JP2012510286A - 少なくとも2種類の可変表面タンパク質(vsp)を発現する変性原生動物、それを含むワクチン及び製造方法、用途及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】2種類以上の可変表面タンパク質(VSP)の同時表面発現からなる変性寄生原生動物を提供すること。
【解決手段】本発明の好ましい実施態様では、原生動物は可変表面タンパク質の完全レパートリーの同時表面発現からなる。原生動物はDicer(低分子2本鎖RNAを切り出す酵素)、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)又は両方の抑制された発現を示す。この場合、RdRP遺伝子又はDicer遺伝子若しくはこれらの混合物はサイレンシング(沈黙)させられている。この原生動物は抗原変異機構を有する任意の原生動物であり得る。この場合、その抗原変異機構はその任意の構成成分のサイレンシングにより無秩序化させ得る。
【選択図】 図1
Description
(a)VSP・CRKGAアミノ酸配列を認識する抗体を固体サポートに結合するステップと、
(b)前記固体サポートを原生動物に接触させるステップと、
(c)可変表面タンパク質(VSP)の完全レパートリーを分離するステップ。
前記原生動物は野生原生動物クローンの混合物であることができ、各クローンは異なる可変表面タンパク質を発現し、又は前記原生動物は完全VSPレパートリーを発現するクローンであることができる。
WB9B10クローントロホゾイト由来の核から単離されたRNAを用いて核ランオンアッセイによりVSP遺伝子の転写を分析した(図1a参照)。前記クローンはその表面上にVSP9B10(ジェンバンクアクセス番号AAK97086)だけを発現する。その結果は、VSPをコード化する殆どの遺伝子が同時に転写されたことを示す。これに対して、異なるランブル鞭毛虫クローン(WB9B10及びWB1267)から抽出された全RNAをVSP遺伝子の保存3’末端に対応するプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションすると、これらクローンの表面上に発現されたVSPに対応する分子サイズの1種類の転写体のみが検出された(図1b参照)。更に、減成生成物と思われる超低分子量バンドも観察された。唯一のVSP転写体の蓄積は、VSP特異性プローブを使用する異なるランブル鞭毛虫クローンにおいて観察された(Nash,T.E.Phil.Trans. R.Soc. Lond. B352,1369-1375(1997)参照)。この実験は、2個以上のVSPが寄生体核中に転写される場合、唯一個のVSP転写体だけが蓄積されることを例証している。
PTGSのキーステップはサイレンスされた遺伝子と相同性のdsRNAの生成である。センス又はアンチセンスVSP生成物を特異的に増幅するようにデザインされたRT-PCRアッセイは、これらのフラグメントをクローニング及び配列決定した後、両方のストランド(鎖)のRNAがトロホゾイト内に存在することを示した(図2参照)。VSPコーディング(符号化)遺伝子用のセンス及びアンチセンスRNAの起こり得る同時転写を評価するために、特定のセンス及びアンチセンスプローブを用いて第2の核ランオン実験をを行った(図1c参照)。このアッセイでは、VSPアンチセンスRNAは検出できなかった。この事実は、これらの分子が転写後に生成されるであろうことを示している。vsp9B10及びvsp1267特異性プライマーを用いるWB9B10からのPCRにより産生された生成物も分析した(図1d参照)。vsp9B10に対応するバンドはゲノムDNA及びセンス相補性DNA中には存在したが、アンチセンスcDNAには殆ど存在しなかった。これに対して、WB9B10クローンの表面上には発現されないvsp1267はゲノムDNAから増幅させることができ、また、同時に、センス及びアンチセンスcDNAの両方からも増幅させることができる。これらの結果は、VSPが同時に転写されること(このことは核ランオンアッセイの結果も裏付けている)及び発現されるアンチセンスVSP転写体が少ししか存在せず、そして、転写はされるが翻訳はされないアンチセンスVSPが存在することを例証している。
迷走性RNAからのdsRNAのRdRP媒介・非刺激生成及び短干渉RNA(siRNA)によりガイドされるdsRNAのRdRP媒介・非刺激生成は或る微生物ではRNAiのトリガリングが必要である。RdRPのランブル鞭毛虫相同性が同定された。このRdRP遺伝子155,257Daの基礎タンパク質を符号化する。この基礎タンパク質は他の真核性RdRPと高い相同性を共有し、そして、同定遺伝子の原生動物特性を示すランブル鞭毛虫ウイルス16により符号化されたものとは著しく異なる。
この実験において、多数の相同性VSP転写体の出現は、幾つかのVSP遺伝子の転写が起こった後に、ランブル鞭毛虫RdRPによりアンチセンスRNAの生成を指図できる。更に、Dicer(及び、恐らくAGO)の存在及び活性度は、RNAi様機構がランブル鞭毛虫における表面抗原変異の発現の調整に関与していることを示唆している。
ランブル鞭毛虫の倍数性及び核が2個存在するために、ランブル鞭毛虫における特定の遺伝子サイレンシングは不可能なので、トロホゾイトのアンチセンス転写体の一部の構成的発現によるランブル鞭毛虫RdRP、Dicer及びAGOの発現をノックダウンすることにより抗原変異中の特徴的RNAi成分の関与を示すための直接試験を行った。RdRP(RdRP-AS)又はDicer(Dicer-AS)の発現減少が起きた場合(図9参照)、その表面に2種類以上のVSPを発現するトロホゾイトが産生された。このトロホゾイト産生は、特異的モノクローナル抗体(図10a及び表2参照)、フローサイトメトリー(図10b参照)及びウエスタンブロット(図10c参照)を用いる免疫蛍光測定法により決定した。ランブル鞭毛虫AGOのサイレンシングは可変クローンを全く産生しなかった。この事実は、この分子が寄生体にとって必須成分であることを示唆する。Dicer又はRdRPがノックダウンされた本発明のトロホゾイトは、増殖しそして通常のように培養物を包嚢し、サイレンシング又はノックダウン処置が適用されてもVSP調整に対して有害な作用を及ぼさない(表2参照)。本明細書に記載した教示から、変性原生動物(例えば、変性マラリア原虫原生動物、トリパノソーマ原生動物又は抗原変異機構を示すその他の全ての原生動物など)を得るために、Dicer、RdRP又はその両方をサイレンスさせるか又はノックダウンさせることができる。
ノックダウン又はサイレンスされたRdRP(RdRP-AS)及びDicer(Dicer-AS)を有するランブル鞭毛虫(Giardia)におけるvsp発現の定量分析
VSP 無し ニセ GiardiaRdRP-AS GiardiaRdRP-AS
VSP9B10 99±0.5 98±1.2 90±0.6 18±2.0
VSP1267 0 0.5±0.12 96±0.2 22±0.9
VSPA6 0 0 48±2.3 17±1.3
VSPS1 0 0 62±4.1 36±2.1
VSPS2 0 0 33±1.1 28±3.9
VSPS7 0 0 73±0.3 65±4.4
モノクローナル抗体 WB9B10 DAS RAS DAS+RAS
対照 0 0 0 0
9B10 99 78 67 75
5Cl 0 96 51 93
6E7 0.1 89 93 84
G10/4 0 0 0 0
9C9 0 0 0 0
1B2 0 66 92 91
7B8 0 89 74 84
6F8 0 87 46 71
7G8 0 90 89 88
1B4 0 77 52 68
WB9B10クローントロホゾイトによる攻撃及びスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30- (0%) N/A N/A
WB9B10 30 無 29-1+ (3.3%) N/A N/A
WB1267 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 無 29+1k (100%) N/A N/A
