JP2012512892A - クプレドキシンを用いて癌を防止する組成物及び方法 - Google Patents

クプレドキシンを用いて癌を防止する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract


本発明は、細胞毒性化合物の優先的移入によって癌細胞を死滅させるかその成長を阻害するための方法及び材料を開示する。細胞毒性化合物の優先的移入は、アズリンのp18及びp28切断型等のクプレドキシンに由来するタンパク質形質導入ドメインを使用することで達成される。

Description

関連出願
本願は、2007年12月14日付で提出された米国特許出願第61/013,709号の優先権を主張する2008年12月15日付で提出された米国特許出願第12/314,703号の一部係属出願である2008年12月18日付で提出された米国特許出願第12/338,480号の一部係属出願であり、米国特許法第119条及び120条に基づきその優先権を主張するものであり;2007年2月8日付で提出された米国特許出願第60/900,098号の優先権を主張する2008年2月8日付で提出された12/028,683号の一部係属出願であり;2005年7月19日付で提出された米国特許出願第60/700,297号の優先権を主張する2006年7月19日付で提出された特許出願第11/488,693号の一部係属出願であり;2004年10月7日付で提出された米国仮特許出願第60/616,782号、及び2005年5月13日付で提出された米国仮特許出願第60/680,500号の優先権を主張する2005年10月6日付で提出された米国特許出願第11/244,105号の一部係属出願である。
技術分野
本発明は、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を含む組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物において前悪性病変の発達、究極的には癌の発達を阻害するための化学予防剤としての、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物の使用に関する。
癌の化学予防では、発癌から浸潤性の癌への進行を逆行、抑制、又は防止(prevent)する天然、合成、又は生物化学的薬剤を使用する。高リスク集団の癌の防止における最近の臨床試験から、化学予防療法が高リスク患者のための現実的な処置であることが示唆されている。化学予防療法は、多源的な場の発癌(multifocal field carcinogenesis)及び多段階発癌という概念に基づく。場の発癌では、組織の場全体が一般的な発癌物質に曝されることで、組織でびまん性の上皮傷害及び変異細胞のクローン増殖が起こる。場全体におけるこれらの遺伝的変異は、場で1又は複数の前悪性病変又は悪性病変が発達する可能性を高める。これらの遺伝的変化及び表現型の変化の段階的な蓄積における多段階発癌。多段階発癌の1又は複数のステップを止めることで癌の発達が阻止又は防止される(非特許文献1参照)。
マウス乳腺臓器培養(MMOC)アッセイを用いて、ホルモンで誘発される乳腺の構造的分化及びDMBAで誘発される腺中の前新生物過形成胞巣状小結節様病変の発達の両方に対する潜在的化学予防剤の阻害効果を評価することができる。若い未交尾動物の乳腺は、インスリン(I)+プロラクチン(P)+アルドステロン(A)存在下で6日間インキュベートすると成熟した腺に分化し得る。これらの腺は妊娠マウスから得られる腺と形態的に類似している。アルドステロンはエストロゲン(E)+プロゲステロン(Pg)で代用することができる。培地にヒドロコルチゾン(H)を含めると、乳腺の機能的分化が刺激される(非特許文献2及び3)。したがって、この培養系で観察されるホルモン誘発性の構造的及び機能的分化は、動物の種々の生理学的段階で観察されるホルモンへの応答を模倣している。
MMOCでは、マウスは癌形成前に顕著な前新生物段階を示す。そのような前新生物病変は、C3Hマウスにおいてマウス乳腺癌ウイルスにより誘発されるか、BALB/cマウスにおいてDMBAにより誘発される。腺を増殖期の3日目と4日目の間に2μg/mlのDMBAに曝し、その後、インスリンのみを含む培地中で2〜3週間腺を退行させると、乳房胞巣状病変(mammary alveolar lesion:MAL)が形成される(非特許文献4及び5)。更に、DMBA誘発乳房病変を含む腺から調製した上皮細胞を同系の宿主に移植すると、乳腺癌が発達する(非特許文献6)。病理学的には、これらの腫瘍は、同じ株のマウスにDMBAを投与した時にインビボで観察されるものと同様のものである(上記文献)。
MMOCにおけるDMBA誘発乳房病変形成は、レチノイド等の種々のクラスの化学予防剤で阻害することができる。これらの化学予防剤には、天然産物に由来する化学予防剤、例えばブラシニン及びレスベラトロール、チオール類、抗酸化剤、オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤、例えばOFMO及びデグエリン、プロスタグランジン合成の阻害剤、Ca調整剤等が含まれる(非特許文献7〜9)。これらの研究は、この臓器培養系が乳癌の発達に対する化合物の有効性を決定する固有のモデルになることを明確に示している。これらの結果はそのような化合物をインビボで投与した場合得られる阻害と密接に関連すると予想することができる。
MMOCは乳管病変(mammary ductal lesion:MDL)の形成も誘発することができる。MDLは、アルドステロン及びヒドロコルチゾンの代わりにエストロゲン及びプロゲステロンを培地に含めることで誘発することができる。卵巣ステロイド存在下での胞巣状構造は非常に小さいが、組織病理切片中に乳管内病変が観察される(非特許文献10)。卵巣ホルモン依存的ER+乳癌に選択的に作用するタモキシフェン等の抗エストロゲン薬はMDL形成を阻害したがMAL形成は阻害しなかった。したがって、従来のMAL誘発プロトコールに加えてこの改変培養モデルを現在MAL及びMOLの両方に対する化学予防剤の効果を評価するために使用することができる。
哺乳動物細胞中へのタンパク質の移入(entry)は多くの場合、一般的に「タンパク質形質導入ドメイン」又はPTDと呼ばれるタンパク質の小セグメントにより行われる。このセグメントは、そのようなタンパク質の哺乳動物細胞中への輸送を促進するための、外来タンパク質に付けたシグナルとして用いることができる。例えば、ヒト線維芽細胞HS68又はマウスリンパ球性白血病L1210細胞中で潜在的抗腫瘍薬としてDNA切断性のメタロポルフィリンの取込みを促進するために、両親媒性ペプチドが用いられる。(非特許文献11)。
膜透過性ペプチド(CPP)又は細胞送達ベクター(CDV)と呼ばれるペプチド、例えばペネトラチン、トランスポータン、Tat(アミノ酸47〜57又は48〜60)、及びモデル両親媒性ペプチドMAPは、短く、両親媒性であり、陽イオン性である、ペプチド及びペプチド誘導体であり、通常、複数のリジン残基及びアルギニン残基を含む(非特許文献12)。これらは、遺伝子治療における細胞毒性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等の種々のカーゴの潜在的な輸送剤又は送達媒体として及び囮ペプチドとして大きな注目を集めている小分子のクラスを形成する(非特許文献13〜19)。
Tsao et al, CA Cancer J Clin 54:150−180(2004) Mehta and Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501(1975) Mehta and Moon, Breast Cancer:Treatment and Prognosis 300, 300(Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986) Hawthorne et al, Pharmaceutical Biology 40:70−74(2002) Mehta et al, Methods in Cell Science 19:19−24(1997) Telang et al, PNAS 76:5886−5890(1979) Jang et al, Science 275:218−220(1997) Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275−1282(2000) Metha et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:212−219(1997) Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103−1106(2001) Chaloin, L. et al. Bioconjugate Chem. 12:691−700(2001) Fischer, P. M., Med Res Rev, 27:755−795(2007) Hallbrink, M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515:101−109(2001) Lindgren, M., et al. Trends Pharmacol. Sci. 21:99−103(2000) Gusarova, et al, J Clin Invest, 117:99−111(2007) Melnick, A., Biochem Soc Trans, 35:802−806(2007) Astriab−Fisher et al, Pharm Res, 19:744−754(2002) El−Andaloussi et al, J Gene Med, 8:1262−1273(2006) Cashman et al, Mol Ther, 6:813−823(2002)
本発明は、細胞に選択的に移入して哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物であり得るペプチドを含む組成物及び方法に関する。
本発明は更に、癌細胞を細胞毒性クプレドキシン接触させることで癌細胞を死滅させることを含む方法であって、細胞毒性クプレドキシンが1又は複数のエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入し、細胞毒性クプレドキシンが配列番号2のC末端のアミノ酸の1又は複数を含むアズリンの切断型である、方法に関する。いくつかの実施形態では、アズリンの切断型は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に由来する。別の実施形態では、アズリンの切断型は配列番号2を含む。更に別の実施形態では、アズリンの切断型は配列番号2からなる。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンはカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に優先的に移入する。別の実施形態では、癌細胞中への細胞毒性クプレドキシンの移入はゴルジ装置に仲介される。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、癌細胞の状態に関係なく癌細胞の細胞膜に接触できるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び/又は受容体に接触する。いくつかの実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸のそれぞれを含み得る。別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸の1又は複数を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、これらのアミノ酸は、配列番号1の位置と同様又は相同な細胞毒性クプレドキシン内の位置に位置し得る。
別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、細胞毒性クプレドキシンは、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
本発明は更に、癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に移入することができ、癌細胞を死滅させることができ、配列番号2のC末端アミノ酸を含む、単離されたペプチドに関する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び/又は受容体に接触する。いくつかの実施形態では、癌細胞中への単離されたペプチドの移入はゴルジ装置により仲介される。別の実施形態では、単離されたペプチドは、緑膿菌(Psuedomonas aeruginosa)に由来する。別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号2を含む。別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号2からなる。更に別の実施形態では、単離されたペプチドは配列番号2のC末端アミノ酸からなる。例えば、単離されたペプチドは、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37配列番号36からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37配列番号36からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
本発明はまた、癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して癌細胞に移入することができ、癌細胞を死滅させることができ、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に見られるアミノ酸の1又は複数を含む、単離されたペプチドに関する。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む。これらの実施形態では、これらのアミノ酸は、配列番号1の位置と同様又は相同な単離されたペプチド内の位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、細胞膜上のアミノ酸、細胞表面ペプチド、及び/又は受容体に接触する。
本発明は更に、上記の単離されたペプチドの1又は複数を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は更に、薬学的に許容されるキャリアを含む。別の実施形態では、薬学的に許容されるキャリアは静脈内投与に適している。
本発明は更に、治療有効量の本発明の医薬組成物の1又は複数を哺乳動物患者に投与することで患者を処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。別の実施形態では、患者は、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。別の実施形態では、癌は、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌から選択される。別の実施形態では、患者は少なくとも1つの高リスク特性を有する。別の実施形態では、患者は前悪性病変を有する。別の実施形態では、患者は癌又は前悪性病変の治療歴を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される。具体的な実施形態では、投与形態は静脈内注射による。
本発明は更に、バイアル中に本発明の医薬組成物の1又は複数を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは更に、活性組成物を患者に投与するための装置を含む。
本発明は更に、カーゴ化合物及び本発明の単離されたペプチドの1又は複数を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドはカーゴ化合物に連結されている。具体的な一実施形態では、カーゴ化合物はタモキシフェンである。別の実施形態では、カーゴ化合物はタンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、及び薬物からなる群から選択される。別の実施形態では、カーゴ化合物は検出可能な物質である。例えば、カーゴ化合物は、X腺CTにより検出可能なX腺造影剤、MRIにより検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤、又は超音波造影剤であり得、超音波により検出される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容されるキャリアを更に含む。
本発明はまた、前述したようにカーゴ化合物及び上記単離されたペプチドの1又は複数を含む医薬組成物に細胞を接触させることでカーゴ化合物を細胞中に送達することを含む方法に関する。
本発明の上記及びその他の態様、利点、及び特徴は添付の図面及び以下の特定の実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
配列の簡単な説明
配列番号1:緑膿菌由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)
配列番号2:p28(緑膿菌のアズリン残基50〜77)のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号3:フォルミジウム・ラミノスム(Phormidium laminosum)由来のプラストシアニンのアミノ酸配列(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly)
配列番号4:鉄酸化細菌由来のラスチシアニンのアミノ酸配列(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys)
配列番号5:アクロモバクター・サイクロクラステス由来のシュードアズリンのアミノ酸配列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)
配列番号6:アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser)
配列番号7:アクロモバクター・キシロソキシダンスssp.デニトリフィカンスI(Achromobacter xylosoxidans ssp. denitriflcans I)由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)
配列番号8:気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp)
配列番号9:メチロモナスsp.J由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu)
配列番号10:髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Z2491由来のアズリンのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)
配列番号11:シュードモナス・フルオレッセン(Pseudomonas fluorescen)由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys)
配列番号12:シュードモナス・クロロラフィス由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys)
配列番号13:ピアス病菌9a5c由来のアズリンのアミノ酸配列(Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly)
配列番号14:キュウリ(Cucumis sativus)由来のステラシアニンのアミノ酸配列(Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)
配列番号15:クロロフレクサス・アウランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)由来のオーラシアニンAのアミノ酸配列(Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn)
配列番号16:クロロフレクサス・アウランティアカス由来のオーラシアニンBのアミノ酸配列(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)
配列番号17:キュウリ由来のキュウリ塩基性タンパク質のアミノ酸配列(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu)
配列番号18:淋菌(Neisseria gonorrhoeae)F62由来のLazのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)
配列番号19:腸炎ビブリオ由来のアズリンのアミノ酸配列(Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys)
配列番号20:クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンBのアミノ酸57〜89のアミノ酸配列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)
配列番号21:シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)のアズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)
配列番号22:髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)のLazのアミノ酸89〜115のアミノ酸配列(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)
配列番号23:腸炎ビブリオのアズリンのアミノ酸52〜78のアミノ酸配列(Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)
配列番号24:気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)のアズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp)
配列番号25:p18(緑膿菌アズリン残基50〜67)のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly)
配列番号26:緑膿菌のアズリンのアミノ酸36〜88のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly)
配列番号27:緑膿菌のアズリンのアミノ酸36〜77のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号28:緑膿菌のアズリンのアミノ酸36〜89のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser)
配列番号29:緑膿菌のアズリンのアミノ酸36〜128のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)
配列番号30:緑膿菌のアズリンのアミノ酸53〜70のアミノ酸配列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)
配列番号31:緑膿菌のアズリンのアミノ酸53〜64のアミノ酸配列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met)
配列番号32:アミノ酸配列DGXXXXXDXXYXKXXD
配列番号33:アミノ酸配列DGXXXXDXXYXKXXD
配列番号34:p18b(緑膿菌アズリン残基60〜77)のアミノ酸配列(Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号35:p28のC末端12アミノ酸(緑膿菌アズリン残基66〜77:p12)の配列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号36:p28のC末端10アミノ酸(緑膿菌アズリン残基68〜77)の配列(Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号37:p28のC末端11アミノ酸(緑膿菌アズリン残基67〜77)の配列(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)
配列番号38はアズリン切断型p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号39はアズリン切断型p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号40はアズリン切断型p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号41は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val Val Gly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu)。
配列番号42は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(アセチル化−Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp−アミド化)。
配列番号43はヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Val Ser Pro Pro Ala Arg)。
配列番号44はヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu)。
配列番号45はヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Phe Ser Phe Phe Ala Phe)。
配列番号46は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys)。
配列番号47は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号48は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号49は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号50は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号51は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号52は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号53は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号54は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号55は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号56は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号57は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号58は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号59は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号60は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号61は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号62は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号63は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号64は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号65は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号66は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号67は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号68は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号69は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号70は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号71は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号72は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号73は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号74は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号75は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
配列番号76は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(X Ser X Ala Ala Asp X Val Val X Asp X Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp X)。
配列番号77は修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(X Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X Asp X Val Val X Asp Ala Ala X Ser X)。
配列番号78はpUC19−azuのプライマーである(5’−CGGGATCCCC GGCAACCTGC CGAAGAACGT CATGGGC−3’)。
配列番号79はpUC19−azuのプライマーである(5’−CGGAATTCGC ATCACTTCAGG GTCAGGG−3’)。
配列番号80はpGST−azu36〜50のプライマーである(5’−GGCCACAACT GGGTACTGTG AACCGCCGCC GACATGCAG−3’)。
配列番号81はpGST−azu36〜50のプライマーである(5’−CTGCATGTCG GCGGCGGTTC ACAGTACCCA GTTGTGGCC−3’)。
配列番号82はpGST−azu36〜77のプライマーである(5’−CCTGAAGCCC GACGACTGAC GTGTCATCGC CCACACC−3’)。
配列番号83はpGST−azu36〜77のプライマーである(5’−GGTGTGGGCG ATGACACGTC AGTCGTCGGG CTTCAGG−3’)
配列番号84はpGST−azu36〜89のプライマーである(5’−CCAAGCTGAT CGGCTCGTGA GAGAAGGACT CGGTGACC−3’)
配列番号85はpGST−azu36〜89のプライマーである(5’−GGTCACCGAG TCCTTCTCTC ACGAGCCGAT CAGCTTGG−3’)。
配列番号86はazu50〜77のプライマーである(5’−CGGGATCCTG AGCACCGCCG CCGACATGCA GGG−3’)。
配列番号87はazu67〜77のプライマーである(5’−CGGGATCCCC GGCCTGGACA AGGATTACCT GAAGCCCG−3’)。
配列番号88はリバースプライマーである(5’−CGGAATTCGC ATCACTTCAG GGTCAGGG−3’)。
配列番号89はpGST−azu−50〜66のプライマーである(5’−GACGGCATGG CTTCCTGACT GGACAAGGAT TACC−3’)。
配列番号90はpGST−azu−50〜66のプライマーである(5’−GGTAATCCTT GTCCA GTCAG GAAGCCATGC CGTC−3’)。
配列番号91はフォワードプライマーである(5’−CGGGATCCCC ATGGTGAGCA AGGGCG−3’)。
配列番号92はリバースプライマーである(5’−CGGAATTCCT TGTACAGCTC GTCCATGCCG−3’)。
配列番号93はpGST−azu50〜77のプライマーである(5’−CCGCTCGAGC CTGAGCACCG CCGCCATGCA GGG−3’)。
配列番号94はpGST−azu50〜77のプライマーである(5’−TTTTCCTTTT GCGGCCGCTC AGTCGTCGGG CTTCAGGTAA TC C−3’)。
配列番号95はポリアルギニン、すなわちArgのアミノ酸配列である(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg)。
配列番号95はp18の一部分のアミノ酸配列である(Ser Gly Leu Asp Lys Asp)。
p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図1Aは、DMBA処置した腺における胞巣状病変の代表的写真及びDMBAと化学予防剤で処置した腺との比較を示す図である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図1B〜1Fは、胞巣状病変の発達に対するp28の効果の代表的写真である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図1B〜1Fは、胞巣状病変の発達に対するp28の効果の代表的写真である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図1B〜1Fは、胞巣状病変の発達に対するp28の効果の代表的写真である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。図1B〜1Fは、胞巣状病変の発達に対するp28の効果の代表的写真である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。 p28及びアズリンの効果について評価した全ての腺の写真である。 DMBA誘発乳腺胞巣状病変に対するp28の有効性を示すグラフである。 腺管病変の代表的切片及びp28の効果を示す写真である。 DMBA誘発腺管病変に対するp28の効果を示すグラフである。 wtアズリン中のαヘリックス及びwtアズリン50〜77タンパク質形質導入ドメイン中のαヘリックスの局在を示すダイアグラムである。プロリン残基によるアズリン50〜77ドメイン中の3個のアミノ酸の置換を示す。 (A)GST−GFP−azu50〜77融合タンパク質の構築を示すダイアグラムである。gst遺伝子の3’末端にgfp遺伝子を導入し(GST−GFPを得るため)、次いで、GST−GFP−azu50〜77融合タンパク質が生成されるようにフレームを合わせてgfp遺伝子の3’末端にazu50〜77断片をライゲーションさせた。細胞可溶化物からGST−GFP−azu50〜77を単一の融合タンパク質として精製した。精製タンパク質をSDS−PAGEにかけ、クーマシーブルー染色(6(B)及び抗アズリン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した(6(C))。 GST−緑色蛍光タンパク質(GFP)及びGST−GFP−アズリン融合タンパク質の内部移行のカイネティクス研究を示すダイアグラムである。種々の濃度のGST−GFP(10(a))又はGST−GFP−azu50〜77(10(b))を用いて37℃で1時間処置したJ774細胞における緑色蛍光をアッセイした。フローサイトメトリーにより1万個の細胞を分析した。(c)GST−GFP−azu50〜77の内部移行の時間依存性。J774細胞を200μg/mlのGST−GFP−azu50〜77と37℃で記載の時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。 (A)前述のGST−GFP融合体と同様にGSTに融合させた外毒素AドメインIII(アミノ酸405〜613)及びドメインIbの一部(アミノ酸381〜404)(GST−PEDIII)を示すダイアグラムである。次いで、PCRを用いてazu50〜77断片をGST−PEDIIIのカルボキシル末端にライゲーションさせた(GST−PEDIII−azu50〜77)。(B)融合タンパク質をグルタチオンセファロース4Bカラムゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製し、SDS−PAGEにかけてサイズを決定した。(C)PEDIIIを介した細胞毒性により決定されるUISO−Mel−2癌細胞及び正常線維芽(FBT)細胞におけるGST−PEDIII−azu50〜77融合タンパク質の作用を示すダイアグラムである。記載されている種々の濃度のGST−PEDIII及びGST−PEDIII−azu50〜77をUISO−Mel−2及びFBT細胞と24時間インキュベートした後、MTTアッセイによって細胞生存率を求めた。 UISO−Mel−2癌細胞及びFBT細胞に対するGST−PEDIII−ラスチシアニン融合タンパク質のPEDIIIを介した細胞毒性を示すダイアグラムである。記載されている種々の濃度のGST−PEDIII及びGST−PEDIII−azu50〜77をUISO−Mel−2及びFBT細胞と24時間インキュベートした後、MTTアッセイによって細胞生存率を求めた。 多様な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドp18及びp28の透過を示す写真である。(A)37℃で2時間後のAlexafluor568標識されたp28又はp18の透過を示す写真である。陽イオン性Arg(配列番号95)を対照として用いた。(B)同じ細胞株中への37℃で2時間後のAlexafluor568標識されたp28又はp18の透過のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。(C)正常細胞の蛍光に対する増加倍率を示すグラフである。4つのメラノーマ細胞株へのp28又はp18の移入を同様に観察した結果、正常細胞からの蛍光に比べて数倍の増加が示された。 癌細胞及び正常細胞中へのazu60〜77(p18b)及びazu66〜77(p12)の移入を示す写真である。細胞をalexafluor568標識されたp18b(A)及びp12(B)と37℃で2時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で画像を記録した。 アズリン及びそのペプチドの細胞膜毒性を示すグラフである。(A)37℃で種々の濃度のp28、p18、及びアズリンに10分間暴露したUISOMel−2細胞のLDH漏出アッセイ。標準可溶化バッファー(cytotox−one試薬)を正の対照として含めた。暴露後の蛍光の変化をλex560nm及びλem590nmで測定した。溶解バッファーを100%LDH放出と定義した。データは正の対照の蛍光に対する%を表す。データは平均値±SEMで表す。(B)p28、p18、及びアズリンとインキュベートしたヒト赤血球からのヘモグロビン漏出。ヒト赤血球をペプチドと37℃で30分間インキュベートし、540nmの吸光度を測定した。0.1%トリトンX−100後のヘモグロビンの放出を100%のヘモグロビン放出と定義した。データは3回の測定の平均値±SEMを表す。 UISO−Mel−2細胞中へのp28及びp18の温度依存的且つ競合的な内部移行を示す写真である。2011MのAlexafluor568標識されたp28(A)及びp18(B)の透過を種々の温度での共焦点顕微鏡法によって評価した。(C)及び(D)非標識ペプチド(200倍過剰量)存在化/非存在下における37℃で30分後のUISO−Mel−2細胞中への5μMのAlexafluor568標識されたp28(C)又はp18(D)の移入の共焦点分析を示す図である。 (A)ヘパリン硫酸(100μg/ml)の存在下/非存在下において37℃で1時間後のUISO−Mel−2細胞中への28、p18(20μM)、及びArg(配列番号95)(10μM)の移入の共焦点分析を示す写真である。 (B)阻害剤存在下におけるp28又はp18の移入のサイトメトリー分析を示すグラフである。阻害剤非存在下における細胞蛍光強度(対照)を100%とみなした。 (C)阻害剤存在下における線維芽細胞中へのp28及びp18の移入のFRCS分析を示すグラフである。 (D)p18及びp28とカベオリンIの共局在を示す写真である(パネル1)。UISO−Mel−2細胞をAlexafluor568標識されたp18又はp28(20μM)又は培地と37℃で2時間インキュベートした。細胞を固定し、抗カベオリン1免疫染色用に処理した。37℃で2時間後のUISO−Mel−2細胞中へのAlexafluor568標識されたp18又はp28(20μM)の移入の抗ゴルジン97抗体による共焦点分析(パネル2)。UISO−Mel−2細胞中におけるAlexafluor568標識されたアズリン、p28、及びp18(赤色)とmitotracker色素(緑色)(パネル3)及びLysotracker色素(緑色)(パネル4)の共局在。細胞は20μMのアズリン、p28、p18、又は培地のみと37℃でインキュベートした。90分インキュベートした後、mitotracker/lysotrackerプローブを添加して細胞を30分間インキュベートした。細胞をDAPI(青色)で対比染色した。アズリン、p28、又はp18の共局在は黄色蛍光として見られる。 種々の濃度のアズリン、p28、又はp18と37℃で72時間インキュベートしたUISO−Mel−2細胞を示すグラフである;MTT(A)、直接細胞計数(B)。対照ウェル中の細胞生存率(MTT)又は細胞数を100%とみなした。データは平均値±SEMを表す。 細胞をタンパク質及び/又はバッファーで処置した後に共焦点顕微鏡で撮影した、細胞による化合物の取込みを示す写真である。(A)ヒト脳腫瘍LN−229細胞を20μMの非標識タンパク質又はPBSバッファーで2時間前処置した後、PBSバッファーで3回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、20μMのAlex568−Pazを37℃で30分間添加した。(B)次いで、LN−229細胞を20μMの非標識タンパク質又はPBSバッファー及び20μMのAlex568−Pazで37℃にて30分間処置した。(C)ヒト脳腫瘍LN−229細胞の別の群を、10μMの非標識タンパク質又はPBSバッファーで2時間前処置した後、PBSバッファーで3回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、10μMのAlex568−Pazを37℃で30分間添加した。(D)次いで、LN−229細胞を10μMの非標識タンパク質又はPBSバッファー及び10μMのAlex568−Pazで37℃にて30分間処置した。(E)ヒト脳腫瘍LN−229細胞を20μMの非標識タンパク質又はPBSバッファー及び20μMのAlex568−Pazで37℃にて30分間処置した。(F)ヒト脳腫瘍LN−229細胞を20μMのAlex568−H.8で37℃にて30分間処置した。(G)ヒト脳腫瘍LN−229細胞を20μMのAlex568−タンパク質で37℃にて30分間処置した。(H)ヒト乳腺癌MCF−7細胞を20μMのAlex568−タンパク質で37℃にて30分間処置した。 細胞へのペプチドの結合及び移入を示すグラフ及びチャートを示す図である。(A)UISO−Mel−2又は線維芽細胞(3×10細胞)をフェノールレッドを含まないMEME培地に懸濁した。Alexafluor568コンジュゲートp28を氷上で10、50、100、150、250、300、及び400μMで30、60、90、及び120秒間を添加することで反応を開始させた。細胞をフローサイトメトリーで分析した。(B)ペプチド濃度(μM)に速度(MFI/秒)をプロットすることでK及びVmaxを計算した。(C)ペプチドの結合及び移入の決定には、Mel2全細胞(50,000細胞/ml)を用い、1000倍過剰量の非標識p28又はアズリンの存在下/非存在下で種々の濃度の(0〜175nM)放射性標識アズリンと37℃で30分間インキュベートし、γ線計数器を用いて細胞ペレットに残った放射活性を計測した。125Iアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン又はp28存在下の放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を求め、スキャッチャード・プロットを作製した。 60μモル濃度のp28色素複合体250μLを注射した後及び対照のPBSを注射した後、(A)24時間目に撮影した、メラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 60μモル濃度のp28色素複合体250μLを注射した後及び対照のPBSを注射した後、(B)48時間目に撮影した、メラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 (C)濃度200μMのp28を注射した24時間後及び48時間後に撮影したメラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 60μモル濃度のp18を注射した(A)17時間後に撮影した、メラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 60μモル濃度のp18を注射した(B)24時間後に撮影した、メラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 60μモル濃度のp18を注射した(C)46時間後に撮影した、メラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。