JP2012510258A

JP2012510258A - 粘液細菌によるオメガ−３脂肪酸の生成

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Publication number: JP2012510258A
Application number: JP2011537901A
Authority: JP
Inventors: マルク・シュタドラー; エルンスト・レーマー; ロルフ・ミュラー; ロナルド・オー・ガルシア; ドミニク・ピストリウス; アレキサンダー・ブラヒマン
Original assignee: インターメッド・ディスカヴァリー・ゲーエムベーハー
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2012-05-10
Anticipated expiration: 2029-12-01
Also published as: DK2367950T3; EP2367950A2; PT2367950T; JP5833446B2; ES2629854T3; HK1161899A1; WO2010063451A2; CN102325892A; US20110275846A1; WO2010063451A3; US10364447B2; CN102325892B; EP2367950B1

Abstract

本発明は、特定の粘液細菌株を培養することによるω-3多価不飽和脂肪酸の生成方法、および上記の方法に適する粘液細菌株を提供する。

Description

本発明は、オメガ-3多価不飽和脂肪酸(PUFA)を、この方法に適する特定の粘液細菌株を培養することにより生成するための方法を提供する。さらに、本発明は、質量分析と連結したガスクロマトグラフィーに基づく物理化学的データと組み合わせた16S rDNA配列データに基づく系統発生解析を用いることによりそのようなオメガ-3生成粘液細菌を同定して、オメガ-3多価不飽和脂肪酸のさらなる生成菌を見出す方法を提供する。

オメガ-3ファミリーのもの[ω-3(「オメガ-3」)脂肪酸としても知られる]を含む長鎖多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、天然の興味深い脂肪酸である。これらは、膜の剛性を減少させる役割を有するリン脂質の重要な構成成分である。エイコサペンタエン酸(EPA)は、ヒトの脳のリン脂質の主要な構成成分であり、プロスタグランジンおよびレゾルビンの前駆体として働く。オメガ-3ファミリーの別の重要なPUFAは、ドコサヘキサエン酸(DHA)である。幼児の発達における認識および行動機能の改善は、この化合物の高いレベルと相関すると考えられる。オメガ-3 PUFA、特にDHAおよびEPAについて、有益な健康効果は、例えば癌、関節リウマチ、心血管疾患の予防、免疫機能の改善、ならびに目および脳の健康である[最近の総括については、Teale MC(編)(2006) Omega-3 fatty acid research. Nova Science Publishers. New Yorkおよびその中の参考文献を参照されたい]。これらの有益な特性を原因として、オメガ-3 PUFAは、健康および食品サプリメント中の栄養脂質として、そして広範囲の食物における機能性成分として広範に用いられている。オメガ-3 PUFAは、現在、食物および飲料工業部門の最も大きくそして最も強力に成長している市場の部分の1つを構成し、過去何年にもわたって需要が実質的に増加している。

今日では、魚油が最も豊富で広く用いられているオメガ-3脂肪酸の天然の供給源であるが、有名な供給源は、乱獲、DHA/EPAを十分に含む高い等級の油の供給の欠如、および品質の問題(におい、処方の困難など)に苦しんでいる。藻類および卵菌を生成生物として含む代替プロセスが確立されているかまたは開発中である[それぞれHinzpeter Iら(2006) Grasas y Aceites 57:336〜342頁およびWard OP、Singh A(2005). Process Biochemistry 40:3627〜3652頁による総括を参照されたい]。高品質の魚油の供給が漸増的に制限されているので、代替の持続可能な生物学的供給源を見出すことが試みられた。20年間にわたって種々の群の海藻が探索され、藻類のバイオマスに基づくいくつかの製品が、この間、市場に参入している。黄色植物の群(「黄色植物門(Chromophyta)」として以前に知られていた藻類様真核生物の群)に属するいくつかの卵菌も、上記の化合物を生成すると時折報告された(例えば、ワタカビ属(Achyla)およびフハイカビ属(Pythium)のもの;[Aki Tら(1998) J Ferm Bioengin 86:504〜507頁;Cheng MHら(1999) Bioresour Technol 67:101〜110頁;Athalye SKら(2009) J Agric Food Chem 57:2739〜2744頁])。その他の黄色植物(例えばシゾキトリウム属(Schizochytrium)およびトラウストキトリウム属(Thraustochytrium);米国特許第7022512号およびWO2007/068997に記載されるように)および渦鞭毛藻類であるアンフィディニウム(Amphidinium)の種(米国特許出願第2006/0099694号)において、DHAは、細胞の脂肪酸含量の48%までに相当でき、これは、真核生物において現在までに知られている最高の含量である。しかし、工業規模でのこれらの生物の培養は、開発から数年が経過してもまだ課題を有する。

現在までに見出されたオメガ-3 PUFAのその他の代替の生物学的供給源は、原核生物の真正細菌である[Nichols Dら(1999)、Curr Opin Biotechnol 10:240〜246頁;Metz JGら(2001)、Science 293:290〜293頁;Gentile Gら(2003) J Appl Microbiol 95:1124〜1133頁]。しかし、工業的規模でのPUFA生成のためのこれらの生物の商業的な活用は、成長が遅いこれらの好冷微生物の特徴、ならびにこれらの元来の低い収率および生産性により、妨げられている。粘液細菌において、20の炭素原子および4つの二重結合を有する未詳PUFAが、海洋のプレシオシスチス属(Plesiocystis)およびエンハイグロミクサ属(Enhygromyxa)で最初に見出された[Iizuka Tら(2003) Int J Syst Evol Microbiol 53:189〜195頁;Iizuka T.ら(2003)、Syst Appl Microbiol 26:189〜196頁]。最近、ARA(オメガ-6 PUFA)が、新規な粘液細菌ファミリーの代表であるフェーズリシスチス・フラバ(Phaselicystis flava)で見出された[Garcia ROら(2009), Int J Syst Evol Microbiol 50(PT12):1524〜1530頁]。

DHAおよびEPAのようなオメガ-3 PUFAの出現は、粘液細菌については全く報告されておらず、現在までに記述されているプロセスは、収率、PUFAの量および特に、重要なオメガ-3 PUFAの生成に関して不十分である。

粘液細菌の分類学および系統発生学
粘液細菌は、プロテオバクテリアのデルタ亜群であるミクソコッカス目(Myxococcales)の生物の単系統性の群として進化したと考えられる。現在では、3つの亜目(シストバクター亜目(Cystobacterineae)、ナンノシスチス亜目(Nannocystineae)およびソランギウム亜目(Sorangiineae))が、粘液細菌において認識されている[Brenner DJら(編) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、第2版、第2巻、パートC、1059〜1072頁、New York:Springer中のReichenbach H(2005) Order VIII. Myxococcales Tchan, Pochon and Prevot 1948, 398AL.]。これらの亜目は、6つの科、すなわちシストバクター科(Cystobacteraceae)、ミクソコッカス科(Myxococcaceae)、ナンノシスチス科(Nannocystaceae)、コフレリア科(Kofleriaceae)、ポリアンギウム科(Polyangiaceae)およびフェーズリシスチス科(Phaselicystidaceae)に分かれる。

ミクソコッカス科は、ミクソコッカス属(Myxococcus)、コラロコッカス属(Corallococcus)およびピキシディコッカス属(Pyxidicoccus)で構成される。関連するシストバクター科では、5つの属(シストバクター(Cystobacter)、アーキアンギウム(Archangium)、ヒアランギウム(Hyalangium)、メリタンギウム(Melittangium)およびスチグマテラ(Stigmatella))が知られている。ナンノシスチス亜目(Nannocsytineae)のナンノシスチス科は、ナンノシスチス(Nannocystis)と2つの海洋の属(エンハイグロミクサおよびプレシオシスチス)とを含む。その関連するコフレリア科は、陸生のコフレリア属(Kofleria)および海洋のヘリアンギウム属(Heliangium)で構成される。ポリアンギウム科は、ヤーネラ属(Jahnella)、コンドロマイセス属(Chondromyces)、ポリアンギウム属(Polyangium)、ビソボラックス属(Byssovorax)およびソランギウム属(Sorangium)を含む。現在のところ、後ろの2つだけが、この目のうちでセルロース分解性の属として知られている。ほとんどのその他の分類群は、単離および培養が困難である。最近発見されたフェーズリシスチス属は、最近設立されたフェーズリシスチス科の唯一の属である[Garcia ROら(2009) Int J Syst Evol Microbiol 59:1524〜1530頁]。現在のところ、20の属が承認できており、粘液細菌として妥当に記述されて、全ての既知の土壌および海洋単離株をカバーしている。

細菌分類学および系統発生学における16S rDNAの全般的な重要性
16S rDNAは、細菌系統学において広くそして一般的に用いられ、分類群の祖先の組分けを指定している。なぜなら、この遺伝子は、種間で高度に保存されているからである[Weisburg WGら(1991) J Bacteriol 173:697〜703頁]。粘液細菌において、16S rDNA系統発生学は、形態学的特徴とともに、遺伝的分類についての強力な証拠を提供する[Sproer Cら(1999)、Int J Syst Bacteriol 49(PT3):1255〜1262頁]。形態学的分類により同じ属に割り当てられたこれらの粘液細菌株は、それらの16S rDNA遺伝子系統発生学において密にクラスタを形成することが見出された。この方法は、そのメンバーの種同士の祖先の関連性のパターンも提供し、これは、表現型の特徴の程度に反映される[Myxobacteria: Multicellularity and Differentiation (Whitworth DE編)中のVellicer GJ、Hillesland K(2008)、17〜40頁、Washington, DC:ASM Press]。

細菌の化学分類学的マーカーとしての脂肪酸プロファイルの重要性
系統発生学は、粘液細菌の形態学的特徴および生理的特徴に従う。最も重要なことには、細胞性脂肪酸含量のGC-MS解析から推測される脂肪酸プロファイルが一般的に用いられ、粘液細菌および細菌生物の多くのその他の群の分類学的分離について容認できると考えられている。なぜなら、脂肪酸プロファイルは、標準化された方法を用いた場合には少なくとも、一定の特徴であることが見出されているからである。この技術は、1989年の初期に最初に用いられた[Tornabenet G(1985) Methods in Microbiology 18、209〜234頁]。よって、このようなGC-MS(またはGC)に基づく脂肪酸プロファイルは、細菌の系統発生学および分類学において広く用いられている。それにも関わらず、特に経済的に重要な脂肪酸の探索を、他の調査手段と組み合わせてそれぞれの脂肪酸生成菌の分類学的および系統発生学的位置を評価する系統的なアプローチは、現在までに行われていない。

生態系における細菌の種多様性および機能的生物多様性を探索するためのPCRに基づく方法の重要性
実在する細菌種の全体的な多様性は、既知で詳細に記述された培養可能な種の数よりはるかに多いことが、長期にわたって議論されている(そしてその間、環境試料中の真正細菌のin situ同定に指向された分子生物学の方法により証明されている)[Amann RIら(1995) Microbiol Rev 59:143〜169頁;Torsvik Vら(1990) Appl Environ Microbiol 56:782〜787頁]。現在の推定によると、実在する細菌の90%ほど多くが、まだ発見されないままである。土壌およびその他の環境試料からの16S rDNAの直接配列決定のような方法を用いることにより、既知で培養可能な細菌種のいずれとも関連付けることができないDNA配列の大きい多様性が漸増的に明らかになっている。しかし、それらの系統発生学的類縁性は、関連する株とのそれらの16S rDNAの相同性比較から明らかになり得る。現在開発中のメタゲノム技術は、将来、これらの「培養できない」生物の遺伝子および酵素を直接利用することを最終的に促進し得る。現在のところ、ほとんどの場合において、今までのところ未調査の細菌生物についての適切な培養条件を見出し、それらの純粋培養の段階でそれらについて調査する必要がまだある。全ての未調査の細菌の特徴決定およびそれらの生物工学的活用のための必要条件として、特別の単離技術を確立する必要がある。このことは、特に、新規な粘液細菌分類群の発見に関して、そして生物工学において大きい可能性を有する真正細菌の種々のその他の群およびその他の細菌群についても当てはまる。

