JP2012504653A - 金属ポルフィリンによるc型肝炎感染症の治療 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、NIH/NIDDKにより与えられたRO1−DK38825の下で米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
亜鉛メソポルフィリン(ZnMP)を、Frontier Scientific(ローガン、ユタ州)から購入した。
亜鉛プロトポルフィリン(ZnPP)を、Frontier Scientific(ローガン、ユタ州)から購入した。
スズメソポルフィリン(SnMP)メソポルフィリンを、Frontier Scientific(ローガン、ユタ州)から購入した。
ジメチルスルホキシド(DMSO)を、Fisher Biotech(フェアローン、ニュージャージー州)から購入した。
マウス抗HCV NS5Aモノクローナル抗体を、Virogen(ウォータータウン、マサチューセッツ州)から取得した。
ウサギ抗HCV NS5Aポリクローナル抗体を、Virogen(ウォータータウン、マサチューセッツ州)から取得した。
マウス抗HCVコアモノクローナル抗体を、Affinity BioReagent(ゴールデン、コロラド州)から取得した。
ヤギ抗ヒトGAPDHポリクローナル抗体を、Santa Cruz(サンタクルーズ、カリフォルニア州)から購入した。
ECL−Plusを、Amersham(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から取得した。
エポキソミシン及びMG132を、Sigma−Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から取得した。
BCAタンパク質アッセイ試薬を、Pierce(ロックフォード、イリノイ州)から取得した。
ダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)及びウシ胎仔血清(FBS)を、HyClone(ローガン、ユタ州)から取得した。
TRIzol及びzeocinを、Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州)から購入した。
G418を、Gibco(グランドアイランド、ニューヨーク州)から取得した。
CellTiter−Glo(登録商標)試薬を、Promega(マディソン、ウィスコンシン州)から取得した。
プライマーは、Integrated DNA Technologies(コーラルヴィル、アイオワ州)により合成されたものとした。
勾配4〜15%のSDS−PAGEゲル及びImmunBlot PVDF膜を、Bio−Rad(ハーキュリーズ、カリフォルニア州)から購入した。
細胞株9−13、CNS3及びHuh−7/T7は、Dr.Ralf.Bartenschlager(ハイデルベルグ大学(ハイデルベルグ、独国))から提供を受けた。複製HCV非構造領域を含有する9−13細胞は、HCVのNS3からNS5Bを安定に発現する。CNS3細胞は、HCVのコアからNS3(Con1単離体の1位〜1233位のアミノ酸残基、Gene Bankアクセッション番号AJ238799)を安定に発現する。Huh−7/T7細胞は、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを構成的に発現する。細胞を、10%(v/v)FBS、及び9−13細胞に関しては500μg/mLのG418、CNS3細胞に関しては10μg/mLのzeocin、又はHuh−7/T7細胞に関しては5μg/mLのzeocinを添加したDMEMにおいて維持した。Con1(サブタイプ1b)全長レプリコンHuh−7.5細胞(Con1細胞)は、Dr.Charles M.Rice(ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州)から提供を受けた。Con1細胞株は、ポリペプチドの2204位のアミノ酸において高度に適応的なセリンからイソロイシンへの置換を有する全長HCV遺伝子型1bレプリコンを含有するHuh−7.5細胞集団である。Con1細胞を、10%(v/v)FBS、並びに0.1mMの非必須アミノ酸、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び選択抗生物質として750μg/mLのG418を添加したDMEMにおいて維持した。
ウエスタンブロットを、Hou et al.の「亜鉛メソポルフィリンが転写因子Bach1の迅速かつ顕著な分解を誘導し、HO−1をアップレギュレートする(Zinc mesoporphyrin induces rapid and marked degradation of the transcription factor Bach1 and up−regulates HO−1)」、Biochim Biophys Acta 2008;1779:195−203に記載のように、本発明者らの研究室の標準的なプロトコルを使用して行った。簡潔に述べると、全タンパク質(30〜50μg)を勾配4〜15%のSDS−PAGEゲル上で分離した。ImmunBlot PVDF膜上への電気泳動転写の後、膜を、5%脱脂粉乳及び0.1%Tween−20を含有するPBS中で1時間ブロッキングし、その後一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体の希釈倍率は以下の通りとした。