処置直前のタンパク質バンドの強度に対する相対的割合である（０時間を１００％として表す）。
ｐ５３のＤＮＡ結合活性
５０μＭのｐ２８又はアズリンと２４時間インキュベートした後、メーカーの取扱説明書に従いＭＣＦ−７細胞から核画分を単離した（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、カリフォルニア州カールズバッドのアクティブモチーフ社（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）製）。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して核抽出物上清を回収した。ブラッッドフォード法を用いてタンパク質濃度を決定した。ＴｒａｎｓＡＭ ｐ５３キット（アクティブモチーフ社製）を用いてｐ５３のＤＮＡ結合活性を測定した。簡潔には、ＤＴＴ及びポリ［ｄ（Ｉ−Ｃ）］を含む４０μｌの結合バッファーを各ウェルに添加してｐ５３のコンセンサスオリゴヌクレオチドへの非特異的結合を防いだ。核抽出物を各ウェルに添加し、Ｈ２Ｏ２処置又はバッファーのみをそれぞれ正及び負の対照とし、ｒ／ｔで１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μｌのｐ５３抗体（１：１０００希釈）を添加し、ｒ／ｔで１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体を添加し、試料を１時間インキュベートして暗黒化で３分間現像した。ＤＮＡへのｐ５３の結合を４５０及び６５５ｎｍの吸光度から求めた。
インビトロ及びインビボにおけるヒト癌細胞の成長に対するｐ２８処置の効果
アズリンは、ｐ５３介在性アポトーシスの誘導を介して抗癌活性を発揮する。図５４Ａ及びＢは、直接細胞計数及びＭＴＴアッセイにより決定された、ｗｔ ｐ５３（正）ＭＣＦ−７細胞に対するｐ２８及びドキソルビシンの効果を示す。ｐ２８は最初、ＭＣＦ−７細胞の増殖をインビトロで用量及び時間依存的に阻害し（図５４Ａ）、細胞数を有意に減少（ｐ＜０．０５）させ、暴露２４時間後に、５μＭでは約２３％、５０〜２００μＭでは約３６％減少させた。ドキソルビシン（ＤＮＡ挿入剤）も時間依存的に細胞成長を有意に阻害した。ＭＴＴアッセイにより求められた細胞生存率はｐ２８では有意に変化しなかったが、ドキソルビシンはＭＣＦ−７細胞の生存率を時間依存的に有意に減少させた（図５４Ｂ）。ｐ２８は、３０日間毎日ｉ．ｐ．暴露した胸腺欠損マウス中の異種移植されたＭＣＦ−７細胞の体積も用量依存的に有意に減少させ（図５４Ｃ）、腫瘍体積は、体重減少又は行動変化を伴わずに、パクリタキセル（登録商標）で観察される程度にまで減少した（ｐ＜０．０５）。３０日目までに、１０ｍｇ／ｋｇのｐ２８を毎日ｉ．ｐ．投与すると、腫瘍細胞接種後１０、１４、２１、及び２５日目に１５μｍｏｌ／ｋｇのパクリタキセル（登録商標）よりも強く（約２０％）ＭＣＦ−７の成長が阻害された。ｐ２８で誘導される腫瘍体積の減少に関連するＢｒｄＵ標識の減少から細胞周期が阻害されたことが示唆された（表５）。対照的に、ＢｒｄＵ標識及び腫瘍体積の減少に伴い、対照と比べて核ｐ５３の染色がｐ２８ではわずかに増え、パクリタキセル（登録商標）処置群では有意に増加した（表Ｘ）。
Figure 2012512892
 腫瘍は全て処置後３１日目に回収。値は平均値±ＳＥＭを表す。それぞれ対照に対して、＊ｐ＜０．０２５、＊＊ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定。
ｐ２８による細胞周期進行の阻害
２つの同系乳癌細胞株、ＭＣＦ−７（ｐ５３ｗｔ）及びＭＤＤ２（ｐ５３ドミナントネガティブ）の細胞周期分析から、ｐ２８に４８〜７２時間暴露した後にＧ２／Ｍ期の細胞集団が増加すること及びその後７２時間目にＭＣＦ−７細胞でアポトーシスが誘導されることが示された（図５５Ａ）。ｐ２８処置ＭＤＤ２細胞では細胞周期進行の阻害又はアポトーシスは実質的になかった（図５５Ｂ）。ｐ２８処置ＭＤＤ２細胞で細胞周期阻害及びアポトーシスがない（図５５Ｂ）ことは、ＭＤＤ２細胞中へのｐ２８の移入の差（図５５Ｃ）又はＶｍａｘ（ＭＣＦ−７：１．８３ＭＦＩ／秒、ＭＤＤ２：２．２１ＭＦＩ／秒）若しくはＫｍ（ＭＣＦ−７：１４４．３μＭ、ＭＤＤ２：１４７．９μＭ）の差によるものではなかった。
ｐ２８によりｐ５３レベルが上昇する
ＭＣＦ−７細胞中でアズリンはｐ５３と複合体を形成してｐ５３の細胞内レベルを上昇させる。ＭＣＦ−７細胞におけるｐ５３の細胞内レベルはｐ２８曝露後にも時間と共に有意に上昇した（図５６）。ＧＳＴプルダウンアッセイからｐ２８がｐ５３に結合することが示唆された（図５６Ｂ）。ここで、ＧＳＴ−ｐ２８及びＧＳＴ−ＭＤＭ２はＭＣＦ−７細胞可溶化物からｐ５３をプルダウンしたが、ＧＳＴ単独ではｐ５３はプルダウンされなかった。ｐ２８のモル濃度を上げてもＧＳＴ−ＭＤＭ２との結合に競合しなかった（図５６Ｃ）ことから、ｐ５３のアミノ酸１８〜２３はｐ２８の好ましい結合部位ではないことが示唆された。ｐ５３タンパク質の種々のモチーフ（アミノ酸３２〜７９、２７７〜２９６、及び３０６〜３９３）を認識するｐ５３抗体の存在下又は非存在下における更なるＧＳＴプルダウンアッセイでｐ５３へのｐ２８の結合がブロックされなかったことから、ｐ２８はこれらの認識部位の外側のｐ５３の領域に結合することが示唆された（図５６Ｃ）。
ＧＳＴ−ｐ５３タンパク質を不動化したセファロース４Ｂ−グルタチオンビーズをｐ２８及びアズリンのアミノ酸６６〜７７、アミノ酸５０〜６７、又はアミノ酸６０〜７７、それぞれ（ｐ２８断片ｐ１２、ｐ１８、及びｐ１８ｂ）とインキュベートした場合、ｐ１８及びｐ１８ｂにより有意な量のｐ２８が置換されたが、ｐ１２を競合物質として用いた場合は置換はわずかであった（図５６Ｄ）。これらの結果は、ｐ５３への結合がｐ２８のアミノ酸１１〜２８（アズリンのアミノ酸６０〜７７）内で最も多く生じることを示唆している。