粘液細菌群は、特定の16S rDNAプライマーを用いるPCRにより特異的に探索できる。土壌微小環境についての以前の研究により、このアプローチを用いて検出できた粘液細菌の少なくとも30のさらなる未知の系統発生学的群が明らかになった。これらは互いに異なるだけでなく、それらの16S rDNA遺伝子も、GenBankおよびその他のパブリックドメインのデータベースに存在する既知の粘液細菌16S rDNA遺伝子配列のものとは異なっていた。これらの結果は、まだ培養も調査もされないままの土壌粘液細菌の未発見の広い多様性が存在することを示唆する[Zhi-Hong W.ら(2005) Env. Microbiol 7(10):1602〜1610頁]。

特に粘液細菌に重点を置いた微生物発酵
粘液細菌株は、通常、水性栄養培地中で、液内好気条件下で発酵される。パイロットおよび工業的規模におけるこの群の生物の大規模発酵の実行可能性についての種々の例が、例えば抗癌剤として最近承認されたエポシロンの発見および開発に関して、科学界において広く知られている。

それらの成長および栄養条件を十分に評価した後に、これらの生物は、通常、実験室での培養において良好に成長でき、それらの生成は、簡単な様式でスケールアップできる。典型的には、微生物は、炭素源およびタンパク質性物質を含有する栄養培地で発酵される。好ましい炭素源は、グルコース、赤砂糖、スクロース、グリセロール、デンプン、トウモロコシデンプン、ラクトース、デキストリン、糖蜜などを含む。好ましい窒素源は、綿実粉、コーンスティープリカー、酵母、乳固体を含む自己消化パン酵母、大豆粕、綿実粕、コーンミール、乳固体、カゼインの膵液消化物、蒸留固体産物(distillers' solids)、動物ペプトンリカー(animal peptone liquors)、肉および骨の端材などを含む。これらの炭素源と窒素源の組合せを有利に用いることができる。微量金属、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄などを発酵培地に加える必要はない。なぜなら、水道水および未精製の成分を培地成分として用いるからである。

生成培養のための大規模発酵は、約18℃〜32℃、好ましくは約28℃の、微生物がうまく成長できる任意の温度で誘導できる。通常、化合物の最適生成は、約2〜8日間の発酵、好ましくは4〜5日間の発酵で得られる。

生成は、振とうフラスコでも、固形培地および撹拌発酵槽でも行うことができる。成長を振とうフラスコまたは大きい容器およびタンクで行う場合、接種する微生物は胞子の形態よりも栄養形態で用いることが好ましい。このことにより、PUFA化合物の生成の著しい遅延と、装置の付随する非効率的な利用が回避される。よって、水性栄養培地に土壌または斜面培養からの一定量を接種することにより、この培地中に栄養型接種材料を作製することが望ましい。若く活発な栄養型接種材料が確保されたら、これを、他の振とうフラスコまたは微生物の発酵に適するその他のデバイスに無菌的に移す。栄養型接種材料を作製する培地は、微生物の適切な成長が得られる限りは、化合物の生成に用いられる培地と同じかまたは異なることができる。

一般的に、撹拌容器中の液内好気発酵での粘液細菌株の播種ならびに化合物の発酵および生成が用いられる。生成は、用いられる容器、発酵槽およびスターター手順に依存しない。化合物は、振とうフラスコ培養またはエアリフト(airlift)もしくはBiowave発酵タンクのようなその他の特別に設計された容器により得ることもできる。大容量発酵のために、栄養型接種材料を用いることが好ましい。栄養型接種材料は、小容量の培養培地に生物の胞子の形態または凍結乾燥ペレットを接種することにより調製する。栄養型接種材料を、次いで、発酵容器に移し、ここで、適切なインキュベーション時間の後に、化合物が最適な収率で生成される。

液内好気培養プロセスにおいて慣例になっているように、滅菌空気を培養培地に分散させる。生物の効率的な成長のために、用いられる空気の容量は、約0.25〜約0.5vvmの範囲である。10l容器における最適速度は、約240rpmで回転する通常の撹拌翼により撹拌しながら約0.3vvmである。泡立ちが問題になるならば、発酵培地にシリコーンのような消泡剤を少量(すなわち1ml/l)加えることが必要である。微好気性生物について、バイオマス生成を支えるためにさらに曝気を低減することが好ましいことがある。発酵は、通常、バッチ形態で行われるが、よりよい成長および生成収率の増加を達成するために、流加発酵法を、元来の培養培地中で必要な栄養源が一旦枯渇したら、それを成長している培養物に供給することにより行うことができる。

所望の生成物は、通常、発酵された粘液細菌株のバイオマスの中にほとんど存在するが、それらが過剰生成された場合、発酵液の培養濾過物にも存在することがある。培養液は、フィルタプレス上でろ過することにより分離できる。PUFA化合物を発酵液から単離して精製するために、例えばクロマトグラフィー吸着法の後に適切な溶媒を用いる溶出、カラムクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィーおよび上記の方法の組合せによる種々の手順を用いることができる。

米国特許第7022512号 WO2007/068997 米国特許出願第2006/0099694号

Teale MC(編)(2006) Omega-3 fatty acid research. Nova Science Publishers. New York Hinzpeter Iら(2006) Grasas y Aceites 57:336〜342頁 Ward OP、Singh A(2005). Process Biochemistry 40:3627〜3652頁 Aki Tら(1998) J Ferm Bioengin 86:504〜507頁 Cheng MHら(1999) Bioresour Technol 67:101〜110頁 Athalye SKら(2009) J Agric Food Chem 57:2739〜2744頁 Nichols Dら(1999)、Curr Opin Biotechnol 10:240〜246頁 Metz JGら(2001)、Science 293:290〜293頁 Gentile Gら(2003) J Appl Microbiol 95:1124〜1133頁 Iizuka Tら(2003) Int J Syst Evol Microbiol 53:189〜195頁 Iizuka T.ら(2003)、Syst Appl Microbiol 26:189〜196頁 Garcia ROら(2009), Int J Syst Evol Microbiol 50(PT12):1524〜1530頁 Brenner DJら(編) Bergey's Manual of Systemic Bacteriology、第2版、第2巻、パートC、1059〜1072頁、New York:Springer中のReichenbach H(2005) Order VIII. Myxococcales Tchan, Pochon and Prevot 1948、398AL Weisburg WGら(1991) J Bacteriol 173:697〜703頁 Sproer Cら(1999)、Int J Syst Bacteriol 49(PT3):1255〜1262頁 Myxobacteria: Multicellularity and Differentiation (Whitworth DE編)、17〜40頁、Washington, DC:ASM Press中のVellicer GJ、Hillesland K(2008) Tornabenet G(1985) Methods in Microbiology 18、209〜234頁 Amann RIら(1995) Microbiol Rev 59:143〜169頁 Torsvik Vら(1990) Appl Environ Microbiol 56:782〜787頁 Zhi-Hong W.ら(2005) Env. Microbiol 7(10):1602〜1610頁 The Prokaryotes、第2版、3416〜3487頁(Balows Aら編) New York:Springer中のReichenbach HおよびDworkin M (1992) The Myxobacteria Reichenbachら、2006. Int J Syst Evol Microbiol. 56(PT10):2357〜2363頁 Brenner DJら(編) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、第2版、New York: Springer Zhang Zら(2000) J Comput Biol 7:203〜214頁 Bode HBら(2006) J. Bacteriol 188:6524〜6528頁 Ring MWら(2006)、J Biol Chem 281:36691〜36700頁(2006) McCurdy, H. D.、Can. J. Microbiol. 15:1453〜1461頁(1969) Li Gら(2003) Bio Techniques 34:908〜909頁(2003) Shimelis OおよびGiese R(2006) J. Chrom. 1117:132〜136頁 The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria、第3版、第7巻、31〜115頁(Dworkin Mら編) New York:Springer中のShimketsら、2006. The myxobacteria Kunze Bら(2006) J Antibiotics 59:664〜668頁 Muller RおよびGerth K(2006) J Biotechnol 121:192〜200頁 Kopp Mら(2004) J Biotechnol 107:29〜40頁 Iizuka Tら(1998) FEMS Microbiol Lett 169:317〜322頁 Larkinら(2007) Bioinformatics Applications Note 23(21):2947〜2948頁 HN Munro(編)Mammalian protein metabolism. New York: Academic Press中のJukes TH、Cantor CR(1969)Evolution of protein molecules、21〜123頁 Saitou NおよびNei M(1987)Mol Biol Evol 4:406〜425頁 Lachnik Jら(2002) J Clin Microbiol 40:3364〜3373頁

ソランギウム亜目の今まで未知の粘液細菌株の特徴決定および同定の過程において、ここでエーテロバクター(Aetherobacter)という名称を提案する今まで未知の新しく発見された属に分類されるものが全て、著しい量の多価不飽和脂肪酸(PUFA)、特にEPAおよびDHAのようなオメガ-3多価不飽和脂肪酸を生成することが、驚くべきことに見出された。EPAおよびDHAの3つの過剰生成菌が見出され、これらは、DSM 21835株と表されるエーテロバクター・ファスキクラタス(Aetherobacter fasciculatus) sp. nov. ined.、DSM 23122株と表されるエーテロバクター・ルフス(Aetherobacter rufus) sp. nov. ined.およびエーテロバクターsp.DSM 23098と命名された。本発明は、粘液細菌の部類に属するあるその他の種の株(特にエンハイグロミクサ属およびソランギウム属の株)も、より少ない程度でDHAおよびEPAを生成することが見出されたという驚くべき新規な発見にも関する。同時に、公共のデータベースで発表されたDNA配列に基づく系統発生学的に関連する細菌のスクリーニングにより、新しく得られたオメガ-3 PUFA過剰生成株に最も近い類縁としていくつかの「未培養」の細菌が明らかになった。これもまたおそらく粘液細菌である。

細菌のこの系統発生学的群は、その生物学的多様性について広く調査されていないと考えられるので、実質的な量でDHAおよび/またはEPAを生成する追加の新しく今までに研究されていない分類群および株が、近い将来発見される可能性が高いと考えられる。このことは、本出願の主題であるPUFA生成株の発見の過程で行われたのと同様のスクリーニングアプローチを用いることにより促進できる。これは、新規なまだ未編集のエーテロバクター属の追加の新しい株だけでなく、粘液細菌のその他の目および科の新規な株にさえ関する。