(C)は、p18を注射した46時間後に撮影した心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び脳を含むマウス臓器の写真も示す。 (A)p18、p28、及びarg−8(配列番号95)を60μモル濃度で注射した12時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。(B)p18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した12時間後に撮影した、マウスの脳を含むマウス臓器の写真である。 (A)尾静脈に600μM濃度のp18及びarg−8(配列番号95)を注射した40時間後に撮影したメラノーマMEL−6腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。p18で処置した動物は50万個の細胞を注入したものであり、arg−8(配列番号95)で処置した動物は百万個の細胞を注入したものである。(B)濃度600μMのp18及びarg−8(配列番号95)を注射した40時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 濃度60μMのp28、p18、及びarg−8(配列番号95)を注射した16時間後に撮影したメラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 (B)濃度60μMのp28、p18、及びarg−8(配列番号95)を注射した24時間後に撮影したメラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 メラノーマMEL−23を有するマウスに濃度60μMのp28及びp18色素ペプチド複合体を注射した48時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 MEL−23腫瘍及び臓器を有するマウスに濃度60μMのp28を注射した24時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 濃度60μMのp28及びarg−8(配列番号95)を注射した16時間後に撮影したメラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 濃度60μMのp18を注射した16時間後に撮影したメラノーマMEL−23腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真。 濃度240μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)による高投与量処置の10時間後及び24時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真である。 濃度240μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)による高投与量処置の28時間後に撮影したMCF−7腫瘍及び臓器を有するマウスの側面写真及び背面写真である。濃度240μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)による高投与量処置の28時間後に撮影したMCF−7を有するマウスの臓器の写真も示す。 濃度240μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)による高投与量処置の50時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 HCT−116腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した24時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 (A)HCT−116腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した24時間後に撮影したマウス臓器の写真である。(B)尾静脈に濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した21時間後に撮影したHCT−116腫瘍を有するマウスの側面写真である。 (A)尾静脈に百万個の細胞を注射した47日後に濃度120μMのp28を注射した24時間後のHCT−116を有するマウスの側面写真及び背面写真である。(B)尾静脈に百万個の細胞を注射した47日後に濃度120μM濃度のp28を注射した4時間後のHCT−116を有するマウスから得られたマウス臓器の写真である。 濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した24時間後に撮影したMEL−6マウスの臓器の写真である。 (A)濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)並びに濃度6060μMのarg−8(配列番号95)を注射した22時間後に撮影したMEL−6マウスの側面写真及び背面写真である。(B)濃度120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)並びに濃度60μMのarg−8(配列番号95)で処置した後のMEL−6マウスの臓器の写真である。 (A)濃度60μM及び120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの臓器の写真である。 (B)濃度60μM及び120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの脳の写真を並べたものであり、脳へのp18及びp28の取込みの差を示している。 濃度60μM及び120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した16時間後に撮影した、ドキソルビシン及びp28の実験中のHT−1080マウスの側面写真及び背面写真である。 (A)濃度60μM及び120μMのp28及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの臓器の写真である。 (B)濃度60μM及び120μMのp28及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの脳の写真を並べたものである。 (A)濃度60μM及び120μMのp18及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの臓器の写真である。 (B)濃度60μM及び120μMのp18及びarg−8(配列番号95)で処置した22時間後に撮影したHT−1080マウスの脳の写真を並べたものである。 尾静脈を介して処置した肺転移を有するHT−1080マウスの写真である。(A)3mg/kg ドキソルビシンIP、3回処置;(B)5mg/kg IP p28、毎日処置;(C)PBS対照、PBS IP、毎日処置;(D)10mg/kg IP p28、毎日処置;(E)20mg/kg IP、毎日処置。 (A)1×10個の細胞を尾静脈に注射(43日)し、処置された全マウスが肺転移を有する動物実験において、濃度60μMのp28を尾静脈に注射した24時間後及び26時間後に撮影したHT−1080マウスの臓器の写真である。動物6982は撮影時には死亡していた。 (B)1×10個の細胞を尾静脈に注射(43日)する動物実験において、濃度60μMのp28を尾静脈に注射した22時間後に撮影したHT−1080マウスの側面写真及び背面写真である。動物6982は撮影時には死亡していた。 1×10個の細胞を尾静脈に注射(43日)する動物実験において、濃度60μMのp28を尾静脈に注射した26時間後に撮影したHT−1080マウスの側面写真及び背面写真である。 Balb−Cペプチド実験において濃度60μM及び120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した12時間後に撮影したマウスの臓器(A)及びマウスの背面(B)の写真である。 Balb−Cペプチド実験において濃度60μM及び120μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)で処置した24時間後に撮影したマウスの臓器(A)及びマウスの側面(B)の写真である。 濃度60μMのp18及びarg−8(配列番号95)を尾静脈に注射した16時間後の(50万個の細胞を尾静脈に注射された)MEL−6マウスの側面写真及び背面写真である。 p18及びp28で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 p18及びp28で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 p28、p18、及びarg−8(配列番号95)で処置した24時間後に撮影したMEL−6マウスの臓器の写真である。 (A)濃度60μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した3時間後のMEL−6マウスの側面写真及び背面写真である。 (B)濃度60μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した22時間後に撮影したMEL−6マウスの側面写真及び背面写真並びにMEL−6マウスの臓器の写真である。 (C)濃度60μMのp18、p28、及びarg−8(配列番号95)を注射した24時間後のMEL−6マウスの臓器の写真である。 (A)マウス脳及び(B)マウス臓器へのp18及びp28の取込みを示す図である)。 50万個の細胞を尾静脈にI.V.注射(44日後)した実験において、濃度24μMのp18及びarg−8(配列番号95)を尾静脈に注射した120時間後に撮影したMEL−6マウスの側面写真及び背面写真である。 p18で処置した168時間後に撮影したMEL−6マウスの臓器の写真である。 細胞注射41日後にarg−8(配列番号95)及びp18を注射した72時間後に撮影したMEL−6マウスの側面写真及び背面写真である。 arg−8(配列番号95)及びp18の注射後に撮影したマウスの背面写真である。 arg−8及びp18を注射した3、24,及び48時間後に撮影したマウスの側面写真及び前面写真である。 p28によるヒト乳癌細胞の成長阻害を示すグラフである。MCF−7細胞をp28(0〜200μM)と37℃で24、48、及び72時間インキュベートした。細胞計数(A)及びMTTアッセイ(B)。ドキソルビシン(10μM)を正の対照として用いた。対照のウェルの細胞数又は生存率を100%とみなした。データは対照±SEMの平均%を表す。p<0.05。 p28によるヒト乳癌細胞の成長阻害を示すグラフである。MCF−7細胞をp28(0〜200μM)と37℃で24、48、及び72時間インキュベートした。細胞計数(A)及びMTTアッセイ(B)。ドキソルビシン(10μM)を正の対照として用いた。対照のウェルの細胞数又は生存率を100%とみなした。データは対照±SEMの平均%を表す。p<0.05。 (C)p28によるMCF−7異種移植片の成長阻害。1群当たり最低10頭のマウスを、10、14、21、及び25日目に15μmol/kgのパクリタキセル(i.p)で処置するか、5又は10mg/kgのp28(i.p.)で30日間毎日処置した。バーは平均値±SEMを表す。p<0.05。 (A)及び(B)はp28による乳癌細胞の透過及び細胞周期のFACS分析を示すグラフである。MCF−7細胞(A)及びMDD2細胞(B)をp28(50μM)で48時間及び72時間処置した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、Yamada, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:4770−4775(2004)に記載されているようにフローサイトメトリーで分析した。G期、S期、G/M期、及びsub−G(アポトーシス)期の細胞の割合を示す。(C)は、カバースリップ上でフェノールレッドを含まないMEM中で一晩培養し、20μMのp28又は10μMの陽イオン性(正の対照)ペプチド、オクタアルギニン(Arg)(配列番号95)を用いて37℃で2時間処置したMCF−7細胞及びMDD2細胞を示す写真を含む。赤色−Alexa fluor568標識p28。青色−DAPI(核)。 p28とp53の相互作用を示す図である。(A)〜(D)は、p53及びp28の細胞内レベルを示す写真である。(A)p28とインキュベートした後のMCF−7細胞中の経時的p53レベル。処置直前のp53レベルに対する増加率(%)(0時間を100%とする)。(B)GST−p28とp53の複合体形成を示すGSTプルダウンアッセイ。左から順に、GST−p28(10及び20μg/反応)、GST−MDM2、及びGST単独。抗p53抗体を用いたイムノブロッティング(IB)によりp53を検出した。(C)モル濃度過剰のp28存在下でGST−MDM2はp53をプルダウンした(上)。3種類の異なる抗p53抗体、Pab1801(32〜79アミノ酸)、ab2433(277〜296アミノ酸)、及びPab1802(306〜393アミノ酸)はp28の存在下でGST−p53不動化ビーズと反応した。抗p28抗体を用いたIBによりp28を検出した(下)。(D)p28によるGST−p53への結合に対する、モル濃度過剰のp28断片p12、p18、及びp18bによる競合。結合相対量(p28単独を100%として表した)。M:p28マーカー。(E)p28又はアズリンに暴露した後のMCF−7核抽出物中におけるp53とDNAの結合を示すグラフである。H処置したMCF−7細胞の核抽出物を内部標準とした。p53に対するモノクローナル抗体を用いてp53−オリゴヌクレオチド複合体を定量した。データは3回の実験の平均値±SEMで表す。 p28によるサイクリン(CDK及びCDKI)カスケードの誘導を示す写真である。MCF−7細胞(A)及びMDD2細胞(B)をp28(50μM)に24、48、及び72時間暴露し、イムノブロッティングによりタンパク質レベルを求めた。p21(C)及びサイクリンB1(D)の細胞内局在及び相対レベル。MCF−7細胞をカバースリップ上でp28と72時間培養した。p21及びサイクリンBを対応する特異的抗体で染色した。(E)抗p−cdc2抗体(カリフォルニア州のサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)を用いてリン酸化cdc2を評価した。全ての結果はアクチンを内部標準として標準化した。 タンパク質構造を示す写真である。A)αヘリックス構造を有するアズリン切断型;B)70nsシミュレーションの結果;C)シミュレーションされたCα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。 タンパク質構造を示す写真である。A)αヘリックス構造を有するアズリン切断型;B)70nsシミュレーションの結果;C)シミュレーションされたCα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。 タンパク質構造を示す写真である。A)αヘリックス構造を有するアズリン切断型;B)70nsシミュレーションの結果;C)シミュレーションされたCα原子間の距離に基づくチオエーテルブリッジ位置の測定。
本明細書において、「細胞」という用語は、「単一細胞」と特に記載のない限り、単数及び複数を含む。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義で使用されている。これらの用語は、1又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。また、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語はまた、限定されるものではないがグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ADPリボシル化等の修飾も含む。ポリペプチドは常に完全な直鎖とは限らないと理解される。例えば、ポリペプチドはユビキチン化によって分岐されていてもよく、典型的には天然のプロセシング及び天然には起こらない人為的操作により生じるイベント等の翻訳後のイベントの結果、環状であってもよい(分岐はあってもなくてもよい)。環状、分岐、及び分岐環状のポリペプチドは、翻訳でない天然のプロセス及び完全に合成的な方法によっても合成され得る。
本明細書において、「薬理活性」という用語は、生体系への薬物又はその他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は有益であることもあり(治療的)、有害であることもある(毒性)。純粋な化学物質又は混合物は、天然(植物、動物、又はミネラル)起源であってもよく、合成化合物であってもよい。
本明細書において、「前悪性(premalignant)」という用語は、前癌性(precancerous)、すなわち制御されていない異常な細胞分裂の前を意味する。
本明細書において、「病変」という用語は異常な組織領域を意味する。
本明細書において、「病的状態(pathological condition)」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させ、種々の因子(例えば栄養失調、工業災害、又は気候)、特定の感染体(例えば、虫、寄生原虫、細菌、又はウイルス)、その生物に固有の欠陥(例えば遺伝的異常)、又はこれらの因子の組合せに対する応答である、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
本明細書において、「状態」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させる、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
本明細書において、「罹患している(suffering from)」という用語は、病的状態の症状を現在示していること、観察可能な症状を伴わずに病的状態を有していること、病的状態からの回復中であること、又は病的状態から回復したことを含む。
本明細書において、「化学予防(chemoprevention)」という用語は、癌の発達又は再発のリスク低減、防止、抑制、回復、又は遅延のための、生物学的なものであっても化学的なものであってもよい薬物、ビタミン、又はその他の天然若しくは合成の薬剤の使用である。
本明細書において、「細胞毒性」という用語は、細胞に対して毒性である性質を指す。例えば、「細胞毒性クプレドキシン」とは、癌細胞等の細胞に毒性であるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、又は構造的等価物である。
本明細書において、「処置(treatment)」という用語は、処置される状態に関連する状態又は症状の進行又は重症度を防止、低減、停止、又は逆転させることを含む。したがって、「処置」という用語は、適切な医学的、治療的、及び/又は防止的投与を含む。癌等の状態の発達を防止又は緩和することも処置に含まれ得る。
本明細書において、「細胞成長を阻害する」という用語は、細胞分裂及び/又は細胞増殖を鈍化又は停止させることを意味する。この用語には、細胞発達の阻害又は細胞死の増加も含まれる。
「治療有効量」とは、処置されている対象の特定の状態の発達の防止、低減、停止、若しくは逆転又はその状態に存在する症状の一部又は完全な軽減に有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
本明細書において、「実質的に純粋な」という用語は、本発明のタンパク質又はその他の細胞産物を修飾して用いる場合、例えば、成長培地又は細胞内容物から他のタンパク質及び/又は他の化合物が実質的に含まれない又は混ざっていない形態で単離されたタンパク質を意味する。「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約75%の量の因子を指し、すなわち「75%実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約85%の化合物を指し、すなわち少なくとも「85%実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約95%の化合物を指し、すなわち少なくとも「95%実質的に純粋」であることを指す。「実質的に純粋な」という用語は、例えば合成反応の試薬及び副産物から合成タンパク質を単離した場合に本発明の合成されたタンパク質又は化合物を修飾しても使用され得る。
本明細書において、本発明のペプチド又は化合物に言及する場合の「医薬品グレード(pharmaceutical grade)」という用語は、自然の状態で見られる場合に材料に通常付随する成分(例えば合成試薬及び副産物)から実質的に又は本質的に単離されており、医薬品としての使用の障害となる成分から実質的又は本質的に単離されている、ペプチド又は化合物である。例えば、「医薬品グレード」のペプチドは如何なる発癌物質からも単離されている。場合によっては、「医薬品グレード」という用語は、組成物を患者への静脈内投与に不適切にする如何なる物質からも実質的に又は本質的に単離されたペプチド又は化合物を指定するために、「静脈内用医薬品グレード」のように、意図する投与方法によって修飾され得る。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、SDS等の界面活性剤及びアジド等の抗菌剤から単離されているものであり得る。
「単離された(isolated)」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という用語は、自然の状態で材料に通常不随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明に係る単離ペプチドは、好ましくは、それらのin situの状況でペプチドに通常会合している材料を含まない。ポリペプチドの「単離された」領域とは、その領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、又はその各断片は、限定されるものではないが、ヌクレオチドシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発、並びに核酸断片を得るため及びタンパク質又はタンパク質断片を実質的に純粋な量で得るための発現ベクターへのクローニング等の当業者による操作が可能なように、そのインビボ環境から実質的に取り出されたものである。
本明細書において、ペプチドに関して、「バリアント」という用語は、野生型ポリペチドと比べて置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸を有し得るアミノ酸配列バリアントを指す。バリアントは野生型ペプチドの切断型であってもよい。「欠失」とは、ポリペプチド内からの1又は複数のアミノ酸の除去であり、「切断」は、ポリペプチドの一方又は両方の末端からの1又は複数のアミノ酸の除去である。したがって、バリアントペプチドはポリペプチドをコードする遺伝子を操作することで作製され得る。バリアントは、ポリペプチドの薬理活性の少なくとも一部を変化させずにポリペプチドの基本的な組成又は特徴を変化させることで作製され得る。例えば、アズリンの「バリアント」は、前悪性哺乳動物細胞の発達を阻害する能力を保持する変異アズリンであり得る。場合によっては、バリアントペプチドは、ε−(3,5−ジニトロベンゾイル)−Lys残基等の非天然アミノ酸で合成される(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc, 112:9633−9635(1990))。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて20個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて15個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて10個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて6個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて5個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて3個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。別の実施形態では、バリアントは本明細書に開示されている方法及び技術を用いて作製される。
本明細書において、「アミノ酸」という用語は、任意の天然又は非天然又は合成のアミノ酸残基を含む、アミノ酸部分、すなわち、1、2、3、又はそれ以上の炭素原子、典型的には1個の(α)炭素原子、で直接連結された少なくとも1つのカルボキシル残基と少なくとも1つのアミノ残基とを含む任意の部分を意味する。
本明細書において、ペプチドに関して、「誘導体(derivative)」という用語は、対象のペプチドに由来するペプチドを指す。誘導は、ペプチドの基本的活性の一部が保持されるようなペプチドの化学的修飾を含む。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳動物細胞において血管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないがペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール(PEG)修飾、リン酸化、若しくはグリコシル化、又は本明細書に開示のその他の方法及び技術が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、ポリペプチド又はその断片と、限定されるものではないが、例えば別のペプチド、薬物分子、又はその他の治療薬剤若しくは医薬品又は検出可能なプローブ等の化学物質との融合体であってもよい。
「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」という用語は、ポリペプチドと候補配列を整列させた時に候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ポリペプチド中のアミノ酸残基の割合と定義される。%アミノ酸同一性を決定するには、配列を整列させ、必要に応じて最大の%配列同一性を得るためにギャップを導入する。保存的置換は配列同一性の一部とみなさない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント手順は当業者に周知である。多くの場合、ペプチド配列の整列にはBLAST、BLAST2、ALIGN2、又はMegalign(DNASTAR社製)ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアが用いられる。特定の実施形態では、Blastp(メリーランド州ベセスダの国立バイオテクノロジー情報センターから利用可能)を、long complexity filter、expect 10、word size 3、existence 11、及びextension 1のデフォルトのパラメータで用いる。
アミノ酸配列を整列させる場合、所与のアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Aの%アミノ酸配列同一性(所与のアミノ酸配列Aが所与のアミノ酸配列Bと、又はそれに対して、特定の%アミノ酸配列同一性を有するとも表現できる)は、
%アミノ酸配列同一性=X/Y*100
(式中、
Xは、配列整列用のプログラム又はアルゴリズムによるA及びBの整列により同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、
Yは、B中のアミノ酸残基の合計数である)として計算することができる。
アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくない。長い配列を短い配列と比較する場合、短い方の配列を「B」の配列とする。例えば、切断型ペプチドを対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、切断型ペプチドを「B」の配列とする。
概略
いくつかの実施形態では、本発明は、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物と、哺乳動物において癌の発達を防止する方法とを提供する。別の実施形態では、本発明は、癌細胞等の哺乳動物細胞に優先的に移入する、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物を提供する。別の実施形態は、哺乳動物における癌の発達又は癌の再発を防止する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を提供する。特定の実施形態は、緑膿菌のアズリン、アズリンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物を含む組成物並びに患者、特に一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者を処置するためのその使用を提供する。
本発明の別の実施形態は、癌細胞を直接及び/又は優先的に透過する方法を含む。本発明の別の実施形態は、癌及び正常細胞を直接及び/又は優先的に透過してその中で化学予防効果を発揮する方法を含む。別の実施形態は、治療化合物を癌細胞に優先的に送達する方法を提供する。最後に、本発明は、前悪性病変を誘発する前又は後に細胞をクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物に接触させて前悪性及び/又は悪性細胞の発達を観察することにより哺乳動物の細胞、組織、及び動物体内における癌の発達を研究する方法を提供する。更に別の実施形態は本明細書中の開示から明らかであろう。
細胞への優先的移入
以前から、緑膿菌により産生される酸化還元タンパク質であるクプレドキシンのアズリンは、正常な細胞には移入しないがJ774肺癌細胞に選択的に移入してアポトーシスを誘導することが知られていた(Zaborina et al, Microbiology 146:2521−2530(2000))。アズリンはヒトメラノーマUISO−Mel−2又はヒト乳癌MCF−7細胞に選択的に移入してこれを死滅させることもできる(Yamada et al., PNAS 99:14098−14103(2002);Punj et al, Oncogene 23:2367−2378(2004))。緑膿菌のアズリンは、J774マウス細網細胞肉腫細胞に優先的に移入し、腫瘍抑制因子タンパク質p53と複合体を形成してこれを安定化し、p53の細胞内濃度を上昇させ、アポトーシスを誘導する(Yamada et al, Infection and Immunity 70:7054−7062(2002))。アズリン分子の種々のドメインの詳細な研究により、アミノ酸50〜77(p28)(配列番号2)が内部移行及びその後のアポトーシス活性に必須なタンパク質形質導入ドメイン(PTD)を有することが示された(Yamada et al, Cell. Microbial. 7:1418−1431(2005)。
現在、アズリン及びp28、p18等のアズリンに由来するペプチドは化学予防特性を有することが知られている。現在、アズリン及びその誘導体p28は、マウス乳腺臓器培養において、前悪性・前新生物性病変の形成を防止することが知られている。マウス乳腺臓器培養モデルでは、50μg/mlのアズリンが胞巣状病変の形成を67%阻害することが分かっている。同様に、25μg/mlのp28も胞巣状病変の形成を67%阻害することが分かっている(実施例1参照)。更に、50μg/mlのアズリンは腺管病変の形成を79%阻害し、25μg/mlのp28は腺管病変の形成を71%阻害することが分かっている(実施例1参照)。共焦点顕微鏡法及びFACにより、アズリン及びp28が正常なマウス乳腺上皮細胞(MM3MG)及び乳癌細胞(4T1)に移入することが示されている。p28は、温度、時間、及び濃度に依存して、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にも移入し、マトリゲル(登録商標)上にプレーティングされたHUVECの毛細管形成を用量依存的に阻害した。共焦点顕微鏡法及びFACはまた、ヒトメラノーマ細胞株(Mel−2、7、29)、乳腺細胞株(MCF−7)、卵巣細胞株(SK−OV3)、膵臓細胞株(CAPAN−2)、膠芽腫細胞株(LN−229)、アストロサイトーマ細胞株(CCF−STTG1)、前立腺細胞株(LN−CAP)、及び腎臓細胞株(ACHN−CRL1611)にp18が選択的に移入することも示した。更に、メラノーマ腫瘍を異種移植した胸腺欠損マウスにおいて赤外色素(λem800nm)標識p18をイメージングしたところ、原発性皮下腫瘍(primary s.c. tumor)で選択的に取り込まれること及び正常な臓器及び組織に蓄積せず遠隔臓器に転移することが明確に示された。したがって、現在、アズリン及びアズリンのバリアントが前悪性・前新生物性病変の形成阻害、したがって、癌、特に哺乳動物患者の乳癌の発達を阻害するために使用され得ることが知られている。
放射線療法、化学療法等の標準的な癌の処置方法では、癌細胞のDNAに損傷を与える。正常なDNA損傷への細胞応答には、DNA修復の活性化、細胞周期の停止、及び致死が含まれる(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row,1988)。例えば、DNA二本鎖の破壊を誘導すると、欠失、二動原体染色体、環、及び分裂後期のブリッジを含む致死的な染色体異常が生じる(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row,1994)。本発明のペプチドは腫瘍及び種々の癌細胞に選択的に取り込まれるため、これらのペプチド(例えば一実施形態ではp18)は、腫瘍及び癌細胞中に材料を導入するための非ウイルスベクターとして使用され得る。例えば、本発明のペプチドは、DNA又はRNA断片を癌細胞に導入することで腫瘍又は癌細胞に治療的DNA又はRNA断片処置を提供するために使用され得る。
タンパク質形質導入ドメイン(PTD)は、その構造的特徴、陽イオン残基、又は両親媒性αヘリックスに基づいて2つのグループを形成する。ただし、両方のクラスに分類されるものもある。一般的に、陽イオン性ペプチドは、負に帯電した表面糖タンパク質に結合することで原核種及び真核種の細胞膜と最初に相互作用し、幅広い正常細胞株及び悪性細胞株への効率的な移入を促進している(Kondejewski, L.H., et al, J Biol Chem 277:67−74(2002);Fuchs, S.M. and Raines, R.T., Biochemistry, 43:2438−2444(2004))。陽イオンペプチドがHSに結合することは、それらがHSへのそれらの親和性が高い(Kd−109nM)ことと一致し、この値は以下の実施例中でアズリン、p18、及びp28に対して報告されているよりも十分高い(Tran, D. et al, Proc Natl Acad Sci USA 84:7957−7961(1987))。
アズリン及びそれに由来するペプチド(例えばp28及びp18)は、癌細胞に優先的に移入して細胞分裂抑制及び細胞毒性メカニズムを介してその増殖を阻害するという固有の特性を有する。酸化還元タンパク質は、通常、細胞透過性ペプチド(CPP)又は抗増殖剤に分類されない。アズリン、p28、及びp18の移入は陽イオン性CPPの移入とは別個のものであると考えられる。両親媒性アズリン断片p18及びp28は、アズリンの54〜67アミノ酸のαヘリックス構造及び部分的βシート構造を含む。多様な組織起源の癌の進行及び転移の変化にインテグリン及びカドヘリンを含む複数の細胞表面受容体の異常なN−グリコシル化が関連していることから、アズリン、p18、及びp28の透過初期段階におけるまだ知られていないN−グリコシル化細胞表面タンパク質の役割が示唆されている(Partridge, E.A., et al, Science 306:120−124(2004);Seales, E.C., et al, Cancer Res 65:4645−4652(2005))。
エンドサイトーシス成分の細胞透過を補助する陽イオン性CPPの温度依存的移入がアズリン及びアズリンのアミノ酸断片50〜77(p28)の移入に反映されている(Yamada, T., et al, Cell Microbiol 7:1418−1431(2005))。正常細胞及び悪性細胞へのアズリンのアミノ酸50〜67(p18)の移入はp28よりも速いようである。p18の方がKが低く、Vmaxが高いことから、アズリンのアミノ酸50〜67はリン脂質膜と会合した時にアズリンの実際のPTDにより近い両親媒性構造を形成することが示唆される。しかし、エネルギー依存的エンドサイトーシスプロセス及びポアに関連するプロセスがこれらのペプチドが利用可能な唯一の移入メカニズムではなさそうである。例えば、陽イオン性ペプチドの移入を阻害し且つ代謝及び膜電位を阻害する、アジ化ナトリウム及びウアバイン(NaATPase阻害剤)は、UISO−Mel−2細胞又は線維芽細胞へのp18又はp28の移入を阻害しなかった(図14B、C)。このことは、いずれのペプチドも直接細胞膜を透過し得ることを示している。
他の陽イオン性CPPの細胞透過に推定される経路、すなわちマクロピノサイトーシス、後期エンドソームへの分配又はアクチンフィラメント若しくは微小管に沿ったリソソームへの分配、及び特定の細胞周期段階での透過、とは異なる透過経路をアズリン由来ペプチドは通常使用している。なぜなら、これらの経路のそれぞれの阻害剤単独では効果がなかったからである(図14B、C)。p18、p28、及びアズリンは、ダイナミン非依存性のクラスリン依存性キャリアを介した様式で、形質膜を透過して、カベオラに結合した後期エンドソーム、リソソーム、及びゴルジに達する(Kirkham, M. and Parton, R.G., Biochem Biophys Acta 1746:349−363(2005))。ノコダゾールによる透過の顕著な阻害と、アクチンフィラメントを破壊するサイトカラシンDによる阻害の相対的欠如は、カベオラを介した移入を示している(上記文献)。この移入経路は、不可欠な細胞表面成分及び一見異なる分子、すなわちデキストラン及び様々な病原体又はその生産物によるものが説明されており、これらは古典的エンドサイトーシス経路を回避するためにカベオラも利用する。β−メチルシクロデキストラン、フィリピン、又はナイスタチンを用いて形質膜からコレステロールを除去することで、膜成分を隔てる液体プラットフォームを提供し且つ膜を区分する形質膜ドメインである脂質ラフトを破壊すると、p18及びp28のUISO−Mel−2細胞及び線維芽細胞中への透過が有意に阻害され(それぞれ50%及び約60%;それぞれ35%及び42%)、このことはかなりの割合(約60%)のp18及びp28がカベオラを介して形質膜を透過することを示している。カベオラは、シグナル伝達の制御因子として機能するカベオリンに特有のタンパク質(カベオリン−1、−2、又は−3)の存在により規定される形質膜の脂質ラフト陥入部の50〜100nmのオメガ型サブセットである。
ブレフェルジンAはゴルジ装置を破壊し、p18の蓄積を阻害する。したがって、この経路及びゴルジ装置もp18及びp28の移入及び細胞内輸送に利用されている。カベオラを介したp18及びp28の細胞透過は、N−グリコシル化阻害剤がUISO−Mel−2細胞への細胞移入を約60%低下させ、線維芽細胞への細胞移入をそれぞれ25%及び35%低下させるという証拠と一致している。p18及びp28の移入のパーセンタイルの差は癌細胞と正常細胞におけるN−グリコシル化膜構造の数及びこのメカニズムを介したp28及びp18の相対的移入経路に関連している(図14B、C)。
アズリン、p28、及びp18は全て、多くの他の潜在的抗癌ペプチドよりも高い親和性及び高い容量で癌細胞に結合する。結合後、このタンパク質/受容体複合体はカベオラ中に局在し、内部移行し、最終的に(カベオソームを介して)ゴルジ、ER、及び核に移行する。カベオラを介した移入に加えて、カイネティクス解析はp28及びp18が非クラスリン・カベオラ介在性プロセスによる形質膜透過も示している。例えばインターロイキン2受容体及び特定のグリコシル−ホスファチジルイノシトール(GPI)固定タンパクの構成的内部移行メカニズムとして、クラスリン及びカベオリン非依存性経路が存在する(Lamaze, C, et al, Mol Cell 7:661−671(2001);Sabharanjak, S., et al, Dev Cell, 2:411−423(2002))。病原体は細胞に侵入するためにクラスリン及びカベオリン非依存性エンドサイトーシスも利用しており、これは、マウスポリオーマウイルスの場合のように単独であってもよく、インフルエンザウイルスの場合のように従来の経路と併用されることもある(Ewers, H., et al, Proc Natl Acad Sci USA 102:15110−15115(2005);Sieczkarski, S.B. and Whittaker, G.R., J Virol, 76:10455−10464(2002))。癌細胞で正常細胞よりもカベオリン−1の発現が増加していることが癌細胞中にアズリン、p28、及びp18が優先的に移入するための唯一の基礎ではないと思われる。線維芽細胞及び複数のその他の正常細胞もその表面にかなりの数のカベオラを有する。
実施例18〜24は、p18(アズリンのアミノ酸50〜67)及びp28(アズリンのアミノ酸50〜77)が、エンドサイトーシス経路、カベオソームに向かう経路、及びカベオソーム非依存経路により癌細胞を優先的に透過することを示している。p18及びp28の細胞透過は、癌細胞への選択性において現在の全てのCPPに対して特徴的である。驚くべきことに、p28のC末端10〜12アミノ酸(配列番号35、36、及び37)は、細胞周期阻害及びアポトーシス活性/細胞毒性に主に関与するドメインを含んでいる。更に、この同じドメインは、細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に最も接触し易く、したがって、移入しやすい;特に、アズリンのアミノ酸69、70、75、76、及び85は細胞膜との接触を提供する。ペプチド鎖中の同じ位置又はアズリンのアミノ酸69、70、75、76、及び85と同様若しくは同等なペプチド鎖中の位置に同じアミノ酸又は同様な構造のアミノ酸を有するペプチドは、特定の細胞膜残基に接触して細胞に移入する同じ又は同様な活性を有するはずである。内部移行した後、p28は最初に細胞分裂停止メカニズムを介して癌細胞の増殖を阻害する。したがって、p18及びp28はそれぞれ、ヒト癌細胞へのアズリンの優先的移入並びにヒト癌細胞上でのアズリンの抗増殖活性及び細胞毒性活性がかなり高いことの原因である。
p18及びp28は、癌細胞に移入することに加え、実施例31に開示の方法を用いて得られた図16〜53に示すように、腫瘍及び哺乳動物の臓器に移入することができる。驚くべきことに、p18及びp28は、例えば図20A、20B、21B、23、24、28、30、31A、32B、33、34B、35A〜B、37A〜C、38A〜C、40A、42A、43A、45A〜D、46、47B、48A〜B、及び50に示されるように、血液脳関門を透過して哺乳動物の脳に移入することもできる。
本発明のペプチドは、DNA又はRNA断片等のその他の分子又は化合物を哺乳動物の癌細胞に導入するために使用することができる。以下に、非限定的な例示的技術及び/又は連結された分子の哺乳動物癌細胞中への移入を容易化する本発明のペプチド(例えば一実施形態ではp18)を用いて導入できる特定のDNA若しくはRNA断片を記載する。例えば、細胞に優先的に移入し得る本発明の化合物は、遺伝子治療、RNAiアプローチ、造血遺伝子導入、相同組換え、リボザイム技術、アンチセンス技術、腫瘍免疫療法及び腫瘍抑制因子、探索医療、アンチジーン治療(アンチセンス、siRNA、及びリボザイム)、アポトーシス、免疫学及び免疫療法、DNAの合成及び修復と共に使用され得る。
遺伝子治療では、腫瘍抑制因子又はアポトーシス誘導因子等の異種遺伝子をその遺伝子の発現に適した条件下で癌細胞に導入する。発現した遺伝子産物は、腫瘍細胞の成長を鈍化させるか、その転移能を阻害するか、それを完全に死滅させることにより、腫瘍細胞に有益な効果を与える。歴史的に、癌遺伝子治療の臨床的有効性は、1)腫瘍内での治療遺伝子発現の制御の欠如及び2)腫瘍へのベクターの選択的ターゲティング、により限定されてきた。本発明の化合物は腫瘍細胞の選択的ターゲティングに取り組む。更に、遺伝子発現を制御するための複数の戦略が提唱されている。戦略の1つは、治療遺伝子を制御するプロモーターが腫瘍選択的転写因子により活性化される転写ターゲティング(transcriptional targeting)である。例としては、乳癌におけるMUC−1プロモーター及び結腸癌におけるCEAプロモーターの使用が含まれる(Kurihara et al, ”Selectivity of a replication−component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen,” J Clin. Invest. 106(6): 763−771, 2000;Konishi et al, ”Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen−producing adenocarcinoma,” J Med. Sci, 48(3):79−89, 1999)。
アンチセンス技術は、選択された遺伝子によって発現されるmRNAに全体的に相補的な核酸分子の細胞への導入に基づく。アンチセンス分子は、典型的には、mRNA分子の翻訳を抑制し、その遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を妨げる。アンチセンス技術の改変例では、遺伝子のDNAにアンチセンス分子が結合して三重らせんを形成することで選択された遺伝子の転写が妨げられ得る。本発明に従って使用することができる特定のアンチセンス薬物の1つはG3139(オブリメルセンとしても知られる;マサチューセッツ州レキシントンのゲンタ社(GENTA, Inc.)製)である。使用できる別の特定のアンチセンス分子はG4460(ニュージャージー州バークレーハイツのゲンタ社が製造しているc−mybアンチセンスとしても知られる)である。