ｐ２８はｐ５３の細胞内レベルを上昇させるので、ｐ２８又はアズリンで処置したＭＣＦ−７細胞核抽出物から得られたｐ５３のＤＮＡ結合活性も調べた。ｐ２８及びアズリンで処置したＭＣＦ−７細胞の核画分中のｐ５３のＤＮＡ結合活性は対照よりも１．８倍及び２．３倍高かった（ｐ＞０．１、ｐ２８ｖｓアズリン）。ｐ５３ｗｔの変異されていないコンセンサスなオリゴヌクレオチド配列は、ｐ２８により誘導されるｐ５３の増加を完全にブロックした。このことから、ＭＣＦ−７細胞の核抽出物中のｐ５３はｗｔ ｐ５３のコンセンサスオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合することが確認された（図５６Ｅ）。
ｐ２８による細胞周期関連タンパク質の調節
ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫＩ）であるｐ２１及びｐ２７をアップレギュレートすると細胞周期進行がブロックされる。ｐ２８は、暴露後の時間経過と共に、ＭＣＦ−７細胞で対照に比べてｐ２１、ｐ２７、ＣＤＫ６、及びサイクリンＢ１の細胞内レベルを上昇させた（図５７Ａ）。ｐ２８で処置したＭＣＦ−７細胞中では、暴露後、有糸分裂プロセスに必須のタンパク質であるＣＤＫ２及びサイクリンＡのレベルが時間と共に低下した（図５７Ａ）。一方、ＭＤＤ２細胞中ではｐ５３、ｃｄｃ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６は実質的に一定に維持され（図５７Ｂ）、サイクリンＡ及びサイクリンＢ１（４８時間）はわずかに増加した。ｐ２１はＭＤＤ２細胞中でｐ５３非依存性の経路により発現され得るので、ｐ２１は検出可能なままであった。しかし、ｐ２８はｐ２１のレベルを変化させなかった（図５７Ｂ）。一方、非処置又はｐ２８に暴露したＭＤＤ２細胞中でｐ２７は検出されなかった。ｐ２８に応答したイムノブロッティングで検出されたＭＣＦ−７細胞中におけるｐ２１及びサイクリンＢ１レベルの上昇はそれぞれ核コンパートメント及び細胞質ゾルコンパートメントにおける上昇に反映されている（図５７Ｃ及びＤ）。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８に暴露すると、不活性型のｃｄｃ２であるリン酸化ｃｄｃ２（ｐ−ｃｄｃ２）の蓄積も誘導された。ＭＤＤ２細胞をｐ２８に暴露してもｐ−ｃｄｃ２のレベルは上昇しなかった（図５７Ｅ）。
マウス臓器中へのｐ１８及びｐ２８のイメージング
小動物のインビボでのイメージングはヒトの癌研究を含む生物学的研究において重要である。タグ化した生物学的プローブを追跡及び可視化することができれば、研究者は、生物学的プロセスを可視化し、作用及び効果のメカニズムを推測することができる。イメージングを用いて、異種移植片を有するヌードマウスの原発性及び転移性腫瘍部位への、近赤外標識されたアズリン並びにアズリン断片ｐ２８及びｐ１８を含むクプレドキシンクラスタンパク質のペプチドの輸送を直接可視化することができる（Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ １０：０５４０１０−１−１１， ２００５；Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｎｅｕｏｔｈｅｒ ２：２１５−２２５， ２００５；Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２２２：１−２９， ２００２）。
手順
Ｍｅｌ２異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスを、腫瘍サイズが０．５ｃｍ３に達するまでモニタリングした。ケタミン：キシラジンの２：１混合物を用いてマウスに麻酔をかけた；推奨用量はマウス体重１グラム当たり１０μｌ（ｓ．ｃ．）である。麻酔下のマウスを、標識ペプチドを注射する前後にｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒを用いて直接スキャンした。ＩＲＤｙｅ（商標）８００ｃｗで標識されたｐ１８／ｐ２８を濃度１．２５μｇ／μｌで１００μｌ（マウス１頭当たり１２５μｇ）、麻酔下のマウスにｉ．ｖ．注射（尾静脈）した。マウスの系から過剰な色素が除去されるまで（通常約５日間）、少なくとも２４時間に１回マウスをスキャンした。５日目に、マウスを屠殺し、個々の動物の最後のスキャンを行った。腎臓、胃、腸、脾臓、脳、心臓、及び肺を含む臓器並びに腫瘍を摘出し、半分に分け、半分を固定して組織学的検査に用いた。臓器及び腫瘍の残った半分は少量のＰＢＳで覆った後、スキャンした。

Claims (76)

  1. 癌細胞を細胞毒性クプレドキシンに接触させることで前記癌細胞を死滅させることを含む方法であって、前記細胞毒性クプレドキシンが１又は複数のエンドサイトーシス経路を介して前記癌細胞に優先的に移入し、前記細胞毒性クプレドキシンがアズリンの切断型であり、前記アズリンの切断型が配列番号２のＣ末端のアミノ酸を含む、方法。