「エーテロバクター・ファスキクラタス」DSM 21835(a〜d)、「エーテロバクター・ルフス」DSM 23122(e〜h)および「エーテロバクターsp.」DSM 23098(i〜l)の成長段階を示す図である。位相差により暗い栄養細胞(a、e、i)。バー、10μm。典型的な酵母細胞澄明化を示すVY/2寒天上の集落を形成しているコロニー(b、f、j)。バー、15mm。VY/2寒天上の子実体の解剖顕微鏡写真(c、g、k)。バー、300μm。押しつぶされた小胞子嚢(sporangioles)から出たわずかに屈折性の粘体胞子(d、h、l)。バー、10μm。 5日間培養の3重の試料から抽出したエーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835の細胞性脂肪酸のGC-MSクロマトグラムを示す図である。 DHAのフラグメンテーションパターンを示す図である。上の線:エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835の代表的な培養試料 DHAのフラグメンテーションパターンを示す図である。下の線:DHAメチルエステルの購入した参照物質 EPAのフラグメンテーションパターンを示す図である。上の線:エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835の代表的な培養試料 EPAのフラグメンテーションパターンを示す図である。下の線:EPAメチルエステルの購入した参照物質粘液細菌の16S rDNA遺伝子配列に基づき、かつEPAおよびDHA生成株(太字)の系統発生学的位置を示す近隣結合系統樹を示す図である。分岐点の数字は、1,000回の再サンプリングに基づく支持されるブートストラップのレベルを示す。60より大きい値のみを示す。バー、ヌクレオチドの位置あたりの0.05置換。凡例*:この系統樹中の基準株ソランギウム・セルロサム(Sorangium cellulosum)は、ソランギウム属におけるオメガ-3脂肪酸の生成の可能性のみを表す。例えばSBSo021およびSBSo024のようなソランギウム・セルロサムのその他の株において(この系統樹には含まれないDNA配列)、EPAの生成はすでに見出されているが、基準株自体はオメガ-3 PUFAを生成しない。粘液細菌の16S rDNA遺伝子配列に基づき、かつEPAおよびDHA生成株(太字)の系統発生学的位置を示す近隣結合系統樹を示す図である。分岐点の数字は、1,000回の再サンプリングに基づく支持されるブートストラップのレベルを示す。60より大きい値のみを示す。バー、ヌクレオチドの位置あたりの0.05置換。凡例*:この系統樹中の基準株ソランギウム・セルロサム(Sorangium cellulosum)は、ソランギウム属におけるオメガ-3脂肪酸の生成の可能性のみを表す。例えばSBSo021およびSBSo024のようなソランギウム・セルロサムのその他の株において(この系統樹には含まれないDNA配列)、EPAの生成はすでに見出されているが、基準株自体はオメガ-3 PUFAを生成しない。 2009年11月22日にGenBankにおいて入手可能な最も相同性が高い50の代表的な配列に対するエーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835(矢印)の16S rDNA配列の類縁性を示すNCBI-BLASTnから作製した近隣結合系統樹を示す図である。 2009年11月22日にGenBankにおいて入手可能な最も相同性が高い50の代表的な配列に対するエーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835(矢印)の16S rDNA配列の類縁性を示すNCBI-BLASTnから作製した近隣結合系統樹を示す図である。

本発明の粘液細菌株は、新規なエーテロバクター属ならびにその新規な種であるエー・ファスキクラタス、エー・ルフスおよびまだ命名されていないエーテロバクター種に分類されると提案される。これらの全ては、1962年にインドネシアで元来回収された土壌および植物残骸試料から単離された。試料は、Zentrum fur Biodokumentation、Landsweiler-Reden、Germanyにて保存されていた。粘液細菌の単離のために、土壌/植物残骸試料を、以前に記載された方法[The Prokaryotes、第2版、3416〜3487頁(Balows Aら編) New York:Springer中のReichenbach HおよびDworkin M (1992) The Myxobacteria]に従って、生存大腸菌(Escherichia coli)をベイトとして用いて処理した。

エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835は、2007年11月に、根の破片およびその他の腐敗植物物質を含む土壌試料から単離された。エー・ルフスDSM 23122株は、2007年12月に単離され、エーテロバクターsp.DSM 23098は、2009年2月に単離された。

上記の粘液細菌株は、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属し、本明細書で提案される新規な未編集のエーテロバクター属および新規な未編集の属(エー・ファスキクラタス、エー・ルフス、エーテロバクターsp.)の代表であり、好気性〜条件的好気性および化学合成従属栄養性であり、ビソボラックス(別名:ビソファーガ(Byssophaga))・クルエンタ(Byssovorax cruenta)DSM 14553^T株(GenBank受入番号AJ833647、配列番号3)のものと約96%同一である配列番号1(DSM 21835)、配列番号2(DSM 23122)および配列番号4(DSM 23098)に示す16S rDNA配列を有し、かつ/または全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3 PUFA含量を有する。以下に、提案される分類群について記載する。

本発明の株の科学的名称は、まだ公開されていない。エーテロバクター属のその他の株は、当該技術において知られていない。この属は、本発明において初めて記載される。その系統発生学的な関係を、以下に概説する。特徴を以下に、そしてより詳細には実施例に概説する。

ミクソコッカス目は、以下の例示する亜目を含み、これらは、順に、以下に例示される科、以下に例示される属および以下に例示される種を含む。

生存可能な培養物が実在する代表的な属および種の16S rDNA配列データの比較から推測される系統発生学的関係を、図10に示す。

3つの新規な株は、形態学的にかなり類似する。エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835は、栄養細胞および子実体に関して、エーテロバクターsp.DSM 23098とほぼ同じ成長段階の外観を共有する。エーテロバクター・ルフスDSM 23122は、赤い子実体およびより小さい小胞子嚢を有することが異なる。さらに、DSM 23122は、白っぽい集落を生成したが、このことがエーテロバクターの残りの2つの株の黄色っぽいオレンジ色と異なる。

生理学的試験も、新規な株および種の間の違いを明らかにした。明らかに、3つの新規な株は、成長のために異なる糖および窒素源を好む。抗生物質耐性は単離株を区別すると考えられ、例えばDSM 21835およびDSM 23098はハイグロマイシンBに耐性であるとみられるが、DSM 23122はこの化合物に感受性である。アンピシリンおよびネオマイシンに対する耐性は、エー・ファスキクラタスDSM 23098およびエー・ルフス DSM 23122をDSM 23098株から区別する。DSM 21835およびDSM 23098は、DSM 23122と比較して、より広い範囲の抗生物質耐性を示すともみられる。

3つの新規な株に由来する16S rDNA配列は、100%ブートストラップ値により支持される系統樹において一緒にクラスタを形成した。エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835は、エーsp.DSM 23098と形態学的に類似するだけでなく、16S rDNA配列も高い程度の相同性を示した(99.4%の同一性)。エー・ルフスDSM 23122は、DSM 21835と98.9%同一であり、DSM 23098と99.2%同一であることが見出された。この関係は、DSM 21835の配列が、DSM 23122よりもむしろDSM 23098と一緒にクラスタを形成した系統樹において注目に値する(図10)。

新しい属および種の説明
1.エーテロバクターR. O. GarciaおよびR. Muller. gen. nov. ined.
語源:エーテロバクター[Ae.the.ro.bac'ter。ギリシャ語男性名詞ギリシャ神話の光の神アイテール(Aether Greek God of Light)(澄明で透明な集落を指す);ギリシャ語中性名詞バクテリウム(bacterium)からのギリシャ語女性名詞バクター(bacter)小さい桿状体、棒;中世ラテン語男性名詞エーテロバクター澄明な集落を形成する桿状体]

栄養細胞、尖っていない末端を有する、中程度に長くほっそりした円筒形の桿状体;寒天の表面および下を滑走することにより移動。集落、フィルム様〜透明-澄明なコロニー。コンゴーレッド陰性、凝集性の遊走細胞を特徴とする縁、固形培地の下にほとんど浸透する;寒天がわずかに沈下する。粘体胞子、尖っていない末端を有する、屈折したほっそりした桿状体、栄養細胞よりも短く、胞子嚢壁で包囲されている。通常、密集しているかまたはクラスタを形成している小さい卵型の小胞子嚢の子実体。酵母は完全に分解される。強い溶菌性。細胞性FAの主要成分としてオメガ-3多価不飽和脂肪酸を有する。パーセントG+C、68.0〜70%。

新規なエーテロバクター属は、粘液細菌の最も類似する承認された属であるビソボラックスからは、多くの点で明確に異なる。形態学的には、ビソボラックスは、非常に濃い赤色の偽変形体様の集落と子実体とを寒天培地上に示す。遊走細胞のこの独立した群れは、この属に非常に特徴的であるとみなされる。小胞子嚢は大きく(幅60〜180μm)、これもまた非常に濃い赤色を示す。対照的に、以下にさらに詳細に説明する株により代表される新規なエーテロバクター属の種は、寒天に深く浸透する集落形成パターンを生じる。エーテロバクターspp.のもぐりこむ細胞により創出される集落はむしろ、放射状(円形)の外観を示す。さらに、集落を形成する細胞は、白色〜明るいオレンジ色を示す。これらの新規な株全てのコロニーの中央は、酵母寒天(VY/2)中で通常、澄明である。単一の小胞子嚢は小さく(<20μm)、しばしば寒天の中にある、密に詰まったクラスタまたは束に配置される。

エーテロバクターspp.とビソボラックスとの間の別の著しい違いは、新しい属のメンバーがセルロースを分解できないことである。両方の属は、それらの脂肪酸プロファイルにおいても著しく異なる。ビソボラックスは、イソ-15:0および直鎖脂肪酸の含量がより高く、DHAおよびEPAを欠く。

16S rDNAの96%の類似性の遺伝子的特徴も、最近設立された粘液細菌の属であるエンハイグロミクサ[Iizuka T.ら(2003) Syst Appl Microbiol 26:189〜196頁]およびビソボラックス[Reichenbachら、2006. Int J Syst Evol Microbiol. 56(PT10):2357〜2363頁]について用いられた。

上記のデータに基づいて、新規なエーテロバクターの株は、既知のビソボラックス属、すなわちそれらの16S rDNAの相同性比較から推測して最も近い類縁であると考えられる粘液細菌の属とは著しく異なると考えられる。形態学、化学生理学、16S rDNA遺伝子の位相幾何学および系統発生解析におけるこれらの違いをまとめて考え合わせるとこれらは一致して、新しい属の設立が正当だと示唆する。

2.エーテロバクター・ファスキクラタスR. O. GarciaおよびR. Muller. sp. nov. ined.
語源:ファスキクラタス[fasc.i.cu'la. ラテン語男性名詞ファスキクラム(fasciculum)小さい束または塊(小胞子嚢の配置を指す)]。

この属の特徴の全てを有する。栄養細胞、ずんぐりした桿状体、1.2〜1.3×2.9〜5.7μmのサイズ、および位相差により暗い。集落は、オレンジ色っぽく、酵母細胞ベイトの完全な澄明化を示し、寒天表面が浅く沈下し、しばしば培地に深く浸透して、凝集性のカーテン様の構造を形成する。子実体は黄-オレンジ色であり、房として密に配置された5〜20の小さい小胞子嚢(10.4×11.4μm)で構成された胞子嚢群(30×50μm)としてしばしば寒天の下に見出される。粘体胞子、丸い末端を有する屈折し、しっかりした桿状体で、栄養細胞に類似するがより短い(1.0〜1.2×3.2〜4.0μm);胞子嚢壁に包囲されている。栄養の型、溶菌性、酵母分解性。セルロースおよびキチンは分解されない。サッカロース、フラクトース、D-マンノースおよびL-アラビノースでの良好な成長。広範囲の抗生物質に対して耐性:ゲンタマイシン、アプラマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、ネオマイシンおよびハイグロマイシンB。カナマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、カルベニシリンおよびリファンピシンに対して感受性。主要な細胞性脂肪酸成分は、C_22:6(ドコサヘキサエン酸、DHA)イソ-C_15:0、C_20:5(エイコサペンタエン酸、EPA)。MolパーセントG+Cは68.9である。

基準株:エーテロバクター・ファスキクラタスは、ブダペスト条約に従ってDMSZ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstr. 7B、38124 Braunschweig、Germanyに、2008年8月27日に、寄託番号DSM 21835の下で寄託した。

エー・ファスキクラタスDSM 21835は、ビソボラックス(別名:ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tのものと96%同一である16S rDNA配列を有する。これは、全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3 PUFA含量を示す。

エー・ファスキクラタスDSM 21835は、グラム陰性でほっそりした桿形状の栄養細胞の特徴的な集落形成、子実体形成および溶菌活性を示すことにより、粘液細菌の部類、ミクソコッカス目のメンバーとして同定された。この株は、好気性〜条件的好気性で、化学合成従属栄養性であり、種々の抗生物質に対しての耐性も示す。

主要な脂肪酸は、C_22:6(ドコサヘキサエン酸)、イソ-C_15:0、アンテイソC_17:0およびC_20:5(エイコサペンタエン酸)である。ゲノムDNAのG+C含量は68.9mol%である。16S rDNA配列は、セルロース分解性ビソボラックス・クルエンタと96%の同一性、ソランギウム・セルロサムと95%の同一性を示す。このことは、この株がミクソコッカス目のソランギウム亜目に属することを明確に示す。さらに、形態学的成長段階および新規な脂肪酸プロファイルにおける独特性は、DSM 21835が新規なエーテロバクター属および新規なエー・ファスキクラタスの種に属するように分類されると提案される新しい分類群に属することを明確に意味する。