RNA干渉(RNAi)に基づく分子も本発明のペプチドに付加することができる。RNAiは通常、二本鎖RNA(「dsRNA」)、低分子ヘアピン型RNA(「shRNA」)、又は同様な特徴を有するその他の核酸分子により仲介される。これらの核酸分子は、ダイサー、ドローシャ等の細胞酵素によりプロセシング又は切断されて小片にされる。次いで、より小さい核酸分子断片が、mRNAの分解を仲介するタンパク質複合体(RISC複合体)によって取り込まれ得る。RISC複合体は、取り込んだ核酸分子と相補的塩基対を形成するmRNAを分解する。このようにしてmRNAが特異的に破壊されることで、コードされているタンパク質の合成が防止される。
リボザイム技術は、標的RNA分子に結合して選択的切断を触媒するRNA分子を発現する核酸分子の細胞への導入に基づく。標的RNA分子は通常mRNA分子であるが、例えばレトロウイルスRNA分子であることもある。
2つの遺伝子不活化(各アレルに1つの不活化)を必要とする相同組換えによる標的遺伝子欠失も本発明と用いることができる戦略である。
本発明の化合物につなげて送達される特定の治療は、癌の発達に必須なタンパク質の発現を制御できる癌特異的転写複合体(CSTC)を標的にしてもよい。例えば、CSTCを標的にした癌治療に関する教示は、参照により本願に援用する米国特許出願第2008/0027002号を参照されたい。
クプレドキシン類は構造類似性の程度が高いため、アズリン以外のクプレドキシン及びその切断型も非エンドサイトーシス経路及びエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入することができ、更に哺乳動物の前悪性病変形成を阻害することができると考えられる。そのようなクプレドキシンは、例えば細菌又は植物に見られ得る。複数のクプレドキシンが緑膿菌のアズリンと同様な薬理活性を有することが知られている。例えば、鉄酸化細菌のラスチシアニン(配列番号4)もマクロファージに移入してアポトーシスを誘導することができる(Yamada et al., Cell Cycle 3:1182−1187(2004);Yamada et al, Cell. Micro. 7:1418−1431(2005)。フォルミジウム・ラミノスム(Phormidium laminosum)のプラストシアニン(配列番号3)及びアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン(配列番号5)もマクロファージに対して細胞毒性である(2006年2月23日に公開された米国特許公開第20060040269号)。したがって、他のクプレドキシンも本発明の組成物及び方法に使用され得ると考えられる。更に、哺乳動物の癌形成を阻害する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物も本発明の組成物及び方法に使用され得る。これらのバリアント及び誘導体としては、限定されるものではないが、クプレドキシンの切断型、アミノ酸の保存的置換、及び本明細書に記載のタンパク質修飾、例えば、限定されるものではないがPEG化及びαヘリックスの全炭化水素安定化(all−hydrocarbon stabling)等が含まれ得る。
p53を介した化学予防
アズリンのアミノ酸50〜77(p28、配列番号2)とp53の相互作用を研究し、後述する実施例26〜30に記載した。本明細書に開示しているように、p28はヒト乳癌細胞を透過し、抗増殖効果を発揮する。これは、ストレスに応答して機能的に活性になり細胞周期の停止又は細胞死を引き起こす腫瘍抑制因子タンパク質であるp53に仲介される。一連のGSTプルダウンアッセイ、グリセロール勾配遠心、微小熱量測定実験、単一分子力分光法、及びコンピュータモデリングを用いた実験は、アズリンがp53のN末端又はDNA結合ドメインのいずれかの内部に結合してその細胞内レベルを上昇させることを示している。本明細書の実施例26〜30及び図54〜57に開示の結果から、p28が結合する部位はp53のN末端及びDNA結合ドメインであるアミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、又は297〜305内に限定される。
p53へのアズリン結合ドメインがアズリンのMet44及びMet64により示される疎水性パッチを含むという示唆が、疎水性パッチを破壊した変異体(変異アズリンM44KM64E)がwtアズリンよりもヒトメラノーマ(Mel−2)細胞への細胞毒性が低いことから裏付けられた。このことは、アズリン分子のp53結合ドメインが疎水性パッチ周辺であることを示している。最近のドッキングシミュレーション研究により、変異複合体では野生型アズリンと比べて約75kJ/molの相互作用自由エネルギーの顕著な消失が示されており、このことも、Met44及びMet64残基周辺のアズリンの疎水性パッチがp53との相互作用に重要であることを示している。Met64残基がp28のp53結合部位内に存在すること(p28のアミノ酸15)、競合アッセイ、変異体実験、及びドッキング実験は、これがp53に結合するアズリンのドメインであることを明確に示している。
腫瘍抑制因子タンパク質p53は、細胞周期進行の阻害剤である21kDaタンパク質p21/Waf1/Cip1を含む多くの遺伝子の転写制御因子として作用する主に核に存在するタンパク質である。MCF−7細胞をp28で処理すると、p53のレベルが上昇し、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)活性(特にそれぞれG及びG/M期の細胞周期進行を制御するcdc2及びCDK2)の強力な阻害剤であるp21の細胞内レベルが高くなる。G/M期の進行では、cdc2キナーゼ及びCDK2キナーゼがそれぞれサイクリンB及びサイクリンAと会合して主に活性化される。CDK阻害剤p21はG/M停止細胞中でサイクリンAと効率的に会合するが、同じ条件下でサイクリンB1はp21と会合せず、サイクリンB1のレベルは連続的に上昇する。これは、MCF−7細胞でp28により誘導されるG/Mでの停止がCDK2及びサイクリンAの阻害に関連していることを示している(図57A)。
MCF−7細胞においてp28により誘導されるp21の増加は、Cip/Kip CDKIファミリーの別の一員であるp27の時間依存的な増加も伴う。Hsu et al., 2008は最近、p53を導入するとルシフェラーゼアッセイにより測定されるp21及びp27の両方のプロモーター活性が上昇することを実証した(Cellular and Molecular Life Sciences(CMLS),2008)。更に、p21及びp27のプロモーターのp53DNA結合活性はp53誘導因子プロゲステロンにより活性化され、このことは、p21だけでなくp27もp53により転写制御されることを意味する。総合すると、データは、p28によるp53レベルの増加が、その後、p21及びp27をアップレギュレートし、それによって、MCF−7細胞において細胞内のCDK2レベル及びサイクリンAレベルの顕著な低下及びG/Mでの細胞周期停止が誘導されることを示している(図57A)。サイクリンB1とp21の間では会合がない又は非効率的であるという報告から、p28暴露後のサイクリンB/cdc2活性の上昇が、p28により誘導されるp21の増加と同様なパターンを反映している可能性が示唆される。p28暴露後にサイクリンB1の細胞内レベル上昇に伴いリン酸化cdc2(不活性型)が増加することから、cdc2−サイクリンB複合体の増加がcdc2リン酸化の増加に反映されていることが示唆される。高レベルの細胞質サイクリンB1を伴うMCF−7及びMDA−MB−468ヒト乳癌細胞での同様なGでの停止が、公知の微小管破壊剤であり且つp21の転写翻訳活性化因子であるノコダゾールで誘導される。オールトランスレチノイン酸(ATRA)、及び酪酸ナトリウム(SB)等の分化誘導物質は、口腔扁平上皮癌細胞において同様な成長阻害及びG停止現象を生じ、この現象はG期の細胞周期調節タンパク質であるCDK6、p21、及びp27の誘導並びにG期の細胞周期調節タンパク質であるCDK2の阻害に関連する。p28はMDD2細胞でp21を増加させず、これらの細胞にはp27が存在しないようであるため、CDK2及びサイクリンAのレベルは有意に変化せず(図57B)、細胞周期の阻害も起こらなかった。ヒト細胞におけるcdc2活性の主要な制御因子であるCDK2とサイクリンAの複合体の減少がp28で誘導されることでG及びG/Mでの停止が引き起こされていることの更なる証拠は、CDK2−サイクリンA複合体を不活性化してG/Mで細胞周期を停止させるサイクリンAのRNAiをHeLa細胞に導入した後に起こるGの遅れである。
p21、p27等のCip/Kipファミリータンパク質はサイクリンA依存性CDK2の強力な阻害剤であるが、これらはサイクリンD依存性キナーゼの正の制御因子としても作用する。Cip/Kipファミリータンパク質はCDK4及びCDK6を安定化する。CDK4は、乳房、神経膠腫、肉腫、子宮頸癌等の幅広い腫瘍で増幅及び過剰発現され、一方、CDK6遺伝子は、扁平細胞癌、神経膠腫、リンパ腫瘍等の特定の種類の悪性腫瘍で増幅される。CDK6の初期レベル又は制御レベルはCDK4よりも低いが、p28に曝したMCF−7細胞ではCDK4レベルは連続的に上昇しないがCDK6レベルは連続的に上昇する。ここでも、p28に応答してp53及びp21が増加しなかったMDD2細胞中ではCDK4及びCDK6は何ら変化しなかった(図57B)。Ink4グループであるCDKIのp16Ink4a、p15Ink4b、p18Ink4c、及びp19Ink4dは、Gでの細胞周期進行を制御するCDK4及びCDK6に特異的に会合してこれを阻害する。MCF−7細胞中ではp16Ink4a遺伝子がホモで欠失しているので、Ink4 CDKIタンパク質はCDK4よりもCDK6に対して少ない阻害効果を示すと考えられ、これは、実質的に安定なCDK4レベル存在下においてCDK6で観察されるCDK6の増加の理論的根拠となる。
総合すると、これらの結果は、p28がp53に結合してp53レベルが上昇し、これがその後p21及びp27によるCDK2−サイクリンA複合体の不活性化を介して抗増殖活性を増幅し、インビトロでMCF−7乳癌細胞においてG/M細胞周期停止及び胸腺欠損マウスにおけるMCF−7異種移植片の成長阻害を引き起こすことを示している。
本発明の組成物
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の態様では、本発明は更に、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌の発達を阻害するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号35、配列番号36、又は配列番号37等のp28(配列番号2)のC末端を含む。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸の1又は複数を含む。
本発明のいくつかの実施形態は更に、癌細胞に優先的に移入するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、カベオラ介在性経路及びゴルジ介在性経路を含むエンドサイトーシス経路により細胞に優先的に移入してその中で化学予防効果を有するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物であるペプチドを提供する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号35、配列番号36、又は配列番号37等のp28のC末端を含む又はからなる。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸の1又は複数を含む。別の実施形態では、ペプチドは、アズリンの同じ又は同様な位置に配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは単離されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは実質的に純粋であるか医薬品グレードである。別の実施形態では、ペプチドは、ペプチドを含む又はから本質的になる組成物中にある。別の特定の実施形態では、ペプチドは非抗原性であり、哺乳動物において、より具体的にはヒトにおいて、免疫応答を惹起しない。いくつかの実施形態では、ペプチドは全長クプレドキシンより短く、クプレドキシンの薬理活性の一部を保持している。具体的には、いくつかの実施形態では、ペプチドはマウス乳腺臓器培養において前悪性病変の発達を阻害する能力を保持し得る。別の実施形態では、ペプチドは、例えばカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して、細胞に直接且つ優先的に移入する能力を保持している。別の実施形態では、ペプチドは、細胞に直接且つ優先的に移入してその中で化学予防効果を発揮する能力を保持している。
別の態様では、本発明は、癌細胞に優先的に移入できるクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物である少なくとも1つのペプチドを含む、特に医薬組成物中の組成物も提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の投与形態用に設計され、投与形態としては、例えば経口、腹腔内、又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、水和していてもよく、(例えば凍結乾燥により)乾燥されていて、後で水和されてもよい。そのような組成物は、水以外の溶媒中、例えば限定されるものではないがアルコール中にあってもよい。
本発明の特定の実施形態はまた、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び/又は腫瘍に優先的に移入するクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、又は構造的等価物であるペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号35又は配列番号36等のp28のC末端である。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号25で表されるp18である。いくつかの実施形態では、ペプチドはp18のバリアント、誘導体、又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、組成物はDNA又はRNAに結合したp18である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは送達後に治療効果を発揮する。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号2で表されるp28である。いくつかの実施形態では、ペプチドはp28のバリアント、誘導体、又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、組成物はDNA又はRNAに結合したp28である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは送達後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン類は構想的相同性が高いので、クプレドキシン類はアズリン及びp28と同じ化学予防特性を有すると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、又はLazであるが、これらに限定されるものではない。特に特定の実施形態では、アズリンは、緑膿菌、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、アクロモバクター・キシロソキシダンスssp.デニトリフィカンスI(Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、メチロモナスsp.(Methylomonas sp.)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhea)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、ピアス病菌(Xylella fastidiosa)、ウルバ・ペルツシス(Ulva pertussis)、又は腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)に由来する。一実施形態では、アズリンは緑膿菌に由来する。別の特定の実施形態では、クプレドキシンは配列番号1及び3〜19のアミノ酸配列を含む。
本発明の態様は、野生型クプレドキシンと比べてアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されているアミノ酸配列バリアントであるペプチドを含む。本発明のバリアントは野生型クプレドキシンの切断型であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、全長野生型ポリペプチドよりも短いクプレドキシンの領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、約10残基超、約15残基超、又は約20残基超の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約100残基以下、約50残基以下、約40残基以下、約30残基以下、又は約20残基以下の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、ペプチド、より具体的には本発明のペプチドに関して配列番号1及び3〜19に対して少なくとも約70%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。
特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアントは緑膿菌のアズリン残基50〜77(p28、配列番号2)、アズリン残基50〜67(p18、配列番号25)、又はアズリン残基36〜88(配列番号26)を含む。別の実施形態では、クプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77(配列番号2)、アズリン残基50〜67(配列番号25)、又はアズリン残基36〜88(配列番号26)からなる。別の特定の実施形態では、バリアントは、アズリン以外のクプレドキシンの同等な残基からなる。また、アズリン残基50〜77(配列番号2)又はアズリン残基36〜88(配列番号26)と同様な薬理活性を有するように他のクプレドキシンバリアントを設計することもできると考えられる。そのためには、BLAST、BLAST2、ALIGN2、又はMegalign(DNASTAR社製)を用いて対象のクプレドキシンアミノ酸配列を緑膿菌アズリン配列と整列させ、緑膿菌アズリンアミノ酸配列上の関連する残基を特定し、対象のクプレドキシン配列上の対応する残基を見出すことで、同等なペプチドを設計する。
本発明の一実施形態では、クプレドキシンバリアントはクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89(配列番号20)を含む。別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸50〜67(配列番号25)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントはシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)のアズリンの少なくともアミノ酸51〜77を含む(配列番号21)。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは髄膜炎菌のLazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号22)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号23)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンバリアントは気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号24)を含む。
バリアントには、天然ではない合成アミノ酸できたペプチドも含まれ得る。例えば、非天然アミノ酸をバリアントペプチドに組み込んで血流中での組成物の半減期を延長又は最適化してもよい。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないがD,L−ペプチド(ジアステレオマー)(例えばFutaki et al, J. Biol. Chem. 276(8):5836−40(2001);Papo et al, Cancer Res. 64(16):5779−86(2004);Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(l):169−76,(1987));異常アミノ酸を含むペプチド(例えばLee et al., J. Pept. Res. 63(2):69−84(2004))、オレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング(hydrocarbon stapling)(例えばSchafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891−5892(2000);Walenski et al., Science 305:1466−1470(2004))、及びε−(3,5−ジニトロベンゾイル)−Lys残基を含むペプチドが含まれる。
別の実施形態では、本発明のペプチドはクプレドキシンの誘導体である。クプレドキシンの誘導体とは、ペプチドが基本的な活性の一部を保持したままでいるようなペプチドの化学的修飾物である。例えば、アズリンの「誘導体」は、エンドサイトーシス経路又は非エンドサイトーシス経路を介して細胞に優先的に移入する能力及び哺乳動物の細胞、組織、又は動物体において前悪性病変の発達を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないが、ペプチドの、炭化水素安定化(hydrocarbon stabling)、アミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール(PEG)修飾、リン酸化、及びグリコシル化、及び本明細書に開示されているその他の方法が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と、限定されるものではないが例えば別のペプチド、薬物分子又はその他の治療薬若しくは医薬品、又は検出可能なプローブ等の化学物質との融合体であってもよい。関心のある誘導体としては、例えば、限定されるものではないが、環状ペプチド(例えばMonk et al, BioDrugs 19(4):261−78(2005);DeFreest et al, J. Pept. Res. 63(5):409−19(2004))、N末端及びC末端の修飾(例えばLabrie et al, Clin. Invest. Med. 13(5):275−8(1990))、並びにオレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング(例えばSchafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891−5892(2000);Walenski et al, Science 305:1466−1470(2004))等の当業者に周知の複数の方法により本発明のペプチド及び組成物の血流中の半減期を延長又は最適化することができる化学的修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、例えば、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を低減する方法、ペプチドのアミド分解を低減する方法、酸化を低減する方法、免疫原性を低減する方法、及び/又はペプチドの構造的安定性を増加させる方法等の方法を用いて変化され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、癌細胞に優先的に移入して且つ/又はその中で細胞毒作用を発揮する能力を高める方法を用いて修飾され得る。1つの修飾クプレドキシン由来ペプチド中で本明細書に記載の修飾の2つ以上が組み合わされてもよく、本明細書に記載の1又は複数の修飾と当業者に周知の薬物動態特性を向上させるその他の修飾とが組み合わされてもよいと考えられる。そのようなバリアント及び誘導体を設計するための多くの方法が当該技術分野で周知である。
生体内変換
ペプチドの薬物動態特性を向上させるアプローチの1つは、生体内変換を受けにくいクプレドキシン由来ペプチドのバリアント及び誘導体を作製することである。生体内変換は、ペプチドの薬理活性を低下させ且つ患者の体から除去される速度を速め得る。これを達成するための方法の1つは、最も生体内変換されやすいアミノ酸及び/又はアミノ酸配列を決定し、それらのアミノ酸をその特定の変換プロセスを受けないアミノ酸で置換することである。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、非天然アミノ酸又は修飾アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、特定の非天然アミノ酸を導入することでクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させる。そのような導入は、部位特異的であってもよく、インビボでの特定の生化学的修飾を回避するようになされてもよい。例示的な非天然アミノ酸としては、b−アミノ酸(例えば、b3及びb2)、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、Pro及びPyrの誘導体、3−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換Phe及びTyr誘導体、直鎖コアアミノ酸(Linear Core Amino Acid)、及びジアミノ酸が含まれる。そのような非天然アミノ酸は、ペプチドの部位特異的修飾、リボソーム翻訳、又は化学合成によってペプチドに導入され得る。これらの方法のそれぞれがクプレドキシン由来ペプチドの合成に適用され得る。
例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非天然クプレドキシンバリアントを作製するための非天然アミノ酸構成要素と野生型アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)を使用することで合成され得る(Hartman, et al, PLoS One, 2(10):e972(2007);Miranda, et al, J. Am. Chem. Soc. 129:13153−13159(2007)参照)。リボソーム翻訳を用いてペプチドに導入することができる非天然アミノ酸の多様性はリボソーム翻訳装置の特異性によって限定される。側鎖及び骨格のアナログを含む、AARSの基質となる90を超える非天然構成要素が明らかにされている(Hartman, et al, PLoS One, 2(10):e972(2007))。50を超える非天然アミノ酸が、全て酵素による翻訳系を用いてペプチド中に高効率で導入され得、最大13個までの異なる非天然アミノ酸がペプチドに含まれ得る(Hartman, et al, PLoS One, 2(10):e972(2007))。いくつかの実施形態では、そのようなアミノ酸がクプレドキシン由来ペプチドに組み込まれ得る。
クプレドキシン又はシトクロムc551又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を化学的に修飾する方法の1つは、例えば疎水性N末端修飾、全タンパク質−ポリマーコンジュゲート化学物質の合成、コードされているアミノ酸及びコードされていないアミノ酸の突然変異誘発、ペプチド骨格の操作、並びに部位特異的ポリマー付加による、薬学的活性の向上した抗HIV小タンパク質CCL−5(RANTES)の設計でとられるステップに従うことであり得る。抗HIVタンパク質は、ポリマー置換基が種々の位置に付加されたCCL−5アナログに天然及び非天然アミノ酸残基を導入することで設計することができる。ポリマー修飾CCL−5誘導体のインビトロ抗HIV活性がCCR−5シグナル伝達に関連しており、ペプチドへの変化がCCR−5活性を破壊しないであろうことが研究により示されている(その開示の全体を本明細書に援用するMiranda, et al, J. Am. Chem. Soc. 129:13153−13159(2007))。
その他の修飾としては、光学活性α−アミノ酸の使用が含まれ得る。光学活性αアミノ酸及びその誘導体は、医薬品中、農薬中、及びキラル配位子として、その使用が広がっている。特に、キラルなグリシン及びアラニン同等物は重要な役割を果たす。α−アミノ酸を構築するための少なくとも1つの立体選択戦略が提唱されており、これは予め決定した立体化学のエナンチオピュアなα−アミノ酸を可能にする(その開示を参照により本明細書に援用する、2008年9月11日にインターネット上で公開された(J. Org. Chem.で公開予定の)Lu, et al. ”Asymmetric Synthesis of α−amino acids: Preparation and alkylation of monocyclic iminolactones derived from α−Methyl trans− cinnamaldehyde”)。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、光学活性α−アミノ酸を用いて鏡像異性的濃縮反復法(enantiomerically enriched iteration)ことで合成され得る。
加水分解は通常、アスパラギン酸を含むペプチドで問題になる。アスパラギン酸は脱水されて環状イミド中間体を形成し易く、これにより、アスパラギン酸が潜在的に不活性なイソアスパラギン酸アナログに変換され、最終的にペプチド鎖が切断される。例えば、ペプチド配列中にアスパラギン酸−プロリンが存在すると、酸の触媒により環状イミド中間体が形成されることでペプチド鎖が切断され得る。同様に、ペプチド配列中にアスパラギン酸−グリシンが存在すると、環状中間体が元々のアスパラギン酸形態(無害)又はイソアスパラギン酸アナログのいずれかへと加水分解され得る。最終的に、全ての形態のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸アナログに完全に変換され得る。セリンとの同様な配列も、脱水され、ペプチド鎖を切断し得る環状イミド中間体を形成し得る。ペプチドの切断は、ペプチドの血中濃度半減期の短縮及び特定の薬理活性の低下を招き得る。
クプレドキシン由来ペプチドの配列中のアスパラギン及び/又はセリンをその他のアミノ酸で置換することで、ペプチドの血中濃度半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の改善された薬物動態特性を有するペプチドが得られると考えられる。想定されるバリアントの1つでは、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはグルタミン酸残基で置換されていてよい。別の想定されるバリアントでは、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のセリン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはスレオニン残基で置換されていてよい。クプレドキシン由来ペプチドのいくつかのバリアントでは、1又は複数のアスパラギン残基及び1又は複数のセリン残基が置換されている。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされている。別の実施形態では、非保存的置換がなされている。
アミノ酸残基の脱アミド化は生体内変換の中でも特に問題である。この塩基触媒反応はしばしばアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシンを含む配列中で起こり、上記のアスパラギン酸−グリシン配列と同様なメカニズムによる。アスパラギン−グリシン配列の脱アミド化は環状イミド中間体を形成し、これはその後加水分解されてアスパラギン酸又はアスパラギンのイソアスパラギン酸アナログを形成する。更に、環状イミド中間体は、アスパラギンのD−アスパラギン酸又はD−イソスパラギン酸アナログへのラセミ化を招き得、これらは全てペプチドを不活性型にし得る。
クプレドキシンペプチド中の脱アミド化はクプレドキシンのアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシン配列のグリシン、アスパラギン、及び/又はグルタミンを別のアミノ酸で置換することで防止され、ペプチドの血中濃度半減期の長期化及び薬理活性の比活性の上昇等の薬物動態特性が改善されたペプチドを生じると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のグリシン残基がスレオニン残基又はアラニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基が別のアミノ酸で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基58及び/若しくは63のグリシン又は他のクプレドキシンの同等なグリシンがアラニン又はスレオニンで置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基59のメチオニン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの同等なメチオニン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基63のグリシン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの同等なグリシン残基がスレオニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは以下の配列を含む。下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌p28配列中に置換により導入されている。
LSTAADMQVVTDMASGLDKDYLKPDD(配列番号38)
アミノ酸の可逆的又は不可逆的酸化も、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性及び/又は血中濃度半減期を低減させ得るという問題を引き起こし得る別の生体内変換プロセスである。システイン及びメチオニン残基が可逆的酸化を受ける主な残基である。システインの酸化は、チオールがより容易に脱プロトン化されて鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を容易に形成する、より高いpHで促進される。これらのジスルフィド結合は、ジチオスレイトール(DTT)又はトリス(2−カルボキシエチルホスフィン)ヒドロクロリド(TCEP)で処理することでインビトロで容易に逆転することができる。メチオニンは化学的経路及び光化学的経路の両方によって酸化されてメチオニンスホキシドを形成し、更にメチオニンスルホンになる。これらはどちらもほとんど逆転させることができない。
クプレドキシン由来ペプチド中の酸化はメチオニン及び/又はシステイン残基を別の残基で置換することで防ぐことができると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のメチオニン及び/又はシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、メチオニン残基がロイシン又はバリン残基で置換される。別の具体的な実施形態では緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基56及び64のメチオニンの1又は複数又は他のクプレドキシン由来ペプチドの同等なメチオニン残基がロイシン又はバリンで置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明のクプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む(下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌のp28配列中に置換により導入されている)。
LSTAADQGVVTDGASGLDKDYLKPDD(配列番号39)
又は
LSTAADQGVVTDGASGLDKDYLKPDD(配列番号40).
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性(例えば細胞に優先的に移入する能力)、血中濃度半減期、及び/又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてジケトピペラジン及びピログルタミン酸の形成が挙げられる。ジケトピペラジン形成は通常、グリシンがN末端から3位以内にある場合、より具体的にはプロリン又はグリシンが1位又は2位以内にある場合に起こる。この反応は、第2及び第3のアミノ酸の間のアミドカルボニル上のN末端窒素の求核攻撃を含み、これにより、最初の2つのアミノ酸が切断されてジケトピペラジンが形成される。一方、ピログルタミン酸形成は、N末端にグルタミンがある場合にはほとんど避けられないと考えられている。これは、N末端窒素がグルタミンの側鎖カルボニル炭素を攻撃して脱アミノ化されたピログルタマイルペプチドアナログが形成される、同様な反応である。この変換はN末端にアスパラギンを含むペプチドでも起こるが、頻度はかなり低くなる。
クプレドキシン由来ペプチドでのジケトピペラジン及びピログルタミン酸形成は、ペプチドの末端から1、2、又は3位のグリシン、N末端から3位のプロリン、又はN末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換することで低減されると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのN末端から1、2、又は3位のグリシンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、グリシン残基がスレオニン又はアラニン残基で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのN末端から3位のプロリンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、プロリンがアラニン残基で置換される。別の実施形態では、N末端のアスパラギンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、アスパラギン残基がグルタミン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血中濃度半減期、及び/又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてラセミ化が挙げられる。この用語はアミノ酸又はペプチドのキラル整合性の全体的消失を指して緩く使用される。ラセミ化では、アミノ酸の一方のエナンチオマー(通常L型)がL型及びD型のエナンチオマーの1:1混合物に塩基触媒変換される。一般的にペプチドの安定性を高める方法の1つは、retro−inverso型(D異性体)ペプチドを作製することである。ペプチド構造の二重変換は、多くの場合、側鎖の表面トポロジーを損なわず、生物学的活性ペプチドを安定化するために広範に使用されてきた(Snyder et al., PLoS Biol. 2:0186−0193(2004))。L−アミノ酸ペプチドだけでなくD−アミノ酸置換Tatも細胞中に内部移行する(Futaki et al, J. Biol. Chem. 276:5836−5840(2001);Huq et al, Biochemistry 38:5172−5177(1999))。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの1又は複数のアミノ酸残基がそのアミノ酸のDアイソマーで置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸残基全てがそれらの残基のD異性体で置換される。一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシン由来ペプチドのretro−inverso(D−異性体)型である。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
DDPKLYDKDLGSAMGDTVVGQMDAATSL(配列番号41)
である。
生体内変換による分解からクプレドキシン由来ペプチドを保護するその他の方法にNアセチル化及びCアミド化がある。これらの誘導体は、ペプチドを分解から保護し得、クプレドキシン由来ペプチドに天然タンパク質中のアルファアミノ基及びカルボキシル基の電荷状態をより正確に模倣させ得る。Nアセチル化及び/又はCアミド化を有するペプチドは市販の業者から供給され得る。本発明の一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのN末端がアセチル化され得る。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのC末端がアミド化され得る。特定の一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
アセチル化−LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD−アミド化(配列番号42)
である。
環化は、本明細書に記載するクプレドキシンを含む治療用ペプチドに有益であり得る更なる様式の生体内変換である。環化は、治療用ペプチドを安定化させることで、より長期の保存、より少ない投与量での投与、より少ない頻度での投与を可能にし得る。環化はペプチドをペプチダーゼ及びプロテアーゼによる分解から保護することが示されている。環化は化学的になされてもよく、酵素的になされてもよい。化学的環化は位置特異性及び立体特異性がないことがあり、環化ではなく多量体化が起こることがあり、複雑な多段階プロセスが必要になることがあるため、酵素的環化が一般的に化学的環化よりも問題が少ない。実際、タンパク質分解酵素に対してチオエーテル環化はジスルフィド結合よりも保護的且つ安定であることが示されている。
ランチビオティック−(メチル)ランチオニン−含有細菌ペプチド中における酵素的環化が示されている(例えば、R. Rink, et al., ”Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design of Peptides That Can Be Modified by Lantibioitic Enzymes” 44 Biochem., 8873−82(2005);R. Rink, et al., ”Production of Dehydroamino Acid−Containing Peptides by Lactococcus lactis” 73:6 Applied and Environmental Microbiology, 1792−96(2007);R. Rink, et al., ”NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization of Designed Nonlantibiotic Peptides” 46 Biochem., 13179−89(2007))(これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。ランチビオティックはグラム陽性細菌により産生され、その成長を阻害する。ランチビオティック中では、酵素を介したセリン及びスレオニン残基の脱水によりデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンが生じ、次いで、脱水されたセリン及びスレオニン残基にシステインが酵素的に結合されてチオエーテル環化物が形成される。天然のランチビオティックは、最大19残基離れた残基間でチオエーテル結合を介したそのような結合を有する。チオエーテル環形成はリーダーペプチドに依存する。環化の位置は、シクラーゼを介した位置特異的且つ立体特異的な閉環並びに脱水可能なセリン及びスレオニン残基の位置に依存する。
特徴が最も解析されているランチビオティックは、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)により産生される5員環ペプチド抗生物質であるナイシンである。ナイシンは、4個のメチルランチオニン、1個のランチオニン、2個のデヒドロアラニン、1個のデヒドロブチリン、及び26個の非修飾アミノ酸で構成される。ナイシンの5個のチオエーテルブリッジは、セリン及びスレオニンに由来するデヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基にシステイン残基が付加されることで形成される。ナイシンは、膜結合タンパク質酵素複合体により翻訳後に導入されるチオエーテル含有アミノ酸を含む。この酵素複合体は、輸送体NisT、セリン及びスレオニンのデヒドラターゼNisB、及びシクラーゼNisCを含む。NisBはセリン残基及びスレオニン残基を脱水してそれらをそれぞれデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンに変換する。その後、形成されたデヒドロ残基へのエナンチオ選択的なシステインの結合をNisCが触媒する。NisTは修飾プレナイシンの搬出を促進する。NisPという別の酵素がプレナイシンからナイシンリーダーペプチドを切断する。
シクラーゼNisCは十分に特徴が解析されている(Li et al, ”Structure and Mechanism of the Lantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis” 311 Science, 1464−67(2006))(その全体を参照により本明細書に援用する)。