WBA6 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 無 30+ (100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 27-3+ (10%) 30- (0%) 30- (0%)
Dicer-AS 90 無 29-1k (0%) 28-2k(0%) 27-3k(0%)
RdRP-AS 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%) 29-1k (0%)
RdRP-AS 90 無 28-2+ (6.6%) 28-2k(0%) 29-1k (0%)
Dicer-AS+ 90 有 28-1+1k(3.3%) 30- (0%) 29-1+ (3.3%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 29-1k (0%) 29-1+ (3.3%) 30- (0%)
RdRP-AS
WB1267クローントロホゾイトによる攻撃及びスナネズミスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 有 30- (0%) N/A N/A
WB1267 30 無 29-1+ (3.3%) N/A N/A
WBA6 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 無 30+ (100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 28-2+ (6.6%) 28-1+1k(3.3%) 30- (0%)
Dicer-AS 90 無 29-1+ (3.3%) 29-1d (0%) 29-1k(0%)
RdRP-AS 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%)
RdRP-AS 90 無 28-1+ 1k(3.3%) 28-2k(0%) 30- (0%)
Dicer-AS+ 90 有 28-2+ (6.6%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 30- (0%) 30- (0%) 30- (0%)
RdRP-AS
嚢胞感染による攻撃及びスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 無 29+1k(100%) N/A N/A
WB1267 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 無 29+1k(96.6%) N/A N/A
WBA6 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 無 30+ (100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 30- (0%) 30- (0%) 30- (0%)
Dicer-AS 90 無 29-1k (0%) 30- (0%) 29-1k(0%)
RdRP-AS 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%) 29-1k (0%)
RdRP-AS 90 無 29-1+ (3.3%) 28-1+1k(3.3%) 29-1k (0%)
Dicer-AS+ 90 有 29-1+ (3.3%) 30- (3.3%) 30- (0%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%)
RdRP-AS
全VSP内に存在する細胞質側尾部の5個のアミノ酸に対して反応するモノクローナル抗体を用いて変性DAS及びRASトロホゾイト(実施例参照)から完全VSPレパートリーを精製した。対照として、ランブル鞭毛虫細胞内抗原GRP78/BiPを過剰発現させ、そして、免疫精製した。次いで、3日間、所定の投与量で3回経口胃投与することにより、これらのアジュバント不含有タンパク質製剤でスナネズミを免疫化させたあ。全ての事例において、ワクチン接種は疾患の症候を引き起こさなかった。この事実は、VSP単独では動物に対して有毒ではないことを示す。動物感染は糞便中の嚢胞を計数することによりモニターし、また、或る場合には、小腸内のトロホゾイトの存在を観察するために、動物を殺処分した。完全VSPレパートリーによる経口免疫化は強烈な免疫応答を発生する。この免疫応答は動物感染を防止する。同様な結果は一次感染中にも観察された。更に、溶媒又はGRP78/BiPが接種された対照動物はクローントロホゾイト個体群に即座に感染した(図15参照)。
WB9B10クローントロホゾイトによる攻撃及び精製VSPによる免疫化後のスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30- (0%) N/A N/A
WB9B10 30 無 28-2+(6.6%) N/A N/A
WB1267 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 無 30+ (100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 25-5+ (16.6%) 27-3+ (0%) 28-1+1k(3.3%)Dicer-AS 90 無 26-3+1k(10%) 25-1+4k(3.3%) 27-3+(10%)
RdRP-AS 90 有 28-2+ (6.6%) 28-1+1d(3.4%) 28-1+1k(3.3%)
RdRP-AS 90 無 26-2+2k(6.6%) 27-2+1k(6.6%) 30- (0%)
Dicer-AS+ 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%) 30- (0%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 29-1k (0%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%)
RdRP-AS
BiP 30 有 30+ (100%) N/A N/A
BiP 30 無 30+ (100%) N/A N/A
クローンWB1276トロホゾイトによる攻撃及び精製VSPによる免疫化後のスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 有 30- (0%) N/A N/A
WB1267 30 無 29-1+ (3.3%) N/A N/A
WBA6 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 無 29+1k(100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 29-1+ (3.3%) 27-2+1k(6.6%) 29-1+(3.3%)
Dicer-AS 90 無 27-3+1(10%) 24-2+4k(10%) 29-1+(3.3%)
RdRP-AS 90 有 28-2+ (6.6%) 29-1+ (3.3%) 28-2k (0%)
RdRP-AS 90 無 26-3+1k(10%) 29-1+ (3.3%) 30- (0%)
Dicer-AS+ 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (3.3%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 29-1k (0%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (3.3%)
RdRP-AS
BiP 30 有 30+ (100%) N/A N/A
BiP 30 無 30+ (100%) N/A N/A
嚢胞感染の攻撃及びスナネズミ感染率(%)
初期感染 スナネズミ MNZ 2ヶ月後攻撃 4ヶ月後攻撃 12ヶ月後攻撃
物質 頭数 処理 (感染率:%) (感染率:%) (感染率:%)
無し 30 有 30+ (100%) N/A N/A