3.エーテロバクター・ルフスR. O. GarciaおよびR. Muller. sp. nov. ined.
語源:ルフス(ru.fus.ラテン語男性形容詞ルフス赤)。
この属の特徴の全てを有する。栄養細胞、ずんぐりした桿状体、1.0〜1.2×3.0〜6.0μmのサイズ、最長で15μm、位相差により暗い。酵母寒天において、集落は、培地中に凝集しながら移動して、縁が白色の環状または円形の構造を形成する。(VY/2寒天)上のコロニーは、完全な酵母分解の結果として澄明で透明の外観を示す。寒天の表面上で、これらは、コロニーの縁に向かって細胞凝集体の土手を有する薄いシートまたはフィルムとしてしばしば生成され、浅い寒天の沈下を示す。子実体、赤〜朱色を示し、1つの土手(120×140μm)または非常に長い巻物(340×400μm〜1900×2900μm)の外観を示し、裸眼で確認でき、最初は細胞凝集体のこぶから発展する。小さい小胞子嚢(6〜12μm)で構成され、胞子嚢群に凝集している(14×15μm〜16×26μm)。粘体胞子、栄養細胞のような丸い末端を有する屈折し、しっかりした短い桿状体(1.0〜2.0μm);胞子嚢壁に包囲されている。栄養の型、溶菌性。セルロースおよびキチンは分解されない。試験した全ての糖において等しく良好な成長:L-アラビノース、フラクトース、ガラクトース、D-グルコース、D-マンノース、糖蜜、ソルビトール、キシロース、セロビオース、ラクトース、マルトース、サッカロースおよび可溶性デンプン。アンピシリン、ネオマイシンおよびゲンタマイシンに耐性。アプラマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンBアンピシリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、カルベニシリンおよびリファンピシンに感受性、主要な細胞性脂肪酸成分は、イソ-C_15:0、C_22:6(DHA)、C_15:0、C_16:0である。C_20:5(EPA)も生成する。モルパーセントG+Cは68.0である。

基準株:エーテロバクター・ルフスは、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)、Braunschweig、Germanyに、2009年11月25日に、寄託番号DSM 23122の下で寄託した。

エー・ルフスDSM 23122株も、EPAおよびDHAを生成することが見出された。形態学的に、この株は、エー・ファスキクラタスDSM 21835株と多くの類似点を共有する。しかし、これら2つの種は、抗生物質感受性、炭素要求性、pH耐性のようないくつかの生理的特徴および16S rDNA配列が異なる。オメガ-3脂肪酸の分析において、エー・ルフスDSM 23122も、DHAおよびEPAをともに生成する。

4.エーテロバクターsp.DSM 23098
エーテロバクターsp.DSM 23098も、上記の株と関連し、その細胞バイオマス内に実質的な量でオメガ3-PUFAを含有することが見出された。この株も、よって、ブダペスト条約に従ってDMSZに、2009年11月12日に、寄託番号DSM 23098で寄託した。

本開示の中の一般的な表現は、好ましくは、以下のまたは上記の意味を有するが、それぞれの実施形態において、1つ、複数または全てのより一般的な表現は、互いに独立して、より具体的な定義で置き換えることができ、よって、それぞれ本発明の好ましい実施形態を形成する。

好ましくは、本発明の目的のために以下の略語が用いられる。

粘液細菌は、好ましくは、界:細菌、門:プロテオバクテリア、綱:デルタプロテオバクテリア、目:ミクソコッカスに科学的に分類される。

本発明の目的のために、「粘液細菌」および「粘液細菌株」の用語は、好ましくは、ミクソコッカス目に属する微生物の任意の種またはその他のメンバーのことをいう。

用いられる用語「メンバー」は、好ましくは、エーテロバクターの相同近縁種のものであると定義される本発明の任意の粘液細菌株について用いられる。

本発明の目的のために、全ての用いられる分類学的関係は、Brenner DJら(編) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、第2版、New York: Springerに従い、本発明の方法は特にこの基準を参照する。

本発明の目的のために、遺伝子類縁性は、「相同性」の用語を用いて記載する。これは、Zhang Zら(2000) J Comput Biol 7:203〜214頁にさらに説明されるhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiのurlからのBLASTn 2.2.22アルゴリズムを用いる本発明の具体的な株のそれぞれの16S rDNAに対するFASTA配列(table 1(表3)に概説するそれらの受入番号により同定される)のバイナリ比較のために16S rDNA配列を用いることに基づく。

本発明による「オメガ-3多価不飽和脂肪酸(PUFA)」は、エイコサ-シス-5,8,11,14,17-ペンタエン酸(20:5EPA)およびドコサ-シス-4,7,10,13,16,19-ヘキサエン酸(22:6DHA)を含む。本発明の第1の態様の方法は、特に、EPAおよびDHAならびに上記の脂肪酸の混合物の生成のために有用である。

本発明の好ましい実施形態は、1または複数のオメガ-3多価不飽和脂肪酸を生成できる粘液細菌株を培養するステップを含むオメガ-3不飽和脂肪酸の生成に関する。

好ましくは、オメガ-3 PUFAを生成「できる」粘液細菌株は、実施例5に記載されるようにして決定されるオメガ-3 PUFAを全細胞性脂肪酸含量の少なくとも0.5重量%含有し、より好ましくは少なくとも1重量%含有し、さらにより好ましくは少なくとも2重量%含有し、なおより好ましくは少なくとも5重量%含有し、最も好ましくは少なくとも10重量%含有し、特に少なくとも15重量%含有するとみなされる。

本発明の好ましい実施形態は、粘液細菌株が、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属する方法に関する。

好ましい実施形態において、粘液細菌株は、ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと少なくとも84%、より好ましくは少なくとも85%または86%、さらにより好ましくは少なくとも87%、88%、89%または90%、なおより好ましくは少なくとも91%、92%または93%、最も好ましくは少なくとも94%、95%、96%同一である16S rDNA配列を有する。

本発明の好ましい実施形態は、粘液細菌株が、ミクソコッカス目のポリアンギウム亜目に属する方法に関する。

好ましい実施形態において、粘液細菌株は、ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^T株と少なくとも85%または86%、より好ましくは少なくとも87%、88%、89%または90%、さらにより好ましくは少なくとも91%、92%または93%、最も好ましくは少なくとも94%、95%、96%同一である16S rDNA配列を有する。

本発明の好ましい実施形態は、粘液細菌株が、全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3多価不飽和脂肪酸含量を有する方法に関する。

さらに好ましい実施形態において、オメガ-3不飽和脂肪酸は、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)およびそれらの混合物から選択される。

本発明のさらなる方法の好ましい実施形態において、上記の培養は、上記の粘液細菌株の種培養インキュベーションと、オメガ-3 PUFA生成のための後続の本培養とを含む。種培養は、VY/2(酵母培地)寒天培地上、最も好ましくはMD1G寒天中で行うのが好ましい。さらに、培養は、25〜32℃、好ましくは約30℃の温度で行うのが好ましい。

本発明のさらなる方法の別の好ましい実施形態において、オメガ-3 PUFA生成のための培養は、液体培地で行われる。特に、培養は、MD1Gブロスで行うのが好ましい。ここでまた、培養は、25〜32℃、好ましくは約30℃の温度で行うのが好ましい。培養の別の好ましい形態は、pHを7.0に調整した同じ培地で、大容量の培地の下で空気を低減して行う。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、方法は、
(i)1または複数の上記のオメガ-3 PUFAを培養物から単離するステップおよび/または
(ii)1または複数の上記のオメガ-3 PUFAを精製するステップおよび/または
(iii)個別のオメガ-3 PUFAを単離するステップ
をさらに含む。

さらに好ましい実施形態において、粘液細菌株は、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属し、本明細書で提案される新規な属(エーテロバクター)および新規な種(ファスキクラタス)の代表であり、好気性〜条件的好気性および化学合成従属栄養性であり、配列番号3に示すビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと約96%同一である16S rDNA配列を有し、かつ/または全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3多価不飽和脂肪酸含量を有する。

好ましい実施形態において、粘液細菌株は、配列番号1に示す16S rDNA配列と少なくとも94%、より好ましくは少なくとも94.5%または95%、さらにより好ましくは少なくとも95.5%、96%、96.5%または97%、なおより好ましくは少なくとも97.5%、98%または98.5%、最も好ましくは少なくとも99.0%、99.2%、99.4%、99.6%または99.8%同一である16S rDNA配列を有する。特に好ましい実施形態において、粘液細菌株は、エーテロバクター・ファスキクラタス(DSM 21835)であり、配列番号1に示す16S rDNA配列を特徴とする。

好ましい実施形態において、粘液細菌株は、配列番号2に示す16S rDNA配列と少なくとも94%、より好ましくは少なくとも94.5%または95%、さらにより好ましくは少なくとも95.5%、96%、96.5%または97%、なおより好ましくは少なくとも97.5%、98%または98.5%、最も好ましくは少なくとも99.0%、99.2%、99.4%、99.6%または99.8%同一である16S rDNA配列を有する。特に好ましい実施形態において、粘液細菌株は、エーテロバクター・ルフス(DSM 23122)であり、配列番号2に示す16S rDNA配列を特徴とする。

好ましい実施形態において、粘液細菌株は、配列番号4に示す16S rDNA配列と少なくとも94%、より好ましくは少なくとも94.5%または95%、さらにより好ましくは少なくとも95.5%、96%、96.5%または97%、なおより好ましくは少なくとも97.5%、98%または98.5%、最も好ましくは少なくとも99.0%、99.2%、99.4%、99.6%または99.8%同一である16S rDNA配列を有する。特に好ましい実施形態において、粘液細菌株は、エーテロバクターsp.(DSM 23098)であり、配列番号4に示す16S rDNA配列を特徴とする。

本発明を、その範囲を限定すると解釈されない以下の実施例によりさらに説明する。当業者は、実施例において用いられる手順を、オメガ-3 PUFAを生成できるさらなる個別の粘液細菌株を同定するために適応させ得ることを認識する。例えば、以下に記載される例示の方法とは異なるその他の既知のクロマトグラフィー法およびその他の既知の質量分析法を用いることができる。

一般的な実験手順
材料および方法
粘液細菌の培養に用いた培地のリスト
CY-SWS
Bactoカジトン(BD、Le Pont de Claix、France) 1g
Bacto酵母エキス(BD、Le Pont de Claix、France) 0.3g
海水塩(SWS)溶液(以下を参照されたい) 1lまで

海水塩溶液(SWS)
クエン酸鉄 0.01g
MgSO₄×7H₂O(Merck、Darmstadt) 8g
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 1g
KCl 0.5g
NaHCO₃ 0.16g
H₃BO₃ 0.02g
KBr 0.08g
SrCl₂×6H₂O 0.03g
微量元素溶液SL-4(以下を参照されたい) 1ml
蒸留水 1lまで

微量元素溶液SL-4
EDTA 0.5g
FeSO₄×7H₂O 0.2g
微量元素溶液SL-6(以下を参照されたい) 100ml
蒸留水 900ml

微量元素溶液SL-6
ZnSO₄×7H₂O 0.1g
MnCl₂×4H₂O 0.03g
H₃BO₃ 0.30g
CuCl₂×2H₂O 0.01g
NiCl₂×6H₂O 0.02g
Na₂MoO₄×2H₂O 0.03g
蒸留水 1lまで

HS培地
MgSO₄×7H₂O(Merck、Darmstadt、Germany) 0.1%(w/v)
KNO₃(Sigma Aldrich、Seelze、Germany) 0.1%(w/v)
Bactoペプトン(BD、Le Pont de Claix、France) 0.15%(w/v)
TRIZMAベース(Sigma Aldrich、Seelze、Germany) 0.2%(w/v)
NaFe-EDTA(Merck、Darmstadt、Germany) 8mg/l
蒸留水 1lまで
pHを7.2に調整