ランチビオティックにおける環化の分析から、環化し易いペプチドのアミノ酸配列及び特徴が特定された。NisB酵素は特定のアミノ酸が隣接する場合にセリン及びスレオニン残基をより頻繁に脱水することが示されている。セリン残基及びスレオニン残基に疎水性の非芳香族残基が近接するランチビオティックプロペプチドで環化がより多く起こることが示されている。修飾されたシステイン隣接残基は通常、修飾されたスレオニン及びセリン隣接残基よりも疎水性が低い。ヘキサペプチドVSPPAR(配列番号43)、YTPPAL(配列番号44)、及びFSFFAF(配列番号45)等の例外も見つかっている。これらのヘキサペプチドは、3位又は4位にプロリンが存在するか両側に隣接するフェニルアラニンを有することで脱水が阻止され得ることを示唆している。環は通常、脱水残基がC末端側に位置するシステインに結合されることで形成される。しかし、脱水残基がN末端側に位置するシステインに結合されることでも環が形成され得る。
ナイシンを脱水及び輸送する酵素はナイシンに特異的でなく、実際、非ナイシンペプチド(及び非ランチビオティックペプチド)の修飾に使用され得ることも示されている。NisBは、ランチビオティックリーダーペプチドにヒトペプチドホルモン等のペプチドがN末端融合された時に、そのようなペプチド中のセリン残基及びスレオニン残基を脱水することが示されている。非ランチビオティックペプチド上でも同様な環形成特性が適用される。すなわち、脱水の程度は、脱水可能なセリン残基及びスレオニン残基に隣接する領域のアミノ酸の内容により調節することができる。セリン及びスレオニンの周辺に疎水性隣接残基(例えばアラニン及びバリン)が存在すると、完全な脱水が可能になり、チオエーテル環形成が促進された。N末端アスパラギン及びC末端隣接アルギニンは脱水を防止した。プロリン残基及びフェニルアラニン残基の存在が脱水に好ましくないことも示されている。一般的に、親水性隣接残基が存在するとセリン残基及びスレオニン残基の脱水が防止された。疎水性隣接残基は脱水に好ましく、親水性隣接残基は脱水に好ましくない。実験により、脱水が起こる場合、セリン及びスレオニンの隣接残基の平均疎水性は正であり、N末端側で0.40、C末端側で0.13であることが示された。また、脱水されないセリン及びスレオニンに隣接する残基の平均疎水性は負であり、N末端側で−0.36、C末端側で−1.03である。脱水は、一連の隣接するスレオニン残基の存在により制限されず、ナイシンリーダーペプチドと脱水される残基の間の距離にも制限されない。
NisCは天然のランチビオティックとは無関連のペプチド中でチオエーテル環の位置特異的形成を触媒することが示されている。一般的に、そのようなペプチドはナイシンリーダーペプチドに融合されなければならない。場合によっては、例えばデヒドロアラニンが2個のアミノ酸によってシステインから隔てられた場合、チオエーテル環は自然発生的に形成され得る。自然発生的環化と異なり、NisCが触媒する環化は脱水されたプレナイシンに立体特異的である。その結果、ナイシン中のメチルランチオニン及びランチオニンはDL形態になる。非ランチビオティック中の環化も立体特異的であると考えられている。
これらの原理は、クプレドキシン並びにそのバリアント及び切断型を含む本明細書に記載の化合物にも適用することができる。
チオエーテルブリッジ
天然には、ランチビオティックの酵素で誘導されるチオエーテルブリッジはブリッジ下に最大19個のアミノ酸を有するように形成される。ブリッジ下に2〜4個のアミノ酸を有するチオエーテルブリッジは多数存在する。
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、構造中にチオエーテルブリッジを導入することで修飾され得る。例えばアズリン切断型p28(配列番号2)がこの方法を用いて修飾され得る。ソフトウェアパッケージGROMACS(www.gromacs.org)を用いた拡張分子動力学シミュレーション(70ns)は、37℃において、6〜16位までのp28のアルファヘリックス領域が不安定であり、ペプチドがベータシータ形態をとりやすいことを示唆している(図58A及びB)。このことと、p53との相互作用に関与すると推定される分子部分が溶媒に曝されたままであることから、p28ペプチドのこの領域にチオエーテルブリッジを導入しても機能性に影響しないことが示唆される。
p28のアミノ酸配列は配列番号2(LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD)である。p18として知られるアミノ酸配列は配列番号25(LSTAADMQGVVTDGMASG)である。配列SGLDKD(配列番号96)がp53と相互作用し得る。チオエーテルブリッジはN側のSer/ThrとC側のCysの間で形成され得る。このセリン/スレオニンは脱水され、その後、システインに結合される。スレオニンがセリンよりも容易に脱水されるため好ましい。一般的に、スレオニンに隣接する疎水性残基(少なくとも1つ)は脱水の程度を高くするため好ましい。隣接残基である負に帯電したアミノ酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸は、脱水に強い悪影響を与える。通常、親水性隣接残基、特にグリシンは、脱水に好ましくない。Cysの前は帯電した親水性残基、特にグルタミン酸/アスパラギン酸になる傾向がわずかにある。チオエーテル環のサイズによっては、環を形成するアミノ酸の嵩高さが重要になる。
一実施形態では、切断型アズリン配列はLSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC(配列番号46)である。p28の25位と28位の間でチオエーテルブリッジが形成され、カルボキシエチダーゼ(carboxyetidase)に対して完全に保護される。2、3、及び25位が脱水されるが、移入配列及びp53との相互作用に関与すると思われる配列はチオエーテル環の導入により変化しない。したがって、ペプチド活性は変化しないと考えられる。スレオニンは2個の疎水性アミノ酸の間にあるので、特定の基準に従ってデヒドラターゼNisBによって完全に脱水されると予想される(Rink et al, Biochemistry 2005参照)。同じ基準により、特にシステインの前にアスパラギン酸が位置するため、シクラーゼNisCによる25位及び28位を含む環化も予測される。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はLSTAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号47)であり、3位と7位の間にチオエーテルブリッジが形成される。3位と7位の間の環はナイシンの環Aと同様に2位のスレオニンを利用する。6位のアスパラギン酸は環化に好ましい。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はLSTAACMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号48)であり、2位のスレオニンがチオエーテルブリッジの形成に利用される。
別の実施形態では、上記段落に記載した切断型アズリン中のチオエーテル環の2つ以上が1つのペプチド中に組み合わされる。
別の実施形態では、多くの切断型アズリン配列を作製し、1個のランチオニン環及び硫黄ブリッジ下の2〜3個の更なるアミノ酸を有するペプチドを分析することでスレオニン環についてスクリーニングしてもよい。これには以下の配列の1つ又は組合せが含まれ得る。
LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号49)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号50)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号51)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号52)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号53)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号54)
LSTAADMTAVVCDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号55)
LSTAADMQTVVCDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号56)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD(配列番号57)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD(配列番号58)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD(配列番号59)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD(配列番号60)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD(配列番号61)
LSTAADMQGVVTNGCASGLDKDYLKPDD(配列番号62)
実用的アプローチは、このような配列を大量に遺伝的に作製し、修飾の程度及び生成レベルに基づいて選択して精製することである。
別の実施形態では、チオエーテルブリッジはp28(配列番号2)の12位のスレオニンとペプチドのC末端の間に形成される。13位のCαと28位のアスパラギン酸の距離は17.52オングストロームであり得、これは1.5ナノメートルよりも大きく、ペプチド構造の大きな変化が示唆される(図58C)。
別の実施形態では、ペプチド配列はLSTAADMQGVVTATMGSGLCKDYLKPDD(配列番号63)であり、14位から4.38オングストロームの距離の2位にチオエーテルブリッジを有する。13位のアスパラギン酸のアラニンへの変異は14位のスレオニンの脱水に好ましい。16位のアラニンのグリシンへの変異は17位のセリンの脱水を完全に妨げ、環化を促進する。
別の実施形態では、ペプチド配列はLSTAADMQGVVTDLTASGLCKDYLKPDD(配列番号64)であり、15位から5.83オングストロームの距離の20位にチオエーテルブリッジを有する。この場合、14位のグリシンのロイシンへの変異は15位のスレオニンの脱水に好ましい。
三次構造の安定化
クプレドキシン由来ペプチドの三次構造の安定性は、とりわけ薬理活性、血中濃度半減期、及び/又は免疫原性を含む薬物動態のほとんどの面に影響を与える(Kanovsky et al, Cancer Chemother. Pharmacol. 52:202−208(2003);Kanovsky et al, PNAS 23:12438−12443(2001)参照)。ペプチドのヘリックスはしばしばランダムコイルになり、プロテアーゼの攻撃をより受けやすくなり、細胞膜を十分に透過しないことがある(Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891−5892(2000))。したがって、ペプチドの全体的構造を安定化する方法の一つはペプチドのαヘリックス構造を安定化することである。ヘリックス形成に関与する分子内水素結合は極性アミド骨格の露出を減らすことで輸送ペプチドの膜透過の障壁を低減するため、関連する薬理活性が増加し、プロテアーゼ切断に対するペプチドの抵抗性が高まる(上記文献)。緑膿菌アズリン(配列番号1)は残基53〜56、58〜64、及び68〜70にαヘリックスを有する。
αヘリックスを安定化する方法の1つは、αヘリックス中のグリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸等のヘリックス破壊性アミノ酸残基又はアラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、若しくはアルギニン等のヘリックスに対して中性のアミノ酸残基を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン等のヘリックス形成性残基又は例えばαアミノ−イソ酪酸(Aib)等のヘリックスに好ましいアミノ酸残基置換体で置換することである(その開示を参照により本明細書に援用するMiranda et al, J. Med. Chem., 51, 2758−2765(2008)参照)。1又は複数のグリシン、プロリン、セリン、及び/又はアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に置換することでクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックスが安定化されることも予期される。具体的な実施形態では、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及び/又はアルギニン残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、Aib、及び/又はメチオニン残基で置換される(Lee et al, Cancer Cell Intl. 11:21(2005)参照)。別の具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中の1又は複数のセリン残基又はグルタミン残基が置換され得る。更に別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基53〜56、58〜64、及び68〜70中のセリン及び/若しくはグルタミン残基又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)のアミノ酸残基57のグルタミン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)のアミノ酸残基52のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)のアミノ酸残基61のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)のアミノ酸残基63のグリシン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)のアミノ酸残基52、57、61、又は63の1又は複数のスレオニン、グルタミン、又はグリシン残基あるいは別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む(下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌p28配列中に置換により導入されている)。
LSAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号65);
LSTAADMGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号66);
LSTAADMQGVVDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号67);
LSTAADMQGVVTDMASGLDKDYLKPDD(配列番号68);
LSAADMGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号69);
LSAADMQGVVDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号70);
LSAADMQGVVTDMASGLDKDYLKPDD(配列番号71);
LSTAADMGVVDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号72);
LSTAADMGVVTDMASGLDKDYLKPDD(配列番号73);
LSTAADMQGVVMASGLDKDYLKPDD(配列番号74);
又は
LSAADMGVVMASGLDKDYLKPDD(配列番号75)。別の実施形態では、他のクプレドキシン由来ペプチド中の対応するアミノ酸がトリプトファンで置換される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、πスタッキング可能な非天然アミノ酸残基を使用する。例えば、Andrews and Tabor(Tetrahedron 55:11711−11743(1999))では、ペプチドのαヘリックス領域中に種々のスペーシングのε−(3,5−ジニトロベンゾイル)−Lys残基対が置換により導入されている。全体の結果は、i,(i+4)のスペーシングが配置の安定化に最も効率的であることを示していた。水の割合を最大90%まで増加させると、ペプチド中のヘリックス含有量が増加した。同じi,(i+4)のスペーシングのε−アシル−Lys残基対は安定化効果を示さなかった。このことは、安定化の大部分がπ−π相互作用によるものであることを示している。一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、リジン残基がε−(3,5−
ジニトロベンゾイル)−Lys残基で置換されるように修飾され得る。具体的な実施形態では、リジン残基がi,(i+4)のスペーシングのε−(3,5−ジニトロベンゾイル)−Lysにより置換され得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間の静電相互作用を利用する。ペプチド中にHis−Cys又はHis−His残基対をi,(i+4)配置で置換により導入した場合、Cu、Zn、又はCdイオンを添加するとペプチドは約50%ヘリックスから約90%ヘリックスに変化した。ルテニウム(Ru)塩をHis−Hisペプチドに添加した場合、大環状のシス−[Ru−(NH3+錯体(式中、Lは2個のヒスチジンの側鎖である)である置換不活性複合体(exchange−inert complex)が形成され、ヘリックスの安定性が改善された(Ghadiri and Fernholz, J. Am. Chem. Soc. 112, 9633−9635(1990))。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、大環状のシス−[Ru−(NH3+錯体(式中、Lは2個のヒスチジンの側鎖である)を含み得る。いくつかの実施形態では、1又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中にi,(i+4)配置で置換により導入され得る。別の実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基53〜56、58〜64、及び68〜70又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中にi,(i+4)配置の1又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が置換により導入され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは更にCu、Zn、Cd、及び/又はRuイオンを含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間でのジスルフィド結合を形成する。ペプチド配列中の隔てられた残基間の正式な共有結合によってヘリックス構造を安定化することも可能である。一般的に用いられる天然の方法はジスルフィド結合の利用である(Pierret et al, Intl. J. Pept. Prot. Res., 46:471−479(1995)。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に1又は複数のシステイン残基対が置換により導入されている。別の実施形態では、緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基53〜56、58〜64、及び68〜70又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に1又は複数のシステイン残基が置換により導入される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、側鎖のラクタムブリッジを利用する。ラクタムとは、アミノ酸の環化により形成され得る環状アミドである。側鎖と側鎖のブリッジは、種々のペプチド及びペプチドアナログ、例えば両親媒性又はモデルαヘリックスペプチド、オキシトシンアンタゴニスト、メラノプトロピン(melanoptropin)アナログ、グルカゴン、及びSDF−1ペプチドアナログにおける束縛にうまく利用されてきた。例えば、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−I)は、ヘリックスに好ましい特定の条件下で徐々にヘリックス構造をとり、ラクタムブリッジを用いて安定化することができる(Miranda et al, J. Med. Chem., 51, 2758−2765(2008))。これらのラクタムブリッジは、サイズ、安定性の効果(effecting stability)、及び結合親和性が異なり得る(上記文献)。そのような修飾は、血漿中での化合物の安定性を向上させた(上記文献)。環化部位間のスペース及び残基の選択によっては、ターン構造又はヘリックス構造の誘導及び安定化にラクタムブリッジを用いることができる。いくつかの実施形態では、近傍のアミノ酸間にラクタムブリッジ(例えばiからi+4へのグルタミン酸−リジンの束縛)を有する1又は複数のクプレドキシン又はバリアントアナログが作製される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはαヘリックス含有量を高くするためにそのような修飾を含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法は、全て炭素による架橋法(all−carbon cross−link)である。全炭化水素架橋法はヘリックス構造の安定化、プロテアーゼ抵抗性、及び細胞透過性を強化することが証明されている(Walensky et al., Science, 305, 1466−1470(2004))。α,α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーをペプチドに導入する。ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全て炭化水素による「ステープル」が生成してヘリックスが架橋される(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc, 122, 5891−5892(2000);Walensky et al.の上記文献)。非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーは、Schafmeister et al.(上記文献)及びWilliams and Im(J. Am. Chem. Soc, 113:9276−9286(1991))に記載されている方法により合成することができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは全炭化水素ステープルにより安定化される。特定の実施形態では、天然のアミノ酸に対応するα,α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの1又は複数対がクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に置換により導入される。別の実施形態では、天然アミノ酸に対応するα、α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザー1又は複数対が緑膿菌アズリン(配列番号1)の残基53〜56、58〜64、及び68〜70又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に置換により導入される。
いくつかの実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
SXAADXVVXDXASGLDKDYLKPDX(配列番号76)(式中、XはL又はアセチル化−Lであり、XはT又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはQ又はWであり、XはG又はAであり、XはT又はWであり、XはG、T、又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはD又はアミド化−Dである)
を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
SXAADXVVXDXASGLDKDYLKPDX(配列番号76)(式中、XはL又はアセチル化−Lであり、XはT又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはQ又はWであり、XはG又はAであり、XはT又はWであり、XはG、T、又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはD又はアミド化−Dである)
からなり得る。
別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
DPKLYDKDLGSAXDXVVXDAAXSX(配列番号77)(式中、XはD又はアセチル化−Dであり、XはM、L、又はVであり、XはG、T、又はWであり、XはT又はWであり、XはG又はAであり、XはQ又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはT又はWであり、及びXはL又はアミド化−Lである)
を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
DPKLYDKDLGSAXDXVVXDAAXSX(配列番号77)(式中、XはD又はアセチル化−Dであり、XはM、L、又はVであり、XはG、T、又はWであり、XはT又はWであり、XはG又はAであり、XはQ又はWであり、XはM、L、又はVであり、XはT又はWであり、及びXはL又はアミド化−Lである)
からなり得る。興味深い具体的なペプチドを表3に示す。
PEG化
PEGと治療及び診断に重要な薬物との共有結合は、インビボでの薬物の血中濃度半減期を長期化し且つ/又はそれらの免疫原性及び抗原性を低減させた(Harris and Chess, Nature Reviews Drug Discovery 2:214−221(2003))。例えば、PEG結合は、とりわけ、インターロイキン(Kaufman et al, J. Biol. Chem. 263:15064(1988);Tsutsumi et al, J. Controlled Release 33:447(1995))、インターフェロン(Kita et al, Drug Des. Delivery 6:157(1990))、カタラーゼ(Abuchowski et al, J. Biol. Chem. 252:3582(1977))、スーパーオキシドジスムターゼ(Beauchamp et al, Anal. Biochem. 131:25(1983))、及びアデノシンデアミナーゼ(Chen et al, Biochem. Biophys. Acta 660:293(1981))等の多くの治療タンパク質の薬物動態特性を向上させた。FDAは、食品、化粧品、並びに注射可能な製剤、局所製剤、直腸用製剤、及び経鼻製剤を含む医薬品における賦形剤又は基材としてのPEGの使用を承認している。PEGはほとんど毒性を示さず、体からそのまま、(PEG<30kDaは)腎臓により又は(PEG>20kDaは)便中に排除される。PEGは水溶性が高い。
治療ペプチドのPEG化は、腎臓の限外ろ過を少なくすることで患者の血流中におけるペプチドの寿命を延長するために用いられ得、これにより、身体からの薬物の排除が減少する。電荷の遮蔽は腎臓透過に影響を与え得る。帯電遮蔽は、タンパク質のイオン化可能な官能基、すなわちアミン又はカルボキシルの、パラムケミカル(paramchemical)な修飾により生じ得る。特に、タンパク質−PEG誘導体を製造するための最も一般的な手法では、タンパク質のアミノ基をアミドに変換して正電荷を失わせ、これにより、タンパク質の限外濾過を変化させることができる。腎臓の限外濾過は中性又は陽性の巨大分子よりもゆっくりと陰イオン性巨大分子を除去することがわかっているので、アミノ基にPEGをコンジュゲートすると血流中でのPEG化ペプチドの永続性が延びると予想される。
分子サイズ及び球状(globular)限外ろ過も治療ペプチドの腎臓限外ろ過に影響を与え得る。腎臓で天然球状タンパク質を除去するための分子量のカットオフは約70kDaであると考えられ、これは血清アルブミンの分子量に近い。したがって、分子量が70kDaを超えるタンパク質は、肝臓への取込み、免疫系によるタンパク質の消化及び切断等の腎臓限外ろ過以外の経路によって主に体から排除される。したがって、PEG化により治療ペプチドのサイズを大きくすることで患者の血流からのそのペプチドの腎臓限外ろ過を低減することができる。
更に、治療ペプチドのPEG化は、ペプチドの免疫原性を低下させ得、また、タンパク質分解酵素、食細胞、及び治療ペプチドとの直接接触を必要とするその他の因子からペプチドを保護し得る。分岐PEGの傘様構造は特に、接近するタンパク質分解酵素、抗体、食細胞等に対して直鎖状のPEGよりも保護効果が高いことが判明している(Caliceti and Veronese, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:1261−12778(2003))。
いくつかの実施形態では、本発明のクプレドキシン由来ペプチドは、システイン分子に共有結合された1又は複数のPEG分子を有するように修飾されている。共有結合は、PEG分子からクプレドキシン由来ペプチドへの直接の共有結合でなくてもよく、互いに共有結合した及び/又はクプレドキシン由来ペプチドに共有結合した、1又は複数のリンカー分子に共有結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは部位特異的PEG化を有する。具体的な実施形態では、PEG分子は緑膿菌アズリン(配列番号1)のシステイン残基3、26、及び/又は112に共有結合されていてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に1又は複数のシステイン残基が置換導入なされ、PEG化される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドをPEG化する方法は、とりわけ、NHS、還元的アニメ化、マリミド、又はエポキシドであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは1又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、若しくはチロシン、又はN末端アミノ基若しくはC末端カルボン酸上でPEG化されていてもよい。更に具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは1若しくは複数のリジン又はN末端アミノ基でPEG化されていてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に1又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、又はチロシン残基が置換により導入なされ、PEG化される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは1又は複数のアミノ基でPEG化されてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ランダムに非部位特異的にPEG化されてよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、PEGベースポリマーの平均分子量が約200〜約100,000ダルトン、約2,000〜約20,000ダルトン、又は約2,000〜約5,000ダルトンであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、分岐PEG、特に約50kDaの分枝PEG分子である1又は複数のPEG分子を含み得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは1又は複数の直鎖状PEG分子、特に約5kDaの直鎖状PEG分子を含み得る。
別の実施形態では、ペプチドは、グルコース調節タンパク質78(GRP78)に特異的に結合して癌細胞中に内部移行する13マーの環状オリゴペプチドPep42とのコンジュゲートであるクプレドキシン、又はそのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体である。クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体は、その開示全体を本明細書に援用するYoneda et al., ”A cell− penetrating peptidic GRP78 ligand for tumor cell−specific prodrug therapy,” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18:1632−1636(2008)に開示されている合成法に従いPep42とコンジュゲートされ得る。
別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの構造的等価物である。クプレドキシンとその他のタンパク質の間の有意な構造的相同性を決定する研究の例としては、Toth et al.(Developmental Cell 1:82−92(2001))が含まれる。具体的には、クプレドキシンと構造的等価物の間の有意な構造的相同性はVASTアルゴリズムを用いて決定され得る(Gibrat et al, Curr Opin Struct Biol 6:377−385(1996);Madej et al, Proteins 23:356−3690(1995))。具体的な実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の構造比較から得られるVASTのp値は約10−3未満、約10−5未満、又は約10−7未満であり得る。別の実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の有意な構造的相同性はDALIアルゴリズムを用いて決定され得る(Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123−138(1993))。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のDALIのZスコアは少なくとも約3.5、少なくとも約7.0、又は少なくとも約10.0である。
本発明の組成物のペプチドはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び/又は構造的等価物の2つ以上であってもよいと考えられる。例えば、ペプチドは、PEG化したアズリンの切断型、すなわち切断型及び誘導体の両方であってもよい。一実施形態では、本発明のペプチドはα,α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーを用いて合成され、その後、ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全炭化水素「ステープル」が形成される(Scharmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891−5892(2000);Walensky et al, Science 305:1466−1470(2004))。更に、アズリンの構造的等価物であるペプチドを他のペプチドに融合させて構造的等価物及び誘導体の両方であるペプチドを作製してもよい。これらの例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は銅に結合してもよく、しなくてもよい。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は緑膿菌アズリン(特にp28)の薬理活性の一部を有する。特定の実施形態では、クプレドキシン及びクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に、限定されるものではないが乳腺細胞における前悪性病変の発達を阻害防止し得る。本発明はまた、哺乳動物の前悪性病変、特に、限定されるものではないがメラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸部癌の細胞の発達を阻害する能力を有し得るクプレドキシン及びクプレドキシンのバリアント、誘導体、構造的等価物も提供する。癌細胞の発達の阻害とは、対照処置と比べて統計的に有意な前悪性病変の発達のあらゆる低減、又は増加速度の低下である。
クプレドキシンはエンドサイトーシス経路を介して癌細胞に優先的に移入することができ、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に乳房細胞、より具体的にはマウス乳腺細胞における前悪性病変の発達及び最終的には癌の発達を阻害することができることが現在知られているので、現在、この活性を保持しているクプレドキシンのバリアント及び誘導体を設計することが可能である。そのようなバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、例えば、クプレドキシンク並びにプレドキシン由来ペプチドの種々のバリアント、誘導体、及び構造的等価物の「ライブラリー」を作製し、次いで、それぞれについて実施例1の例示的方法のような当該技術分野で公知の多数の方法の1つを用いて優先的移入及び/又は化学予防活性、特にマウス乳腺臓器培養における優先的移入及び/又は化学予防活性を試験することで作製することができる。得られた化学予防活性及び/又は細胞に優先的に移入する能力を有するクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は本発明の方法においてアズリン又はp28の代わりに又はそれに加えて使用することができると考えられる。
いくつかの特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、マウス乳腺臓器培養(MMOC)において7,12−ジメチルベンズ(a)アントラセン(DMBA)で誘発される前悪性病変の発達を非処置の対照と比べて統計的に有意に防止し得る。この活性についてのペプチドの試験は、Mehta et al.(J Natl Cancer Inst 93:1103−1106(2001))及びMehta et al.(Meth Cell Sci 19:19−24(1997)に記載されているように又は実施例1に記載されているようにMMOCモデル系を用いて行うことができる。癌の発達が阻害されているかどうかを決定するその他の方法は当該技術分野で周知であり、それらを用いてもよい。
いくつかの特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物はMMOCモデルにおいて乳腺胞巣状病変(MAL)の発達を非処置の対照と比べて統計的に有意に阻害する。いくつかの具体的な実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、MMOCモデルにおける乳管病変(MDL)の発達を非処理対照と比べて統計的に有意に阻害する。これらの活性についてのペプチドの試験は、実施例1に記載されているように、DMBAにより前悪性病変の形成が誘発されるMMOCモデル系を用いて行うことができる。MMOCモデル系における前悪性病変の発達の評価は、実施例1に記載されているように、形態計測学的分析又は組織病理学的分析によって決定され得る。
いくつかの特定の実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び/又は腫瘍に優先的に移入することができる。いくつかの実施形態では、バリアントはp18の誘導体又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び/又は腫瘍に選択的に移入してDNA又はRNAを送達することができる。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは送達後に治療効果を発揮する。いくつかの実施形態では、バリアントはp28の誘導体又は構造的等価物である。いくつかの実施形態では、バリアント、誘導体、又は構造的等価物は哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において癌細胞及び/又は腫瘍に選択的に移入してDNA又はRNAを送達するができる。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは遺伝子又は遺伝子の一部である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは送達後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン
これらの小さいブルー銅タンパク質(クプレドキシン)は、細菌の電子伝達鎖に関与するか機能が未知の電子伝達タンパク質(10〜20kDa)である。銅イオンは単独でタンパク質基質に結合される。銅周辺の2個のヒスチジンリガンド及び1個のシステインリガンドへの特別な歪んだ三角形平面配置により、金属部位の非常に特異な電子特性及び強い青色が生じる。複数のクプレドキシンは中〜高分解能の結晶学的解析がなされている。
クプレドキシンは一般的に配列相同性は低いが構造相同性は高い(Gough & Clothia, Structure 12:917−925(2004);De Rienzo et al, Protein Science 9:1439−1454(2000))。例えば、アズリンのアミノ酸配列同一性は、オーラシアニンBのアミノ酸配列に31%、ラスチシアニンのアミノ酸配列に16.3%、プラストシアニンのアミノ酸配列に20.3%、シュードアズリンのアミノ酸配列に17.3%である(表1を参照)。しかし、これらのタンパク質の構造類似性はより顕著である。アズリンとオーラシアニンBの構造を比較したVASTのp値は10−7.4、アズリンとラスチシアニンでは10−5、アズリンとプラストシアニンでは10−5.6、アズリンとシュードアズリンでは10−4.1である。
全てのクプレドキシンは8本鎖のギリシャキーβ−バレル(greek key beta−barrel)又はベータ−サンドイッチフォールドを有し、高度に保存された部位構造を有する(De Rienzo et al, Protein Science 9:1439−1454(2000))。メチオニン、ロイシン等の多くの長鎖脂肪族残基の存在により、顕著な疎水性パッチがアズリン、アミシアニン、ラン藻プラストシアニン、キュウリ塩基性タンパク質の銅部位周辺に存在し、それよりは低い程度でシュードアズリン及び真核プラストシアニンの銅部位周辺に存在する(上記文献)。疎水性パッチは、ステラシアニン及びラスチシアニンの銅部位にもこれより低い程度で見られるが、これらは異なる特徴を有する(上記文献)。
Figure 2012512892
整列させた長さ:2つの構造間で重なる同等なC−アルファ原子対の数、すなわち、3Dでの重ね合わせを計算するために使用された残基の数。
p値:VASTのp値は、比較の有意性の尺度であり、確率で表される。例えば、p値が0.001であれば、全く偶然にこの質のマッチを見る見込みは1000分の1である。VASTのp値は、MMDBデータベース中に500個の独立した無関係の種類のドメインがあると仮定して多重比較の影響について調整されている。したがって、示されているp値は各ドメイン対をペアワイズ比較して500で割ったp値に相当する。
スコア:VAST構造類似性スコア。この数は、重ねられた二次構造要素の数及びその重ね合わせの質に関連する。VASTスコアが高いほど類似性が高い。
RMSD:オングストロームで表した2乗平均平方根重ね合わせ残差。この数字は、同等なC−アルファ炭素間の平均平方距離の平方根として、2つの構造の最適な重ね合わせ後に計算される。RMSD値は構造アラインメントの程度に応じて大きくなり、RMSDを全体的な構造類似性の記述に用いる場合はこのサイズを考慮に入れなければならない。
卵成熟におけるエフリンアンタゴニストであることが示されている線虫(C.elegans)主要精子タンパク質(Kuwabara, Genes and Development 17:155−161(2003))。
アズリン
アズリンは、特定の細菌の電子伝達に関与するクプレドキシンファミリーに属する128アミノ酸残基の銅含有タンパク質である。アズリンには、緑膿菌(PA)由来のもの(配列番号1)、A.xylosoxidans由来のもの、及びA.denitrifican由来のものが含まれる(Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859−871(2002))。アズリン間のアミノ酸配列同一性は60〜90%で変動し、これらのタンパク質は強い構造的相同性を示した。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフを有する特徴的なβサンドイッチを有し、単一の銅原子が常にタンパク質の同じ領域に配置される。更に、アズリンは、銅部位を囲む本質的に中性の疎水性パッチを有する(上記文献)。
プラストシアニン
プラストシアニンは、1分子当たり1個の銅分子を含み、酸化型が青色である、ラン藻、藻類、及び植物の可溶性タンパク質である。これらは、葉緑体中で生じ、そこで電子キャリアとして機能する。1978年にポプラのプラストシアニンの構造が決定されてから、藻類(セネデスムス属、エンテロモルファ属、クラミドモナス属)及び植物(フレンチビーン)のプラストシアニンの構造が結晶学的方法又はNMR法により決定され、ポプラの構造は1.33Åの解像度まで解明された。配列番号3は、好熱性ラン藻のフォルミジウム・ラミノスム由来のプラストシアニンのアミノ酸配列を示している。別の関心のあるプラストシアニンはウルバ・ペルツシスのものである。