無し 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB9B10 30 無 29+1k(100%) N/A N/A
WB1267 30 有 30+ (100%) N/A N/A
WB1267 30 無 30+ (100%) N/A N/A
WBA6 30 有 29+1- (96.6%) N/A N/A
WBA6 30 無 30+ (100%) N/A N/A
Dicer-AS 90 有 27-3+ (10%) 27-3+(10%) 28-2+(6.6%)
Dicer-AS 90 無 25-3+2k(10%) 23-2+5k(10%) 30- (0%)
RdRP-AS 90 有 30- (0%) 28-1+1k (3.3%) 29-1+ (3.3%)
RdRP-AS 90 無 28-2+ (10%) 27-1+2k (6.6%) 29-1+ (3.3%)
Dicer-AS+ 90 有 29-1+ (3.3%) 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%)
RdRP-AS
Dicer-AS+ 90 無 29-1+ (3.3%) 29-1k (0%) 29-1k (0%)
RdRP-AS
BiP 30 有 30+ (100%) N/A N/A
BiP 30 無 30+ (100%) N/A N/A
ランブル鞭毛虫を、成牛の血清及び胆汁が補足されたTY-33培地中で培養した(Lujan,H.D.,Mowatt,M.R.,Conrad,J.T.,Bowers,B.及びNash,T.E.,J.Biol.Chem.270,29307-29313(1995))。対応する抗VSPモノクローナル抗体を用いて免疫蛍光分析法に基づく限界希釈及び選択によりトロホゾイトの連続的クローニングを行った。被嚢形成は既に報告されている通りに行った(Lujan,H.D.,Mowatt,M.R.,Conrad,J.T.,Bowers,B.及びNash,T.E.,J.Biol.Chem.270,29307-29313(1995))。WB株クローン9B10、1267及びA6並びにGSクローン株H7のランブル鞭毛虫トロホゾイトを使用した。
Mowatt,M.R.L.,H.D.;Cotten,D.B.;Bowers,B.及びNash,T.E.;Yee,J.;Nash,T.E.;Stibbs,H.H.,
Mol Microbol 15,955-63(1995)に記載された方法に従って全ランブル鞭毛虫DNAを単離した。
VSPセンスプライマー(S1-S4)を1μgの総RNAに添加し、70℃で5分間加熱した。前記に列挙された全ての見込みのあるプライマーセンス/アンチセンス組合せを使用するか又は特異的vsp1267及びvsp9B10プライマー(1267_F,5'-ATG TTG TTG ATA GCC TTC TAT C-3')(SEQ ID N゜119); 1267_R,5'-CTA CGC CTT CCC CCT GCA TAT G-3')(SEQ ID N゜120); 9B10_F,5'-ATG TTT GGC AGT TTT GTT CTC-3')(SEQ ID N゜121); 9B10_R,5'-TCA CGC CTT CCC TCT ACA TAT G-3')(SEQ ID N゜122))を用いて、逆転写反応サンプル(2μL)を増幅した。RT-PCR生成物を電気泳動法により分析し、QiaexIIゲル抽出キット(Qiagen社製)により精製した。ランブル鞭毛虫トロホゾイト分化中又はサイレンシング実験中に異なる遺伝子の発現を研究するために、RT-PCRを下記の特異的プライマー対と共に使用した。gDicer(645bp):HL160, 5'-TGG CGG CGT CGT ATC AGT TAT-3')(SEQ ID N゜123)、 HL161, 5'-TCC CCG CAC GCA AGA AGA A-3')(SEQ ID N゜124)、gAgo(912bp): HL-164, 5'-ATT GCC CCC TAC GGT GTC-3')(SEQ ID N゜125)、HL-165, 5'-CTC TGC CGG CCT TCC TAC-3')(SEQ ID N゜126)、gRdRP(569bp): HL187, 5'-CAT GGG TTG CAG TTT CTT GAC GA-3')(SEQ ID N゜127)、HL188, 5'-AGC CCC TTA TCT GTT GCC TCC TTC-3')(SEQ ID N゜128)、yCWP1差示的発現対照(533bp): HL183, 5'-TCG CCC TGG ATG TTT CGG ACA T-3')(SEQ ID N゜129), HL184, 5'-AGG CGG CTC AGG CAG TA-3')(SEQ ID N゜130)及びGDH構成的発現(407bp): HL185, 5'-AGT GGG GCG GGT CTT TAC TCA-3')(SEQ ID N゜131), HL186, 5'-TGT TCG CGC CCA TCT GGT AGT TCT TCT-3')(SEQ ID N゜132)。これらの反応生成物も単離し、下記に示すようにノーザンブロット法のためのプローブとして使用した。
総RNA(10〜15μg)を1.2%アガロース・ホルムアルデヒドゲルで分画し、ハイボンド(Hybond)N+(GE社製)に移し、常法によりUV架橋剤(UVP社製)で固定させた。保存されたC-末端フラグメント(アンチセンスプライマーR2)を、γ-[32P]-ATP(5'末端標識系、Promega社製)を用いてT4ポリヌクレオチドキナーゼと共に放射性同位元素標識した。grdrpおよびその他のDANフラグメントはランダムプライミング(プライム-A-遺伝子標識系、Promega社製)により一律に標識した。
細胞を4℃の氷冷溶解バッファー(10mM Tris-HCl pH8.4, 1.5mM MgCl2, 0.14M NaCl及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル)1mLに再懸濁させた。2.25μlのNonidet(ノニデット)P-40(界面活性剤)を添加し、懸濁液を氷上で15分間インキュベーションした。2000gで1分間遠心分離することにより核を回収し、4℃の氷冷核洗浄バッファー(20mM Tris-HCl pH8.4, 140mM KCl, 10mM MgCl2, 20%(V/V)グリセロール及び14mM β-メルカプトエタノール)1mLで2回洗浄した。次いで、この核を50μLのラベリングバッファー(20mM Tris-HCl (pH8.4, 4℃), 10mM MgCl2, 20%(V/V)グリセロール及び14mM β-メルカプトエタノール, 各1mMのATP, GTP及びCTP, 10mM ホスホクレアチン, 100μg/mLホスホクレアチンキナーゼ並びに0.1μM[32P]UTP, 5000μCi/mL)に再懸濁させ、37℃で40分間インキュベーションした。RT-PCRによりVSP生成物が産生された。p-GEM T-easyベクター(Promega社製)にクローン化された3μgのvsp9B10、vsp1267、vspH7及びvspA6をスロット・ブロット装置(BioRad社製)を用いてハイボンドN+上に移送した。更に、インビトロ転写反応で産生されたセンス及びアンチセンス転写体も同様な条件下でブロットした。