オートクレーブ後に以下のものを補充:
K₂HPO₄(Merck、Darmstadt、Germany) 0.00625%(w/v)
グルコース(Merck、Darmstadt、Germany) 0.4%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Merck、Darmstadt、Germany) 0.0075%(w/v)
蒸留水 1lまで

可溶性培地M
Bactoファイトン(BD、Le Pont de Claix、France) 10g
マルトース一水和物(Merck、Darmstadt) 10g
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 1g
MgSO₄×7H₂O(Merck、Darmstadt) 1g
エチレンジアミン四酢酸、鉄(III)-ナトリウム塩(Fluka、Buchs、Switzerland) 8mg
HEPES(Serva、Heidelberg) 12g/k
蒸留水 1lまで

MD1液体培地
Bactoカジトン(BD、Le Pont de Claix、France) 0.3%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
MgSO₄×7H₂O (Merck、Darmstadt) 0.2%(w/v)
KOHを用いてpHを7.0に調整

MD1G液体培地
Bactoカジトン(BD、Le Pont de Claix、France) 0.3%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
MgSO₄×7H₂O(Merck、Darmstadt) 0.2%(w/v)
グルコース(Acros Organics、Geel、Belgium) 0.35%(w/v)
KOHを用いてpHを7.0に調整

VY/2液体培地
パン酵母(「Frischbackhefe」、Nurnberg、Germany) 0.5%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
HEPES(Serva、Heidelberg) 5mM
KOHを用いてpHを7.0に調整

VY/2マルトース
パン酵母(「Frischbackhefe」、Nurnberg、Germany) 0.5%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
マルトース一水和物(Merck、Darmstadt) 0.3%(w/v)
HEPES(Serva、Heidelberg) 5mM

VY/2-SWS
NaCl 20 g
パン酵母(「Frischbackhefe」、Nurnberg、Germany) 2.5g(湿潤重量)
Bacto寒天(BD、Le Pont de Claix、France) 15g
海水塩溶液(上記を参照されたい) 1l
1M NaOHを用いてpHを7.5に調整

LB培地
Bactoトリプトン(BD、Le Pont de Claix、France) 10g
Bacto酵母エキス(BD、Le Pont de Claix、France) 5g
NaCl(Difco) 5g
蒸留水 1lまで
KOH溶液を用いてpHを7.0に調整

VY/2寒天培地
パン酵母(「Frischbackhefe」、Nurnberg、Germany) 0.5%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
HEPES(Serva、Heidelberg) 5mM
寒天(Difco) 1.5%(w/v)
KOHを用いてpHを7.0に調整

MD1G寒天培地
Bactoカジトン(Difco) 0.3%(w/v)
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.05%(w/v)
MgSO₄×7H₂O(Merck、Darmstadt) 0.2%(w/v)
グルコース(Acros Organics、Geel、Belgium) 0.35%(w/v)
寒天(Difco) 1.5%(w/v)
KOHを用いてpHを7.2に調整

緩衝水寒天
CaCl₂×2H₂O(Sigma-Aldrich、Seelze、Germany) 0.1%(w/v)
Bacto寒天 1.5%(w/v)
HEPES 20mM
KOH溶液を用いてpHを7.0に調整

鉱物塩寒天(ST21寒天)
溶液A
K₂HPO₄ 0.1%(w/v)
Bacto酵母エキス 0.002%(w/v)
Bacto寒天 1%(w/v)
蒸留水中で水の容量の約3分の2で調合する。

溶液B
KNO₃ 0.1%(w/v)
MgSO₄×7H₂O 0.1%(w/v)
CaCl₂×2H₂O 0.1%(w/v)
FeCl₃ 0.02%(w/v)
MnSO₄×7H₂O 0.01%(w/v)
残りの水の容量で調合する。別々にオートクレーブする。溶液AとBを合わせる。

CT7寒天
トップアガー層
MgSO₄×7H₂O 0.1%(w/v)
K₂HPO₄ 0.02%(w/v)
キチン(Sigma) 0.05%(v/v)
Bacto寒天 1.5%(w/v)
KOHを用いてpHを7.5に調整し、オートクレーブの後にベースの寒天の上に薄い層として注ぐ。

寒天ベース層
CaCl₂×2H₂O 0.1%(w/v)
Bacto寒天 1.5%(w/v)
HEPES 5mM
pHを7.2に調整し、オートクレーブする。

Cel3寒天
セルロース粉末MN300[Macherey and Nagel (Duren、Germany)] 0.5%(w/v)
KNO₃ 0.1%(w/v)
Bacto寒天 1.0%(w/v)
pHを7.2に調整する。
KNO₃を別にオートクレーブし、培地が約50℃に冷却された後に培地に加える。鉱物塩寒天(ST21寒天)の上に薄い層として注ぐ。

参照株
いくつかの株を、実施例5および6で行った作業について参照として用い、それらの参照DNA配列データを、GenBank(National Center for Biotechnology Informationにより提供されるデータベース;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)および/またはEMBL (European Molecular Biology Laboratory、http://www.embl.de/)により作製されるそれぞれのデータベースのような公共データベースから比較のために検索した。これらを全てtable 1(表3)に列挙する。可能であれば、これらの配列に言及する出版物を引用し、配列データはここでは示さない。

オメガ-3 PUFA、特にDHA、EPAの生成:MD1G寒天からの活発に集落を形成している細胞を、よく成長した寒天プレートからはがし、20mlのMD1Gブロスを含有する100mlフラスコに接種した。この培養物を、ロータリーシェーカー上で7日間、160rpmおよび30℃にて種培養としてインキュベートした。種培養から採取した2mlの一定量を、50mlの液体MD1G培地(すなわち、脂肪酸分析のための生成培地)を含有する3本の250mlフラスコに導入した。フラスコを10日間、種培養のものと同じ速度および温度にて振とうした。主に凝集細胞を含有していた2mlの一定量を、5日および10日間のインキュベーションの後に各フラスコから採取した。湿潤および乾燥細胞重量を、次いで、計算した。

細胞性脂肪酸の抽出:細胞性脂肪酸を、FAME法を用いて抽出した[Bode HBら(2006) J. Bacteriol 188:6524〜6528頁;Ring MWら(2006)、J Biol Chem 281:36691〜36700頁(2006)]。抽出物の一定量(5μl)を、GC-MSにより分析した。

EPAおよびDHAを含む細胞性脂肪酸の同定:オメガ-3 PUFA(EPAおよびDHA)を含む細胞性脂肪酸を、フラグメンテーションパターンおよび保持時間に基づいて同定した。これらの脂肪酸(FA)を、37の脂肪酸メチルエステルを含有するFAME混合参照標準物質(Sigma-Aldrich)と比較した。DHAおよびEPAの存在を、Sigma-Aldrichからの参照標準物質(シス-4,7,10,13,16,19-DHA、シス-5,8,11,14,17-EPA)を用いて確認した。

EPAおよびDHAの定量:
GC-MSを、5973電子衝撃質量選択的検出器および7683B注入器(Agilent、Waldbronn、Germany)を有するAgilent 6890Nガスクロマトグラフで、ジメチル-(5%フェニル)-ポリシロキサンキャピラリーカラム(Agilent HP-5ms、0.25mm×30m×0.25_m)と、1ml/分の流速でのキャリアガスとしてのヘリウムとを用いて行った。試料を、スプリットモード(スプリット比、10:1)で注入した。カラム温度は130℃に2.5分間維持し、240℃まで5℃/分の速度で上昇させ、300℃まで30℃/分で傾斜させ、300℃にて5分間保持した。その他の温度は、次のとおりであった:入口、275℃;GC-MSトランスファーライン、280℃;イオン源、230℃;および4重極、150℃。質量選択的検出器は、m/z 40〜500の質量範囲を走査するスキャンモードで作動させた。データ解析は、AMDISソフトウェア、バージョン2.64(NIST、Gaithersburg、MD、USA)で、定量のために「積算シグナル」の値を用いて行った。量は、全脂肪酸メチルエステルの積算値の合計に対するパーセンテージで計算した。

DHAおよびEPAを、参照FAME混合物中に存在する量(それぞれ2%または各0.2μg/μl)に基づいて推定した。5μlの一定量を参照混合物から採取し、95μlのクロロホルムと混合して、100μlの最終容量を得た。この混合物から、一定量を、上記で特定するGC-MS解析のためにカラムに注入した。

DHAおよびEPAは、まず、FAME混合物中で、フラグメンテーションパターンおよび保持時間の分析により決定した。これらのピーク面積を、次いで、標準物質中に存在する量を表す積算シグナル面積を用いて計算した。

細胞性脂肪酸抽出物をGC-MSにおいて分析した後に、DHAおよびEPAに相当するピークを、試料中に存在する量を表す積算シグナルを用いて測定した(保持時間範囲:EPA 17.5〜18.5分、DHA 20.5〜21.5分)。

DHAおよびEPAの量を、試料積算シグナルの平均を標準物質積算シグナルで除することにより計算した。これに、次いで、標準物質の脂肪酸の濃度と脂肪酸抽出物の全容量を乗じた。以下の式を参照されたい。
SFA×AIS/IS×TVFAE=所望のPUFAの質量
SFA=標準物質FA濃度[容量あたりの質量]
AIS=試料の平均積算シグナル
IS=標準物質の積算シグナル
TVFAE=FA抽出物の全容量[容量]

多価不飽和オメガ-3 PUFAの全パーセンテージが、最終的に、平均のEPAとDHAの総和から得られた。細胞性脂肪酸のパーセンテージを、3重の試料の平均から決定した。

株の維持:オメガ-3 PUFAを生成する全ての粘液細菌株は、VY/2寒天で日常的に培養して維持したが、ここでこれらの株は、かなり成長することが見出された。長期間の保存は、液体窒素の下で10%グリセロール中にて行った。

形態学的観察:集落を形成しているコロニーおよび子実体を、Olympus(Hamburg、Germany) SH-ILLB実体顕微鏡で観察し、Axiocam MRC(Zeiss、Gottingen、Germany)カメラを用いて撮影した。子実体は、レーザ走査蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いても分析した。栄養細胞および粘体胞子の形態を、位相差顕微鏡(Zeiss)を用いて研究した。全ての成長段階を、VY/2寒天上でも観察した。

生理学的試験:グラム染色およびコンゴーレッド染色に対する栄養細胞の反応を決定した。後者での染色は、McCurdy, H. D.、Can. J. Microbiol. 15:1453〜1461頁(1969)の方法に従った。カタラーゼ活性を、3% H₂O₂を用いて試験した。セルロース分解は、全て濾紙(2×1cm)を重層したVY/2およびST21寒天上で行い、並行してCel-3 寒天上でも試験して[The Prokaryotes.第2版、3416〜3487頁(Balows Aら編) New York:Springer中のReichenbach H.およびDworkin M(1992) The Myxobacteria]、セルロース粉末の分解を決定した。キチンの分解アッセイは、Reichenbach Hら(2006) Int J Syst Evol Microbiol 56:2357〜2363頁に記載されるようにして行った。

微生物捕食試験:グラム陰性細菌である大腸菌の1晩培養物を、水寒天状にスポット接種(直径約10mm)し、風乾した後に、環境試料を接種した。培養プレートを、パラフィルムで密閉し、30℃にて1週間インキュベートした。微生物食物ベイトの澄明化が、広がる粘液細菌コロニーによる溶菌作用を示した。

温度、pH、炭素および窒素源ならびに抗生物質に対する成長応答:異なるレベルの温度に対する成長応答および抗生物質耐性についての試験も、VY/2寒天で行った。栄養細胞の接種材料は、同じ培地から採取した活発に成長している集落から得た。用いた抗生物質は、アプラマイシン(Fluka、Buchs、Switzerland)、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシンB(Roth、Karlsruhe、Germany)、トブラマイシン(Sigma-Aldrich)、スペクチノマイシン(Serva、Heidelberg、Germany)、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン(全てSynopharm、Barsbuttel、Germanyから)、カルベニシリン、ネオマイシン、リファンピシンおよびゲンタマイシン(Applichem、Darmstadt、Germany)であり、全て濾過滅菌し、オートクレーブした培地を冷却(50℃)した後に加えた。