  2. 前記アズリンの切断型が緑膿菌に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アズリンの切断型が配列番号２を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記アズリンの切断型が配列番号２からなる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞毒性クプレドキシンがカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に優先的に移入する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記癌細胞への前記細胞毒性クプレドキシンの移入が、ゴルジ装置に仲介される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記細胞毒性クプレドキシンが、前記癌細胞の状態に関係なく前記癌細胞の細胞膜に接触できるアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項７に記載の方法
  10. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項７に記載の方法。
  11. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む、請求項７に記載の方法。
  12. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
  13. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の方法。
  14. 癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に移入することができ、前記癌細胞を死滅させることができ、配列番号２のＣ末端のアミノ酸を含む、単離されたペプチド。
  15. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  16. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  17. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  18. 前記癌細胞中への前記単離されたペプチドの移入がゴルジ装置に仲介される、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  19. 前記単離されたペプチドが緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  20. 前記単離されたペプチドが配列番号２を含む、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  21. 前記単離されたペプチドが配列番号２からなる、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  22. 前記単離されたペプチドが、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  23. 前記単離されたペプチドが、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１４に記載の単離されたペプチド。
  24. 癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に移入することができ、前記癌細胞を死滅させることができ、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に見られるアミノ酸の１又は複数を含む、単離されたペプチド。
  25. 前記単離されたペプチドが、配列番号１の６９、７０、７５、７６、及び８５位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む、請求項２４に記載の単離されたペプチド。
  26. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項２４に記載の単離されたペプチド。
  27. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項２４に記載の単離されたペプチド。
  28. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項２４に記載の単離されたペプチド。
  29. 請求項１４に記載の単離されたペプチドを含む医薬組成物。
  30. 薬学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記薬学的に許容されるキャリアが静脈内投与に適したものである、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 治療有効量の請求項２９に記載の医薬組成物を哺乳動物患者に投与することによって前記患者を処置することを含む方法。
  33. 前記患者がヒトである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記患者が、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記癌が、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頚癌から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記患者が少なくとも１つの高リスク特性を有する、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記患者が前悪性病変を有する、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記患者が癌又は前悪性病変の治療歴を有する、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記医薬組成物が、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記投与形態が静脈内注射である、請求項３９に記載の方法。