藻類と維管束植物のプラストシアニン間では、配列が相違している(例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質間で62%の配列同一性)にも関わらず、三次元構造は保存されている(例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質のCアルファ位において0.76Åのrms偏差)。構造的特徴としては、8本鎖逆平行ベータバレルの一端における歪んだ四面体銅結合部位、顕著な負のパッチ、及び平坦な疎水性表面が含まれる。銅部位は、電子伝達機能に最適化されており、負及び疎水性のパッチが生理学的反応相手の認識に関与すると提唱されている。化学修飾、架橋、及び部位特異的突然変異誘発実験により、シトクロムfとの結合相互作用における負及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニンに関わる2つの機能的に大きな電子伝達系路のモデルが確認された。推定電子伝達系路の1つは比較的短く(約4Å)、疎水性パッチ中に溶媒露出銅リガンドHis−87を含み、もう一方の経路はそれより長く(約12〜15Å)、負のパッチ中にほぼ保存された残基Tyr−83が関与する(Redinbo et al, J. Bioenerg. Biomembr. 26:49−66(1994))。
ラスチシアニン
ラスチシアニンは、チオバチルス属(今はアシドチオバチルス属と呼ばれる)から得られたブルー銅含有単鎖ポリペプチドである。鉄酸化細菌由来の非常に安定で非常に酸化性のクプレドキシンラスチシアニン(配列番号4)の酸化型のX線結晶構造が多波長異常回折により決定され、1.9Åの解像度まで解明されている。ラスチシアニンは、6本鎖及び7本鎖のβシートで構成されるコアベータサンドイッチフォールドから構成される。他のクプレドキシン同様、銅イオンが、歪んだ四面体形に配置された4個の保存残基(His85、Cys138、His143、Met148)のクラスターにより配位されている(Walter, R.L. et al, J. Mol. Biol. 263:730−51(1996))。
シュードアズリン
シュードアズリンはブルー銅含有単鎖ポリペプチドのファミリーである。アクロモバクター・サイクロクラステス(Achromobacter cycloclastes)から得られたシュードアズリンのアミノ酸配列を配列番号5に示す。シュードアズリンのX線構造分析から、シュードアズリンはアズリンと配列相同性は低いが同様な構造を有することが示された。シュードアズリンとアズリンの全体的構造の主な違いは2つである。シュードアズリンはアズリンよりも長いカルボキシ末端を有し、これは2個のアルファヘリックスからなる。ペプチド中央の領域で、アズリンは短いαヘリックスを含むフラップを形成する伸張されたループを含むが、これがシュードアズリンでは短くなっている。銅部位における唯一の主な違いはMET側鎖のコンホメーション及びMet−S銅結合長であり、Met−S銅結合長はシュードアズリンでアズリンよりも有意に短い。
フィトシアニン
フィトシアニンとして特定可能なタンパク質には、限定されるものではないが、キュウリ塩基性タンパク質、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン(cucumber peeling cupredoxin)、エンドウ豆の鞘(pea pods)の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質が含まれる。キュウリ塩基性タンパク質及びエンドウ豆の鞘タンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンで置換されている。
オーラシアニン
好熱性緑色滑走光合成細菌クロロフレクサス・アウランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)からオーラシアニンA、オーラシアニンB−1、及びオーラシアニンB−2と命名された3つの小さなブルー銅タンパク質が単離されている。2個のB型は糖タンパク質であり、互いにほとんど同じ特性を有するが、A型とは異なる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、見かけのノマー分子質量が14(A)、18(B−2)、及び22(B−1)kDaであることが示された。
オーラシアニンAのアミノ酸配列が決定され、オーラシアニンAは139残基のポリペプチドであることが示された(Van Dreissche et al, Protein Science 8:947−957(1999))。公知の小さな銅タンパク質プラストシアニン及びアズリン同様、His58、Cys123、His128、及びMet132が、それらが進化上保存されている金属リガンドであるとした場合に予想される通りの間隔で配置されている。二次構造予測も、オーラシアニンが緑膿菌のアズリン及びポプラの葉のプラストシアニンと同様な一般的なベータバレル構造を有することを示している。しかし、オーラシアニンは、両方の小さな銅タンパク質配列クラスの配列特徴を有しているようである。アズリンのコンセンサス配列との全体的類似性はプラストシアニンのコンセンサス配列との全体的類似性とほぼ同じであり、30.5%である。オーラシアニンのN末端配列領域1〜18にはグリシン及びヒドロキシアミノ酸が顕著に多い(上記文献)(例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Aである配列番号15を参照されたい(NCBIタンパク質データバンクアクセッション番号AAM12874))。
オーラシアニンB分子は標準的なクプレドキシンフォールドを有する。クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンBの結晶構造が研究されている(Bond et al., J. Mol Biol. 306:47−67(2001))。追加的N末端鎖を除き、この分子は細菌のクプレドキシン、アズリンと非常に類似している。他のクプレドキシンにおけるのと同様、ポリペプチドの鎖4上にCuリガンドの1つが存在し、他の3つは鎖7及び鎖8の間の大きなループに沿って存在する。Cu部位の形状は後者の3つのリガンド間のアミノ酸間隔を用いて説明される。結晶解析されたオーラシアニンBのCu結合ドメインはおそらく、複数の他の膜結合電子伝達タンパク質において知られているテザーと有意な配列同一性を示すN末端テイルによって細胞質膜のペリプラスム側に繋ぎ止められている。B型のアミノ酸配列はMcManus et al. J. Biol. Chem. 267:6531−6540(1992)に記載されている(例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Bである配列番号16を参照されたい((NCBIタンパク質データバンクアクセッション番号1QHQA))。
ステラシアニン
ステラシアニンは、植物クプレドキシンの広範なファミリーであるフィトシアニンのサブクラスである。ステラシアニンの例示的配列を配列番号14として本明細書に含める。セイヨウワサビ(horseradish)の根から得られたステラシアニンであるウメシアニン(Koch et al, J. Am. Chem. Soc. 127:158−166(2005))及びキュウリステラシアニン(Hart el al, Protein Science 5:2175−2183(1996))の結晶構造も公知である。このタンパク質の全体的フォールドは他のフィトシアニンと同様である。エフリンB2タンパク質外部ドメインの三次構造はステラシアニンと有意な類似性を有する(Toth et al, Developmental Cell 1:83−92(2001))。ステラシアニンの例示的アミノ酸配列は全米バイオテクノロジー情報センタータンパク質データバンクのアクセッション番号1JERに見られる(配列番号14)。
キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的アミノ酸配列を配列番号17として本明細書に含める。タイプ1ブルー銅タンパク質であるキュウリ塩基性タンパク質(CBP)の結晶構造は1.8Åの解像度で解明されている。この分子は、ギリシャキーベータバレル構造を有する点で他のブルー銅タンパク質と似ているが、バレルが一方の側で開いており、「ベータサンドイッチ」又は「ベータタコス(beta−taco)」と記述する方が近い(Guss et al, J. Mol. Biol. 262:686−705(1996))。エフリンB2タンパク質外部ドメインの三次構造はキュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似性を有する(50α炭素に関してrms偏差1.5Å)(Toth et al, Developmental Cell 1:83−92(2001))。
Cu原子は、結合長がCu−N(His39)=1.93A、Cu−S(Cys79)=2.16A、Cu−N(His84)=1.95A、Cu−S(Met89)=2.61Aである通常のブルー銅NNSS配位を有する。ジスルフィド結合(Cys52)−S−S−(Cys85)が分子構造の安定化に重要な役割を果たしているようである。ポリペプチドのフォールドは、ブルー銅タンパク質(フィトシアニン)サブファミリー及びCBPと配列同一性が高い非金属タンパク質であるブタクサアレルゲンRa3に典型的なものである。現在フィトシアニンとして特定可能なタンパク質はCBP、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン、エンドウ豆の鞘の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質である。CBP及びエンドウ豆の鞘のタンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンに置換されている。キュウリ塩基性タンパク質の例示的配列はNCBIタンパク質データバンクのアクセッション番号2CBPに見られる(配列番号17)。
使用方法
本発明は、他の点では健康な患者の悪性病変を防止する方法であって、前述したクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物である少なくとも1つのペプチドを患者に投与することを含む方法を提供する。化学防止療法は、発癌に関与するプロセスを遮断することで癌の発達が妨げられるという仮説に基づく。クプレドキシン緑膿菌アズリン及び切断型アズリンペプチドp28は、現在、前悪性病変の初期の形成を阻害するか存在している前悪性病変を死滅させるかその成長を阻害することによって前悪性病変の発達を阻害することが知られている。
したがって、前悪性病変の発達を阻害する能力を有する前述のクプレドキシン又はそのバリアント、切断型、誘導体、若しくは構造的等価物をその他の点では健康な患者の防止的化学療法に使用することができると考えられる。そのようなその他の点では健康な患者は、いくつかの実施形態では、一般集団よりも癌を発達させるリスクが大きい患者である。本発明の組成物を用いた処置により防止され得る癌としては、限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒトであり得る。別の実施形態では、患者はヒトでない。
本発明は更に、癌細胞に優先的に移入する組成物及び方法を含む。クプレドキシン、特にアズリン誘導体p18及びp28は現在、ゴルジ装置が仲介し得るカベオラ介在性エンドサイトーシスを含む本明細書に記載の特定のメカニズムを介して癌細胞に移入することが知られている。したがって、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、癌細胞に移入してこれを死滅させるために使用することができ、細胞膜を横切るカーゴの輸送にも使用することができると考えられる。
本発明は更に、発癌物質による誘発の前又は後に哺乳動物細胞をクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物と接触させて細胞の発達を観察することを含む、癌の発達を研究する方法を含む。いくつかの実施形態では、細胞はマウス乳腺細胞であり、別の実施形態では、細胞は、哺乳動物において悪性になり得るその他の細胞である。
一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者としては、高リスク特性を有する患者、前悪性病変を有する患者、及び初期癌の治療歴を有する又は前悪性病変の根治的処置を施された患者である(Tsao et al, CA Cancer J Clin 54:150−180(2004)参照)。高リスク特性は、患者の行動的要因、遺伝的要因、環境的要因、又は生理的要因であり得る。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする行動的要因には、限定されるものではないが、喫煙、食事、飲酒、ホルモン置換療法、高い肥満度指数、未産、ビンロウジ(betal nut)の使用、口腔洗浄薬の頻繁な使用、ヒトパピローマウイルスへの暴露、小児期の及び慢性的な日光への暴露、若年齢での初性交、複数の性的パートナー、及び経口避妊薬の使用が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする遺伝的要因には、限定されるものではないが、癌の家族歴、BRCA1及びBRCA2の遺伝子保有状態、乳房新生物の前病歴、家族性腺腫性ポリポーシス(FAP)、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌(HNPCC)、赤毛又はブロンド毛及び皮膚が色白の表現型、色素性乾皮症、及び民族性が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする環境特性としては、限定されるものではないが、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロマート、ヒ素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ[a]ピレン、放射線、及びゴム由来の芳香族アミンへの暴露、又は塗料への職業的暴露が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくするその他の種々の要因としては、限定されるものではないが、気道閉塞による慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染症、住血吸虫症、高齢、及び免疫不全状態が含まれる。
更に、癌を発達させるリスクの高い患者は、特定の種類の癌について開発された種々のリスクモデルを用いて決定され得る。例えば、乳癌に罹りやすい患者は、とりわけ、ゲイル(Gail)リスクモデル又はクラウス(Claus)モデルを用いて決定され得る(Gail et al, J Natl Cancer Inst 81:1879−1886(1989);Cuzick, Breast 12:405−411(2003);Huang et al, Am J Epidemiol 151:703−714(2000)参照)。
前悪性病変を有する患者は一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。患者が前悪性病変を有するかどうかは当業者に周知の多くの方法で決定され得る。前悪性病変起源の中間体マーカー又はバイオマーカーを患者の体内で測定して患者が前悪性病変を有するかどうかを決定してもよい。大部分の癌患者において、腫瘍細胞及び隣接する組織学的に正常な組織で染色体異常が生じている。染色体異常の進行は前悪性病変から浸潤癌への表現型の進行と並行する(Thiberville et al, Cancer Res. 55:5133−5139(1995))。したがって、癌に関連する染色体異常を患者の前悪性病変を検出するための中間体マーカーとして用いることもできる。癌に伴う一般的な染色体異常には、限定されるものではないが、3p(FHIT等)、9p(p16INK4、p15INK4B、及びp19ARFでは9p21)、17p(p53遺伝子等では17p13)及び13q(網膜芽細胞腫遺伝子Rb等には13q14)等の腫瘍抑制因子遺伝子における対立遺伝子の欠失又はヘテロ接合性の消失(LOH)が含まれる。3p及び9pにおける欠失は喫煙及び肺癌の初期段階に関係している(Mao et al, J. Natl. Cancer Inst. 89:857−862(1997))。3p、5q、8p、17p、及び18qに影響を与える欠失は上皮癌において一般的な変化である(Tsao et al., CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 (2004)参照)。癌に関連するその他の染色体変異として、癌遺伝子を活性化するものが含まれる。その存在を中間体マーカーとして使用することができる癌遺伝子には、限定されるものではないが、Ras、c−myc、上皮増殖因子、erb−B2、及びサイクリンE、D1、及びB1が含まれる(上記文献のp154参照)。
その他の中間体マーカーとしては、前悪性細胞及び癌細胞においてアップレギュレートされる遺伝子産物を挙げることができる。前悪性細胞においてアップレギュレートされ得る遺伝子には、限定されるものではないが、シクロオキシゲナーゼCOX−1及びCOX−2、テロメラーゼが含まれる。癌細胞及び一部の前悪性細胞のその他のバイオマーカーには、限定されるものではないが、p53、上皮増殖因子受容体(GFR)、増殖細胞核抗原(PCNA)、RAS、COX−2、Ki−67、DNA異数性、DNAポリメラーゼ−α、ER、Her2neu、E−カドヘリン、RARβ、hTERT、p16INK4a、FHIT(3p14)、Bcl−2、VEGF−R、HPV感染、LOH 9p21、LOH 17p、p−AKT、hnRNP A2/B1、RAF、Myc、c−KIT、サイクリンD1、E、及びB1、IGF1、bcl−2、p16、LOH 3p21.3、LOH 3p25、LOH 9p21、LOH 17p13、LOH 13q、LOH 8p、hMSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTP1、NF−κB、AP1、D3S2、HPV感染、LOH 3p14、LOH 4q、LOH 5p、膀胱腫瘍抗原(BTA)、BTK TRAK(ワシントン州レドモンドのアリデックス社(Alidex, Inc)製)、尿路マトリックスタンパク質22、フィブリン分解産物、自己分泌型細胞運動刺激因子(autodrine motility factor)受容体、BCLA−4、サイトケラチン20、ヒアルロン酸、CYFRA21−1、BCA、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、及び組織ポリペプチド抗原(TPA)が含まれる(上記文献のp155〜157参照)。
初期癌を治療された患者又は前悪性病変の根治的処置を施された患者も一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い。続発性原発腫瘍(Second primary tumor)とは、癌の病歴を有する人における新たな原発性癌を意味する。続発性原発腫瘍は、頭頸部癌における主な死亡原因である(上記文献のp150)。続発性原発腫瘍と転移は前者が新規なものであるのに対し後者は既に存在する腫瘍を起源とするという点では異なる。乳、頭頸部、及び皮膚の癌又は前悪性病変の治療歴を有する患者は続発性原発腫瘍を発達させるリスクが特に高い。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物は、当業者に周知の多くの経路及び多くの投与計画により患者に投与することができる。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、又は吸入により投与される。組成物は、癌を発達させるリスクのある患者内の部位にペプチドを送達する任意の手段によって患者に投与され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物は静脈内投与される。
一実施形態では、方法は、患者にクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物の1単位投与量及び別の化学予防薬を含む組成物の1単位投与量を、任意の順番で、又はほぼ同時に、又は他方の投与からほぼ所定の時間以内に、例えば他方の薬物を投与した約1〜約60分後若しくは他方の薬物を投与した約1〜約12時間後に、共投与することを含み得る。関心のある化学予防薬としては、限定されるものではないが、タモキシフェン、アロマターゼ阻害薬、例えばレトロゾール及びアナストロゾール(Arimidex(登録商標));レチノイド、例えばN−[4−ヒドロキシフェニル]レチンアミド(4−HPR、フェンレチニド);非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、例えばアスピリン及びスリンダク;セレコキシブ(COX−2阻害薬)、デフルオロメチルオルニチング(DFMO)、ウルソデオキシコール酸、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ阻害薬、EKI−785(EGFR阻害薬)、ベバシズマブ(VEGF受容体に対する抗体)、セツキシマブ(EGFRに対する抗体)、レチノール、例えばビタミンA、ベータ−カロテン、13−シスレチノイン酸、イソトレチノイン、及びパルミチン酸レチニル;α−トコフェロール、インターフェロン、腫瘍退縮アデノウイルスdl1520(ONYX−015)、ゲフィチニブ、エトレチナート、フィナステリド、インドール−3−カルビノール、リスベラトロール、クロロゲン酸、ラロキシフェン、及びオルチプラズが含まれる。
癌細胞及び腫瘍への化合物の移入を促進する組成物
本発明は、細胞中にカーゴ化合物を送達するための方法及び材料に関する。本発明に係るカーゴ化合物の送達は好適な輸送ポリペプチドを用いて達成される。本発明の一実施形態では、カーゴ化合物が輸送ポリペプチドに連結される。好適な輸送ペプチドとしては、クプレドキシン又は「クプレドキシン移入ドメイン」を含むクプレドキシンの断片が含まれる。「クプレドキシン移入ドメイン」という用語は、哺乳動物の癌細胞中にクプレドキシンが移入するために必要なアミノ配列を含むクプレドキシンの断片を意味する。本発明により送達されるカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖;RNA、DNA、及びアンチセンス核酸を含む核酸;色素、蛍光及び放射活性タグ、微粒子又はナノ粒子、毒素、無機及び有機分子、小分子、並びに薬物(例えば化学予防薬)が含まれる。いくつかの実施形態では、薬物及び毒素は腫瘍細胞を死滅させる。
本発明の一実施形態では、クプレドキシンは、緑膿菌のアズリン(配列番号1)等のアズリンである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシンは、とりわけ、プラストシアニン、ラスチシアニン、又はシュードアズリンである。具体的な実施形態では、アズリンはとりわけ、緑膿菌、シュードモナス・シリンゲ、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、淋菌、腸炎ビブリオ、又は気管支敗血症菌に由来する。
一実施形態では、カーゴ化合物は、癌細胞等の細胞の細胞周期進行を停止又は遅延させるために送達される。そのような癌細胞としては、例えば、とりわけ、骨肉腫細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、軟組織肉腫細胞、又は乳癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、又は前立腺癌細胞を挙げることができる。例えば、カーゴ化合物は、とりわけ、細胞周期調節タンパク質、例えばp53;サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、例えばp16、p21、又はp27;自殺タンパク質、例えばチミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼ;サイトカイン又はその他の免疫調節タンパク質、例えばインターロイキン1、インターロイキン2、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF);又は毒素、例えば緑膿菌の外毒素Aであり得る。別の実施形態では、上記のクラスの化合物の1つの生物学的活性断片が送達される。別の実施形態では、カーゴ化合物は標的組織の画像を生成するために送達される。例えば、標的組織は癌であってよく、カーゴ化合物は、X線コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)、及び超音波による検出のための画像を生成するために一般的に使用されるものであってよい。これらの実施形態では、カーゴ化合物は、ガンマ線放出性又は陽電子放出性のラジオアイソトープ、磁気共鳴画像法の造影剤、X線造影剤、又は超音波造影剤である。
本発明は更に、哺乳動物の癌細胞にDNA又はRNAを選択的に導入する方法を含む。そのような実施形態では、DNA又はRNAがカーゴ化合物である。いくつかの実施形態では、方法は、DNA又はRNAに結合されたp18又はp28を提供すること及び化合物を哺乳動物の体に導入することを含む。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは遺伝子又は遺伝子断片である。いくつかの実施形態では、DNA又はRNAは哺乳動物の細胞中に導入された後に治療効果を発揮する。
クプレドキシン移入ドメイン
本発明は、癌細胞にペプチドを優先的に移入させ、連結されたカーゴを哺乳動物の非癌細胞ではなく癌細胞に輸送することを可能にする、タンパク質形質導入ドメインを提供する。クプレドキシンタンパク質がタンパク質形質導入ドメインであるクプレドキシン移入ドメインを含み、これが、連結されたカーゴの哺乳動物の癌細胞への移入を促進することを見出した。いくつかの実施形態では、連結されたカーゴの癌細胞への選択的輸送を促進するためにクプレドキシンタンパク質全体が使用され得る。別の実施形態では、連結されたカーゴの癌細胞への輸送にクプレドキシンの一部が使用され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、全長野生型タンパク質よりも短いクプレドキシン領域からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンの約10残基超、約15残基超、又は約20残基超からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンの約50残基以下、約40残基以下、又は約30残基以下からなる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クプレドキシンに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約99%である。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインはアズリン移入ドメインである。本発明の一実施形態では、アズリン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸50〜77(p28;配列番号2)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸36〜77(配列番号27)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸36〜89(配列番号28)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸36〜128(配列番号29)を含む。
本発明の更に別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸50〜67(p18;配列番号25)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸53〜70(配列番号30)を含む。本発明の更に別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸53〜64(配列番号31)を含む。
本明細書に記載の実施例、特に実施例19は、p18(アミノ酸50〜67)に存在しないp28のC末端領域が細胞膜上の特定の残基に接触して細胞へのアクセスを可能にしているであろうことを示している。したがって、本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、p28の少なくともアミノ酸66〜77(配列番号35)を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、p28の少なくともアミノ酸68〜77(配列番号36)を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、p28の少なくともアミノ酸67〜77(配列番号37)を含むアズリン移入ドメインである。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、配列番号2の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸の1又は複数を含む。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、配列番号2のアミノ酸69、70、75、76、及び85を含む。
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、緑膿菌アズリン以外のクプレドキシンに由来する移入ドメインである。種々の実施形態においてクプレドキシン移入ドメインは、ラン藻フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン(配列番号3);鉄酸化細菌のラスチシアニン(配列番号4);アクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン(配列番号5)、シュードモナス・シリンゲのアズリン(配列番号21);髄膜炎菌のアズリン(配列番号10);腸炎ビブリオのアズリン(配列番号8)、又はクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニン(配列番号15及び16)の断片であり得る。
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89(配列番号20)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、シュードモナス・シリンゲのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号21)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、髄膜炎菌のLazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号22)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号23)を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号24)を含む。
クプレドキシン移入ドメインの修飾
本発明の別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを化学的に修飾するか遺伝的に変化させて、細胞中に優先的に移入し且つ/又はカーゴ化合物を輸送する能力を保持しているバリアントを作製する。例えば、実施例14は、54、61、及び70位にプロリン残基を導入された緑膿菌アズリンがUISO−Mel−2細胞に移入する能力を保持していることを示している。
別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、保存されたアミノ酸配列DGXXXXXDXXYXKXXD(配列番号32)又はDGXXXXDXXYXKXXD(配列番号33)(式中、Dはアスパラギン酸、Gはグリシン、Yはチロシン、Kはリジン、Xは任意のアミノ酸である)を含む(実施例17参照)。
クプレドキシン移入ドメインのバリアントは標準的な技術で合成され得る。誘導体は、天然化合物から直接又は修飾若しくは部分的置換によって形成されるアミノ酸配列である。アナログは、天然化合物と同一ではないが同様な構造を有し、特定の要素又は側鎖に関して天然化合物と異なるアミノ酸配列である。アナログは、合成されてもよく、異なる進化起源のものであってもよい。
誘導体又はアナログが修飾アミノ酸を含む場合、バリアントは、全長であっても全長でなくてもよい。クプレドキシン移入ドメインのバリアントとしては、限定されるものではないが、クプレドキシン移入ドメインに、同じ長さのアミノ酸配列の全体の同一性又は相同性アルゴリズムにより整列された配列と比較した時の同一性が少なくとも約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%、又は99%の実質的に相同な領域を含む分子が含まれる。
別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントは、緑膿菌アズリン残基50〜77(p28;配列番号2)に対して有意な構造類似性を有する。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントは、膿菌アズリン残基50〜67(p18;配列番号25)に対して有意な構造類似性を有する。クプレドキシンと他のタンパク質の間に有意な構造的相同性があるかを決定する研究例としては、Toth et al. (Developmental Cell 1:82−92(2001))が含まれる。具体的には、クプレドキシン移入ドメインと緑膿菌アズリン残基50〜77(配列番号2)の間の有意な構造的相同性は、VASTアルゴリズム(Gibrat et al, Curr Opin Struct Biol 6:377−385(1996);Madej et al, Proteins 23:356−3690(1995))を用いて決定される。具体的な実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントと緑膿菌アズリン残基50〜77(配列番号2)との構造比較のVAST p値は約10−3未満、約10−5未満、又は約10−7である。別の実施形態では、クプレドキシン移入ドメインのバリアントと緑膿菌アズリン残基50〜77(配列番号2)の間の有意な構造的相同性は、DALIアルゴリズム(Holm & Sander, J Mol. Biol. 233:123−138(1993))により決定することができる。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のDALIのZスコアは少なくとも約3.5、少なくとも約7.0、又は少なくとも約10.0である。
クプレドキシン移入ドメインへの修飾は、オリゴヌクレオチド介在(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、PCR突然変異誘発、並びに本明細書に開示されている方法及び技術等の当該技術分野で公知の方法を用いてなされ得る。部位特異的突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1−7(1986);Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329−50(1987))、カセット変異導入、制限部位選択的変異導入法(restriction selection mutagenesis)(Wells et al, Gene 34:315−23(1985))、又はその他の公知の技術をクローニングしたDNAに行うことでクプレドキシン移入ドメインバリアント核酸を作製してもよい。更に、クプレドキシン移入ドメインに対する構造類似性を有する移入ドメインをコードするヌクレオチドが当該技術分野で周知の方法で合成され得る。更に、野生型又はバリアントのクプレドキシン移入ドメインであるタンパク質分子が当該技術分野で周知の方法で合成され得る。
クプレドキシン移入ドメイン及びカーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメイン複合体をコードする核酸
別の態様では、本発明は、カーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、カーゴ化合物がタンパク質又はペプチドである、核酸分子を提供する。本発明に係る核酸分子は、当該技術分野で公知の技術を組み合わせて作製することができる。例えば、クプレドキシン移入ドメインの核酸配列及びカーゴ化合物の核酸配列は化学合成又はクローニングによって別々に作製され得る。次いで、リガーゼを用いて核酸配列を順番通りにライゲーションさせて目的の核酸分子が得られる。
クプレドキシン移入ドメインを用いてカーゴ化合物を送達する方法
多数のアルギニンリッチペプチドが哺乳動物細胞膜を通って移動してそのような細胞内にタンパク質カーゴタンパク質を運搬することが知られている(Suzuki, T., et al. J. Biol. Chem. 277:2437−43(2002))。例えば、HIV Tatタンパク質の短いアルギニンリッチな11アミノ酸(アミノ酸47〜57)セグメントは哺乳動物細胞中へのカーゴタンパク質の輸送を可能にする(Schwarze, SR., et al. Trends Cell Biol. 10:290−95(2000))。アルファヘリックス含有量を増やし、アルギニン残基の配置を最適化した合成移入ドメインは、タンパク質形質導入ドメインとしてより高い潜在力を有することが示されている(Ho, A., et al. Cancer Res. 61:474−77(2001))。比較すると、緑膿菌アズリンは1つのアルギニン残基を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞へのカーゴ化合物の移入を促進するクプレドキシン断片、例えばp18(配列番号25)及びp28(配列番号2)の使用を含む。そのような断片は、細胞への移入に必要な断片を特定する任意の方法によって決定され得る。そのような方法の1つでは、クプレドキシン断片をマーカー物質に連結し、クプレドキシン断片が細胞に移入するかどうかを試験する。そのような方法を用いて前述の好適なクプレドキシン断片が特定され得る。
本発明の種々の実施形態で、カーゴ化合物は、クプレドキシン又はその断片、例えば、緑膿菌のアズリン(配列番号1);ラン藻フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン(配列番号3);鉄酸化細菌のラスチシアニン(配列番号4);又はアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリン(配列番号5)、シュードモナス・シリンゲのアズリンの断片(配列番号21)、髄膜炎菌のアズリン(配列番号10)、腸炎ビブリオのアズリン(配列番号19)、気管支敗血症菌のアズリン(配列番号8)、クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンA及びB(配列番号15及び16)、とりわけ、アズリン及びアズリン様タンパク質に付加されている。別の実施形態では、カーゴは、p28(配列番号2)、p18(配列番号25)、又は配列番号35〜37のいずれか等のクプレドキシン移入ドメインに連結されている。
本発明の種々の実施形態で、クプレドキシン移入ドメインはインビトロ、エクスビボ、又はインビボでカーゴ化合物を細胞内に送達する。例えば、送達は、papスメアのようにクプレドキシン移入ドメインとカーゴ化合物の複合体を細胞培養に添加することによってインビトロで達成され得る。あるいは、送達は、患者から採った試料、例えば血液、組織、又は骨髄に複合体を添加し、処置済試料を患者に戻すことで、エクスビボで達成され得る。送達は、患者に複合体を直接投与することでも達成され得る。本発明の方法は、治療、予防(prophylactic)、診断、又は研究を目的に用いられ得る。本発明により送達されるカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、アンチセンス核酸を含む核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、有機分子、無機分子、小分子、及び薬物が含まれる。
一実施形態では、検出可能な物質、例えば、蛍光物質、例えば緑色蛍光タンパク質;発光物質;酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ;又は放射性標識若しくはビオチン化したタンパク質を送達して検出可能な表現型を細胞に付与する。同様に、蛍光物質等の検出可能な物質で標識された微粒子又はナノ粒子を送達することができる。好適なナノ粒子の一例は、参照により明示的に本明細書に援用する2002年5月7日に付与された米国特許第6,383,500号に記載されている。多くのそのような検出可能な物質が当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、カーゴ化合物は、X線コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、超音波画像法、又は放射性核種シンチグラフィーに適した検出可能な物質である。これらの実施形態では、カーゴ化合物は診断目的で患者に投与される。X線CT、MRI、及び超音波により得られる画像を強めるためにカーゴ化合物として造影剤が投与される。クプレドキシン移入ドメインにより腫瘍組織にターゲティングされる放射性核種カーゴ化合物の投与を放射性核種シンチグラフィーに用いることができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン移入ドメインは、カーゴ化合物と共に又はカーゴ化合物なしで、放射性ヌクレオチド(radionucleotide)を含み得る。別の実施形態では、カーゴ化合物は、ガンマ線放射性又は陽電子放射性のラジオアイソトープ、磁気共鳴画像法の造影剤、X線造影剤、又は超音波造影剤である。
カーゴ化合物としての使用に適した超音波造影剤には、限定されるものではないが、標的部分とマイクロバブルの間に必要に応じて連結部分Lを更に含む生体適合性気体のマイクロバブル、液体キャリア、及び界面活性剤マイクロスフェア(surfactant microsphere)が含まれる。この文脈において、液体キャリアという用語は水溶液を意味し、界面活性剤という用語は、溶液の界面張力を低下させる任意の両親媒性材料を意味する。界面活性剤マイクロスフェアの形成に適した界面活性剤の一覧は、参照により明示的に本明細書に援用する欧州特許第0727225(A2)号に開示されている。界面活性剤マイクロスフェアという用語は、ナノスフェア、リポソーム、小胞等を含む。生体適合性気体は、空気又はフルオロカーボン、例えばエコー輝度に差を生じさせることで超音波画像法においてコントラストを生じさせるC〜Cパーフルオロアルカンであり得る。気体は、マイクロスフェアに含有されるかカプセル化され、これにクプレドキシン移入ドメインが(必要に応じて連結基を介して)結合している。この結合は、共有結合、イオン性結合、又はファンデルワールス力によるものであり得る。そのような造影剤の具体例としては、複数の腫瘍新血管系受容体結合性のペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣薬を有する脂質カプセル化パーフルオロカーボンが含まれる。
カーゴ化合物としての使用に適したX線造影剤としては、限定されるものではないが、1又は複数のX線を吸収する又は原子番号が20以上の「重」原子が含まれ、これらは必要に応じてクプレドキシン移入ドメインとX線吸収原子の間に更に連結部分Lを含んでもよい。X線造影剤に使用されることが多い重原子はヨウ素である。近年、金属キレートを含むX線造影剤(例えば米国特許第5,417,959号)及び複数の金属イオンを含むポリキレートを含むX線造影剤(例えば米国特許第5,679,810号)が開示された。更に最近では、X線造影剤として多核クラスター錯体(multinuclear cluster complex)が開示されている(例えば、米国特許第5,804,161号、国際公開第91/14460号、及び同第92/17215号)。
カーゴ化合物としての使用に適したMRI造影剤としては、限定されるものではないが、1又は複数の常磁性金属イオンが含まれ、これは、クプレドキシン移入ドメインと常磁性金属イオンの間に必要に応じて連結部分Lを更に含んでもよい。この常磁性金属イオンは、金属錯体又は金属酸化物粒子の形態で存在する。米国特許第5,412,148号及び同第5,760,191号にMRI造影剤に使用するための常磁性金属イオンのキレーターの例が記載されている。米国特許第5,801,228号、同第5,567,411号、及び同第5,281,704号には、MRI造影剤に使用するための2種以上の常磁性金属イオンを錯体化するのに有用なポリキレート剤(polychelant)の例が記載されている。米国特許第5,520,904号には、MRI造影剤として使用するための常磁性金属イオンを含む微粒子組成物が記載されている。
別の実施形態では、カーゴ化合物は癌細胞等の細胞中で細胞周期進行を停止又は遅延させるために送達される。そのような癌細胞としては、例えば、骨肉腫細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、軟組織肉腫細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、又は前立腺癌細胞を挙げることができる。例えば、カーゴ化合物としては、細胞周期調節タンパク質、例えばp53;サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、例えばp16、p21、又はp27;自殺タンパク質、例えばチミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼ;サイトカイン又はその他の免疫調節タンパク質、例えばインターロイキン1、インターロイキン2、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF);又は毒素、例えば緑膿菌の外毒素Aを挙げることができる。別の実施形態では、上記クラスの化合物の1つの生物学的活性断片が送達される。
更に別の実施形態では、カーゴ化合物は核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は上記クラスの化合物の1つをコードする。更に別の実施形態では、カーゴ化合物は癌の処置に使用される薬物である。そのような薬物としては、例えば、5−フルオロウラシル;インターフェロンα;メトトレキサート;タモキシフェン;及びビンクリンスチンが含まれる。上記の例は説明のためにだけ提供するものであり、他にも多数のこのような化合物が当業者に公知である。別の実施形態では、核酸は遺伝子治療に有用である。