窒素含有化合物の利用は、10mMのL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、尿素、KNO₃および(NH₄)₂SO₄を補った水寒天で分析した。同じ培地において、カザミノ酸(BD)および種々のペプトン源[トリプトン、カジトン、ペプトン、ネオペプトン、ファイトン(BD)]も0.3%の濃度で試験した。

炭素源利用は、5mMのHEPESを補った水寒天で決定した。最終pHは、オートクレーブの前にKOHを用いて7.0に調整した。フラクトース、D-マンノース、サッカロース、L-アラビノース、D-グルコース、D-ガラクトース、ソルビトール、セロビオース、可溶性デンプン、糖蜜、マルトース、キシロースおよびソルビトールを、それぞれ0.35%の濃度で補充した。

G+C含量および16S rDNA解析:ゲノムDNAを、活発に成長している細胞から、QiagenゲノムDNA精製キットのグラム陰性細菌用のプロトコルを用いて抽出した。新規な細菌のDNAのG+C含量を、HPLCにより決定した[Li Gら(2003) Bio Techniques 34:908〜909頁(2003);Shimelis OおよびGiese R(2006) J. Chrom. 1117:132〜136頁]。16S rDNA解析は、Garcia ROら(2009) Int J Syst Evol Microbiol 50(PT12):1524〜1530頁に従って行った。得られた16S rDNA配列を、NCBI-BLASTヌクレオチド-ヌクレオチドデータバンクとも比較した。このサービスは、U.S. National Library of Medicine 8600、Rockville Pike、Bethesda MD、20894 USAに所在のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)によりBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)として提供される。特に、ヌクレオチドデータベース(BLASTn)を検索した。

(実施例1)
本発明の株による脂肪酸の生成
エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835、エーテロバクター・ルフスDSM 23122およびエーテロバクターsp.DSM 23098
A.オメガ-3 PUFA(DHA、EPA)の生成:MD1G寒天培養物の表面上の活発に集落を形成している細胞から、エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835、エー・ルフスDSM 23122およびエーテロバクターsp.DSM 23098を、MD1G液体培養において凝集体として成長させた。この条件により、細胞を光学密度により定量することが可能になった。振とう培養の5日目に採集された細胞は、黄色っぽい色を示し、顕微鏡観察により長くほっそりした桿状体(栄養細胞)であることが明らかになった。成長の10日目に、細胞は赤になり、顕微鏡観察の後に、おそらく子実体を示す構造が明らかになった(図1a)。これらは、胞子を中に含む包囲する壁(小胞子嚢)を含み、寒天表面上で見出される子実体と類似性を示す(図1b)。栄養細胞は、黄色っぽい塊の原因であるとみられ、おそらく、10日間のインキュベーション後に胞子に変換された。この事象は、エー・ファスキクラタスDSM 21835においてのみ観察された。

両方の株は、50mlの種培養を接種した750mlのMD1Gを含有する1lフラスコに接種した場合に良好に成長したが、より凝集した細胞ペレットが生じ、細胞は、10日以上のインキュベーション後であっても子実体に変換されなかった。

高容量の培地においてより良好な成長が観察されたことは、おそらく寒天の下にもぐりこむ両方の株の性質を反映し、このことは、空気に対するより少ない需要が成長のために要求されることを示唆する。さらに、観察された弱いカタラーゼ反応も、この仮説を支持する。これらのデータの分析は、全てのエーテロバクター株が、微好気性または条件的好気性の可能性があることを意味した。この基本的な情報は、株の培養において、そして結果としてPUFA生成の分析のために重要であると考えられる。

Tables2〜7(表4〜9)は、それぞれMD1G振とうフラスコ中での5日間および10日間の培養後のエーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835、エー・ルフスDSM 23122およびエーテロバクターsp.DSM 23098の3重の細胞重量測定を示す。DHAおよびEPAのピークを、3重の試料から積算シグナルを用いて測定した。

図2は、MD1G培地での5日間の発酵の後に採取された脂肪酸含有抽出物のGC-MSクロマトグラムを示す。DSM 23122株およびDSM 23098株は、同等であるがわずかにより少ない量のDHAおよびEPAを生成した(Tables3および4(表5および6)を参照されたい)。

B.EPAおよびDHAを含む細胞性脂肪酸の同定:図2は、エー・ファスキクラタスDSM 21835の細胞性脂肪酸のGC-MSクロマトグラムを示す。tables 5〜7(表7〜9)において、インキュベーションの5日目および10日目から抽出された脂肪酸の対応するパーセンテージを示す。

細胞性脂肪酸を、上記の一般的な方法および材料の章に記載されるようにして同定した。

試料のフラグメンテーションパターンにより、エー・ファスキクラタスDSM 21835株について図3および4に例示的に略述するように、DHAおよびEPAのメチルエステル標準物質に対して質量単位を同定した。

C.細胞性脂肪酸の抽出および定量:tables 2〜7(表4〜9)に示すように、3つの株全ては、乾燥細胞質量の少なくとも15%の全PUFA(一緒にしたEPAおよびDHA)を含有する。観察された最高の量は、25%を超えていた。データは、さらに、最適な生成に10日間の期間内で到達することを示す。

(実施例2)
エー・ファスキクラタスDSM 21835株の同定
DSM 21835株は、2007年11月に、根の破片およびその他の腐敗植物物質を含むインドネシアの土壌試料から単離された。この株は、緩衝水寒天の表面上の細菌ベイトにおいて成長する黄色っぽいオレンジ色の子実体を形成したので見出された。解剖顕微鏡下の形態学的観察により、胞子嚢群内に詰まった小胞子嚢のクラスタが明らかになった。洗浄した子実体材料を新鮮なVY/2寒天上に接種すると、薄く繊細な集落が生成され、これが寒天の表面上および内部に凝集しながら遊走した。集落を形成する物質を連続的に繰り返して継代することにより、純粋株が単離される。

形態学的および培養の特徴決定:
集落:VY/2寒天上では、細菌コロニーまたは集落は、典型的に、カーテン様の外観を生じながら広がる(図1b)。細胞密度は、集落の縁でより高い。遊走細胞は凝集しながら移動し、同時に酵母細胞を澄明化する。細胞は、寒天の表面上でも凝集して広がり、浅い降下を示し得る。生存大腸菌をベイトとする水寒天において、集落コロニーは寒天の表面上に薄く広がって、長く微細な放射状のすじを生成する。MD1寒天において、細菌は、表面上に広がりにくく、通常、特に接種部位において深く成長する傾向にある。黄色っぽいクリーム色のコロニーが、特徴的な寒天の沈下を伴ってこの培地で典型的に形成される。薄くフィルム様の集落構造物が、この寒天上に出現する。

栄養細胞:スライドマウント中の栄養細胞は、1.2〜1.3×2.9〜5.7μmの長くほっそりした桿状体(図1a)で、ソランギウム亜目に典型的な丸い末端を有する。細胞の両極端には暗いスポットの顆粒があり、これらは、位相差顕微鏡において明確に観察できる。運動性は、寒天の下および表面上を滑走することにより生じる。栄養細胞は、MD1G培地中の振とうフラスコ発酵中に凝集して黄色っぽい色素を生成する。

子実体:VY/2寒天上で、子実体は、クラスタまたは連鎖した様式で通常配置される束または胞子嚢群に詰まった小胞子嚢で構成される(図1c)。通常、これらは、2週間のインキュベーション後に発生する。子実体は、通常、集落の縁および寒天の下で生成される。子実体の発生中に時折、黄色の拡散性色素が観察される。小胞子嚢は球状〜卵型の形状であり、10.4×11.4μmである。典型的な胞子嚢群は30×50μmであり、5〜20の小さい小胞子嚢を含有する。澄明で光沢がある透明な粘液が、しばしば、VY/2寒天の表面上で子実体を包囲するのが見られる。

粘体胞子:押しつぶした小胞子嚢は、おそらく粘体胞子である、密に詰まり光学的に屈折した桿状細胞を放出する(図1d)。これらは、より短く、栄養細胞とほぼ同じ幅(1.0〜1.2×3.2〜4.0μm)で、多少丸い末端を有する。

生理的特徴
染色、分解および溶菌特性:栄養細胞は、グラム陰性およびカタラーゼ陽性である。集落コロニーは、ソランギウム亜目に典型的であるように、コンゴーレッドで染色されないままである。水寒天上の生存細菌食物ベイト(大腸菌)は完全に分解され、室温にて6日間のインキュベーションの後に澄明化され、強い溶菌特性を示唆する。この株は、Cel-3寒天および濾紙を重層したST21寒天上でセルロースを分解できず、CT-7寒天上のキチン粉末も分解されない。寒天分解は、VY/2およびMD1寒天で成長した培養物において共通して観察される。

温度およびpHに対する成長応答。酵母寒天上で、最適な成長は、30℃のインキュベーションで観察されるが、かなりの成長は、同じ寒天上で18℃にてまだ達成される。37℃では成長しない。同じ培地において、この株は、pH5〜9の範囲で成長でき、集落の最大の直径はpH7.0にて明らかになる。しかし、4.0未満およびpH10を超えるpHでは成長の証拠は見出されない。

炭素源の利用。この株の成長を支持する最良の炭素源は、ラクトースである。かなりの成長は、糖蜜、マルトースおよびキシロースで、穏やかな成長はサッカロース、フラクトース、D-マンノース、L-アラビノース、ガラクトース、ソルビトール、マンノースおよびグルコースでも観察される。セロビオースおよび可溶性デンプンでは成長が乏しい。子実体は、単糖(例えばグルコース、マンノース)およびソルビトールの存在下で観察できた。

窒素源の利用。集落コロニーの最大の直径は、グルタミン酸、硝酸カリウムおよびアスパラギン酸を用いて達成される。尿素および硫酸アンモニウムは乏しい成長しか可能にせず、むしろ薄くまばらな集落をもたらす。複合窒素源のうち、カジトン、ペプトンおよびネオペプトンが最適である。トリプトンおよびファイトンは、まだかなりの成長を示すが、株はカザミノ酸では乏しくしか成長しない。

抗生物質耐性:この株は、カナマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、カルベニシリンおよびリファンピシンに感受性である。耐性は、ゲンタマイシン、アプラマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、ネオマイシンおよびハイグロマイシンBに対して観察される。

Mol%G+C分析。DNAのG+C含量は、68.9mol%である。

(実施例3)
エーテロバクター・ルフスDSM23122株の同定
粘液細菌DSM23122株は、2007年11月に、根の破片およびその他の腐敗植物物質を含むインドネシアの土壌試料から単離された。この試料は、1962年に元来回収され、Zentrum fur Biodokumentation、Landsweiler-Reden、Germanyにて保存されていた。土壌は、標準的なベイト法を用いる単離のために処理した[The Prokaryotes、第2版、3416〜3487頁(Balows Aら編) New York:Springer中のReichenbach HおよびDworkin M (1992) The Myxobacteria]。この株は、鉱物塩寒天上の濾紙の表面上の赤っぽい色のその子実体により認められた[The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria、第3版、第7巻、31〜115頁(Dworkin Mら編) New York:Springer中のShimketsら、2006. The myxobacteria]。子実体を同じ新鮮な培地上に接種すると、薄く繊細な集落が出現し、これが寒天の表面上に凝集しながら遊走する。この株は、集落を形成する物質を新しい培養培地上に繰り返して継代した後に、純粋に単離された。