小型RANの検出は既に報告されている方法(35, Hutvagner, G., Mlynarova,L及びNap,J.P., RNA 6, 1445-1454(2000))に従って行った。簡単に言えば、15μgのランブル鞭毛虫総RNAを1Xローディングバッファー中で65℃で10分間にわたって変性し、そして、15%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲル上にロードした。電気泳動により分離した後、RNAを0.5X Trisborate-EDTAバッファー(pH8)中でハイボンドN+メンブラン上に、TBE 0.5Xにおいて100Vで45分間にわたって電気ブロッティングし、最後にUVで固定させた。[32P]標識リボプローブを、p-GEM T-easyベクター(Promega社製)にクローン化されたvsp遺伝子9B10、1267及びH7を用いてT7又はSP6RNAポリメラーゼによりインビトロで転写した。80mM NaHCO3及び160mM Na2CO3の存在下で60℃で1時間にわたってインキュベーションすることにより標識RNAは部分的に加水分解された。各加水分解VSPを25%ホルムアルデヒド、0.5 NaCl、25mM EDTA, 1X Denhardt溶液及び150μg/mL 変性サケ精液DNA中でハイブリダイゼーションさせ、そして42℃で一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼーション完了後、メンブランを2X SSC, 0.5% SDSで30分間2回洗浄し、そして、0.5X SSC, 0.5% SDSで45℃で15分間1回洗浄した。続いて、各逆加水分解vsp転写体を同じ方法でハイブリダイゼーションさせ、メンブラン信号をコダック社の-70℃のXARフィルムに曝露させるか又はホスホイメージャー(phosphoimager)(Amersham社製)に曝露させることにより検出した。鎖長は市販のソース(Decade(登録商標)RNAマーカース, Ambion社製)から得た。
ランブル鞭毛虫クローンWB9B10、WBA6又はWB1267の細胞質抽出物と共にdsRNA分子をインキュベーションすることにより、Dicer活性度を分析した。GEM T-easyベクター(Promega社製)にクローン化されたp-vsp9B10、vsp1267、vspH7、cwp2及びgdh遺伝子をインビトロで転写し、全長のセンス[32P]標識RNAプローブを生成した。これらを精製し、そして小型RNA汚染物質の不存在についてテストした。純粋又は混合vsp転写体をランブル鞭毛虫抽出物と共に37℃で1時間インキュベーションした。[32P]UTPで標識されたか又は標識されていない等量の転写センス及びアンチセンスRNA(vsp1267、vsp9B10、cwp2及びgdh)をインビトロでアニーリングすることによりdsRNAを生成した。これらのdsRNAをTris-HCl (pH7.5)/20mM NaCl中に再懸濁させ、95℃で1分間加熱し、そして、12時間かけて室温にまで放冷させた。細胞溶解物を1x107-1x108細胞から産生させた。これを500μLのバッファー(25mL Tris-HCl (pH7.5)、250mM スクロース及び完全TMプロテアー阻害剤カクテル含有)に再懸濁させ、超音波処理し、そして、2000gで15分間遠心分離して非分解細胞と核を分離し、次いで、dsRNAと共に37℃で1時間インキュベーションした。その後、全RNAを抽出し、電気泳動し、そして、小型RNAについて既に説明したようにして移送した。低分子量RNAの選別はMicrocon-100濾過装置により行った。小型RNAを含有する濾液を300mM NaCl/0.6mL イソプロパノールで沈殿させ、20%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲルにロードし、そして電気泳動した。エンドヌクレアーゼ活性度に対するATPの効果を測定するために、ランブル鞭毛虫細胞質抽出物を2mM グルコース/0.1U/μLヘキソキナーゼ(Sigma社製)と共に35℃で30分間インキュベーションすることにより、ATPを涸渇させた。10mM ホスホクレアチン、100μg/mL ホスホクレアチンキナーゼ又はこれら両方の存在下又は不存在下で、[32P]UTP標識vsp1267dsRNAを溶解物に添加した。トリゾールを用いて全RNAを抽出した。このRNAサンプルは、前記のようなMicrocon-100濾過装置を用いた低分子量RNAに富むRNAサンプルであった。このサンプルを電気泳動し、そして生成物を前記に記載したようにして検出した。ランブル鞭毛虫抽出物を用いて処理するdsRNAの生成物をゲル精製し、リゲーションし、増幅し、クローン化、そして配列決定した(Ngo,H., Tschudi、C., Gull,K.及びUllu,e., Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,14687-14692(1998))。
RT-PCRのために、トロホゾイトからの全RNA抽出物及びプライマーとしてのオリゴ(dT)20を用いて、cDNA合成を行った。ランブル鞭毛虫におけるコドン利用知識と共に、幾つかの微生物からの既知RdRPのアライメントは、適度に退化されたプライマーのデザインを可能にする。このようなプライマーは例えば、RdRP_F: (5'-TA(T/C),GT(T/C)TTT AC(T/C)GAT GGC G(C/G)A GG)-3')SEQ ID N゜133及びSEQ ID N゜134; 及びRdRP_R: (5'-TCA CC(A/G) TCC AGG TC(G/A) CTG CC)-3')SEQ ID N゜135及びSEQ ID N゜136などである。これらオリゴヌクレオチドを用いて産生されたPCRを電気泳動し、ゲル精製し、ランダムプライミングにより放射性同位元素で標識し、そしてElbashir,S.M., Lendeckel,W.及びTuschl,T.,Gene Dev 15, 188-200(2001)に報告されているように、λgt22aにおけるランブル鞭毛虫cDNAライブラリのスクリーニングするために使用した。λZAPgDNAライブラリのスクリーニングはElbashir,S.M., Lendeckel,W.及びTuschl,T.,Gene Dev 15, 188-200(2001)に記載されているようにして行った。DNAフラグメントをpBlueScript SKII+にクローン化させ、そして、自動配列決定にかけた。Invitrogen社から市販されているキット及びプライマーの5'-CTT GTG CAT AGT AAA CAA AG-3' SEQ ID N゜137及び5'-CAA ATG GTC GAT GCT GGG-3' SEQ ID N゜138を用いて3,5'-RACEを行った。インビトロにおけるgRdRP活性度について、抗HA-セファロース(Sigma社製)を用いるアフィニティにより形質移入トロホゾイトからHA-タグ付RdRPを精製した。酵素活性度を20μLの反応混合物中で35℃で60分間かけて検定した。この反応混合物は、50mM Hepes(pH7.6)、20mM 酢酸アンモニウム、5mM MgCl2、0.1% Triton X-100、各1mLの4個のリボヌクレオシド トリホスフェート([α-32P]含有)及び1U/μLRNasinを含有し、更に、VSPと寄生プライマーの存在下又は不存在下で前記のようにしてインビトロで転写することにより生成されたssRNAサブストレート(250μg/mL)が添加されていた。反応生成物をアガロースゲル電気泳動、続いて転送及びオートラジオグラフにより分析した。
全gRdRP、gDicer、gAgo及びVSPH7を導入し、更に、対応する場合には、TAA停止コドンの前にインフルエンザ・ヘムアグルチニン・エピトームを導入するためにプラスミドPTubPac37を変性させた(Touz,M.C.,Gottig,n.,Nash,T.E.及びLujuan,H.D., J.Biol.Chem.277, 50557-50563(2002))。gAgoコーディング領域をプラスミドpTubNterPacに導入した。ここで、起こるかもしれないHAタグとPIWIドメインとの干渉を避けるために、遺伝子はヘムアグルチニンのコーディング領域の後に導入した。ランブル鞭毛虫のトロホゾイトのトランスフェクション(形質移入)は既報のエレクトロポレーション(電気穿孔法)(Yee,J.及びNash,T.E., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92,5615-5619(1995))により行った。細胞を氷上で10分間インキュベーションし、成長培地中で37℃で一晩培養し、プロマイシン(puromycin)耐性細胞として選別した。公知文献(Touz,M.C.,Gotting,N.,Nash,T.E.&Lujan,H.D.,J.Biol.Chem.