抗HCV NS5A抗体及び抗GAPDH抗体については1:2000、並びに抗HCVコア抗体については1:5000。その後膜を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(希釈倍率1:10000)と共に1時間インキュベートした。最後に、結合した抗体を、製造業者のプロトコルに従ってECL−Plus化学発光システムにより可視化した。Kodakの1DV3.6コンピュータ式画像化システム(ロチェスター、ニューヨーク州)を使用して、ウエスタンブロッティング後に得られた各特異的バンドの相対的な光学密度を測定した。データを、1の値を割り当てられた対照(ビヒクルで処理した細胞により得られた値に対応する)に対する百分率として表す。
pFK−Con1/GDD構築物及びpFK−Con1/GND構築物(遺伝子型1b)は、Dr.R.Bartenschlager(ハイデルベルグ大学、ハイデルベルグ、独国)から贈呈された。pFK−Con1/GND構築物は、NS5Bポリメラーゼ活性部位のGDDモチーフをGNDへと変化させる1アミノ置換を有するpFK−Con1/GDDの複製欠損変異体であった。pFK−Con1/GDD又はpFK−Con1/GNDのトランスフェクションを、以下の手順に記載したように行った。簡潔に述べると、T7 RNAポリメラーゼを安定に発現するHuh−7/T7細胞を、トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートに播種し、80%コンフルエンスまで増殖させた。製造業者の取扱説明書に従って、Lipofectamine及びPlus Reagent(Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州)により、細胞を、0.8μg/ウェルのpFK−Con1/GDD又はpFK−Con1/GNDを48時間トランスフェクトした。
HCV感染性クローンpJ6/JFH1は、Dr.C.Rice(ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州)から提供を受けた。全長キメラゲノムを、Lindenbach et alにより記載されたように、感染性J6(遺伝子型2a)由来のコア−NS2遺伝子領域、及び感染性JFH1(遺伝子型2a)由来のNS3−NS5B遺伝子領域を使用して構築した。HCV J6/JFH1のRNAを生成するために、pJ6/JFH1プラスミドを、XbaIで直線化し、エタノール沈殿、プロテイナーゼKでの消化、フェノール−クロロホルム抽出により精製した。直線化したプラスミドを、MEGAscript T7キット(Ambion、オースティン、テキサス州)を使用するin vitro転写のための鋳型として使用した。HCVのRNAのトランスフェクションのために、Huh−7.5細胞を、トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートに播き、70〜80%コンフルエンスをトランスフェクトした。2μg/ウェルのHCVのRNA及び4μL/ウェルのLipofectamine2000(Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州)を使用することにより、1:2のRNA/lipofectamine比率で、細胞を48時間トランスフェクトした。HCV感染のために、HCVのRNAを48時間トランスフェクトした細胞からの細胞培養上清を収集し、0.20μmフィルターを通して濾過し、24ウェルプレートにおいてナイーブHuh−7.5細胞を72時間感染させた。
免疫沈降を、製造業者のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、細胞を、低温の放射免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液(50mMのTris−HCl[pH7.4]、150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.25%のデオキシコール酸ナトリウム、1%のIGEPAL CA−630、1mMのPMSF、1mMのNaF、1mMのNa3VO4、並びに各々1μg/mlのアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン)中に回収した。試料を、プロテインA/Gアガロースにより4℃で10分間予め清掃し(pre−cleared)、その後一次抗体と共に4℃で一晩穏やかに回転させながらインキュベートし、その後プロテインA/Gビーズで4℃で1時間インキュベートした。ビーズを遠沈させ、RIPA緩衝液で2回洗浄した。タンパク質試料を、4〜15%SDS−PAGEゲル上における電気泳動により分離し、PVDF膜に移し、ウエスタンブロット分析に関して記載したように、結合したユビキチンを抗ユビキチン抗体を使用して検出した。
処理した細胞からの全RNAを抽出し、Hou et alに記載されるようにcDNAを合成した。リアルタイム定量的RT−PCRを、Bio−Rad(ハーキュリーズ、カリフォルニア州)のMyiQ(商標)単色リアルタイムPCR検出システム、及びiQ(商標)SYBR Green SupermixリアルタイムPCRキット(Bio−Rad)を使用して行った。鋳型を含まずかつ逆転写酵素を含まない試料を陰性対照として含むものとし、該試料は予想通り無視できる程度のシグナルしか産生しなかった(Ct値>35)。倍率の変化値を、同じ試料中のGAPDHの量に対して正規化した後で比較Ct分析により算出した。