癌の処置に適したカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、エチレンイミン、及びトリアゼン;代謝拮抗薬、例えば葉酸拮抗薬、プリンアナログ、及びピリミジンアナログ;抗生物質、例えばアントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、及びプリカマイシン;酵素、例えばL−アスパラギナーゼ;ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;5アルファレダクターゼ阻害剤;17ベータヒドロキシステロイド脱水素酵素3型の阻害剤;ホルモン剤、例えばグルココルチコイド、エストロゲン/抗エストロゲン薬、アンドロゲン/抗アンドロゲン薬、プロゲスチン、及び黄体ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド;微小管破壊剤、例えばエクチナサイジン又はそのアナログ及び誘導体;微小管安定化剤、例えばタキサン、例えば、パクリタキセル(Taxol(商標))、ドセタキセル(Taxotere(商標))、及びそのアナログ、並びにエポチロン、例えばエポチロンA〜F及びそのアナログ;植物由来産物、例えばビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン;及びトピオソメラーゼ阻害剤;プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;及び種々の薬剤、例えばヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、白金配位錯体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン;並びに抗癌剤及び細胞毒性薬剤として使用されるその他の薬剤、例えば生体応答修飾物質、成長因子;免疫調節剤及びモノクローナル抗体が含まれる。
これらのクラスの抗癌剤及び細胞毒性薬剤の代表例としては、限定されるものではないが、塩酸メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、ダカルバジン、メトトレキサート、チオグアニン、メルカプトプリン、フルダラビン、ペンタスタチン(pentastatin)、クラドリビン、シタラビン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、サフラシン、サフラマイシン、キノカルシン(quinocarcin)、ディスコデルモリド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、タモキシフェン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、ブセレリン、ロイプロリド、プテリジン、ダイネース(diyneses)、レバミソール、アフラコン(aflacon)、インターフェロン、インターロイキン、アルデスロイキン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、リツキシマブ、BCG、トレチノイン、塩酸イリノテカン、ベタメトゾン(betamethosone)、塩酸ゲムシタビン、アルトレタミン、及びトポテカ(topoteca)、及びその任意のアナログ又は誘導体が含まれる。
これらのクラスの好ましい一員としては、限定されるものではないがパクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、マイトマイシンC、エクチナサイジン743、又はポフィロマイシン(pofiromycin)、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド、リン酸エトポシド、又はテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン(leurosidine)、ビンデシン、及びロイロシンが含まれる。
カーゴ化合物として有用な抗癌剤及びその他の細胞毒性薬剤の例としては以下のものが含まれる:ドイツ特許第4138042.8号、国際公開第97/19086号、同第98/22461号、同第98/25929号、同第98/38192号、同第99/01124号、同第99/02224号、同第99/02514号、同第99/03848号、同第99/07692号、同第99/27890号、同第99/28324号、同第99/43653号、同第99/54330号、同第99/54318号、同第99/54319号、同第99/65913号、同第99/67252号、同第99/67253号、及び同第00/00485号に記載されているようなエポチロン誘導体;国際公開第99/24416号に記載されているようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤(米国特許第6,040,321号も参照);並びに国際公開第97/30992号及び同第98/54966号に記載されているようなプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;及び米国特許第6,011,029号に一般的及び具体的に記載されているような剤(この米国特許の化合物は、AR調節剤、ER調節剤等の任意のNHR調節剤(限定されるものではないが、本発明のものも含まれる)、LHRH調節剤、又は去勢手術と共に、特に癌の処置において使用することができる)。
上記のその他の治療薬は、本発明の化合物と共にカーゴ化合物として使用する際、例えば米医薬品便覧(Physicians’Desk Reference(PDR))に記載されている量で又は当業者に決定されるように使用され得る。
クプレドキシン移入ドメインを含む医薬組成物
クプレドキシン移入ドメインを含む又はからなる医薬組成物及びカーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメインの複合体を含む医薬組成物を任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。複合体は、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、調合物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤することを可能にする。好適な補形剤としては、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。
そのような組成物は、例えば、細胞型の検出若しくは画像化又は細胞死に関連する状態の処置若しくはその防止に使用され得る。組成物は、細胞死への抵抗性に関連する状態を防止又は処置するために十分な量で投与され得る。本明細書において、「細胞死への抵抗性に関連する状態」という用語は、思慮分別のある熟練の外科医又は臨床医に決定される同様な種類の正常な細胞と比べて少なくとも細胞の寿命が長い傾向を特徴とする疾患、状態、又は疾病を意味する。通常、宿主生物はヒト又は動物等の哺乳動物である。
クプレドキシン移入ドメインを含む組成物の投与
クプレドキシン移入ドメインを含む組成物は、任意の好適な経路、例えば、経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、膣内、経尿道、経鼻、局所、経皮(percutaneousすなわちtransdermal)又は非経口(例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内投与)によって投与され得る。組成物及びその医薬製剤は意図する目的を達成するために有効な任意の量で投与され得る。細胞死への抵抗性に関連する状態を処置するために投与される場合、組成物は治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、処置対象の発達を防止するかその既存の症状を軽減するのに有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
適切な用量は、当然ながら、例えば使用するクプレドキシン移入ドメインを含む化合物、宿主、投与形態、並びに処置又は診断されている状態の性質及び重症度によって異なる。しかし、本発明の方法の一実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物の1日用量(daily dosage)が約0.001〜約20mg/kg体重の時にヒトにおいて十分な処置結果が得られることが示されている。一実施形態では、ヒトの処置に指定される1日用量は、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物約0.7〜約1400mgであり得、これは例えば1日1回、週1回、月1回、及び/又は連続投与により、適宜投与される。1日投与量(daily dose)は、1日当たり1〜12回の個別の用量であってもよい。あるいは、投与量を、2日に1回、3日に1回、4日に1回、5日に1回、6日に1回、週に1回、以下同様に1日単位で最大31日に1回投与してもよい。投薬は、錠剤、パッチ、i.v.投与等を含む任意の適用可能な投与形態を用いた連続投与、間欠投与、又は単回投与であり得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は約0.01〜20mg/kg体重である。具体的な実施形態では、投与量レベルは約10mg/kg/日、約15mg/kg/日、約20mg/kg/日、約25mg/kg/日、約30mg/kg/日、約35mg/kg/日、約40mg/kg/日、約45mg/kg/日、又は約50mg/kg/日である。
クプレドキシン移入ドメインを含む化合物を患者に導入する方法は、いくつかの実施形態では、癌の処置に知られる他の薬物との同時投与である。そのような方法は当該技術分野で周知である。具体的な実施形態では、クプレドキシン移入ドメインを含む化合物は、癌を処置する他の薬物を含む又はそれと組み合わされたカクテル又は共投与の一部である。そのような薬物には、例えば本明細書に記載したものが含まれ、具体的には5−フルオロウラシル;インターフェロンα;メトトレキサート;タモキシフェン;及びビンクリンスチンが含まれる。上記の例は説明のためだけに提供するものであり、他にも同様な化合物が多数当業者に公知である。
クプレドキシン移入ドメイン又は移入ドメインとカーゴ化合物を組み合わせた融合タンパク質をコードする核酸分子をベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与(Nabel et al.に付与された米国特許第5,328,470号(1994年、米国))又は定位注射(Chen et al, Proc Natl Acad Sci USA, vol.91, pp3054−57(1994))により対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤を含んでもよく、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター(例えばレトロウイルスベクター)が無傷(intact)で産生される場合、医薬製剤は遺伝子送達系を生成する1又は複数の細胞を含み得る。
一態様では、組成物は、in situで複合体が作製されるようにDNAとして送達される。一実施形態では、DNAは、例えばUlmer et al, Science 259:1745−49(1993)に記載されているように、また、Cohen, Science 259 1691−92(1993)に概括されているように、「ネイキッド(naked)」である。ネイキッドDNAの取込みは、細胞中に効率的に輸送されるキャリア(例えば生分解性ビーズ)上にDNAをコーティングすることで促進され得る。そのような方法では、DNAは、核酸発現系、細菌発現系、及びウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれかに含まれ得る。そのような発現系にDNAを組み込む技術は当業者に周知である(例えば、国際公開第90/11092号、同第93/24640号、同第93/17706号、及び米国特許第5,736,524号参照)。
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは2つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、DNAを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須でない領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来DNAはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター(例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム)は、組成物のDNA等の外来DNAを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクターでは、導入されたDNAは、挿入されたDNAを転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。組成物ポリヌクレオチドを誘導可能なプロモーターに作動可能に連結することで、wtアズリン移入ドメイン組成物ポリペプチド又は断片の発現を制御することができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487−511(1990))及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導可能なプロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)も予期される。
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。通常、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
クプレドキシン移入ドメイン−カーゴ化合物複合体を含むキット
別の態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の1又は複数を含むキットを提供する:(1)カーゴ化合物に連結されているか単独であるクプレドキシン移入ドメイン(p18若しくはp28等)を含む試薬;(2)薬学的に許容されるアジュバント又は補形剤を含む試薬、(3)シリンジ等の、投与のための手段(vehicle);(4)投与の指示書。同じ容器中に要素(1)〜(4)の2つ以上が見られる実施形態も予期される。
クプレドキシン、クプレドキシン移入ドメイン、クプレドキシン移入ドメイン−カーゴ化合物複合体、又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む医薬組成物
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む医薬組成物は任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。実質的に純粋な又は医薬品グレードのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に調合物を製剤することを可能にする。好適なキャリア又は補形剤には、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤は保存剤を実質的に含まない。別の実施形態では、医薬製剤は少なくとも1つの保存剤を含んでもよい。医薬品の剤形に関する一般的方法論はAnsel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins, Baltimore MD(1999))に記載されている。
本発明に使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、注射(例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等)、吸入、局所投与、坐剤、経皮パッチ、又は経口等の種々の方法で投与され得る。薬物送達系に関する一般的情報は上記のAnsel et alに記載されている。いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、とりわけ、皮下及び静脈内投与用に注射剤として製剤して直接使用することができる。注射可能な製剤は、特に、化学予防療法に適した患者の処置への使用に都合がよいことがある。クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む組成物は、ポリプロピレングリコール等の保護剤又は同様なコーティング剤と混合した後に経口摂取することもできる。
投与が注射によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、水溶液、特に生理学的に適合性のあるバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー等の中に処方され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の製剤化剤(formulatory agent)を含み得る。あるいは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、使用前に好適なビヒクル(例えば発熱性物質を含まない滅菌水)と構築されるための粉末形態であってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドにより刺激される免疫応答を亢進するアジュバント又は任意のその他の物質を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドへの免疫応答を阻害する物質を含む。
投与が静脈内輸液によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の投与に用いられる静脈内輸液は、クリスタロイド又はコロイドで構成され得る。本明細書において、クリスタロイドは無機塩又はその他の水溶性分子の水溶液である。本明細書において、コロイドはゼラチン等のより大きな不溶性分子を含む。静脈内輸液は無菌であり得る。
静脈内投与に使用され得るクリスタロイド液としては、限定されるものではないが、表2に示されるように、通常の食塩水(濃度0.9%の塩化ナトリウム溶液)、乳酸リンゲル又はリンゲル液、及びD5Wとも呼ばれる5%デキストロース水溶液が含まれ得る。
Figure 2012512892
乳酸リンゲル液は28mmol/Lの乳酸、4mmol/LのK、及び3mmol/LのCa2+を更に含む。
投与が吸入によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、又はその他の好適な気体等の好適な噴射剤を用いて加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることで用量単位が決定され得る。吸入器(inhaler)又は吹き付け器(insufflator)で使用するためのカプセル及び薬包(例えばゼラチン)は、タンパク質とラクトース又はでんぷん等の好適な粉末基材との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
投与が局所投与によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、当該技術分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁液等として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、投与は経皮パッチによる。投与が坐剤によるものである場合(例えば直腸内又は腟内)、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の組成物は、従来の坐剤基剤を含む組成物に製剤化されてもよい。
投与が経口によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて容易に製剤化され得る。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等の固体キャリアを用いてもよく、そのようなキャリアは、クプレドキシン及びそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物を、処置する対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤化することを可能にする。例えば散剤、カプセル剤、錠剤等の経口用固体製剤のための好適な補形剤としては、糖、セルロース標品、造粒剤、結合剤等の充填剤が含まれる。
当該技術分野で周知のその他の従来のキャリアとして、細菌莢膜性多糖類、デキストラン、又は遺伝子操作されたベクター等の多価キャリアも含まれる。更に、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む徐放性製剤は、長期間にわたるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の放出を可能し、徐放性製剤がない場合にはクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物が治療効果を引き出す又は高める前に対象の系から除去され且つ/又は例えばプロテアーゼ及び単純な加水分解により分解される。
本発明のペプチドの血流中における半減期は当業者に周知の複数の方法により延長又は最適化することができる。本発明のペプチドバリアントには、限定されるものではないが、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体内の前悪性病変の発達を阻害するペプチドの活性を維持しつつ、血流中でその安定性、比活性、寿命を高め得及び/又はクプレドキシンの免疫原性を低下させ得る種々のバリアントが含まれ得る。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を低減するもの、ペプチドの脱アミド化を低減するもの、酸化を低減するもの、免疫原性を低減するもの、ペプチドの構造的安定性を強化するもの、又はペプチドのサイズを大きくするものが含まれる。そのようなペプチドには、環状ペプチド(Monk et al, BioDrugs 19(4):261−78(2005);DeFreest et al, J. Pept. Res. 63(5):409−19(2004))参照)、D,L−ペプチド(ジアステレオマー)(Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836−40(2001);Papo et al, Cancer Res. 64(16):5779−86(2004);Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(l):169−76(1987)参照);異常アミノ酸を含むペプチド(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69−84(2004)参照)、N末端及びC末端の修飾(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275−8(1990)参照)、炭化水素ステープリング(Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891−5892(2000);Walenski et al., Science 305:1466−1470(2004)参照)、及びPEG化も含まれる。
種々の実施形態において、医薬組成物は、キャリア及び補形剤(限定されるものではないが、バッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤、懸濁剤、増粘剤、及び/又は保存剤が含まれる)、水、油、食塩水、デキストロース及びグリセロールの水溶液;生理学的条件に近づけるために必要なその他の薬学的に許容される補助剤物質、例えば緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等を含む。当業者に公知の任意の好適なキャリアを本発明の組成物の投与に使用できるが、キャリアの種類は投与形態によって異なることが理解されよう。化合物は、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化してもよい。生分解性マイクロスフェアも本発明の医薬組成物のキャリアとして使用され得る。好適な生分解性マイクロスフェアは、例えば米国特許第4,897,268号、同第5,075,109号、同第5,928,647号、同第5,811,128号、同第5,820,883号、同第5,853,763号、同第5,814,344号、及び同第5,942,252号に開示されている。
医薬組成物は従来の周知の滅菌技術で滅菌されてよく、あるいは滅菌ろ過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま又は凍結乾燥されてパーケージ化され得、凍結乾燥標品は投与前に無菌溶液と混合される。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の投与
p18又はp28等のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、医薬組成物として投与製剤化され得、任意の好適な経路、例えば経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、腟内、経尿道、経鼻、局所、経皮(percutaneousすなわちtransdermal)、又は非経口(例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内)、又は硝子体内投与(vitreous administration)により投与され得る。その医薬製剤は、その意図する目的の達成に有効な任意の量で投与され得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は通常、約0.01〜20mg/日/kg体重である。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む化合物は、単独又は他の活性薬剤及び/若しくはカーゴ化合物との組合せで、癌の防止に有用である。適切な用量は、当然ながら、例えば使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物、宿主、投与形態、並びに潜在的な癌の性質及び重症度によって変わる。しかし、一般的に、1日用量が約0.01〜20mg/kg体重の時にヒトにおいて満足な結果を得られることが示される。ヒトにおいて指定される1日用量は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物約0.7〜約1400mgであり、これは、例えば1日1回、週1回、月1回、及び/又は連続投与によって、適宜投与される。1日投与量は、1日当たり1〜12回の個別の用量にしてもよい。あるいは、投与量は、2日に1回、3日に1回、4日に1回、5日に1回、6日に1回、週に1回、以下同様に1日単位で最大31日以上に1回投与してもよい。あるいは、投与は、パッチ、i.v.投与等を用いた連続投与であってもよい。
正確な処方、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して主治医が決定する。投薬の量及び間隔は、カーゴ化合物を有する又は有さない活性なクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の治療効果を維持するのに十分な血漿濃度が得られるように個別に調節され得る。通常、所望のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物は、意図する投与経路及び標準的な薬学的実務に即して選択された薬学的キャリアとの混合物の形態で投与される。
一態様では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物はDNAとして送達され、その結果、in situでポリペプチドを生じる。一実施形態では、DNAは、例えばUlmer et al.(Science 259:1745−1749(1993))に記載されておりCohen(Science 259:1691−1692(1993))に概括されているように「ネイキッド」である。ネイキッドDNAの取込みは、生分解性ビーズ等のキャリア上にDNAをコーティングした後細胞中に効率的に輸送させることで増加し得る。そのような方法では、DNAは、核酸発現系、細菌発現系、及びウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれに含まれてもよい。そのような発現系にDNAを取り込ませるための技術は当業者に周知である(例えば、国際公開第90/11092号、同第93/24640号、同第93/17706号、及び米国特許第5,736,524号参照)。
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは2つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、外来DNAを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須な領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来DNAはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター(例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム)は、クプレドキシンDNA等の外来DNAを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクター中では、導入されたDNAは、挿入されたDNAが高度に転写されるように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。クプレドキシン並びにそのバリアント及び誘導体ポリペプチドを誘導可能なプロモーターに作動可能に連結することで、特定の因子に応答するクプレドキシン並びにそのバリアント及び誘導体の発現を制御することができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487−511(1990))及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導可能なプロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、その他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)も予期される。更に、本発明のペプチド(例えば一実施形態ではp18)は、治療化合物を癌細胞又は腫瘍に選択的に送達するベクターとして使用され得る。
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。ベクターは通常、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含むキット
一態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の1又は複数を含む治療法(regimen)又はキットを提供する:(1)少なくとも1つのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物を含む薬理活性組成物;(2)更なる化学予防薬;(3)シリンジ、ネブライザー等の、生物学的活性組成物を患者に投与する装置。
キットを提供する場合、適切であれば、組成物の種々の成分は別個の容器にパッケージ化され、使用直前に混合されてもよい。そのように成分を別個にパッケージ化することで、活性成分の機能を失うことなく長期間の保存が可能になり得る。
キットに含められる試薬は、種々の成分の寿命が維持され且つ容器の材料による吸着又は変化が起こらない任意の種類の容器に入れて提供され得る。例えば、密封されたガラス製アンプルに、凍結乾燥したクプレドキシン並びにそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物又はバッファーを窒素等の中性の非反応性気体下でパッケージ化して含めてもよい。アンプルは、任意の好適な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボナート、ポリスチレン等、セラミック、金属、又は同様な試薬を保持するために通常使用される任意のその他の材料からなり得る。好適な容器のその他の例としては、アンプルと同様な物質で作製され得る単純なボトル、並びに裏地がアルミニウム又は合金等のホイルである内部を含み得る包み(envelope)が含まれる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は無菌アクセスポートを有し得、例えば皮下注射針で孔を開けることができるストッパーを有するボトルである。その他の容器は、容易に除去可能な膜で隔てられた2つのコンパートメントを有し得、この膜を除去することで成分を混合することができる。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム等であり得る。
キットに指示書を付けてもよい。指示は、紙等の基体に印刷されてもよく且つ/又は電子読取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、CD−ROM、DVD−ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、フラッシュメモリー素子等として提供されてもよい。詳細な指示は物理的にキットに付属されなくてもよく、その代わりに、キットのメーカー又は供給業者が指定するインターネットウェブサイトに使用者を導いてもよく、又は電子メールで提供されてもよい。
クプレドキシン、クプレドキシン移入ドメイン並びにそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物の修飾
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物を化学的に修飾するか遺伝子操作して前述したバリアント及び誘導体を作製してもよい。そのようなバリアント及び誘導体は標準的な技術により合成され得る。クプレドキシン移入ドメインも同様に修飾され得る。
クプレドキシンの天然のアレルバリアントに加えて、前悪性病変の発達を阻害するクプレドキシンの能力を大きく変化させることなくコードされるクプレドキシンのアミノ酸配列に変化を生じさせるような変異をクプレドキシンのコード配列中に入れることでも変化を導入することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、薬理活性を変えることなくクプレドキシンの野生型配列から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基はそのような薬理活性に必要なものである。例えばクプレドキシン間で保存されているアミノ酸残基は特に変化を受けにくく、したがって、「必須」であると予想される。
ポリペプチドの薬理活性を変化させない保存的置換を行うことができるアミノ酸は当該技術分野で周知である。有用な保存的置換を表3の「好ましい置換」に示す。1つのクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置換する保存的置換は、置換が化合物の薬理活性を顕著に変化させない限り、本発明の範囲内である。
Figure 2012512892
(1)βシート又はαヘリックスコンホメーション等のポリペプチド骨格の構造、(2)電荷、(3)疎水性、又は(4)標的部位の側鎖の嵩、に影響を与える非保存的置換は薬理活性を変化させ得る。残基は、表4に示すように一般的な側鎖特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換ではこれらのクラスの1つのメンバーが別のクラスに交換される。置換は保存的置換部位、より具体的には非保存部位に導入され得る。
Figure 2012512892
バリアントポリペプチドは、オリゴヌクレオチド介在(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCR突然変異誘発等の当該技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。部位特異的突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1−7(1986);Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329−350(1987))、カセット変異導入、制限部位選択突然変異誘発(Wells et al, Gene 34:315−323(1985))、又はその他の公知の技術をクローニングしたDNAに対して用いてクプレドキシンバリアントDNAを作製することができる。
クプレドキシンの公知の変異を用いて本発明の方法で使用するバリアントクプレドキシンを作製することもできる。例えば、アズリンのC112D変異体及びM44KM64E変異体は天然アズリンとは異なる細胞毒性及び成長停止活性を有することが知られており、そのような変化した活性は本発明の処置方法において有用であり得る。
以下の具体的な実施例を参照することで本発明を更に深く理解することができる。実施例は説明のみを目的として記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況から示唆され得る又は適切であり得る形態の変更及び均等物の置換も予期される。本明細書中では具体的な用語を使用するが、そのような用語は説明的であることを意図しており、限定することを目的としたものではない。前述したような本発明の修正例及び変更例をその精神及び範囲から逸脱することなく作製することができる。
MMOCモデルにおけるDMBA誘発乳腺病変に対するペプチドp28の効果
マウス乳腺臓器培養(MMOC)モデルを用いることで、DMBAに応答した乳腺胞巣状病変(MAL)又は乳管病変(MDL)の発達に対する潜在的な化学予防剤の有効性を評価することができる。DMBAは適切なインキュベーション条件下で培地中のホルモン環境に応じてMAL又はMDLを形成する(Hawthorne et al, Pharmaceutical Biology 40:70−74(2002);Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103−1106(2001))。培養中にエストロゲン及びプロゲステロンで処置された腺では腺管病変が発達したが、アルドステロン及びヒドロコルチゾンで処置された線ではエストロゲン及びプロゲステロンに非依存性の胞巣状病変が形成された。発癌物質又は化学予防剤に暴露されなかった乳腺は、成長促進ホルモンの非存在下で構造的に退行し、3日目と4日目の間に24時間DMBAで処置すると、ホルモンの枯渇によって引き起こされる構造の退行が防止された。これは、線が正常なホルモン応答性を失って発達過程が変化したためであると推測される。形質転換細胞を同系マウスに移植して乳腺腺癌を発生させることで、これらの抑制されない領域の前悪性・前新生物性の性質が証明された。
胸部の乳腺対を各Balb/cマウスから無菌的に切り出し、線を複数の群に分けた。培地中で4種類に希釈したp28の効果を評価した。被験薬剤を用いずに発癌物質で処置した線を化学予防剤非存在下での発生率を決定するための尺度とした。更に化学予防の正の対照となる対照を含めた。アズリンを濃度50μg/mlで培地に含めた。胞巣状病変(MAL)では、染色された腺(全ての病変を含む腺)を病変の発生について評価した(所定の処置群における腺の合計数と比較)。腺管病変(MDL)でも同様のプロトコールを採用したが、以下の方法のセクションに記載するように、ホルモンの組合せが胞巣状病変と腺管病変では異なる。腺をホルマリンで固定した後、病理組織診断に用いた。切片をエオシン及びヘマトキセレンで染色し、顕微鏡下で評価した。ここでは対照と処置群の間で腺管病変が何倍異なるかを比較する。
臓器培養手順
研究に用いる実験動物は、マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー社(Charles River)から入手した3〜4週齢の若い未交尾のBALB/c雌マウスである。1μgのエストラジオール−17β+1mgのプロゲステロンを9日にわたって毎日マウスに皮下注射した。ステロイドで前処置しなかった動物はインビトロでホルモンに応答しないため、この処置は必須である。この培養全体の手順は詳細に記載されている(Jang et al, Science 275:218−220(1997);Mehta, Eu. J. Cancer 36:1275−1282(2000);Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 89:212−219(1997);Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103−1106(2001))。
簡潔には、頸椎脱臼によりマウスを殺し、絹のラフト上で胸部の乳腺対を切り出し、無血清Waymouth MB752/1培地中で10日間インキュベートした(5腺/5ml/シャーレ)。乳腺胞巣状病変(MAL)を誘発するためのプロトコールでは、グルタミン、抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン100ユニット/ml培地)、及び成長促進ホルモン(培地1ml当たり、5μgのインスリン(I)、5μgのプロラクチン(P)、1μgのアルドステロン(A)、及び1μgのヒドロコルチゾン(H))を培地に添加した。腺管病変(MDL)の誘発では、培地に5μg/ml、5μg/mlのP、0.001μg/mlのエストラジオール17β、及び1μg/mlのプロゲステロン(Pg)を含めた(Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103−1106(2001))。3日目と4日目の間に発癌物質DMBA(2μg/ml)を培地に添加した。本実験では、DMBAを終濃度4mg/mlでDMSOに溶かし、50μgのIを100mlの培地に添加して終濃度を2μg/mlにした。対照のシャーレには溶媒としてDMSOを含めた。
4日目に、腺を新鮮な培地ですすぎ、DMBAを含まない新鮮な培地の入った新しいシャーレに移すことで培地からDMBAを除去した。10日間インキュベートした後、I(5μg/ml)だけを含む培地中に腺を更に14日間維持した。培養期間全体を通して、腺は95%O及び5%CO環境下で37℃に維持した。増殖促進期の最初の10日間、培地に化学予防剤を含めた。被験ペプチドp28を12.5〜100μg/mlの4種類の濃度で評価した。培地中の50μg/mlのアズリンを評価した。ペプチドは使用前に滅菌水に溶かしてろ過した。培地は週に3回(月曜、水曜、金曜)交換した。暴露の最後に、腺をホルマリンで固定した。結果はカイ二乗分析及びフィッシャー直接検定で解析した。
MALの形態計測解析
MALを検査するために、腺をアルムカーミン(alum carmine)で染色し、病変が存在するかどうかを評価した。乳腺病変の有無、各腺における病変の重症度、及び薬剤の毒性について腺にスコアを付けた。腺をキシレン中に保存し、解剖顕微鏡下で、乳腺病変の有無、発生率、重症度について各腺を評価した。乳腺病変について正又は負のスコアを乳腺に与え、その群中の腺の総数に対する病変を示す腺の割合として発生率を求めた。化学予防剤を用いた処置による管の拡大又は乳腺構造の崩壊を毒作用と見なした。発生率についてデータを統計解析し、潜在的化学予防剤の有効性を決定した。
図1Aに、DMBAで処置した腺における胞巣状病変の代表的写真及びDMBAと化学予防剤で処置した腺との比較を示す。胞巣状病変の発達に対するp28の効果を図1B〜1Fに示し、図2にまとめた。ペプチドp28は濃度25μg/mlでMAL形成を67%阻害した。濃度を更に100μg/mlに上げてもペプチドの効果は高まらなかった。このペプチドとアズリンの比較から、p28はMALの発達に対してアズリン同じくらい効果的であることが示された。濃度50μg/mlのアズリンは67%の阻害であった。統計解析から、p28の効果は12.5μg/ml超でDMBA対照と比べて統計的に有意であることが示された(p<0.01、フィッシャー直接検定;カイ二乗分析)。
MDLの組織病理学的評価
MDLについて、腺を組織病理学的に評価した。腺を5ミクロンの切片に縦方向に切片化し、エオシン・ヘマトキセリンで染色した。各腺の縦断切片を複数のフィールドに分類し、それぞれのフィールドを腺管病変について評価した(Mehta et al, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103−1106(2001))。簡潔には、顕微鏡下で腺全体を評価した。小さい腺は大きい腺に比べて総フィールドが少ない。したがって、各腺でフィールドの数は異なる。多くの場合、管を横切る切片の数も腺によって大きく異なり、そのため、群によって数が異なる。管の過形成又は異形を含むフィールドを決定し、評価されたフィールドの総数を各腺で比較した。過形成又は異形と極度に閉塞した腺は区別しなかった。これらの組織学的パターンを含む全てのフィールドを病変に対して正とみなした。重症度について処置群を対照と比較し、阻害率を算出した。
図3に代表的腺管病変を示す。DMBAは、過形成、異形から管の完全閉塞まで、さまざまな腺管病変を誘発する。腺管病変/管切片の総数の割合を決定した。ここでも、濃度12.5μg/mlのp28はMDL形成を15%だけ抑制した。しかし、25μg/mlでは、50μg/mlのアズリンに匹敵する有意な病変阻害を示した。濃度12.5μg/ml超のp28の効果は統計的に有意であった(p<0.01、フィッシャー直接検定)。これらの結果を図4にまとめた。化学予防剤の効果はしばしばMALとMDLで異なり得る。例えば、タモキシフェンはMDLの発達は阻害するがMALの発達は阻害しない。アズリン及びp28がエストロゲン及びプロゲステロンに依存性の腺管病変並びに非依存性の胞巣状病変の両方を阻害するということは興味深い。