277,50557-50563(2002))に記載されているように、トランスフェクションの後15日目に、抗HA-モノクローナル抗体(Sigma社製)を用いる間接免疫蛍光分析を非被嚢トロホゾイトに対して行った。公知文献(Touz,M.C.,Gotting,N.,Nash,T.E.&Lujan,H.D.,J.Biol.Chem.277,50557-
50563(2002))に記載されているように、固定トロホゾイトにおける異なるVSPの発現をテストするために、抗VSPモノクローナル抗体を使用した。この研究において産生された新規なモノクローナル抗体を同様に使用した。アルゴン/ヘリウム/ネオンレーザとX100(開口数=1.4)油浸対物レンズを備えたツァイス(Zeisss)社製のLSM5パスカルレーザスキャンニング共焦点顕微鏡を用いて共焦点像を集めた。0.3μmの単一共焦点セクションをオーバースリップ(zセクション)に対して平行にした。ツァイス(Zeisss)社製の電荷結合素子(CCD)カメラを用いて像を捕捉し、LSM及びアドビ(Adobe)社製のホトショップ(Photoshop)ソフトウェアで処理した。gRdRP、gDicer及びgAgoの機能的分析のために、VSP9B10特異的センスプライマー(Eco RVサイト含有)及びアンチセンスプライマー(Nco Iサイト含有)を使用し、各遺伝子のORFの一部をPCRにより増幅した。PCR生成物を精製し、制限し、そしてベクターpTubHAPacにクローンさせた。この方法において、遺伝子はpTubHAPac内部に逆に挿入され、アンチセンス構造体が得られた。このアンチセンス構造体はその後、発現の阻止のために使用した(Touz,M.C.,Gotting,N.,Nash,T.E.&Lujan,
H.D., J.Biol.Chem.277,50557-50563(2002))。配列は常に、ダイ・ターミネーター・サイクルシークエンス法により確認した。遺伝子ノックダウンはトランスフェクションされたトロホゾイトから抽出された全RNAについて上記に示した遺伝子特異的プライマーを用いてRT-PCR及びqRT-PCRにより確認し、そして、ベクターのみで又は各分子のHAタグ付バージョンを発現する同じベクターでトランスフェクションされた対照細胞と比較した。
各200mgの(a)sMBSクロスリンカーを用いてKLHにコンジュゲートされたNH2-CRGKA-COOHペプチドのHPLC精製製剤又は(b)合成多重抗原ペプチド[NH2-CRGKA]8-[K]7-bAla-OH(何れもBiosynthesis社製)又はWBアイソレート由来でSigmaアジュバント系(Sigma社製)に乳化された培養トロホゾイトのタンパク質抽出物を皮下注射することにより、6週齢の雌のBALB/cマウスを免疫化させた。21日間経過後に同一製剤200mgを皮下注射することによりマウスを追加免疫し、更に20日間経過後に抗原製剤を静脈注射することによりマウスを追加免疫した。それから3日後に、マウスを安楽死させ、NSO骨髄腫細胞への融合のために脾臓細胞を使用した。オリジナルペプチドを用いるELISA法及び非被嚢トロホゾイト及び被嚢トロホゾイトを用いる感染免疫蛍光分析法によりハイブリドーマ分泌抗体を選別した。VSPに対するモノクローナル抗体を既報(Mowatt,M.R.L.,H.D.;Cotten,D.B.;Bowers,B.,Yee,J.,Nash,T.E.,Stibbs,H.H., Mol Microbol
15,955-63(1995))の通りに全トロホゾイトを用いて産生した。
ランブル鞭毛虫クローン1267からの生成物をフェノール及びクロロホルム/イソアミルアルコール(24/1% v/v)で抽出することにより精製し、ARNaseと共にインキュベーションすることによりARN夾雑物を取り除き、そしてメタノールで沈殿させた。メチルデオキシリボヌクレオチドの存在を高速液体クロマトグラフ(HPLC)により決定した。デオキシリボヌクレオチドの分離は、フェノメネックス・ルナ(Phenomenex Luna)(HPLCカラム)5μm C18, 4.6x150mmで行った。この方法は、既知濃度の標準デオキシリボヌクレオチドの吸収に基づいて較正した。
1.寄生体
アフガニスタンでランブル鞭毛虫症に罹患したと思われる症候性患者からランブル鞭毛虫WC株(ATCC30957)を単離した(“アフガニスタン、プエルトリコ、エクアドル及びオレゴン由来のランブル鞭毛虫の抗原分析”, Smith PD, Gillin FD, Kaushal NA及びNash
TE, Infect. Immun. 1882 May; 36(2): 714-9 )。また、米国からの症候性患者からGS/M株を単離した(“アフガニスタン、プエルトリコ、エクアドル及びオレゴン由来のランブル鞭毛虫の抗原分析”, Smith PD, Gillin FD, Kaushal NA及びNash TE, Infect. Immun. 1882 May; 36(2): 714-9 )。12mLのネジ式キャップ付ホウケイ酸塩ガラス管内に充填された、20%成人血清(Invitrogen社製)、牛胆汁(Sigma社製)及び抗生物質/抗真菌溶液(Invitrogen社製)が補充されたTYI-S-33培地中で37℃で、WB株由来のクローン及び形質転換トロホゾイトを培養した(“医学的に重要な管腔寄生性原生生物の培養方法”, Clark CG, Diamond LS, Clin. Microbiol. Rev. 2002 Jul; 15(3):329-41 )。異なる表面タンパク質を発現するランブル鞭毛虫クローンを、嫌気性チャンバー(BD)内の96穴培養プレート(DeltaLabs社製)で限界希釈することにより得た。このクローンを特異的モノクローナル抗体を用いる免疫蛍光分析法により選別した(“限界希釈の統計的検討の考察を伴うランブル鞭毛虫の新規なクローン化方法”, Baum KF, Berens RL, Jones RH, Marr JJ., J. Parasitol. 1988 Apr.; 74(2): 267-9)。反応性クローンを培養培地中で一晩増幅し、使用前に均質性を検証した。WB1267(Mab5Cl)、9B10(Mab9B10)、A6(MabA6)及びGS/M/H7(MabG10/4)クローンを対照実験及び感染で使用した(Nash, T.“ランブル鞭毛虫における表面抗原変異性及び抗原変異”, Parasitol Today 8, 229-234(1992))。
ランブル鞭毛虫RdRP及びDicer酵素をコード化する遺伝子に対する相補的配列はpTubHApacプラスミド中でクローン化された(“保存チロシン系モチーフを必要とするランブル鞭毛虫におけるリソソーム様末梢液胞に対する胞嚢特異性システインプロテアーゼの選別”, Touz MC, Lujan HD, Hayes SF, Nash TE, J. Biol. Chem. 2003 Feb. 21; 278(8):6420-6. Epub 2002 Dec. 3)。α−チュブリンプロモータの存在及び抗生物質ピューロマイシンの選択により、ランブル鞭毛虫トロホゾイトにおける構成性及び安定的遺伝子発現が可能になった。白金HiFi TaqDANポリメラーゼ(Invitogen社製)を使用し、Ncol及びEcoRV制限部位を含有し、その後ベクターをクローン化するオリゴヌクレオチドプローブを使用し、WB/9B10クローンcDNAからPCRにより、Dicer及びRdRP酵素をコード化する遺伝子を増幅した。プライマーは、DAF:5'-AGT TGA AAC TAT CAT GGT TGC TCC CGA A-3' SEQ ID N゜141、DAF:5'-CCA CCA TGG TTG AAC GCC GAA TCC AAC-3' SEQ ID N゜142、RAF:
5'-GCG ATA GGT TGC AGT TCC ATG ACG TTC TTG A-3' SEQ ID N゜143及びRAR: 5'-
CCA CCA TGG TCG CTA CCT TAG CAT CAT CC-3' SEQ ID N゜144であった。制限酵素による消化により構成を検証し、後に配列決定した。酵素サイレンシング検証は前記のようなqRT-PCRにより行った。
“ランブル鞭毛虫におけるホタルルシフェラーゼの一過性形質転換及び発現”,Yee J., Nash TE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995 June 6;92(12):5615-9に詳細に報告されているように、エレクトロポレーションによりランブル鞭毛虫のトランスフェクション(形質転換)を行った。概要を述べれば、12mLチューブ内で交会するまで成長したWB/9B10クローントロホゾイト培養物を0.4cmプレート内の0.3mL完全TYI-S-33培地に再懸濁させた。次いで、最終容量が100μLになるまで、プラスミドを10〜15μL添加した。この混合物を氷上で10分間培養した。細胞をBTXエレクトロポレーター内で350V、100μF及び700Ωでエレクトロポレーションした。氷上で10分間培養した後、細胞を完全培地を12mL含有するチューブに移し、嫌気性雰囲気中で37℃で一晩インキュベーションした。翌日、培地をピューロマイシンで補完し、トロホゾイトを37℃で7〜10日間インキュベーションした。クローン細胞系を得るために、限界希釈を96穴プレート内で実行した。
氷中で20分間冷却することにより、トロホゾイトをチューブから分離させた。細胞を回収し、成長培地中に再懸濁させ、ガラス板に塗布し、このガラス板を37℃の湿気の多いカメラ内で1時間インキュベーションし、トロホゾイトをガラス板に再接着させた。このプレパラートを温培地で3回洗浄し、更に温PBSで2回洗浄した。-20℃で30分間1:1アセトン/メタノール混合液で固定することにより細胞を透過性に転性させ、そして、1XPBS/0.05%Tween20, BSA2.5%中で30分間ブロックした。最初、1XPBS/0.05%Tween20, BSA2.5%中で希釈された異なるVSPに対するモノクローナル抗体と共に細胞を1時間インキュベーションした。異なるVSPに対して標的化されたモノクローナル抗体は、mAb9B10(抗VSP-9B10)、mAb5Cl(抗VSP1267)、mAb6E7(抗VSPA6)、mAb1B2(抗VSPS1)、
mAb2D5(抗VSPS2)、mAb2EI(抗VSPS3)、mAb2G2(抗VSPS4)、mAb6F8(抗VSPS5)、
mAb7A9(抗VSPS6)、mAb7B8(抗VSPS7)、mAb7C2(抗VSPS8)、mAb7C9(抗VSPS9)、
mAb7C10(抗VSPS10)、mAb7D4(抗VSPS11)、mAb2D4(抗VSPS12)、mAb3B8(抗VSPS13)、