  41. バイアル中に請求項２９に記載の組成物を含むキット。
  42. 請求項２４に記載の単離されたペプチドを含む医薬組成物。
  43. 薬学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 前記薬学的に許容されるキャリアが静脈内投与に適したものである、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 治療有効量の請求項４２に記載の組成物を哺乳動物患者に投与することで前記患者を処置することを含む方法。
  46. 前記患者がヒトである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記患者が、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記癌が、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記患者が少なくとも１つの高リスク特性を有する、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記患者が前悪性病変を有する、請求項４６に記載の方法。
  51. 前記患者が癌又は前悪性病変の治療歴を有する、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記医薬組成物が、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される、請求項４５に記載の方法。
  53. 前記投与形態が静脈内注射である、請求項５２に記載の方法。
  54. バイアル中に請求項４２に記載の組成物を含むキット。
  55. 請求項１４に記載の単離されたペプチド及びカーゴ化合物を含む医薬組成物。
  56. 前記単離されたペプチドが前記カーゴ化合物に連結されている、請求項５５に記載の医薬組成物。
  57. 前記カーゴ化合物がタモキシフェンである、請求項５６に記載の医薬組成物。
  58. 前記カーゴ化合物が、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、トキシン、及び薬物からなる群から選択される、請求項５５に記載の医薬組成物。
  59. 前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、請求項５５に記載の医薬組成物。
  60. 前記カーゴ化合物が、Ｘ線ＣＴによって検出可能なＸ線造影剤である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  61. 前記カーゴ化合物がＭＲＩによって検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  62. 前記カーゴ化合物が、超音波造影剤であり、超音波によって検出可能である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  63. 薬学的に好適なキャリアを更に含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
  64. 細胞を請求項５５に記載の医薬組成物と接触させることでカーゴ化合物を前記細胞中に送達することを含む方法。
  65. 請求項５９に記載の医薬組成物を患者に投与することで癌を診断することを含む方法。
  66. 請求項２４に記載の単離されたペプチド及びカーゴ化合物を含む医薬組成物。
  67. 前記単離されたペプチドが前記カーゴ化合物に連結されている、請求項６６に記載の医薬組成物。
  68. 前記カーゴ化合物がタモキシフェンである、請求項６７に記載の医薬組成物。
  69. 前記カーゴ化合物が、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、及び薬物からなる群から選択される、請求項６６に記載の医薬組成物。
  70. 前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、請求項６６に記載の医薬組成物。
  71. 前記カーゴ化合物がＸ線ＣＴによって検出可能なＸ線造影剤である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 前記カーゴ化合物がＭＲＩによって検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  73. 前記カーゴ化合物が、超音波造影剤であり、超音波によって検出可能である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  74. 薬学的に好適なキャリアを更に含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
  75. 細胞を請求項６６に記載の医薬組成物と接触させることでカーゴ化合物を前記細胞中に送達することを含む方法。
  76. 請求項７０に記載の医薬組成物を患者に投与することで癌を診断することを含む方法。
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