この例は、p28及びアズリンの両方が乳組織における前癌性病変の発達を防止し得ることを示している。したがって、p28及びアズリンは哺乳動物患者中で化学予防剤として使用され得る。
遺伝子送達用の潜在的ベクターとしてのクプレドキシン及び誘導体ペプチドの癌細胞選択的透過
クプレドキシンファミリーのタンパク質の一員であり緑膿菌から単離されたアズリンは、癌細胞に移入し、p53を介したアポトーシスをインビトロ及びインビボで誘導する。潜在的な遺伝子送達用ベクターとしての陽イオン性及び陰イオン性のクプレドキシン及び由来ペプチドの透過の選択性を評価した。以下のクプレドキシンを試験した:アズリン(14kDa、pI5.7)、ラスチシアニン(17kDa、pI8.0)、及びプラストシアニン(11kDa、pI5.4)。その結果、アズリンの透過が最も選択的であることが示された。
アズリン(azu)の25アミノ酸(a.a.)断片を合成し、種々の癌細胞及び組織学的に対応する正常細胞への透過を評価した。共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリー(FACS)による分析により、Alexafluor568(800Da)で標識された18アミノ酸(1.7kDa、azu50〜67)断片(p18)がヒトメラノーマ(Mel−2、7、29)、乳房(MCF−7)、卵巣(SK−OV3)、膵臓(CAPAN−2)、膠芽腫(LN−229)、アストロサイトーマ(CCF−STTG1)、前立腺(LN−CAP)、及び腎臓(ACHN−CRL1611)の細胞株を選択的に透過するが、それらのそれぞれの対照は透過しないことが示された。LDHの放出及び溶血アッセイから、p18は、透過中に癌細胞膜構造を破壊せず、ヒト赤血球の溶血を生じることが示された。このことは、p18が膜構造を破壊せずにヒト癌細胞を透過することを示唆している。Mel−2細胞を、細胞内部移行の特異的阻害剤(サイトカラシンD:アクチン重合化の阻害;タキソール:微小管脱重合化の阻害;クロルプロマジン:クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害;アジ化ナトリウム:代謝阻害;又はスタウロスポリン:細胞周期阻害)で前処理してもp18の透過にほとんど影響はなかった。しかし、Mel−2細胞をナイスタチン(カベオラ形成阻害剤)及びブレフェルジンA(ゴルジ装置破壊剤)と一緒にインキュベートするとp18の透過が有意に阻害されたことから、エンドサイトーシスプロセスが、一部、p18の透過に関与していることが示唆される。異種移植されたメラノーマ腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおいて赤外色素(λem=800nm)で標識されたp18をイメージングした結果、正常な臓器及び組織に蓄積されず、原発性s.c.腫瘍への選択的取込み及び遠隔臓器転移が明確に示された。したがって、本発明のペプチド(例えば一実施形態ではp18)は、遺伝子(すなわち任意のDNA/RNA断片)治療用の非ウイルスベクターとして大きな有用性を有するようである。
プラスミド構築
較正DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、融合グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)−切断型wtアズリン(azu)誘導体を発現するプラスミドを構築した。図5は種々の切断型wtアズリンコンストラクトの模式図である。pGST−azu36〜128の場合、増幅されたPCR断片を市販のGST発現ベクターpGEXSX(08855、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャムバイオサイエンス社製)のBamHl及びEcoRl部位に挿入した。この断片を、pUC19−azuを鋳型とし、プライマー5’−CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC−3’(配列番号78)及び5’−CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG−3’(配列番号79)(追加的に挿入されたBamHl部位及びEcoRI部位にそれぞれ下線を引いた)を用いて増幅した。QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(92037、カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製)を用いて終止コドンを導入することでazu遺伝子のカルボキシル末端切断を累加的に行った。
pGST−azu36〜50、pGST−azu36〜77、及びpGST−azu36〜89の場合、それぞれSer51、Ser78、及びGly90に終止コドンを導入した。pGST−azu36〜128を有するプラスミドを鋳型DNAとして用いた。部位特異的突然変異誘発に用いたこれら3組のオリゴヌクレオチドを以下に示す。pGST−azu36〜50では、5’−GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG−3’(配列番号80)及び5’−CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC−3’(配列番号81)。pGST−azu36〜77では、5’−CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C−3’(配列番号82)及び5’−GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G−3’(配列番号83)。pGST−azu36〜89では、5’−CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC−3’(配列番号84)及び5’−GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG−3’(配列番号85)。プラスミドpGST−azu50〜77及びpGST−azu67〜77を、pGST−azu36〜77を鋳型DNAとして用いたPCRにより作製した。
増幅されたPCR断片azu50〜77及びazu67〜77は、フォワードプライマーに5’−CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G−3’(配列番号86)及び5’−CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG−3’(配列番号87)(追加で導入したBamHI部位を下線で表す)を用いて得られた。どちらもリバースプライマーには5’−CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG−3’を使用した(配列番号88)。
gst−azu50〜77を有するプラスミドを用いて、以下のオリゴヌクレオチドでGly67に終止コドンを導入することでpGST−50〜66を作製した:5’−GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C −3’(配列番号89)及び5’−GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC−3’(配列番号90)。緑色蛍光タンパク質をコードする緑色蛍光タンパク質遺伝子(gfp)もPCRで増幅した。使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーは、各オリゴヌクレオチドの5’末端にBamHl部位及びEcoRI部位を含む、5’−CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG−3’(配列番号91)及び5’−CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G−3’(配列番号92)である。得られたPCR断片をpGEXSXベクター中にライゲーションして、pGST−GFPを作製した。gst−gfp−azu50〜77を有するプラスミドDNAの作製には、pGSTazu50〜77を鋳型とし、プライマー5’−CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CATGCA GGG−3’(配列番号93)及び5’−TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C−3’(配列番号94)(それぞれ導入したXhoI及びNotI部位を下線で示す)を用いたPCRによってazu−50〜77遺伝子を増幅させた。精製azu50〜77断片をpGST−GFPのXhol及びNotlの唯一の制限酵素部位に導入した。
タンパク質の精製
wtアズリン及びM44KM64E変異体アズリンを作製し、参照により本明細書に援用するYamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.101, pp.4770−75(2004)及び同時係属中の米国特許出願10/720,603号に記載されているように精製した。簡潔には、Kukimoto et al, FEBS Lett, vol.394, pp87−90(1996)に記載されている方法に従ったPCRによりwtアズリン遺伝子を増幅した。PCRは緑膿菌株PAO1のゲノムDNAを鋳型DNAとして用いて行った。
増幅されてHindlll及びPstlで消化された545bpのDNA断片をpUC19の対応する部位に挿入し、アズリン遺伝子がlacプロモーターの下流に位置するようにすることで、発現プラスミドpUC19−azuAを作製した。大腸菌JM109をアズリン遺伝子発現のための宿主株として用いた。組換え大腸菌株を、50μgml−1のアンピシリン、0.1mMのIPTG;及び0.5mMのCuSOを含む2YT培地中で16時間、37℃で培養し、アズリンを産生させた。
M44KM64E変異体アズリンを作製するために、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製)を用いてアズリン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行った。変異はDNAシークエンシングで確認した。
アシディチオバジルス・フェロオキシダンス(Acidithiobadilus ferrooxidans)のクプレドキシンであるラスチシアニンをコードするrus遺伝子を有するプラスミドDNA(pET9a)は日本、千葉の財団法人電力中央研究所のKazuhiko Sasaki博士から寄贈された。
Sasaki, K., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.67, pp.1039−47(2003)の方法を若干改変して用い、rus遺伝子を乗せた大腸菌BL21(DE3)からラスチシアニンを単離した。簡潔には、ベータ−アラニンバッファー(pH4.0)及びTSK−ゲルCM−650カラム(18936、ペンシルベニア州モンゴメリービルのトーソー・バイオサイエンス社(Tosoh Bioscience, LLC)製)の代わりに酢酸バッファー(pH4.0)及びCM−セファロース(63178、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社製)を使用した。2つの別の精製クプレドキシン、フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン及びアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリンはそれぞれ、英国ケンブリッジ大学のDr. Beatrix G. Schlarb−Ridley及び英国ニューカッスルアポンタイン大学のDr. Christopher Dennisonからの寄贈である。
全ての組換えGST融合誘導体を以下のように精製した:大腸菌BL21を宿主株として使用した。Lブロス中で初期対数増殖期に0.4mMのIPTGで誘導した後、グルタチオンセファロース4Bアフィニティークロマトグラフィー及びセファデックス75ゲルろ過カラムとPBS(08855、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャムバイオサイエンス社製)を用いて、細胞抽出物からGST融合タンパク質を精製した。ALEXA FLUOR(登録商標;97402、オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブス社(Molecular Probes、Inc.)製)で標識された精製タンパク質、wtアズリン、及びGST誘導体、又はその他のバリアントをメーカーの取扱説明書に従って単離した。結合しなかった遊離の蛍光化学物質はゲルろ過カラムで除去した。
細胞培養
その内容を参照により本明細書に援用するYamada, T. et al Infect. Immun. vol.70, pp.7054−62(2002);Goto, M., et al. Mol Microbiol, vol.47, pp.549−59(2003);及びYamada, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.99, pp.14098−103(2002)に記載されているように、J774及びUISO−Mel−2細胞(米国メリーランド州フレデリックのフレデリック癌研究開発センター(Frederick Cancer Research and Development Center)から入手可能)を培養した。ヒト正常線維芽細胞(シカゴのイリノイ大学シカゴ校(UIC)の外科腫瘍学部(Department of Surgical Oncology)の保存培養コレクション(stock culture collection))を、2mMのL−グルタミン、0.1mMのMEM必須アミノ酸を含み10%熱失活ウシ胎児血清、100ユニット/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンが添加されたイーグル塩とMEM培地で培養した。Punj et al. Oncogene 23:2367−78(2004)に記載されているようにMCF−7及びMOF−10F細胞を培養した。
J774、UISO−Mel−2、及び線維芽細胞の共培養並びに共焦点顕微鏡法
J774、UISO−Mel−2、及び線維芽細胞を個別のカバースリップ上で培養した。一晩インキュベートした後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、3種類全ての細胞株を、ALEXA FLUOR(登録商標)568がコンジュゲートされたwtアズリン200μg/mlを含む培養皿に入れた。次いで、細胞を5%CO下にて37℃で0.5又は3.5時間インキュベートした。
顕微鏡試料を調製するために、37℃で一晩、細胞をカバースリップ上で培養した。タンパク質処置する前に培養細胞を37℃又は4℃に2時間置いた。予め温めた37℃の新鮮な培地又は氷冷した4℃の新鮮な培地を赤色蛍光(ALEXA FLUOR(登録商標)568で標識された)クプレドキシン又はGST融合誘導体と混合し、細胞とインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、−20℃でメタノールを用いて5分間固定した。PBSで2回洗浄し、核を染色するための1.5μg/mlの4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)(VECTASHILD、カリフォルニア州バーリンゲームのベクター社製)を含む封入剤を添加した後、共焦点顕微鏡で画像を撮った。
J774細胞中へのクプレドキシンの移入
wtアズリン、その変異体バリアントM44KM64E、プラストシアニン、シュードアズリン、及びラスチシアニンを実施例6と同様にJ774細胞とインキュベートし、共焦点顕微鏡を用いて細胞を調べた。これらの実験では、クプレドキシンを赤色の蛍光を放たせるためのALEXA FLUOR(登録商標)568とコンジュゲートし、200μg/mlの濃度で37℃にて1時間、J774細胞とインキュベートした。また、別の実験で、野生型のアズリン及びラスチシアニンを約6〜7μMの濃度で37℃にて1時間、J774細胞とインキュベートした。核をDAPIで青色に染色した。これらのタンパク質のない対照も維持した。全ての場合で、J774細胞の細胞質ゾル中へのクプレドキシンの移入が見られた。同様の実験で、オーラシアニンA及びBはMCF7癌細胞に優先的に移入し、対照の非癌細胞には移入しなかった。
種々の細胞型へのwtアズリン及びラスチシアニンの移入
wtアズリンは、MCF−7細胞と比べてMCF−10F細胞への細胞毒性活性が低い(Punj et al. Oncogene 23:2367−2378(2004))。J774、腹腔マクロファージ、肥満細胞、ヒト乳癌MCF−7、及びヒト正常上皮MCF−10F細胞(シカゴにあるイリノイ大学シカゴ校(UIC)の外科腫瘍学部の保存培養コレクション)を実施例5と同様に処置して調べ、wtアズリンがこれらの細胞に移入できるかどうかを試験した。
wtアズリンは45mmのインキュベーション中にJ774細胞中に内部移行した。しかし、腹腔マクロファージ又は肥満細胞中へのwtアズリンの内部移行は非常に非効率的であった。6時間のインキュベーション後も、これらの細胞への移入は非常に限定的であった。同様に、wtアズリンは乳癌MCF−7細胞に効率的に移入したが、正常乳腺MCF−10F細胞中への移入速度は非常に低かった。
Alexa fluor(登録商標)コンジュゲートアズリンはUISOMel−2及びMCF−7癌細胞には効率的に移入したが、正常乳腺MCF10A1細胞には移入しなかった。しかし、Alexa fluor(登録商標)コンジュゲートラスチシアニンは、UISO−Mel−2及びMCF−7癌細胞だけでなく正常MCF10A1細胞にも移入した。細胞質ゾル中に一様にラスチシアニンが分布されている癌細胞中とは異なり、MCF10A1細胞中ではラスチシアニンの多くが核を囲む核膜腔中に隔離されていた。
wtアズリン介在性の細胞毒性及び成長阻害
種々の細胞へのwtアズリンの移入の特異性を更に評価するために、37℃で30分間又は3.5時間インキュベートしている間のJ774、UISO−Mel−2、及び正常線維芽細胞中へのAlexa fluorコンジュゲートwtアズリンの移入を調べた。wtアズリンは30mmではJ774及びUISO−Mel−2細胞中への急速な移入が見られたが、この期間中に線維芽細胞の細胞質ゾル中に見られたwtアズリンは極微量であった。3.5時間インキュベーション後、線維芽細胞中では少量のwtアズリンだけが確認された。
その内容を参照により本明細書に援用するYamada, T., et al. Infect. Immun. 70:7054−62(2002), Goto, M., et al Mol. Microbiol 47:549−59(2003)、及び2003年11月24日付で提出された同時係属中の米国特許出願第10/720,603号に記載されているように、wtアズリンの細胞毒性を測定するための3(4,5ジメチルチアゾール−2−イル−2,5テトラゾリウムブロミド)(MTT)アッセイを行った。図1(b)は、24時間インキュベーション中にJ774及びUISO−Mel−2細胞でのみ有意なwtアズリン介在性の細胞毒性が観察されたことを示している。
M44KM64E変異体アズリンはJ774細胞中でアポトーシス誘導活性をほとんど示さなかったが、1mg/mlの濃度でG期からS期への細胞周期進行を有意に阻害した(約95%)。細胞周期進行は、その内容を参照により本明細書に援用するHiraoka, Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.101:6427−32(2004)及びYamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:4770−75(2004)に記載されているようにフローサイトメトリーを用いて分析した。図1(a)は、線維芽細胞を500μg/ml又は1mg/mlのM44KM64E変異体アズリンで処置した時に、細胞周期進行の阻害の程度が約20%であったことを示している。
線維芽細胞及びMCF−10F細胞へのwtアズリンの微量注入
Punj, V., et al., Oncogene 23:2367−78(2004)に記載されている方法を用いてwtアズリンを線維芽細胞及びMCF−10F細胞に微量注入した。核DNAの凝縮及び断片化につながるアポトーシスの誘導について細胞を調べた。有意な核DNA(DAPIで青色に標識されている)の凝縮及び断片化は、微量注入された単一細胞中においてwtアズリンと5時間インキュベートした後には観察されたが、アズリンとの30分間のインキュベーション中には観察されなかった。
37℃におけるwtアズリン融合誘導体の内部移行
実施例1と同様にN末端及びC末端の両方が切断されたwtアズリンの一連のGST融合体を作製し、精製した(図2(a)及び2(b))。ALEXA FLUOR(登録商標)568をコンジュゲートしたwtアズリン、GST、及びGST−azu融合誘導体を用いて、37℃で1時間のインキュベーション中におけるJ774細胞中への内部移行を実施例5に記載の方法を用いて調べた。核はDAPIで染色した。
wtアズリンは内部移行したが、GSTは細胞周辺に残り、内部移行しなかった。GST−azu36〜128及びGST−azu36〜89は、GST−azu36〜77同様、内部移行した。しかし、更なる切断型から、GST−azu50〜77は内部移行するが、GST−azu36〜50は非常に非効率的であり表面上で凝集塊を形成するようであることが示された。
4℃におけるアズリン融合誘導体の内部移行
4℃でインキュベートしたJ774細胞中へのwtアズリン及びGST−azu融合誘導体の内部移行を調べた。4℃では、1時間のインキュベーション中におけるJ774細胞中へのwtアズリンの内部移行が極度に損なわれた。GST−azu36〜128及びGST−azu36〜89でも同様に損なわれた。更に短いGST−azu36〜77、GST−azu50〜77、GST−azu50〜66、及びGST−azu67〜77も4℃での内部移行が極度に損なわれていた。
J774及びメラノーマUISO−Mel−2細胞におけるGST−GFP−azu50〜77融合タンパク質のエネルギー依存的内部移行
GSTをGFPと融合させてGST−GFP融合誘導体を作製した。更に、azu50〜77をGST−GFP(M53kDa)融合タンパク質に融合させた(図6(a))。精製したGST、GST−GFP、及びGST−GFP−azu50〜77融合誘導体の移動度をSDS−PAGEで調べた(図6(b))。検出にはクーマシーブルー染色及び抗アズリン抗体を用いたウェスタンブロッティング(図6(c))を用いた。
種々の濃度のGST−GFPで処置したJ774細胞のフローサイトメトリー法による測定から、このタンパク質がJ774細胞に結合することが示された。種々の濃度のGST−GFP−azu50〜77融合タンパク質で処置したJ774細胞をフローサイトメトリーで分離すると、GST−GFPのみよりも蛍光が有意に減少していた(図7)。哺乳動物細胞中にGFPが内部移行すると蛍光が消失することが知られている。この蛍光の減少はJ774細胞を200μg/mlのGST−GFP−azu50〜77融合タンパク質で処置して37℃で更に長い時間インキュベートした時にも見られた。
GST−GFP及びGST−GFP−azu50〜77の結合及び内部移行の特徴に何らかの差があるかどうかを調べるために、J774及びUISO−Mel−2細胞の両方をGST−GFP及びGST−GFP−azu50〜77と一緒に37℃及び4℃でインキュベートした。共焦点顕微鏡を用いて緑色蛍光を観察した。J774細胞では、GST−GFP融合タンパク質は37℃及び4℃のいずれにおいても表面に結合し、内部移行しなかった。一方、GST−GFP−azu50〜77は37℃では内部移行したが4℃では内部移行しなかった。UISO−Mel−2細胞では、GST−GFP融合タンパク質は37℃及び4℃の両方で表面に維持されていた。一方、J774細胞同様、GST−GFP−azu50〜77融合タンパク質は37℃では内部移行したが4℃では内部移行しなかった。
細胞膜の透過及びエンドサイトーシスメカニズムによる哺乳動物細胞中へのWtアズリンの移入
wtアズリンの移入が受容体介在性エンドサイトーシスのみに依存して移入する場合、移入は、ミトコンドリアのエネルギー生産の脱共役剤であるプロトノフォアカルボニルシアニドm−クロロフルニルヒドラゾン(CCCP)でブロックされるか、非標識のアズリン又は受容体をブロックするその他のクプレドキシンとプレインキュベートすることでブロックされる。J774及びUISO−Mel−2細胞を、10倍過剰濃度のクプレドキシンと4℃で2時間インキュベートし、細胞を十分に洗浄してクプレドキシンを除去し、ALEXA FLUOR(登録商標)568コンジュゲートアズリンと37℃で1時間インキュベートした。クプレドキシンで処置しなかった細胞と同程度の内部移行アズリンが存在した。受容体介在性エンドサイトーシスの公知の阻害剤であり細胞マイクロフィラメントネットワークを破壊するサイトカラシンD(63195、ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社から入手可能)及びゴルジ装置を破壊して古典的な小胞介在性の分泌を阻害することが知られているブレフェルジンA(63195、ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社から入手可能)の影響も試験した。濃度20pMのCCCP及び0.25〜0.5pMのサイトカラシンDはUISO−Mel−2細胞中へのアズリンの取込みを有意に減少させた。一方、ブレフェルジンAは有意な影響を与えなかった。
UISO−Mel−2細胞中へのGST−PEDIII−azu50〜77融合誘導体の移入
Hwang, J. et al, Cell 48:129−36(1987);Reiter, Y. and Pastan, I, Trends Biotechnol. 16:513−20(1998)に記載されているように緑膿菌外毒素AドメインIII(PEDIII)のGST融合体を構築した。このGST−PEDIII融合誘導体は外毒素Aのアミノ酸381〜613を含む。PEDIIIは、真核細胞中でADPリボシルトランスフェラーゼ活性を有し且つ真核生物の伸長因子2を阻害することにより真核細胞中で細胞タンパク質合成を阻害することが知られている。
GST−GFP−azu50〜77の場合と同様にPCRを用いてazu50〜77配列をGST−PEDIII融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した(図8(a))。これら2種類の融合タンパク質(GSTPEDIII及びGST−PEDIII−azu50〜77)をグルタチオンセファロース4Bカラムクロマトグラフィーにより52kDa及び54kDaのタンパク質として精製した(図8(b))。次いで、UISO−Mel−2及び正常線維芽(FBT)細胞を種々の濃度のこれらのタンパク質と37℃で24時間インキュベートし、実施例9に記載したようにMTTアッセイにより細胞死の程度を求めた。
GST−PEDIIIは低い細胞毒性しか示さなかったが、GST−PEDIII−azu50〜77融合タンパク質は、UISO−Mel−2細胞中への効率的移入による高い細胞毒性を有していた(図8(c))。一方、これらの融合タンパク質は線維芽細胞に対する細胞毒性レベルは低かった。
wtアズリンのαヘリックスの不安定化はUISO−Mel−2細胞中への内部移行に実質的に影響を与えない
αヘリックスがアズリンの移入に関与するかどうかを調べるために、wtアズリンの54、61、及び70位に3個のヘリックス不安定化プロリン残基を導入し(図6)、全長A54PT61PK70P変異体アズリンのUISO−Mel−2細胞への移入を調べた。これらの位置の単一突然変異体及び二重突然変異体も構築し、移入について試験した。A54PT61PK70P変異体アズリンは、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社製)を用いたアズリン遺伝子の部位特異的突然変異誘発により作製した。
これらの変異体を200μg/mlでUISO−Mel−2細胞と37℃で1時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。全ての場合において、ALEXA FLUOR(登録商標)568コンジュゲート変異体アズリンはUISO−Mel−2細胞中に移入した。同様に、GST−GFP−azu50〜77融合タンパク質及びその三重A54PT61PK70Pazu変異体バリアントのUISO−Mel−2細胞中への移入を調べたが、有意な差は観察されなかった。
UISO−Mel−2細胞中へのGST−PEDIII−ラスチシアニン融合誘導体の移入
緑膿菌外毒素AドメインIII(PEDIII)のGST融合体を実施例15と同様に作製した。GST−GFP−azu50〜77の場合と同様にPCRを用いて、全長ラスチシアニン配列をGST−PEDIII融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した。融合タンパク質をグルタチオンセファロース4Bカラムクロマトグラフィーにより精製した。次いで、UISO−Mel−2及びFBT細胞を種々の濃度の融合タンパク質と37℃で24時間インキュベートし、実施例7に記載したようにMTTアッセイを用いて細胞死の程度を測定した。
GST−PEDIII−ラスチシアニン融合タンパク質はUISO−Mel−2細胞に対して高い細胞毒性を示した(図9)。一方、この融合タンパク質はFBT細胞に対しては低いレベルの細胞毒性しか示さなかった。
ヒト細胞株中へのp18及びp28の移入
細胞培養及び細胞株:ヒトの癌及び非癌(不死化及び非不死化)細胞株をATCCから入手した[肺癌(A549及びNCI−H23腺癌)、正常肺(CCD−13Lu)、前立腺癌(DU145及びLN−CAP)、正常前立腺(CRL11611)、乳癌(MCF−7)、正常乳房(MCF−10A)、結腸癌(HCT116)、正常結腸(CCD33Co)、線維肉腫(HT1080)、及び卵巣癌(SK−OV3腺癌)]。皮膚から単離した正常線維芽細胞を樹立した。正常卵巣細胞(HOSE6−3)はDr.S.W.Tsao(香港大学)から寄贈された。メラノーマ系統(UISO−Mel−2、23、29)を樹立及び特徴解析した。UISO−Mel−2を除く全ての細胞を、10%熱失活ウシ胎児血清(ジョージア州ローレンスビルのアトランタバイオロジカル社(Atlanta Biological Inc.)製)、100ユニット/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加したMEM−E(カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製)中で、37℃、5%CO又は空気中で培養した。
増殖アッセイ/細胞成長:メラノーマ細胞を12×103細胞/ウェルの密度で平底24ウェルプレート(ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製)に播種(4複製(replicate))した。24時間後、培地を交換し、新鮮なp18、p28、アズリン、又はペプチドを含まない同様な体積の培地(8複製)を72時間毎日添加した。次いで、細胞をベックマンコールター(Z1コールター粒子カウンター)で計数した。値は4つの複製の平均値±SDを表す。
MITTアッセイ:メラノーマ細胞を2000細胞/ウェルの密度で平底96ウェルプレート(ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製)に播種し、24時間付着させた。次いで、新たに調製したペプチド(10μl)又は培養培地を各ウェルに添加した。24時間後、培地を交換し、p18、p28、又はアズリンを毎日添加した。72時間インキュベートした後、10μlのMTT試薬(メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社(Trevigen)製)を各ウェルに添加し、試料をRT/sigで3時間インキュベートし、界面活性剤100μlを各ウェルに添加し、更に37℃で3時間試料をインキュベートした。SpectraMax340プレートリーダー(カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社製)で吸光度を測定し、非処置対照と比較した処置細胞の570nmの吸光度変化率を決定した。値は平均値±−SDを表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントt検定により決定した。
ペプチド合成:p18(Leu50〜Gly67:LSTAADMQGVVTDGMASG(配列番号25))、p28(Leu50〜Asp77:LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号2))、p18b(Val60〜Asp77:VTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号34))、MAP、マストパラン−7、及びポリアルギニン(Arg)(配列番号95)を含む全てのアズリン由来ペプチドはC S Bio社(C S Bio, Inc.;カリフォルニア州メローパーク)による合成である。ペプチドは分注された凍結乾燥粉末として受け取り、気密デシケーター中に−20℃で保存した。その後、全てのペプチドを質量分析法及び逆相HPLCで分析し、95%超の純度及びマスバランス(mass balance)であることを確認した。
アズリンペプチドの予測モデル化:GENETYXソフトウェア(ver.6.1)を用いてアズリン由来ペプチドのRobsonの構造モデルを作製した(Gamier, J., Osguthorpe, D. J., and Robson, B., J Mol Biol, 120:97−120(1978))。MAPASソフトウェアを用いて、強く膜に接触する所与のタンパク質構造を予測し、そのような接触部を最も形成し易いタンパク質表面領域を決定した(Sharikov, Y. et al, Nat Methods, 5:119(2008))。タンパク質すなわちアズリンが、膜親和性残基スコア(MRS)>3、膜親和性領域スコア(MAS)>60%、及び膜親和性非対称係数(Kmpha)>2.5である場合、タンパク質は真の膜接触領域を有する確率が高い。
ペプチド/タンパク質標識:ペプチドを1mlのPBSに溶解させ、Alexafluor568色素(オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ社製)とタンパク質:色素の比率1:2で混合し、100μlの重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を連続撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。p12にはSlide−A−Lyzerg Dialysis Cassettes 1000 MWCO、その他のものには2000 MWCO(イリノイ州ロックフォードのピアース・バイオテクノロジー社(Pierce Biotechnology)製)を用いて、冷PBSに対して透析することで、標識ペプチドを遊離の色素から分離した。
細胞透過/共焦点分析:細胞をガラス製のカバースリップ上に播種し、5%CO下にて37℃で一晩付着させた。細胞を新鮮な培地ですすぎ、予め温めた、Alexafluor568標識アズリンペプチド(20μM)若しくはArg8(配列番号95)(5μM)を含む培地中又は培地のみの中で、37℃にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをPBSで3回すすぎ、細胞を2.5%ホルマリンで5分間固定し、PBSで2回、d.i.HOで1回洗浄し、カバースリップを、核対比染色用の1.5μg/mlのDAPI(カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製VECTASHIELD(登録商標))を含む培地中でマウントした。細胞の取込み及び分布を倒立共焦点レーザー走査顕微鏡(ドイツ、ゲッティンゲン、カールツァイス社(Carl Zeiss Inc.)のモデルLC510)下で撮影した。
ガラス製カバースリップ上で成長中の細胞をAlexafluor568で標識されたアズリン又はペプチドと37℃にて2時間インキュベートすることで、リソソーム又はミトコンドリアとペプチドの共局在を調べた。Mitrotracker(MitroTracker(登録商標) Green FM、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製)又はlysotracker(LysoTracker(登録商標) Green DND−26、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製)をインキュベーションの最後の30分間に添加した(終濃度1μM)。細胞をPBSで3回すすぎ、2.5%ホルマリンで5分間固定し、PBSで2回洗浄し、0.1%トリトン−X100を含むPBS中で15分間インキュベートした。次いで、細胞を1μg/mlウサギ抗ヒトゴルジン(golgin)97又は抗ヒトカベオリンI(マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcam社製)を含むPBS中で1%BSAと共にインキュベートした。4℃で1時間インキュベートした後、カバースリップをPBSで1回洗浄し、Alexafluor 468コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を含むPBS中で10分間インキュベートし、PBSで2回、d.i.H2Oで1回洗浄した。次いで、カバースリップを核対比染色用の1.5μg/mlのDAPIを含む培地中でマウントした。Alexafluor568(赤色)とAlexafluor468(緑色)の共局在(黄色)を分析し、撮影した。
カバースリップ上のUISO−Mel−2細胞を、100μg/mlのヘパリン硫酸(ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ社製)を含むMEM−E中で30分間プレインキュベートし、p18、p28、又はArg(配列番号95)を終濃度が20μMになるように添加した。1時間後、カバースリップを前述のように洗浄、固定、及び分析した。
FFACSによる細胞透過:細胞(1.0×10/500μlPBS)を、Alexafluor568で標識したp18若しくはp28(20μM)、Arg(5μM)と又は培地のみと37℃で2時間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、2.5%ホルマリンで5分間固定し、PBSで2回洗浄し、200μlのPBSに再懸濁し、篩に通して単一細胞懸濁液を得た。MoFlo Cell Sorter(デンマーク、グロストルップ(Glostrup)のDako社製)λex568nm及びλem603nmを用いて試料を分析し、バックグラウンドレベルに対する平均蛍光強度の倍率を計算した。結果は3つの別々の実験の平均蛍光を表す。
移入阻害剤:37℃でフェノールレッド及び血清を含まないMEM−E中に維持したUISO−Mel−2細胞(3×10/300μl)を以下を含む阻害剤で前処置した:クロロプロマジン(Chloropromazine)(クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤、10μg/ml、60分間);アミロリド(マクロピノサイトーシス阻害剤、50μM、30分間);ナイスタチン(50μg/ml、30分間);メチル−β−シクロデキストリン(MβCD、5mM、60分間);フィリピン(カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤、3μg/ml、60分間);タキソール(微小管安定化剤、20μM、30分間);スタウロスポリン(細胞周期阻害剤、250nM、10分間);アジ化ナトリウム(代謝阻害剤、1mM、60分間);ウアバイン(ATPase依存性Na+/K+ポンプ阻害剤、50mM、60分間);ブレフェルジンA(BFA;ゴルジ装置破壊剤、100μM、60分間);ワートマニン(初期エンドソーム阻害剤、100nM、30分間);モネンシン(後期エンドソーム/リソソームにおける阻害、10μM、60分間);ノコダゾール(カベオソーム形成を阻害、10μM、60分間);サイトカラシンD(アクチンフィラメント及び微小管破壊剤、5μM、30分間);ベンジル2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシド(BnGalNac;O結合型グリコシル化阻害剤、3mM、48時間);ツニカマイシン(N結合型グリコシル化阻害剤、20μg/ml、48時間);及びノイラミニダーゼ(タンパク質からシアル酸残基を切断、IU/ml、30分間)。終濃度は個々の阻害剤の用量反応曲線から決定した。次いで、Alexafluor568標識されたp18又はp28(20μM)を添加し、1時間インキュベートし、細胞を洗浄及び固定し、前述したようにサイトメトリー分析用に調製した。
細胞膜毒性アッセイ/LDH漏出アッセイ:LDH漏出アッセイをメーカーの取扱説明書(CytoTox−One、ウィスコンシン州のプロメガ社)に従い100μlのUISO−Mel−2細胞(5×10)を用いて行った。ペプチド/タンパク質なしの細胞を負の対照として用いた。実験は3回繰り返した(データは平均値±SEMを表す)。
溶血アッセイ:ヒト全血試料(2〜3ml)を1000×gで10分間遠心し、ペレットをPBSで1回、pH7.4のHKRバッファーで1回洗浄した(18)。次いで、赤血球が4%となるように細胞ペレットをHKRバッファーに再懸濁し、50μlを、ペプチド、アズリン(5、50、及び100μM)、又は0.1%トリトンX−100を含むHRKバッファー950μlと共に1.5ml試験管に移してRBC膜を完全に破壊した。MAP及びマストパラン7(カリフォルニア州トランスのBachem California, Inc.社製)を正の対照とした。37℃で30分間回転させながらインキュベートした後、チューブを1000×gで2分間遠心し、上清300μlを96ウェルプレートに移し、540nmの吸光度を記録した。
移入のカイネティクス:1.5mlチューブ中のUISO−Mel−2細胞(5×10細胞)をフェノールレッドを含まないMEME培地に懸濁した。Alexa fluor568コンジュゲートp18を0、10、20、50、100、150、及び200μMで5、10、15、及び20秒間又はAlexafluor568コンジュゲートp28を1、10、25、50、100、150、及び200μMで30、60、90、及び120秒間氷上で添加することで、反応を開始させた。インキュベーション後、250μlの反応混合液に1mlの冷PBSを添加した。細胞を4℃、600×gで2分間、2回遠心した。各反応液について少なくとも10,000個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、バックグラウンド及び相対蛍光を計算した。
アズリンの 125 I標識及び競合アッセイ:ペプチドの結合及び移入の測定には、UISO−Mel−2細胞を含むHEPES溶液(50,000細胞/ml)を用いた全細胞(whole cell)アッセイを用い、1000倍過剰量の非標識p18、p28、又はアズリン存在下/非存在下で種々の濃度(0〜175nM)の放射性標識されたアズリンと37℃で30分間インキュベートし、次いで氷冷PBSで3回洗浄し、細胞ペレットに残留する放射活性をγ線計数器で測定した。125Iアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン、p18、又はp28存在下での放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
癌細胞中への優先的移入に関与するp28のドメイン
ペプチド−GSTコンストラクトから得られた初期のデータから、アズリンのアミノ酸50〜77が細胞透過のPTDとして定義され、これはアズリン分子を安定化するアズリンの残基54〜67を含むαヘリックス領域を示す構造的証拠とよく一致している。共焦点分析は最初、p28/アズリンのp28及びp18(図10A)がヒトメラノーマ、前立腺癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞を比較的同様な効率で透過するが、組織学的に対応する正常細胞株は同じ程度に透過しないことを示唆していた(図10A)。唯一の例外は肺線維芽細胞に由来する細胞株であるCCD13−Luであった。陽イオン性のArg(配列番号95)は素早く効率的に線維芽細胞(図10A)及び試験した全てのその他の正常細胞株に取り込まれた(データ示さず)。
これらの観察結果は、より感度の高いFACs解析で確認され(図10B)、肺癌を除き、p28及びp18の蛍光は対応する正常細胞株よりもそれぞれ約0.5〜6倍及び約0.5〜3倍高かった。組織学的亜種メラノーマ内でも細胞内蛍光強度に同様なパターンが観察され、p18の相対強度はp28で観察された強度の約50%であった(図10C)。バックグランドに対する蛍光強度も、p28に曝された正常細胞及び癌細胞の組よりもp18に曝された正常細胞及び癌細胞の組で一貫して低く(データ示さず)、ここでも、個々の細胞への移入はp18の方が少ないことが示された。全ての場合で、癌細胞又は正常細胞中へのp18及びp28の移入程度は、移入に優先性の観察されなかったArg(配列番号95)で観察されたよりも有意に低かった(図10A)。予測されたp18のRobson構造(データ示さず)はC末端アミノ酸が部分的なβシートを形成することを示唆している。このこと及びp18がp28の親水性C末端10アミノ酸(アミノ酸68〜77)を欠いており短いことは、アズリンの推定PTDであるp18の癌細胞及び正常細胞への移入が、エンドサイトーシスプロセス又は膜受容体介在プロセスによる移入よりも非エンドサイトーシスプロセスによる移入の方が速いことを示している。MAPASのデータ(MRS 3.74、MAS 87.1、Kmpha 2.37)は、アズリンのアミノ酸69、70、75、76、85が最も膜に接触し易いことを示しており、p18(アミノ酸50〜67)には存在しないp28のC末端領域が細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に接触することを示している。