mAb4A2(抗VSPS14)、mAb7F4(抗VSPS15)、mAb7H2(抗VSPS16)などである。適当なモノクローナル抗体と共にインキュベーションした後、ガラス板を1XPBS/0.05%Tween20で2回洗浄し、次いで、1/200希釈FITC又はTRITCで標識された第2のヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体と共に、ブロッキング溶液中で1時間にわたってインキュベーションした。核をDAPIと対比させた。アルゴン/ヘリウム/ネオンレーザとX100(開口数=1.4)油浸対物レンズを備えたLSM5ツァイスパスカルレーザ共焦点顕微鏡(Zeiss Plan Apochromat社製)により共焦点像を得た。カバースライドに対して平行に0.3ミクロン共焦点セクション(セクションz)を撮像した。像はZeissカメラを使用するデバイスにより集め、LSM及びAdobeホトショップソフトウエアで処理した。特定のVSPを発現する細胞の%は500個の細胞を3回計数するか又はフローサイトメトリー(流動細胞計測法)により演算した。
前記の実施例2で述べたようにして5アミノ酸VSP尾部に対するモノクローナル抗体の産生を行った。
“ロイシンリッチ反復を有する新規なランブル鞭毛虫嚢胞壁タンパク質の同定”及び“分泌顆粒形成及びタンパク質アセンブリーの嚢胞壁への包含”,Lujan HD, Mowatt MR, Conrad JT, Bowers B及びNash TE, J. Biol. Chem. 270, 29307-29313(1995)に報告されている方法に従い。タンパク質トロホゾイト抽出物をポリアクリルアミドゲル電気分解(SDS-PAGE)及びウエスタンブロッティング分析にかけた。
動物に対して行われた全ての処置は、Catolica de cordoba大学の動物のケア及び使用の制度委員会により承認されたプロトコルに従って実行された。また、免疫化ガイドラインは全ての動物により十分に許容された。6週齢の雌の内生繁殖スナネズミの病原体非感染標本(SPF)(Meriones unguiculatus)を、Catolica de Cordoba大学のBioterio de animales de investigacionから入手し、各スナネズミを12時間照明,12時間暗黒サイクルで空調(18-22℃, 40-50%湿度)されたバイオハザードラック(Techniplast社製)に収容した。スナネズミには、高圧滅菌処理された飼料と、フィルター滅菌されたビタミン溶液混合物が追補された滅菌水をアドリブで与えた。この研究において、使用されるスナネズミがランブル鞭毛虫寄生体又は全ての他の関連物に絶対に感染していないことを保証するために、当研究所内で誕生したスナネズミのみを使用した。全ての動物は、動物ケアのアルゼンチン・カウンシルの規則及び決定に従い、かつ、国際的動物注意規則に従い、SPF研究室条件下で飼育された。感染前に、トロホゾイト及び嚢胞から抽出された全てのタンパク質の製剤を使用してELIZA法により、スナネズミがランブル鞭毛虫又はランブル鞭毛虫のタンパク質に対する血清抗体に対して陰性であることを試験した。感染後、スナネズミのうちの何匹かの対照群に20mgのメトロニダゾールを3日間経口投与し、低レベルの腸内ランブル鞭毛虫の全ての存在可能性を除外するために、攻撃感染前に10日間放置した。
処置を開始するために、スナネズミを濾過空気が供給される滅菌ゲージ内に配置し、水及び飼料は高圧滅菌釜(オートクレーブ)で滅菌した。濃度が100mg/mLのメトロニダゾール使用液を調製した。この溶液500μLを日用量としてスナネズミに3日間連続的に経口投与した。引き続く4日間はスナネズミに抗生物質は投与しなかった。その後、メトロニダゾール使用液500μLによる処置を数日間継続した。メトロニダゾール2mLをオートクレーブ滅菌された飲料水400mLに添加することにより処置を補完した。この飲料水は処置全期間を通してスナネズミが飲むことが出来る唯一の水である(スナネズミはこの希釈メトロニダゾール水溶液を9日間摂取する)。処置全期間を通して毎日糞便を集め、モノクローナル抗体7D2(嚢胞壁抗タンパク質))について、嚢胞の存在を決定するために、免疫蛍光分析法による顕微鏡観察コントロールを毎日行った(“ロイシンリッチ反復を有する新規なランブル鞭毛虫嚢胞壁タンパク質の同定”及び“分泌顆粒形成及びタンパク質アセンブリーの嚢胞壁への包含”,Lujan HD, Mowatt MR, Conrad JT, Bowers B及びNash TE, J. Biol. Chem. 1995 Dec 8; 270, 29307-29313)。処置の期間中、正常なスナネズミのフローラ(細菌叢)は酵母の増大を被り、処置完了後数日中にその正常な状態を回復した。
0.5mLのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁されたトロホゾイト又は嚢胞2x105を経口胃摂取することによりスナネズミに感染を誘発させた。何匹かのスナネズミには同じ投与経路で0.5mLのPBSを投与した。感染したスナネズミから得られたサンプルが有する生育力及び感染力が急速に失われることを避けるために、感染したスナネズミから収集した新鮮な嚢胞を使用した。感染スナネズミからの糞便収集は、初日(0日目)から30日目まで毎日行った。嚢胞又はトロホゾイトは光学顕微鏡により、又は嚢胞(mAb7D2)又はトロホゾイト特異的抗原(BIP; Mab9C9)を用いる免疫蛍光分析法により視覚的に同定した。
定期的にかつ無作為に選択されたスナネズミを殺処分し、小腸を単離し、長手方向に切開し、そして、培養培地中に4℃で30分間懸濁させた。上澄液を集め、ランブル鞭毛虫トロホゾイトについて試験した。この試験は光学及び蛍光顕微鏡により行うか又は“ランブル鞭毛虫の優性表面抗原に対するnu/+及び再構築nu/nuマウス由来のインビトロ合成免疫グロブリンA”,Gottstein B, Deplazes P及びTanner I, Parasitol Res 79, 644-648(1993)に報告された方法に従い培養培地中に6日間配置させることにより行った。
前掲書に記載された方法に従って産生された、これらの形質転換トロホゾイト内に発現されたVSPの完全レパートリーを、保存VSP尾部の5アミノ酸に対して産生された本発明のMab12F1を用いる免疫アフィニティ法により精製した。A-セファロース(Amersham社製)を使用し、ハイブリドーマ細胞の培養物のIP注射により生成された腹水液からマウスの免疫グロブリンを単離した。生成mAbを磁気ビーズ(Dynal社製)に結合させ、そして、トロホゾイトの血漿膜含有ミクロソーム画分由来のVSPを精製するために使用した。精製VSPを0.01%Tween20含有PBSに再懸濁させ、定量し、そして、スナネズミを経口的に免疫するために使用した。個々のVSPは特異的mAbを用いる同じ方法論により精製した。
9B10WBから単離されたランブル鞭毛虫トロホゾイトを、プラスミドpTubHA.pacでトランスフェクションした。このプラスミドpTubHA.pacは、完全長のランブル鞭毛虫小胞体シャペロンBiP/GRP78を含有していた(“原始的真核生物の分化中の分子シャペロンBiP/GRP78の増大発現”, Lujan hd, Mowatt MR, Conrad JT, Nash TE, Biol cell. 1996;86(1):
11-8)。このエピトープの3個のコピーをヘムアグルチニン(HA-BIP)で標識した。形質転換トロホゾイトをRIPAバッファ液に溶菌させ、そして、抗HA免疫精製キット(Sigma社製)を用いてBIPタンパク質を単離した。
滅菌PBS/0.01%Tween20混合液に懸濁された寄生体タンパク質200μgを、各投与間に3日間の時差を設けて、スナネズミに連続的に3回経口投与して免疫化させた。BIP、膜標本又は精製VSPが免疫抗原として使用された場合、同量のタンパク質をスナネズミに投与した。
下記に記載されるような血中抗体の存在を検出するために、感染又は免疫化の初日後に血液サンプルを回収した。スナネズミをエーテルで安楽死させ、眼窩静脈叢から血液を採取するか又は心臓内穿刺により血液を採取した。血液サンプルを800xgで15分間遠心分離することにより血清を回収し、使用するまで-70℃で保存した。スナネズミを二酸化炭素で殺処分した。
感染、非感染及び免疫化スナネズミの小腸分泌物をマウスにおけるように回収した(Heyworth, M.F.,“異なるアイソタイプのマウス抗体による死滅に対するジアルジア・ムリス・トロホゾイトの比較感受性”, J Parasitol 78, 73-76(1992))。
要約すれば、スナネズミを水を与えながら1日間断食させ、その後、殺処分した。小腸を十二指腸から盲腸まで抉り出し、その内容物をシリンジで吸引し、そして分別した。或る場合には、腸内容物を4℃で5000xgで遠心分離し、細胞、遺残及び細菌を分別した。また、或る実験では、小腸の内腔を3mLの冷PBSで5回洗浄し、前記のように遠心分離した。上澄液を濾過滅菌し、使用するまで-70℃で保存した。
このアッセイは96穴平坦底面プレートで実施した。成牛血清無しのTYI-S-33培地中のVSP(全て加熱不活化済)に対する特異的抗原を含有するスナネズミの腸分泌物、血清又は腹水の幾つかの希釈液と共に約5x105個のトロホゾイトを4℃で1時間インキュベーションした。これらを混合し、顕微鏡によりトロホゾイト凝集をアッセイした。寄生体表面に結合した抗体はヤギ抗マウス免疫グロブリン標識TRITCにより例証された。
LIST OF SEQUENCES
<110> Conicet
Luj n, Hugo
<120> Modified protozoan expressing at least two dos variable surface proteins (VSP), a vaccine comprising it, and procedures, uses and methods thereof
<130> Conicet
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<170> PatentIn version 3.5
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tgaggacctg cttaggctcg cag 23
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 78
cttcttgacn cacacgccgt tctc 24
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 79
tagcagcccc cgttcatgcg gaa 23
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 80
acctcctcac agacgctctt tcca 24