形態学的および培養の特徴決定:
集落。固形VY/2培地上(図1f)では、細菌コロニーまたは集落は、典型的に、寒天の表面上および寒天の下で広がる。より高い細胞密度が集落の縁で観察され、白いバンドとして観察できる。遊走細胞は凝集しながら移動し、オートクレーブされた酵母細胞を澄明化する。寒天の表面上の集落は、浅い降下を示す。生存大腸菌をベイトとする水寒天において、集落は薄く透明に広がって、時折長く微細な放射状のすじを生じる。ベイトと接触すると、波または畝様の集落の縁の構造が生成される。ベイト細菌は、2〜3日間のインキュベーションの後に完全に分解される。

栄養細胞。栄養細胞(図1e)は、1.1〜1.2×3.0〜7.0μmの長くほっそりした桿状体で、ソランギウム亜目に典型的な丸い末端を有する。細胞の両極端には、位相差顕微鏡により明らかになるように、暗いスポットの顆粒がある。運動性は、寒天の表面上および寒天の下を滑走することにより達成される。栄養細胞ペレットは、液体MD1培地中で白っぽいままである。

子実体。完全に発達した子実体が、2週間のインキュベーションの後に観察された。VY/2および水寒天において、子実体(図1g)は、375×650μm〜425×1400μmの赤っぽい塊で構成され、通常、裸眼で確認できる。明視野および位相差顕微鏡の下で、これらの塊は、小さく緻密な小胞子嚢で構成されることが明らかになる。通常、これらは、1週間のインキュベーションの後に、栄養細胞の白い凝集体として発生し始める。典型的には、子実体は、寒天の表面上の、通常、集落の縁にあるが、時折、結実は寒天の下で生じて、形態学的に同様の構造をもたらす。単一の小胞子嚢(4.0×7.0μm)は、シストバクター科の単一の栄養細胞の長さのほぼ2倍になる。

粘体胞子。押しつぶした小胞子嚢は、おそらく粘体胞子である、密に詰まり光学的にわずかに屈折した桿状細胞を放出する(図1h)。これらは短く、栄養細胞とほぼ同じ幅(1.0×2.0μm〜1.1×3.0μm)で、丸い末端を有する。

生理的特徴
染色および溶菌特性。集落コロニーは、ソランギウム亜目に典型的であるように、コンゴーレッドで染色されないままである。栄養細胞は、グラム陰性およびカタラーゼ陽性である。この株は、関連する属とは、Cel-3上のセルロース粉末およびST21寒天上の濾紙を分解できない点で異なる。CT-7寒天上のキチン粉末も分解されなかった。部分的な寒天分解は、VY/2およびMD1寒天上で共通して観察された。

温度およびpHに対する成長応答。酵母寒天上で、最適な成長は、30℃のインキュベーションで観察されるが、かなりの成長は、同じ寒天上で18℃にてまだ達成される。37℃では成長しない。同じ培地において、成長は、pH5〜8の範囲で観察され、pH7.0が最適である。pH4.0以下およびpH9.0以上では成長の証拠は見出されない。

炭素源の利用。試験した全ての炭素源が等しく利用された。

窒素源の利用。集落コロニーの最大の直径は、グルタミン酸、アスパラギン酸、硫酸アンモニウムおよび硝酸カリウムを用いて達成されるが、この株は、尿素中では成長が乏しい。複合窒素源のうち、カジトンが最適な成長を示す。ペプトン、ネオペプトンおよびトリプトンは、まだかなりの成長を示し、ファイトンは乏しい成長しか示さず、カザミノ酸を用いると全く成長が観察されない。

抗生物質耐性。この株は、ゲンタマイシン、アンピシリンおよびネオマイシンに耐性である。感受性は、アプラマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンB、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、カルベニシリンおよびリファンピシンに対して観察された。

Mol%G+C分析。DNAのG+C含量は、68.0mol%である。

(実施例4)
エーテロバクターsp.DSM 23098株の同定
DSM 23098株は、2009年2月に、インドネシアの土壌試料から単離された。試料は1962年に元来回収され、Zentrum fur Biodokumentation、Landsweiler-Reden、Germanyにて保存されていた。土壌は、記載された方法に従って生存ベイト大腸菌を用いる単離のために処理した[The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria、第3版、第7巻、31〜115頁(Dworkin Mら編) New York:Springer中のShimketsら、2006. The myxobacteria]。この細菌は、寒天の表面上に独立した集落を形成するそのほぼ透明のコロニーにより認識され、新しい培養培地へ繰り返して継代することにより純粋に単離した。

形態学的および培養の特徴決定
集落。酵母培地(VY/2)において、コロニー(図1k)は、集落の中央にそってほぼ透明に広がる。よく成長したコロニーの縁にて環が見られる。拡大する環コロニーは、より低い寒天濃度(例えば8〜10g/l寒天)にてより明確であり、通常、縁の周囲でオレンジ色を示す。光の下でのインキュベーションにより、より強い色素形成を引き起こすことができ、より濃いオレンジ色の集落が得られる。遊走細胞は凝集しながら移動し、同時にオートクレーブされた酵母細胞を澄明化して、寒天培地の部分的〜完全な澄明化をもたらす。酵母寒天の表面上での集落形成は、浅い沈下を示す。しかし、これも、寒天濃度が低減するとより深くなり得る。生存大腸菌をベイトとする水寒天において、集落は薄くほぼ透明に広がる。縁は、典型的には、寒天表面上で波様のパターンを示す。時折、短く繊細なさざ波も、寒天の表面上で見られる。異なる細菌と接触すると、ほとんどの溶菌性粘液細菌と同様に、コロニーの波または畝様の構造が生成される。栄養細胞は、粘液細菌において通常観察されるように、寒天プレート培養物の縁に到達した後に通常死滅する。飢餓および好ましくない条件下では、遊走細胞または集落は、子実体の発生を経る。

栄養細胞。栄養細胞(図1i)は、1.1〜1.2×3.0〜11.0μm(ほとんどは6〜7μm長しかない)の長くほっそりした位相差により暗い桿状体であり、ソランギウム亜目において典型的に見出されるように丸い末端を有する。運動性は、寒天の表面上および寒天の中を滑走することによるものであった。液体培養で成長する場合、子実体発生の土手形成中の寒天表面のものと同様に、黄色〜明るいオレンジ色の栄養細胞ペレットが生成された。

子実体。VY/2寒天において、子実体(図11)は小胞子嚢で構成され、これらは、通常、オレンジ色のスポットとして観察でき、典型的には寒天の中にある。時折、子実体を取り囲む透明の粘液が、エー・ファスキクラタスと同様に、寒天表面上で観察される。子実体の発生は、黄色〜明るいオレンジ色の土手として見える栄養細胞の凝集塊から開始する。小胞子嚢は、30×37μm〜125×67.5μmの束で構成される。これらの束は、8×7〜17×15μmのサイズの3〜9つの卵型〜球状の小胞子嚢を含有する。

粘体胞子:押しつぶした小胞子嚢は、おそらく粘体胞子である、密に詰まり光学的にわずかに屈折した桿状細胞を放出する(図1m)。これらは、わずかにより短く、栄養細胞とほぼ同じ幅(1.0〜1.2μm×3.0〜5.0μm)で、丸い末端を有する。この特徴は、ソランギウム亜目と一致する。

生理的特徴
染色および溶菌特性。栄養細胞は、グラム陰性およびカタラーゼ陽性である。集落コロニーは、その他のソランギウム亜目と同様に、コンゴーレッドで染色されないままである。この株は、関連するセルロース分解性の属とは、Cel-3上のセルロース粉末およびST21寒天上の濾紙を分解できない点で異なる。CT-7寒天上のキチン粉末も、集落形成細胞により分解されなかった。浅い寒天の沈下が、ほとんどの固形培養培地でも観察され、この株が寒天も分解できることを示す。

微生物捕食試験:ベイトにした細菌は、30℃にて5〜7日間のインキュベーションの経過で澄明化されたが、このことは、溶菌活性を示唆した。

温度およびpHに対する成長応答:酵母寒天上で、かなりの成長が18〜30℃の範囲で達成されるが、37℃では成長しない。同じ培地において、成長は、pH6〜8の範囲で観察され、集落の最大の直径はpH7.0で観察された。

炭素源の利用:可溶性デンプンを除く試験した炭素源はいずれも、この株の成長をよく支持しなかった。

窒素源の利用:成長は、試験した全ての無機窒素源において乏しい。種々の複合有機窒素源のうち、トリプトンが最適である。しかし、この株は、ペプトン、ネオペプトンおよびカジトンでも良好に成長し、ファイトンおよびカザミノ酸でさえ、無機窒素源よりも比較的よく適した。

抗生物質耐性。この株は、トブラマイシンおよびハイグロマイシンB以外は、試験した全ての抗生物質に対して感受性である。

(実施例5)
粘液細菌におけるPUFA生成の比較研究
分類学と、一方で系統発生学および他方でオメガ-3 PUFAの生成との相関関係を確立するために、一連の基準株ならびに粘液細菌および近縁の滑走細菌の種々の分類群からのその他のよく特徴決定された代表的な株を、DHA、EPAおよびその他の脂肪酸の生成についての比較のために研究した。これらの株の大多数をTable1(表3)に列挙し、それらの16S rDNA配列も系統発生研究のために得た(実施例6)。さらに、SBコレクションからのいくつかのさらなる株も、GC-MSによるFAプロファイルについて研究したが、これらは、ソランギウム・セルロサムと形態学的に一致しているが、今までのところ分子系統発生学に含まれていないものであった。

この目的のために、種々の粘液細菌および関連する系統発生学的群の標準株および基準株をDSMZ(Braunschweig;Germany)、Helmholtz Center for Infectious Diseases(HZI、dto.)またはUniversitat des Saarlandesのカルチャーコレクション(Saarbrucken、Germany;SB)から得た。ほとんどの細菌は、50 mlのそれぞれの培養培地(以下に示すように)を含有する300mlのエルレンマイヤーフラスコ中で、170rpmでの振とう培養として培養した。インキュベーション温度は、ハリアンギウム・テピドゥム(これは37℃でインキュベートした)以外は30℃であった。ポリアンギウム属、コンドロマイセス属、ヤーネラ属およびビソボラックス属のメンバーは、Kunze Bら(2006) J Antibiotics 59:664〜668頁により提案されるプロトコルに従って、VY/2培地(ビソボラックスの場合はマルトースを加えた)で培養した。アーキアンギウム、コラロコッカス、ヒアランギウム、コフレリア、メリタンギウム、ミクソコッカス、ナンノシスチス、ピキシディコッカス、スチグマテラおよびアンギオコッカス(Angiococcus)(現在はシストバクターに分類される)の種、ならびにシストバクター・アルメニアカおよびシー・ディシフォルミスは、MD1培地で培養した(Shimketsら、2006)。その他の全てのシストバクターspp.は、M-medで成長し[Muller RおよびGerth K(2006) J Biotechnol 121:192〜200頁]、HS培地[Kopp Mら(2004) J Biotechnol 107:29〜40頁]を、ソランギウムの種に用いた。エンハイグロミクサおよびプレシオシスチスに属する海洋粘液細菌は、VY/4-SWSで成長した[Iizuka Tら(2003a) Int J Syst Evol Microbiol 53:189〜195頁;Iizuka Tら(2003b) Syst Appl Microbiol 26:189〜196頁]が、ハリアンギウムはCY-SWSで培養した[Iizuka Tら(1998) FEMS Microbiol Lett 169:317〜322頁]。フェーズリシスチス・フラバの脂肪酸プロファイルは、Garcia ROら(2009) Int J Syst Evol Microbiol 59:1524〜1530頁から得た。ヘルペトシフォン(Herpetosiphon)に属する滑走細菌はHZIから、フレキシバクター(Flexibacter)はSBから得た。後者の細菌はLB培地で培養し、ヘルペトシフォンの株は固形VY/2寒天培地で成長した。

分析のための脂肪酸の抽出
大多数の株について、細胞ペレットを振とう培養の2ml液体培養の一定量から得て、これらを60℃にて30分間、真空遠心により完全に乾燥させた。液体培地で成長しなかったヘルペトシフォンspp.については、白金耳一杯の細胞を、よく成長した固形培地の寒天の表面からかきとった。