同じ細胞株をアズリン60〜77(p18b)又はp28のC末端12アミノ酸であるアミノ酸66〜77(p12)に曝すことでp18及びp28の優先的透過を確認した(図11A、B)。ここでは、p18及びp28で観察された優先的透過は完全に消失し、p18b(理論的pI 4.13)は短いαヘリックス及び部分的βシートを有し、極端に親水性であり、これらが合わさって優先的移入が消失している可能性がある。p12(理論的pI 4.33)はαヘリックス二次構造を欠くがやはり親水性であり、全体的な親水性が細胞透過の選択性低下への主要な要因であることが示唆される。
細胞透過は膜破壊の結果ではない
アズリン、p28、及びp18の細胞透過は膜破壊によるものではない。5〜100μMのp28、p18、又はアズリン存在下でUISO−Mel−2細胞を用いたLDH漏出アッセイ(図12A)により、ペプチドもアズリンも形質膜の完全性を変化させて細胞に移入したのではないことが示唆された(18)。膜破壊がないことを、両親媒性αヘリックスとして細胞膜を通過してヘテロ三量体Gタンパク質を活性化する肥満細胞脱顆粒ペプチドマストパラン7及び受容体模倣MAPに対してヒト赤血球へのアズリン、p28、及びp18の溶血活性を測定することで確認した。マストパラン7は25μMで完全な細胞溶解を引き起こしたが、アズリン、p28、及びp18は対照(ペプチドなし)と比べて溶血効果を有さなかった(図12B)。
p18/p28の透過はエネルギー依存的且つ飽和性である
UISO−Mel−2細胞中へのp28(図13A)及びp18(図13B)の透過は温度依存性である。細胞透過及び細胞内輸送は4℃では3時間にわたり比較的ゆっくりと起こるが、22℃及び37℃では移入及び種々のコンパートメントを介した細胞内輸送は素早く起こり、p18及びp28は暴露から2時間以内にUISO−Mel−2細胞の核中に存在した。200倍過剰量の非標識ペプチド存在下で30分後のUISO−Mel−2細胞中への5μMのp28(図13C)又はp18(図13D)の透過は大きく抑制され、このことは、移入が飽和プロセスであり、特異的受容体又は細胞表面のタンパク質若しくは特定の残基が少なくとも一部初期の移入に関与していることを示唆している。
p23及びp18のカイネティクス
ヒト線維芽細胞と比較したUISO−Mel−2細胞中へのp28及びp18のカイネティクスを、インキュベーション後、細胞を固定して平均蛍光強度(MFI)を測定した時に計算した。ペプチド濃度(μM)と速度(MFI/秒)をプロットするかスキャッチャード分析により、各ペプチドのK及びVmaxを算出した。アズリン断片50〜67(p18)及び50〜77(p28)の癌細胞への透過(それぞれVmax 2.46、Km 101.6及びVmax 1.87、Km 159.1)及び正常細胞中への透過(それぞれVmax 2.88、Km 102.1及びVmax 1.89、Km 166.0)は互いに有意に異なりp18が約42%速く移入するが、正常細胞及び癌細胞中への各ペプチドの移入速度は実質的に同じである。p28に癌細胞を暴露した後の方がp18の場合よりも蛍光量が増加しているのは、悪性細胞へのp28の移入量の増加によるものであろう。125Iアズリン及びp18は同様な親和性でUISO−Mel−2細胞に結合した。対称的に、より高い温度(37℃vs4℃)でより長い時間(20分間vs2分間)暴露した場合、p18(K 18分、Bmax 0.51pm)又はアズリン(K 10nm及び0.48pm)よりもp28が有意により高い親和性でより多くUISO−Mel−2細胞に結合した(K 2.5μm、Bmax 3.0pm)。これらの結果は、アズリン、p28、及びp18は全て移入前に癌細胞及び正常細胞の表面の部位に比較的高い親和性及び容量で結合するが、移入は2種以上のメカニズムを介し得ることを示している。
p18/p28の透過にはカベオラ及びゴルジ複合体が関与する
1つのクラスとして、pTat、Arg(配列番号95)等の陽イオン性CPPは、エンドサイトーシスの前に陰イオン性の硫酸化プロテオグリカンに最初に結合することで細胞に移入する。無血清条件下で100μg/mlのヘパリン硫酸(HS)の存在下/非存在下でp28及びp18及びArg(配列番号95)をUISO−Mel−2細胞とインキュベートすると、細胞内のArg(配列番号95)の量は有意に低下するが、p28又はp18の移入は変化しない(図14A)。O結合型グリコシル化の特異的阻害剤BnGalNac及びシアル酸残基を切断するネルアミニダーゼ(neruaminidase)の存在下/非存在下におけるUISO−Mel−2細胞中へのp18及びp28の透過を更に特徴解析した結果(図14B)、透過阻害は観察されなかった。しかし、N結合型グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンは細胞膜を横切るp18及びp28の透過を有意に低下させた。
UISO−Mel−2細胞中へのp18及びp28の移入を、エネルギー依存的輸送機構(すなわちATP)の阻害剤を用いて更に分析した。アジ化ナトリウム(図14B)及びウアバイン(Na ATPaseポンプ)はどちらのペプチドの透過も有意に阻害せず、このことはこれらのペプチドの透過に非エンドサイトーシス経路が関与し得ることを示唆している。クラスリン介在性エンドサイトーシスの特異的阻害剤であるクロルプロマジン(CPZ)も透過に影響を与えず、マクロピノサイトーシス阻害剤であるアミロリドも影響を与えなかった(図14B)。タキソールによる微小管の安定化も透過に影響を与えなかったが、サイトカラシンDを用いたアクチンフィラメントの破壊及びマクロピノサイトーシスはp18及びp28の透過を再現可能に少し(約20%)阻害した。アミロリドが影響を与えなかったことから、サイトカラシンDの阻害活性はアクチンフィラメントへの影響によるものと考えられる。
スタウロスポリンで細胞周期を阻害しても透過はブロックされなかった。このことは、透過が細胞周期特異的でないことを示唆している。p18及びp28の癌細胞形質膜の透過にスタウロスポリンが影響しないことから、Srcキナーゼ/チロシンキナーゼ依存性経路が透過に関与しなかったことと、ダイナミン非依存性、したがってカベオラの出芽(budding)非依存性であることも示唆される。p18及びp28のどちらも、形質膜内に存在しエンドサイトーシス中間体の特定の集団内に存在するタンパク質であるフロチリン−1と共局在せず(データ示さず)、このことも、内部移行におけるフロチリン及びダイナミンの役割を否定している。一方、カベオラ輸送を阻害しコレステロール動員の阻害剤である、したがって、カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤であるノコダゾールは、透過を50〜65%阻害した。
次いで、初期エンドソーム形成阻害剤であるワートマニン、後期エンドソーム/リソソームを阻害するモネンシン、及びゴルジ装置破壊剤であるブレフェルジンA(BFA)を用いてp18及びp28の細胞内配置を解析した。ワートマニンは、p18又はp28のいずれの細胞内蓄積もブロックしなかったことから、コレラ毒素とは異なり、p18及びp28の細胞内輸送にはカベオラから初期エンドソームへの経路が関与しないことが示唆された。p18及びp28の細胞内輸送に初期エンドソームが関与しないことから、クラスリン介在性エンドサイトーシスもこれらのペプチドの内部移行に関与しないことが示唆される。
しかし、モネンシン(図14B)及びBFAは両方のペプチドの細胞内蓄積を低下させ、p28への阻害効果(約30%)はp18への阻害効果(約10%)よりも大きかった(図14B)。線維芽細胞中へのp28及びp18の透過はMβCD、ノコダゾール、モネンシン、及びツニカマイシンでも阻害されたが、アミロリド、アジ化ナトリウム、及びCPZでは阻害されなかった(図14C)。このことは、癌細胞及び正常細胞中への移入の少なくとも1つのメカニズムが類似しているが、癌細胞中への更なる優先的蓄積は、共通する膜の受容体又は構造体(すなわちカベオラ)の数によって変わり得ることを示している(図14D、パネル1、2)。Alexafluor568標識されたp18及びp28はカベオリン−1及びゴルジン97抗体と共局在した(図14D、パネル1、2)ことから、これらのオルガネラがp18及びp28の細胞内輸送に関与することが確認された。興味深いことに、アズリンはミトコンドリア特異的蛍光と共局在したが、p18及びp28はミトコンドリア特異的蛍光と共局在しなかった(図14D、パネル3)。一方、p28及びアズリンはリソソームと共局在したが、p18はリソソームと共局在しなかった(図14D、パネル4)。
p28及びp18の機能的解析
アズリンは複数のヒト癌細胞株の成長をインビトロ及びインビボで阻害する。図15A及びBに、MTT及び細胞計数により測定したUISO−Mel−2細胞に対するp18及びp28の影響をアズリン及びダカルバジン(DTIC)と比較して示す。暴露72時間後、アズリンは100μM及び200μMで細胞生存率を約15%低下させた(p<0.05)(図15A)。p28は100μM及び200μMで細胞生存率をそれぞれ14%及び22%低下させた(p<0.05)。一方、p18は何ら影響を与えず、ダカルバジン(DTIC)はUISO−Mel−2の生存を用量依存的に有意に低下させた。アズリン及びp28(200μM)はUISO−Mel−23細胞及びUISO−Mel−29細胞の生存も有意に低下させた。p18はUISO−Mel−2細胞の増殖に何ら影響しなかった。細胞の直接計数により測定されたp28及びアズリンによるメラノーマ細胞増殖阻害の明らかな上昇(約30〜35%:UISO−Mel−2)は、阻害効果が何らかの遅延後のアポトーシスを伴う細胞周期のレベルに主に存在することを示唆している。p18は、癌細胞を優先的に透過するが、p28とは異なり、細胞増殖に対する阻害活性を実質的に有さない。この結果は、p28の細胞分裂阻害活性及び細胞毒性活性が配列のC末端10〜12アミノ酸にあることを示している。
細胞へのアズリン及びp28の結合及び移入
UISO−Mel−2又は線維芽細胞(3×10細胞)をフェノールレッドを含まないMEME培地に懸濁した。Alexafluor568コンジュゲートp28を10、50、100、150、250、300、及び400μMで30、60、90、及び120秒間氷上で添加することで反応を開始させた。細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞中へのペプチドの取込みを図17Aのグラフに示す。ペプチド濃度(μM)と速度(MFI/秒)をプロットすることでKm及びVmaxを算出した。これらの計算結果を図17Bに示す。ペプチドの結合及び移入の測定には全Mel2細胞(50,000細胞/ml)を用い、1000倍過剰量の非標識p28又はアズリンの存在下/非存在下で種々の濃度の放射標識アズリン(0〜175nM)と一緒に37℃で30分間インキュベートし、細胞ペレットに残留した放射活性をγ腺計数器で計数した。結果を図17Cに示す。125Iアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合とみなし、非標識アズリン又はp28の存在下における放射活性を非特異的結合とみなした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
アズリン由来ペプチドを用いたp53を介した癌成長阻害:材料及び方法
細胞培養
ATCC(バージニア州マナッサス)から入手したヒト乳癌細胞株MCF−7(p53wt)、及びDr.Andrei V. Gudkov(オハイオ州クリーブランドのラーナー研究所(Lerner Research Institute))から寄贈されたMDD2(p53ドミナントネガティブ)を、10%熱失活ウシ胎児血清、100ユニット/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加した、2mMのL−グルタミン、0.1mMの必須アミノ酸を含むMEM−E(カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製)中で培養した。
細菌培養及びアズリンの単離
大腸菌JM109を宿主株として用いて野生型アズリンを生産した。培養条件及びタンパク質精製工程はYamada, et al., Infect Immun, 70:7054−7062(2002)及びGoto, et al., Mol Microbiol, 47:549−449(2003)に記載されている通りである。
ペプチド合成
p18(Leu50〜Gly67:LSTAADMQGVVTDGMASG(配列番号25))、p28(Leu50〜Asp77(配列番号2);LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD)、p18b(Val60〜Asp77(配列番号34):VTDGMASGLDKDYLKPDD)、p12(Gly66〜Asp77:SGLDKDYLKPDD(配列番号35))、及びポリアルギニン(Arg)(配列番号95)を含む全てのアズリン由来ペプチドはCSBio社(カリフォルニア州メンローパーク)により95%超の純度及び質量バランスで合成された。
増殖アッセイ
細胞を12×10細胞/ウェルの密度で24ウェルプレート(ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製)中のMEM−E中に4複製分(quadruplicate)播種し、5、50、100、及び200μMのp28存在下で24、48、及び72時間インキュベートした。培地は毎日交換した。対照のウェルにはp28を含まないMEM−Eを入れた(8複製分)。ドキソルビシン(10μM)を正の対照として用いた(Z1カウンター;カリフォルニア州フラートンのベックマンコールター社製)。値は対照の(%)を表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントt検定により決定した。
MTTアッセイ
MCF−7細胞を2000細胞/ウェルの密度で播種し(4複製(quadruplicate))、24時間付着させ、新たに調製したペプチド(10μl)又はMEM−Eを各ウェルに添加した。24時間後、培地及びp18、p28、アズリン、又はドキソルビシンを毎日添加した。インキュベーション後、10μlのMTT試薬(メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社製)を各ウェルに添加し、試料をRTで3時間インキュベートし、100μlの界面活性剤を各ウェルに添加し、37℃で更に3時間インキュベートした。吸光度(570nm)を測定し(SpectraMax340プレートリーダー;カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社(Molecular Devices Corporation)製)、処置した細胞における変化率を決定した。対照と処置群の間の有意性(p<0.05)はスチューデントt検定により決定した。
異種移植モデル
エストラジオールで前処置(0.72mg/ペレット、60日間放出;フロリダ州サラソータのイノベイティブ・リサーチ社(Innovative Research)製)された雌の胸腺欠損マウス(ハーラン社(Harlan)製;4〜5週齢)の右側腹部に3×10個のMCF−7細胞をs.c.接種し、処置前に対照及び実験群にランダムに分けた。対照動物にはPBS/ひまし油をi.p.投与した。パクリタキセル(15μmol/kg)を含むPBS/ひまし油を腫瘍細胞接種後10、14、21、及び25日目にi.p.注射するか、p28(5又は10mg/kg)を含む滅菌PBSを30日間毎日i.p.注射した。腫瘍体積は週3回測定し、体重は週2回測定した。マウスの死体解剖を31日目に行い、全ての腫瘍を回収して病理組織診断及び免疫細胞化学に用いた。対照と処置群の間の有意性(p<0.05)はスチューデントt検定により決定した。
免疫細胞化学
死体解剖の2時間前にBrdU(50mg/kg体重)をi.p.注射した。BrdUで標識された腫瘍細胞核を抗BrdUモノクローナル抗体(ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製)を用いて特定した。圧力釜中で6分間10mMのクエン酸バッファーで処置したホルマリンで固定した5μのパラフィン切片中のp53の発現を定量した。冷却したスライドを3%Hで10分間処置して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ブロッキング用血清で10分間覆い、p53抗体(DO−1;カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)に室温で2時間曝した。ラット抗マウスIgG2aを二次抗体として用いた。Vectastain Elite ABCキット(カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製)及び3,3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社製)を用いてp53発現細胞を特定した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。各腫瘍周辺の10個の非重複フィールド(250細胞/フィールド)をp53標識細胞についてスクリーニングした(40×)。
共焦点顕微鏡法
細胞を5%CO下、37℃でガラス製カバースリップ上に一晩播種し、新鮮な培地ですすぎ、予め温めたAlexa Fluor568標識ペプチド(20μM)若しくはArg(配列番号95)(5μM)を含む培地又は単独培地中にて37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをPBSで3回すすぎ、2.5%ホルマリンで5分間固定し、PBSで2回、d.i.HOで1回洗浄し、核対比染色用の1.5μg/mlのDAPI(VECTASHIELD(登録商標)、ベクター・ラボラトリーズ社製)を含む培地中でマウントした。固定した細胞を、メタノール及びアセトンで透過処理し、PBSで洗浄し、1:200希釈した抗p21又はサイクリンB(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)とインキュベートし、サイクリンB1及びp21の染色を調べた。二次抗体とコンジュゲートしたAlexa Fluor568を1:100希釈して用いた。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡(モデルLC510;ドイツ、ゲッティンゲンのカールツァイス社製)を用いて細胞取込み及び細胞内分布を調べた。
カイネティクス
MCF−7及びMDD2細胞(3×10細胞)をフェノールレッドを含まないMEM−Eに懸濁した。Alexa Fluor568コンジュゲートp28を1、10、25、50、100、150、及び200μMで30、60、90、及び120秒間氷上で添加することで反応を開始させた。インキュベーション後、反応混合物に1mlの冷PBSを添加し、細胞を2回、4℃、600×gで2分間遠心した。各時点及び濃度について少なくとも10,000個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、そのバックグラウンド及び相対蛍光を算出した。
細胞周期の分析
MCF−7及びMDD2細胞を50μMのp28と一緒に37℃で48時間及び72時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、70%エタノールを用いて−20℃で固定した。固定細胞をPBSで2回洗浄し、20μg/mlのRNase Aを含む50μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)のPBS溶液で染色した。フローサイトメトリー(EPICS Elite ESP;カリフォルニア州フラートンのベックマンコールター社製)を用いてDNA含量を測定した。各実験について最低一万個の細胞を回収した。
イムノブロッティング
MCF−7及びMDD2細胞を50μMのp28と一緒に0、24、48、及び72時間培養し、前述(3)の方法に従って全細胞可溶化物を調製した。リン酸化cdc2(p−cdc2)の細胞可溶化物を10mMのNaF、137mMのNaCl、1mMのNaVO、10mMのEDTA、1%のNP−40、1mMのDTT 及びプロテイナーゼ阻害剤(シグマ・アルドリッチ社製)中に調製した。p53、p27、CDK、サイクリンに対する抗体(以上はサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)、p21に対する抗体(インビトロジェン社製)をメーカーの取扱説明書に従って用いた。モノクローナルアクチン抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)を用いてアクチンの発現を調べ、ECL試薬(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社)を用いてタンパク質バンドを可視化した。
抗p28抗体
p28(カリフォルニア州メンローパークのCSBio社製)のN末端にシステインを導入し、次いで、このペプチドを、システイン残基のチオール基を介してキーホールリンペット・ヘモシアニンにコンジュゲートさせ、この複合体を皮内及び皮下で接種し、ウサギ(ニュージーランドホワイト;ミシガン州のコーヴァンス社(Covance)製)中でp28(アズリンのアミノ酸60〜77)の11〜28アミノ酸に特異的なポリクローナル抗体を産生させた。p28(0〜3μg/ウェル)を用いた直接ELISA法により抗体価を求めた。96ウェルプレート(ニューヨーク州ロチェスターのNunc社製)を1μg/ウェルのp28でコーティングした場合、25℃で基質(1−Step PNPP、イリノイ州ロックフォードのピアース社製)と15分間インキュベートした後の450nmにおける再現可能な吸光度変化0.5を得るには、1:140,000の抗体希釈物で十分であった。
GSTプルダウンアッセイ
本質的にPunj, et al, Oncogene 23:2367−2378(2004)に記載されているようにGSTプルダウンアッセイを用いて、p53へのp28の結合をアッセイした。精製したGST−p28(10及び20μg/反応液)、GST−MDM2(20μg/反応液)、及びGST単独(20μg/反応液)をグルタチオンセファロース4Bビーズ(ニュージャージー州のGEヘルスケア社製)に結合させ、結合しなかったペプチドをPBSで2回洗浄して除去した。プロテイナーゼ阻害剤カクテル(シグマ・アルドリッチ社製)を含むPBS/0.1%トリトンX−100を氷上で15分間用いてMCF−7細胞の全細胞可溶化物を調製し、4℃、14000rpmで30分間遠心した。得られた上清をビーズと混合し、4℃で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄して結合しなかった細胞可溶化物を除去した後、SDS試料バッファー中で煮沸し、10%SDS−PAGEにかけた。膜を、スキムミルク(5%)を含むTBST(Tris/0.05%Tween20)及びポリクローナルp53抗体(FL−393、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)を含む5%スキムミルクと4℃でインキュベートし、TBSTで3回洗浄し、二次ウサギIgG−HRP抗体(シグマ・アルドリッチ社製)を添加し、室温(r/t)で1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄した。
p53上の潜在的結合部位を以下のようにして特定した。p28の存在下(10〜50モル濃度分過剰)でGSTプルダウンアッセイを用いてp53のMDM2結合部位(アミノ酸18〜23)の相互作用を解析し、イムノブロッティング(IB)によりp53のバンドを検出した。入手可能な最も広い範囲のp53をカバーする3つの異なる抗p53抗体、Pab1801(32〜79アミノ酸;サンタクルーズ・バイオテクノロジー社)、ab2433(277〜296アミノ酸;マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcam社製)、及びPab1802(306〜393アミノ酸;サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)をそれぞれp28の存在下でGST−p53不動化ビーズと反応させた。インキュベーション後、試料をPBSで2回洗浄して結合しなかったp28を除去し、ネイティブPAGE試料バッファー(Tri/グリセロール/BPB)中で煮沸し、5%ネイティブPAGEにかけた。エレクトロブロッティング(0.2Ampで1時間)により試料をPVDF膜に移し、膜をスキムミルク(5%)を含むTBSTでブロッキングし、p28に対するポリクローナル抗体(1:5000希釈)を含む5%スキムミルクと4℃でインキュベートした。TBSTで洗浄した後、HRPコンジュゲートウサギ抗IgG抗体(1:7000希釈、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製)を添加した。p28のバンドをECL試薬を用いて可視化した。グルタチオンセファロース4Bビーズ上に不動化したGST−p53(20μg/反応液)に対してp28とp28の断片p12、p18、及びp18bとの間で競合アッセイを行うことでp28上の結合ドメインを特定した。反応液を4℃で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄して結合しなかったp28を除去し、次いで、ネイティブPAGE試料バッファー(Tri/グリセロール/BPB)中で煮沸し、5%ネイティブPAGEにかけた。エレクトロブロッティング(0.2Ampで1時間)によりタンパク質をPVDF膜に移し、ブロッキングし、p28に対するポリクローナル抗体と4℃で16時間インキュベートした。p28のバンドをECL試薬で可視化した。Gel&Graph Digitizing Software、UN−SCAN−IT(商標)(ユタ州オレム(Orem)のシルク・サイエンティフィック社(Silk Scientific Inc.)製)を用いてバンドの強度を決定し、特異的タンパク質/アクチンの比率を算出した。各タンパク質バンドの下に示した数字は、処置直前のタンパク質バンドの強度に対する相対的割合である(0時間を100%として表す)。
p53のDNA結合活性
50μMのp28又はアズリンと24時間インキュベートした後、メーカーの取扱説明書に従いMCF−7細胞から核画分を単離した(Nuclear Extraction kit、カリフォルニア州カールズバッドのアクティブモチーフ社(Active Motif)製)。14,000rpm、4℃で10分間遠心して核抽出物上清を回収した。ブラッッドフォード法を用いてタンパク質濃度を決定した。TransAM p53キット(アクティブモチーフ社製)を用いてp53のDNA結合活性を測定した。簡潔には、DTT及びポリ[d(I−C)]を含む40μlの結合バッファーを各ウェルに添加してp53のコンセンサスオリゴヌクレオチドへの非特異的結合を防いだ。核抽出物を各ウェルに添加し、H処置又はバッファーのみをそれぞれ正及び負の対照とし、r/tで1時間インキュベートした。ウェルを3回洗浄し、100μlのp53抗体(1:1000希釈)を添加し、r/tで1時間インキュベートした。洗浄後、HRPをコンジュゲートした二次抗体を添加し、試料を1時間インキュベートして暗黒化で3分間現像した。DNAへのp53の結合を450及び655nmの吸光度から求めた。
インビトロ及びインビボにおけるヒト癌細胞の成長に対するp28処置の効果
アズリンは、p53介在性アポトーシスの誘導を介して抗癌活性を発揮する。図54A及びBは、直接細胞計数及びMTTアッセイにより決定された、wt p53(正)MCF−7細胞に対するp28及びドキソルビシンの効果を示す。p28は最初、MCF−7細胞の増殖をインビトロで用量及び時間依存的に阻害し(図54A)、細胞数を有意に減少(p<0.05)させ、暴露24時間後に、5μMでは約23%、50〜200μMでは約36%減少させた。ドキソルビシン(DNA挿入剤)も時間依存的に細胞成長を有意に阻害した。MTTアッセイにより求められた細胞生存率はp28では有意に変化しなかったが、ドキソルビシンはMCF−7細胞の生存率を時間依存的に有意に減少させた(図54B)。p28は、30日間毎日i.p.暴露した胸腺欠損マウス中の異種移植されたMCF−7細胞の体積も用量依存的に有意に減少させ(図54C)、腫瘍体積は、体重減少又は行動変化を伴わずに、パクリタキセル(登録商標)で観察される程度にまで減少した(p<0.05)。30日目までに、10mg/kgのp28を毎日i.p.投与すると、腫瘍細胞接種後10、14、21、及び25日目に15μmol/kgのパクリタキセル(登録商標)よりも強く(約20%)MCF−7の成長が阻害された。p28で誘導される腫瘍体積の減少に関連するBrdU標識の減少から細胞周期が阻害されたことが示唆された(表5)。対照的に、BrdU標識及び腫瘍体積の減少に伴い、対照と比べて核p53の染色がp28ではわずかに増え、パクリタキセル(登録商標)処置群では有意に増加した(表X)。
Figure 2012512892
腫瘍は全て処置後31日目に回収。値は平均値±SEMを表す。それぞれ対照に対して、p<0.025、**p<0.01;スチューデントt検定。
p28による細胞周期進行の阻害
2つの同系乳癌細胞株、MCF−7(p53wt)及びMDD2(p53ドミナントネガティブ)の細胞周期分析から、p28に48〜72時間暴露した後にG/M期の細胞集団が増加すること及びその後72時間目にMCF−7細胞でアポトーシスが誘導されることが示された(図55A)。p28処置MDD2細胞では細胞周期進行の阻害又はアポトーシスは実質的になかった(図55B)。p28処置MDD2細胞で細胞周期阻害及びアポトーシスがない(図55B)ことは、MDD2細胞中へのp28の移入の差(図55C)又はVmax(MCF−7:1.83MFI/秒、MDD2:2.21MFI/秒)若しくはK(MCF−7:144.3μM、MDD2:147.9μM)の差によるものではなかった。
p28によりp53レベルが上昇する
MCF−7細胞中でアズリンはp53と複合体を形成してp53の細胞内レベルを上昇させる。MCF−7細胞におけるp53の細胞内レベルはp28曝露後にも時間と共に有意に上昇した(図56)。GSTプルダウンアッセイからp28がp53に結合することが示唆された(図56B)。ここで、GST−p28及びGST−MDM2はMCF−7細胞可溶化物からp53をプルダウンしたが、GST単独ではp53はプルダウンされなかった。p28のモル濃度を上げてもGST−MDM2との結合に競合しなかった(図56C)ことから、p53のアミノ酸18〜23はp28の好ましい結合部位ではないことが示唆された。p53タンパク質の種々のモチーフ(アミノ酸32〜79、277〜296、及び306〜393)を認識するp53抗体の存在下又は非存在下における更なるGSTプルダウンアッセイでp53へのp28の結合がブロックされなかったことから、p28はこれらの認識部位の外側のp53の領域に結合することが示唆された(図56C)。
GST−p53タンパク質を不動化したセファロース4B−グルタチオンビーズをp28及びアズリンのアミノ酸66〜77、アミノ酸50〜67、又はアミノ酸60〜77、それぞれ(p28断片p12、p18、及びp18b)とインキュベートした場合、p18及びp18bにより有意な量のp28が置換されたが、p12を競合物質として用いた場合は置換はわずかであった(図56D)。これらの結果は、p53への結合がp28のアミノ酸11〜28(アズリンのアミノ酸60〜77)内で最も多く生じることを示唆している。
p28はp53の細胞内レベルを上昇させるので、p28又はアズリンで処置したMCF−7細胞核抽出物から得られたp53のDNA結合活性も調べた。p28及びアズリンで処置したMCF−7細胞の核画分中のp53のDNA結合活性は対照よりも1.8倍及び2.3倍高かった(p>0.1、p28vsアズリン)。p53wtの変異されていないコンセンサスなオリゴヌクレオチド配列は、p28により誘導されるp53の増加を完全にブロックした。このことから、MCF−7細胞の核抽出物中のp53はwt p53のコンセンサスオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合することが確認された(図56E)。
p28による細胞周期関連タンパク質の調節
CDK阻害剤(CDKI)であるp21及びp27をアップレギュレートすると細胞周期進行がブロックされる。p28は、暴露後の時間経過と共に、MCF−7細胞で対照に比べてp21、p27、CDK6、及びサイクリンB1の細胞内レベルを上昇させた(図57A)。p28で処置したMCF−7細胞中では、暴露後、有糸分裂プロセスに必須のタンパク質であるCDK2及びサイクリンAのレベルが時間と共に低下した(図57A)。一方、MDD2細胞中ではp53、cdc2、CDK2、CDK4、及びCDK6は実質的に一定に維持され(図57B)、サイクリンA及びサイクリンB1(48時間)はわずかに増加した。p21はMDD2細胞中でp53非依存性の経路により発現され得るので、p21は検出可能なままであった。しかし、p28はp21のレベルを変化させなかった(図57B)。一方、非処置又はp28に暴露したMDD2細胞中でp27は検出されなかった。p28に応答したイムノブロッティングで検出されたMCF−7細胞中におけるp21及びサイクリンB1レベルの上昇はそれぞれ核コンパートメント及び細胞質ゾルコンパートメントにおける上昇に反映されている(図57C及びD)。MCF−7細胞をp28に暴露すると、不活性型のcdc2であるリン酸化cdc2(p−cdc2)の蓄積も誘導された。MDD2細胞をp28に暴露してもp−cdc2のレベルは上昇しなかった(図57E)。
マウス臓器中へのp18及びp28のイメージング
小動物のインビボでのイメージングはヒトの癌研究を含む生物学的研究において重要である。タグ化した生物学的プローブを追跡及び可視化することができれば、研究者は、生物学的プロセスを可視化し、作用及び効果のメカニズムを推測することができる。イメージングを用いて、異種移植片を有するヌードマウスの原発性及び転移性腫瘍部位への、近赤外標識されたアズリン並びにアズリン断片p28及びp18を含むクプレドキシンクラスタンパク質のペプチドの輸送を直接可視化することができる(J Biomed Optics 10:054010−1−11, 2005;J Amer Soc Exp Neuother 2:215−225, 2005;Topics Curr Chem 222:1−29, 2002)。
手順
Mel2異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスを、腫瘍サイズが0.5cmに達するまでモニタリングした。ケタミン:キシラジンの2:1混合物を用いてマウスに麻酔をかけた;推奨用量はマウス体重1グラム当たり10μl(s.c.)である。麻酔下のマウスを、標識ペプチドを注射する前後にiCor Odyssey Imagerを用いて直接スキャンした。IRDye(商標)800cwで標識されたp18/p28を濃度1.25μg/μlで100μl(マウス1頭当たり125μg)、麻酔下のマウスにi.v.注射(尾静脈)した。マウスの系から過剰な色素が除去されるまで(通常約5日間)、少なくとも24時間に1回マウスをスキャンした。5日目に、マウスを屠殺し、個々の動物の最後のスキャンを行った。腎臓、胃、腸、脾臓、脳、心臓、及び肺を含む臓器並びに腫瘍を摘出し、半分に分け、半分を固定して組織学的検査に用いた。臓器及び腫瘍の残った半分は少量のPBSで覆った後、スキャンした。

Claims (76)

  1. 癌細胞を細胞毒性クプレドキシンに接触させることで前記癌細胞を死滅させることを含む方法であって、前記細胞毒性クプレドキシンが1又は複数のエンドサイトーシス経路を介して前記癌細胞に優先的に移入し、前記細胞毒性クプレドキシンがアズリンの切断型であり、前記アズリンの切断型が配列番号2のC末端のアミノ酸を含む、方法。
  2. 前記アズリンの切断型が緑膿菌に由来する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記アズリンの切断型が配列番号2を含む、請求項1に記載の方法。
  4. 前記アズリンの切断型が配列番号2からなる、請求項1に記載の方法。
  5. 前記細胞毒性クプレドキシンがカベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に優先的に移入する、請求項1に記載の方法。
  6. 前記癌細胞への前記細胞毒性クプレドキシンの移入が、ゴルジ装置に仲介される、請求項5に記載の方法。
  7. 前記細胞毒性クプレドキシンが、前記癌細胞の状態に関係なく前記癌細胞の細胞膜に接触できるアミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
  8. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項7に記載の方法。
  9. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項7に記載の方法
  10. 前記細胞毒性クプレドキシンが前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項7に記載の方法。
  11. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む、請求項7に記載の方法。
  12. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
  13. 前記細胞毒性クプレドキシンが、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項7に記載の方法。
  14. 癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に移入することができ、前記癌細胞を死滅させることができ、配列番号2のC末端のアミノ酸を含む、単離されたペプチド。
  15. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  16. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  17. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  18. 前記癌細胞中への前記単離されたペプチドの移入がゴルジ装置に仲介される、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  19. 前記単離されたペプチドが緑膿菌(Psuedomonas aeruginosa)に由来する、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  20. 前記単離されたペプチドが配列番号2を含む、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  21. 前記単離されたペプチドが配列番号2からなる、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  22. 前記単離されたペプチドが、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37配列番号36からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  23. 前記単離されたペプチドが、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37配列番号36からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  24. 癌細胞の細胞膜に接触することができ、カベオラ介在性エンドサイトーシスを介して前記癌細胞に移入することができ、前記癌細胞を死滅させることができ、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に見られるアミノ酸の1又は複数を含む、単離されたペプチド。
  25. 前記単離されたペプチドが、配列番号1の69、70、75、76、及び85位に位置するアミノ酸のそれぞれを含む、請求項24に記載の単離されたペプチド。
  26. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上のアミノ酸に接触する、請求項24に記載の単離されたペプチド。
  27. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の細胞表面ペプチドに接触する、請求項24に記載の単離されたペプチド。
  28. 前記単離されたペプチドが、前記癌細胞の細胞膜上の受容体に接触する、請求項24に記載の単離されたペプチド。
  29. 請求項14に記載の単離されたペプチドを含む医薬組成物。
  30. 薬学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項29に記載の医薬組成物。
  31. 前記薬学的に許容されるキャリアが静脈内投与に適したものである、請求項30に記載の医薬組成物。
  32. 治療有効量の請求項29に記載の医薬組成物を哺乳動物患者に投与することによって前記患者を処置することを含む方法。
  33. 前記患者がヒトである、請求項32に記載の方法。
  34. 前記患者が、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者である、請求項33に記載の方法。
  35. 前記癌が、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頚癌から選択される、請求項34に記載の方法。
  36. 前記患者が少なくとも1つの高リスク特性を有する、請求項33に記載の方法。
  37. 前記患者が前悪性病変を有する、請求項33に記載の方法。
  38. 前記患者が癌又は前悪性病変の治療歴を有する、請求項33に記載の方法。
  39. 前記医薬組成物が、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される、請求項32に記載の方法。
  40. 前記投与形態が静脈内注射である、請求項39に記載の方法。
  41. バイアル中に請求項29に記載の組成物を含むキット。
  42. 請求項24に記載の単離されたペプチドを含む医薬組成物。
  43. 薬学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項42に記載の医薬組成物。
  44. 前記薬学的に許容されるキャリアが静脈内投与に適したものである、請求項43に記載の医薬組成物。
  45. 治療有効量の請求項42に記載の組成物を哺乳動物患者に投与することで前記患者を処置することを含む方法。
  46. 前記患者がヒトである、請求項45に記載の方法。
  47. 前記患者が、一般集団よりも癌を発達させるリスクが高い患者である、請求項46に記載の方法。
  48. 前記癌が、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌から選択される、請求項47に記載の方法。
  49. 前記患者が少なくとも1つの高リスク特性を有する、請求項46に記載の方法。
  50. 前記患者が前悪性病変を有する、請求項46に記載の方法。
  51. 前記患者が癌又は前悪性病変の治療歴を有する、請求項46に記載の方法。
  52. 前記医薬組成物が、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体内注射、及び経口からなる群から選択される形態で投与される、請求項45に記載の方法。
  53. 前記投与形態が静脈内注射である、請求項52に記載の方法。
  54. バイアル中に請求項42に記載の組成物を含むキット。
  55. 請求項14に記載の単離されたペプチド及びカーゴ化合物を含む医薬組成物。
  56. 前記単離されたペプチドが前記カーゴ化合物に連結されている、請求項55に記載の医薬組成物。
  57. 前記カーゴ化合物がタモキシフェンである、請求項56に記載の医薬組成物。
  58. 前記カーゴ化合物が、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、トキシン、及び薬物からなる群から選択される、請求項55に記載の医薬組成物。
  59. 前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、請求項55に記載の医薬組成物。
  60. 前記カーゴ化合物が、X線CTによって検出可能なX線造影剤である、請求項59に記載の医薬組成物。
  61. 前記カーゴ化合物がMRIによって検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項59に記載の医薬組成物。
  62. 前記カーゴ化合物が、超音波造影剤であり、超音波によって検出可能である、請求項59に記載の医薬組成物。
  63. 薬学的に好適なキャリアを更に含む、請求項55に記載の医薬組成物。
  64. 細胞を請求項55に記載の医薬組成物と接触させることでカーゴ化合物を前記細胞中に送達することを含む方法。
  65. 請求項59に記載の医薬組成物を患者に投与することで癌を診断することを含む方法。
  66. 請求項24に記載の単離されたペプチド及びカーゴ化合物を含む医薬組成物。
  67. 前記単離されたペプチドが前記カーゴ化合物に連結されている、請求項66に記載の医薬組成物。
  68. 前記カーゴ化合物がタモキシフェンである、請求項67に記載の医薬組成物。
  69. 前記カーゴ化合物が、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、核酸、色素、微粒子、ナノ粒子、毒素、及び薬物からなる群から選択される、請求項66に記載の医薬組成物。
  70. 前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、請求項66に記載の医薬組成物。
  71. 前記カーゴ化合物がX線CTによって検出可能なX線造影剤である、請求項70に記載の医薬組成物。
  72. 前記カーゴ化合物がMRIによって検出可能な磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項70に記載の医薬組成物。
  73. 前記カーゴ化合物が、超音波造影剤であり、超音波によって検出可能である、請求項70に記載の医薬組成物。
  74. 薬学的に好適なキャリアを更に含む、請求項66に記載の医薬組成物。
  75. 細胞を請求項66に記載の医薬組成物と接触させることでカーゴ化合物を前記細胞中に送達することを含む方法。
  76. 請求項70に記載の医薬組成物を患者に投与することで癌を診断することを含む方法。
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