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 81
gcttgtatcc gtcggccgga gtc 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 82
cactcggagc acccagtggc gca 23
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 83
cacttggtgg cgtcgtccgc attg 24
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 84
acagcgncgg agatccccgc tatgg 25
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 85
agaggaagcc cacgaggccc cc 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 86
ggcaattaat taatagaaac at 22
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 87
gctattaggc aattaattaa tag 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 88
ttccgcaaca caattagcct gag 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 89
tgcactttgt attactactg gcg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 90
gcacttctta caagtctgat cag 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 91
ttaaattacc agtnnctccc gct 23
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 92
attactctca ccaatcgtga cccc 24
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 93
gcgtnatcat tagggaaata tcc 23
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 94
ttaagggnnc tcaggctatt cgtg 24
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 95
tcaggacaga cccngggtag cag 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 96
cgtcggcgca gttttccaaa tac 23
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 97
agtgcaaact ccgttggttt tatcc 25
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 98
gcatcggctg tcgtgcacaa cgt 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 99
gccgctggtc tngacgtagc agg 23
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 100
agtcgtagag caagctcctg caag 24
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 101
accccgttga tgggcacata gttt 24
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 102
cttccgtctt nnaaataatc ctacc 25
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 103
gaatcgtaac cccggttgcg tcg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 104
acttagcaca accggccaca ccc 23
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 105
cttatcagcc gtactacagg taag 24
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 106
acggtgctag ccctagttgt aga 23
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 107
cgttcttcaa ggnnctcaga ttgtt 25
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 108
ctctgcaatg catgttccct tt 22
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 109
cgacccgggt ggtgccgctc ttgc 24
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 110
ccattgctgt ctntatcttg ccc 23
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 111
gtgttatctt ngcacacgat gc 22
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> Giardia intestinalis
<400> 112
gacgggagta gaactctgag gaga 24
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sentido S1
<400> 113
cvtgtgchrr stgcaa 16
<210> 114
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sentido S2
<400> 114
tgcacsrsct gcyabcc 17
<210> 115
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sentido S3
<400> 115
tagtgydsyv mvtgyaa 17
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sentido S4
<400> 116
cgatcatgac gggcttct 18
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer antisentido R1
<400> 117
ccbacgaggc cyccsacgac 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer antisentido R2
<400> 118
cgccttccck ckrcakayga 20
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sentido para vsp1267
<400> 119
atgttgttga tagccttcta tc 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer antisentido vsp1267
<400> 120
ctacgccttc cccctgcata tg 22
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer hacia adelante vsp9B10
<400> 121
atgtttggca gttttgttct c 21
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer antisentido vsp9B10
<400> 122
tcacgccttc cctctacata tg 22
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL60 gDicer
<400> 123
tggcggcgtc gtatcagtta t 21
<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL161 gDicer
<400> 124
tccccgcacg caagaagaa 19
<210> 125
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL164 gAgo
<400> 125
attgccccct acggtgtc 18
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL165 gAgo
<400> 126
ctctgccggc cttcctac 18
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL187 gRdRP
<400> 127
catgggttgc agtttcttga cga 23
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL188 gRdRP
<400> 128
agccccttat ctgttgcctc cttc 24
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL 183 CWP1
<400> 129
tcgccctgga tgtttcggac a 21
<210> 130
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL184 CWP1
<400> 130
aggcgggtga ggcagta 17
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL185 GDH
<400> 131
agtggggcgg gtctttactc a 21
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HL186 GDH