乾燥細胞を、次いで、500uL FAME溶液(メタノール、トルエン、硫酸;50:50:2v/v)を用いて一晩抽出した。その後、400uLのR2試薬(0.5M NH₄HCO₃、2M KCl)の一定量を加えた。試料をボルテックスで混合した後に、溶液を5000rpmにて4分間遠心し、溶液の上相から採取した75ulの抽出物を、25ulのMSTFAを用いて誘導体化した。次いで、試料を37℃にて30分間インキュベートした後に、GC-MS分析に供した。

結果をtables 8および9(表10および11)に示し、これらは、多量のEPAおよびDHAが、新しいエーテロバクター属のメンバーに特に限定されることを明らかにする。粘液細菌の種々の群は、オメガ-3-PUFAの生成を全く示さなかった。その他のソランギウム亜目のうち、研究した全ての基準株は、オメガ-3 PUFAがないことが見出された。驚くべきことに、SBコレクションからのソランギウム・セルロサムの2つの最近単離された株は、この属および種の一般的な形態学的および生理的特徴を示し、table 8(表10)に示すようにGC-MSにより研究した場合に、少量のEPAの生成を明らかにした。この観察結果は、さらなるソランギウムspp.およびソランギウム亜目のその他の種をさらに精密に調べることにより、これらのオメガ-3 PUFAについてのさらなる生成株が偶然に明らかになるとの仮定を生じさせる。

海洋の種であるエンハイグロミクサ・サリナ(ナンノシスチス亜目)の基準株においても、EPAが少量見出され(table 9(表11))、このことは、オメガ-3 PUFAを生成するこの亜目の全般的な可能性を明らかにする。上記の化合物は、同時に研究した滑走非結実真正細菌(フレキシバクター、ヘルペトシフォン)では見出されず、これらは、「従来技術」において列挙した例以外は、化学分類研究の過程におけるそれらの脂肪酸プロファイルについて現在までに広く研究されているグラム陽性およびグラム陰性の真正細菌のその他のいずれの分類群においても見出されなかった。エンハイグロミクサおよびソランギウムにおけるEPAの発見さえも、以前には報告されていなかったが、これはおそらく、細菌の主要なFA成分だけが、現在までにGC-MSによる化学分類評価中に考慮されたという事実による。粘液細菌は、よって、本研究の過程で見出されたように、容易に培養でき、同時に、商業的に価値があるオメガ-3 PUFA(すなわちDHAおよびEPA)を著しい量で生成できる多くの種を有する真正細菌の唯一の部類のままである。GC-MSによるFAプロファイリングのよく確立された化学分類技術を、DHAおよびEPAに特に重点を置くように改変して、これらの化合物のさらなる生成菌を、我々の研究において同定した。これらのデータから、粘液細菌のある分類群が、培養可能な残りの真正細菌とは、オメガ-3 PUFAを生成する能力を有する点で異なると結論付けられる。全ての存在する真正細菌種の90%までが発見されずかつ記載されていないままであるので、これもまたオメガ-3 PUFAを生成できる新規なエーテロバクター属に加えてさらなる生成菌を見出す機会は大きい。本特許出願で提供される実施例に従う系統発生学的および化学分類学的データを含む新規なストラテジーが、よって、オメガ-3 PUFAを生成するさらなる粘液細菌を発見するために提案される。

(実施例6)
特にオメガ-3 PUFAに重点を置いた脂肪酸生成に関する粘液細菌の系統発生学
粘液細菌は、現在、6つの科、20の属および46の種に分けられ、これらは形態学的、生化学的および生理的特徴に基づいて分けることができる。この分類学は、それらの16S rDNAの類似性分析に基づいて分子系統発生学的研究によっても反映され、このことにより、粘液細菌が単系統性の群であることが明らかになる[Myxobacteria: multicellularity and differentiation(Whitworth D編)、17〜40頁、ASM Press:Washington DC中のVelicer G、Hillesland K(2008);Sproer Cら(1999) Int J Syst Bacteriol 49、1255〜1262頁; Garcia ROら(2009) Int J Syst Evol Microbiol 59:1524〜1530頁]。

新規な未記述のエーテロバクター属のメンバーがそれらのバイオマス中の主要な脂肪酸としてオメガ-3 PUFAを生成できたという驚くべき発見の後に、PUFAおよびその他の脂肪酸の分布と、特に新規なエーテロバクター属によるPUFAの過剰生成の特異性とについて調べるために、粘液細菌の部類の代表的な株の一団を選択して、それらの脂肪酸プロファイルを研究した。好ましくは、陸生および海洋の種を含む培養可能な種の基準株を選択した。

本研究において用いた参照16S rDNA遺伝子配列は、GenBankからダウンロードした。基準株および新規な株の修正した配列も含んだ(table 1(表3))。配列アラインメントを、ソフトウェアClustalWバージョン2.0.[Larkinら(2007) Bioinformatics Applications Note 23(21):2947〜2948頁]を用いて創出した。

配列間の距離行列を、Jukes-Cantorモデル[HN Munro(編)Mammalian protein metabolism. New York: Academic Press中のJukes TH、Cantor CR(1969)Evolution of protein molecules、21〜123頁]を用いて計算した。距離行列から、近隣結合系統樹を、Saitou NおよびNei M(1987)Mol Biol Evol 4:406〜425頁により記載されるようにして構築した。1000回の反復のブートストラップを設計し[Felsenstein J(1985)Evolution 39:783〜791頁]、合意樹を、Geneious系統樹ビルダーを用いて行った。これらの全てのプログラムは、Geneious(Auckland、New Zealand)から入手可能なGeneious Pro 4.7.6ソフトウェアに含まれている。

ゲノムDNAを、活発に成長している培養物から、QiagenゲノムDNA精製キット(Gentra Systems Inc.、Minneapolis、USA)のグラム陰性細菌用のプロトコルを用いて抽出した。ギャップおよび「N」配列を有する株だけを、繰り返しの16S rDNA遺伝子配列決定のために調製した。16S rDNA遺伝子配列がない全ての基準株も含めた(図5)。DNAの一定量を、ユニバーサルプライマーを用いるPCRのために調製した[Lachnik Jら(2002) J Clin Microbiol 40:3364〜3373頁]。これらのプライマー(フォワードプライマーGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA;リバースプライマーAAGGAGGTGATCCAGCCGCA)は、PCR生成物の配列決定のためにも用いた。さらなるプライマーを設計して、遺伝子の末端配列をカバーし、これらもまたさらなる配列決定のために用いた。PCR生成物の精製は、NucleoSpinキット(Macherey-Nagel、Duren、Germany)を用いて行った。

16S rDNA配列データの相同性解析:広く用いられ、良好に確立されたBLASTn解析[Zhang Zら(2000) J Comput Biol 7:203〜214頁]に従って、エーテロバクター株の新しく得られた16S rDNA配列を、発表された配列データに対する相同性について確認した。tables 10〜12(表12〜14)は、それぞれ個別の株についてのBLASTn検索の結果を示す。エー・ファスキクラタスDSM 21835の16S rDNA配列は、セルロース分解性ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと96%、ソランギウム(別名:ポリアンギウム)・セルロサムの株と95%の同一性を示した(table 10(表12))。驚くべきことに、エー・ルフスDSM 23122およびエーテロバクターsp.DSM 23098の16S rDNA配列も、ビソボラックス・クルエンタと96%(table 11(表13))、ソランギウム・セルロサムの株と95%(table 12(表14))の同一性を示した。

上記のデータにより、16S rDNAの相同性から推測されるように、3つ全てのエーテロバクター株が、ミクソコッカス目のメンバーとして同定されることがさらに確認されることが明らかになる。新規な細菌株は、ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタおよびソランギウム(別名:ポリアンギウム)・セルロサムとの相同性により示されるように、ポリアンギウム科のメンバーと最も近い類縁である。最も近い類似性(96〜98%)は、エーテロバクター属に幾分すぐに近縁である粘液細菌の今までのところ未培養のさらなる種をおそらく示し得る細菌クローンに対して見出された。この関係は、エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835について、例示的に図6に示す。ほぼ同一の結果が、その他のエーテロバクター株について得られた。

(実施例7)
アウトグループ生物
上記の実施例で概説したのと同じ手順を用いて決定して、IFO 15060株に由来するフレキシバクター・フレキシリス(Flexibacter flexilis)の16S rDNA配列(GenBank受入番号AB078050)は、エーテロバクター・ファスキクラタスおよびその他のエーテロバクターの種のものと76%の類似性を示したが、ヘルペトシフォン・ガイセリコラ(Herpetosiphon geysericola)の16S rDNA配列(GenBank受入番号AF039293)は、BLAST比較において75%の類似性を示した。

これらの2つの種は、滑走細菌であり、プロテオバクテリアのデルタ亜群に属する。これらは、粘液細菌と近い類縁であるとみられるが、子実体およびオメガ-3 PUFAを生成しない。

Claims

1または複数のオメガ-3多価不飽和脂肪酸を生成できる粘液細菌株を培養するステップを含むオメガ-3不飽和脂肪酸の生成方法。

粘液細菌株が、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属する、請求項1に記載の方法。

粘液細菌株が、ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと少なくとも84%同一である16S rDNA配列を有する、請求項1または2に記載の方法。

粘液細菌株が、ソランギウム亜目のポリアンギウム科に属する、請求項2または3に記載の方法。

粘液細菌株が、ビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと少なくとも85%同一である16S rDNA配列を有する、請求項4に記載の方法。

粘液細菌株が、全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3多価不飽和脂肪酸含量を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

粘液細菌株が、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属し、本明細書で提案される新規な属(エーテロバクター)および新規な種(ファスキクラタス)の代表であり、好気性から条件的好気性および化学合成従属栄養性であり、配列番号3に示すビソボラックス(ビソファーガ)・クルエンタDSM 14553^Tと約96%同一である16S rDNA配列を有し、かつ/または全細胞性脂肪酸含量の少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のオメガ-3多価不飽和脂肪酸含量を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

粘液細菌株が、配列番号1に示す16S rDNA配列と少なくとも97%同一、好ましくは少なくとも99%同一である16S rDNA配列を有し、最も好ましくは配列番号1に示す16S rDNA配列を有する、請求項7に記載の方法。

粘液細菌株が、エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835株である、請求項8に記載の方法。

粘液細菌株が、配列番号2に示す16S rDNA配列と少なくとも97%同一、好ましくは少なくとも99%同一である16S rDNA配列を有し、最も好ましくは配列番号2に示す16S rDNA配列を有する、請求項7に記載の方法。

粘液細菌株が、エーテロバクター・ルフスDSM 23122株である、請求項10に記載の方法。

粘液細菌株が、配列番号4に示す16S rDNA配列と少なくとも97%同一、好ましくは少なくとも99%同一である16S rDNA配列を有し、最も好ましくは配列番号4に示す16S rDNA配列を有する、請求項7に記載の方法。

粘液細菌株が、エーテロバクターsp.DSM 23098株として意図的に分類される、請求項12に記載の方法。

ω-3不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)およびそれらの混合物から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

(i)1または複数の前記オメガ-3多価不飽和脂肪酸を培養物から単離するステップおよび/または
(ii)1または複数の前記オメガ-3不飽和脂肪酸を精製するステップおよび/または
(iii)個別のオメガ-3不飽和脂肪酸を単離するステップ
をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項1から14で定義されるオメガ-3多価不飽和脂肪酸を生成できる粘液細菌株。

エーテロバクター・ファスキクラタスDSM 21835、エーテロバクター・ルフスDSM 23122またはエーテロバクターsp.DSM 23098である、請求項16に記載の粘液細菌株。

請求項1から15のいずれか一項に記載の方法により得ることができるオメガ-3多価不飽和脂肪酸の混合物。

少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも15重量%のEPAおよびDHAを含有する、請求項18に記載のオメガ-3多価不飽和脂肪酸の混合物。