<400> 132
tgttcgcgcc catctggtag ttct 24
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer F RdRP_F
<400> 133
tatgttttta ctgatggcgc agg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RdRP_F 2
<400> 134
tacgtcttta ccgatggcgg agg 23
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RdRP_R
<400> 135
tcaccatcca ggtcgctgcc 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RdRP_R 2
<400> 136
tcaccgtcca ggtcactgcc 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer of sequencemiento F
<400> 137
cttgtgcata gtaaacaaag 20
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer of sequencemiento R
<400> 138
caaatggtcg atgctggg 18
<210> 139
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCSnewSense
<400> 139
gattccgggc ccagatctat cgatacgcgt atgcattcgc gagatatctg c 51
<210> 140
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCSnewAntisense
<400> 140
gcggccgcag atatctcgcg aatgcatacg cgtatcgata gatctgggcc cg 52
<210> 141
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer DAF
<400> 141
agttgaaact atcatggttg ctcccgaa 28
<210> 142
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer DAR
<400> 142
ccaccatggt tgaacgccga atccaac 27
<210> 143
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RAF
<400> 143
gcgataggtt gcagttccat gacgttcttg a 31
<210> 144
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RAR
<400> 144
ccaccatggt cgctacctta gcatcatcc 29
Claims (40)
- その表面上に2種類以上の可変表面タンパク質を同時発現することからなることを特徴とする変性原生動物寄生体。
- その表面上に可変表面タンパク質の完全レパートリーを同時発現することからなることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- Dicer、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)及びこれら両方からなる群から選択される酵素を抑制発現することからなることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- RdRP遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- Dicer遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- RdRP遺伝子及びDicer遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- 前記原生動物は抗原変異機構を有することを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- 前記原生動物はランブル鞭毛虫、マラリア原虫、バベシア及びトリパノソーマからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の変性原生動物寄生体。
- その表面上に2種類以上の可変表面タンパク質を発現する少なくとも変性原生動物からなることを特徴とする原生動物により発生された感染に対するワクチン。
- 前記原生動物はその表面上に可変表面タンパク質の完全レパートリーを発現することを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 前記原生動物はDicer、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)及びこれら両方からなる群から選択される酵素を抑制発現することからなることを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 原生動物RdRP遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 原生動物Dicer遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 原生動物RdRP遺伝子及びDicer遺伝子はサイレンスされていることを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 前記原生動物は抗原変異機構を有することを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 前記原生動物はランブル鞭毛虫、マラリア原虫、バベシア及びトリパノソーマからなる群から選択されることを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 賦形剤又はアジュバントを更に有することを特徴とする請求項9に記載のワクチン。
- 下記のステップ、
(a)VSP・CRKGAアミノ酸配列を認識する抗体を固体サポートに結合するステップと、
(b)前記固体サポートを原生動物に接触させるステップと、
(c)可変表面タンパク質(VSP)の完全レパートリーを分離するステップと、 (a)
からなることを特徴とする原生動物可変表面タンパク質(VSP)の完全VSPレパートリーの精製方法。 - 原生動物は野生型原生動物のクローンの混合体であり、各クローンは異なる可変表面タンパク質を発現することを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 原生動物は2種類以上の異なるVSPを発現するクローンであり、前記クローンはRdRP、Dicer及びこれらの両方からなる群から選択される遺伝子をサイレンスすることからなる変性原生動物のクローンであることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 原生動物はVSPの完全レパートリーを発現するクローンであり、前記クローンはRdRP、Dicer及びこれらの両方からなる群から選択される遺伝子をサイレンスすることからなる変性原生動物のクローンであることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 原生動物はランブル鞭毛虫、マラリア原虫、バベシア及びトリパノソーマからなる群から選択されることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 賦形剤又はアジュバントと、2種類以上の原生動物可変表面タンパク質とからなり、前記タンパク質の各々は異なることを特徴とするワクチン。
- 原生動物可変表面タンパク質の完全レパートリーからなり、前記タンパク質の各々は異なることを特徴とする請求項23に記載のワクチン。
- 原生動物はランブル鞭毛虫、マラリア原虫、バベシア及びトリパノソーマからなる群から選択されることを特徴とする請求項23に記載のワクチン。
- 可変表面タンパク質(VSP)の完全レパートリーからなり、前記タンパク質は請求項18に記載された方法を使用して得られることを特徴とするワクチン。
- 少なくとも2種類の可変表面タンパク質(VSP)を発現する変性原生動物からなるワクチンを所定量、哺乳動物に投与することからなることを特徴とする免疫化方法。
- 原生動物はVSPの完全レパートリーを発現することを特徴とする請求項27に記載の免疫化方法。
- 経口、皮下、静脈内及び筋肉内からなる群から選択される形態で投与されることを特徴とする請求項27に記載の免疫化方法。
- 原生動物は、RdRP、Dicer及びこれらの両方からなる群から選択される遺伝子をサイレンスすることからなる変性原生動物であることを特徴とする請求項27に記載の免疫化方法。
- 原生動物感染に対して哺乳動物を免疫化することからなり、前記原生動物は抗原変異機構を有することを特徴とする請求項27に記載の免疫化方法。
- 原生動物可変表面タンパク質の組合せからなるワクチンを所定量、哺乳動物に投与することからなることを特徴とする免疫化方法。
- 経口、皮下、静脈内及び筋肉内からなる群から選択される形態で投与されることを特徴とする請求項32に記載の免疫化方法。
- 可変表面タンパク質の組合せは、RdRP、Dicer及びこれらの両方からなる群から選択される遺伝子をサイレンスすることからなる変性原生動物から単離されることを特徴とする請求項32に記載の免疫化方法。
- 原生動物感染に対して哺乳動物を免疫化することからなり、前記原生動物は抗原変異機構を有することを特徴とする請求項32に記載の免疫化方法。
- 少なくとも50〜500μgの範囲内の投与量の可変表面タンパク質が投与されることを特徴とする請求項32に記載の免疫化方法。
- 配列SEQ ID N゜1aSEQ ID N゜112の範囲内で選択される配列であることを特徴とするヌクレオチド配列。
- dsRNAの配列であることを特徴とする請求項37に記載の配列。
- RdRP遺伝子をサイレンスするために、配列SEQ ID N゜1aSEQ ID N゜112の範囲内で選択される少なくとも一つの配列の使用。
- Dicer遺伝子をサイレンスするために、配列SEQ ID N゜1aSEQ ID N゜112の範囲内で選択される少なくとも一つの配列の使用。
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