9−13細胞を、10μMのZnMPの存在下又は非存在下において100μg/mLのシクロヘキシミド(CHX)と共にインキュベートした。ウエスタンブロットを、抗HCV NS5A抗体及び抗GAPDH抗体を使用して行った。ウエスタンブロットのバンド強度を、デンシトメトリー分析により測定した。GAPDHのバンドを、タンパク質負荷量に関して補正するための内部標準として使用した。
処理した細胞の細胞毒性に対するZnMPの効果を、CellTiter−Glo(登録商標)試薬を使用して、代謝的に活性な細胞の存在を示すATPの存在の定量化に基づいて生細胞の数を決定することにより測定した。細胞を、処理の24時間前に2500〜5000細胞/ウェルで96ウェルプレート中に播いた。細胞を、表示した濃度のZnMPで、2時間、6時間及び24時間、三連で(in triplicate)処理し、等容量のCellTiter−Glo(登録商標)試薬を各ウェルの細胞培養培地に添加した。発光を、積分時間が0.25〜1秒間に設定されたBio−Tek(ウィヌースキ、バーモント州)のSynergy HTマイクロプレートリーダーにおいて読み取った。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。
初期の解析により、結果が正規分布していることが示された。したがって、パラメトリックな統計手法を使用した。スチューデントのt検定又はANOVAを使用して(必要に応じて)、試料間の差異を解析した。P<0.05の値を統計的に有意とみなした。実験を少なくとも3回繰り返して、同様の結果を得た。全ての実験が、各処理群に関して少なくとも三連の試料を含むものとした。単一の実験からの代表的な結果を示す。統計解析を、SAS研究所(カリー、ノースカロライナ州)のJMP4.0.4ソフトウェアにより行った。
この実施例では、ZnMPによるHCVタンパク質のダウンレギュレーションを調査した。種々の濃度のZnMP(0μM、1μM、5μM、10μM)に4時間曝露した9−13細胞及びCon1細胞におけるNS5Aタンパク質レベル、CNS3細胞におけるコアタンパク質レベル、並びにpFK−Con1/GND(Con1の複製欠損変異体をコードするプラスミド)をトランスフェクトしたHuh−7/T7細胞におけるNS5A及びコアタンパク質レベルを評価した。処理後、細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、4〜15%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜に移し、抗HCV NS5A抗体、抗HCVコア抗体又はGAPDH特異的抗体で探索し、NS5A、コア又はGAPDHに対応するバンドを、上で記載したようなECL−Plus化学発光により検出した。図において、NS5Aの量又はコアタンパク質レベルを、処理により変化しないGAPDHに対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を1と設定した。データを、三連の試料からの平均値±SEとして示す。*は、ビヒクルのみと異なる(P<0.05)。
実施例2では、NS5Aタンパク質レベルに対する亜鉛キレート剤N,N,N,N−テトラキス−(2−ピリジルメチル)エチレンジアミン(TEPN)の効果を調査した。9−13細胞を、ZnMP処理の30分前に、表示した濃度のTEPNで処理し、その後細胞を、ZnMP、又は対照としての単独でのビヒクル(DMSO)に4時間曝露した。全タンパク質を抽出した。NS5A及びGAPDHのタンパク質レベルを、ウエスタンブロットにより測定した。棒グラフは定量的な結果を示す。NS5Aタンパク質の相対量を、処理により変化しないGAPDHの量に対して正規化した。単独でのビヒクル由来のNS5Aのバンド強度を1に設定した。*は、ビヒクルのみと異なる(P<0.05)。図3に示すように、亜鉛キレート剤TEPNは、9−13細胞におけるZnMPに媒介されるNS5Aタンパク質レベルの著しいダウンレギュレーションに影響を及ぼさなかった。
実施例3では、ZnMPによるNS5Aタンパク質のダウンレギュレーションを、該ダウンレギュレーションが翻訳後レベルで起こるか否かを決定するために調査した。9−13細胞を、10μMのZnMPの存在下又は非存在下において100μg/mLのシクロヘキシミド(CHX)で表示した期間(0時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間)処理し、その後細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、4〜15%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離して、PVDF膜に移し、抗HCV NS5A抗体又はGAPDH特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによりNS5A又はGAPDHのタンパク質レベルを検出した。図4A及び図4Bに示すように、ZnMP及びシクロヘキシミド(CHX)で処理した9−13細胞におけるNS5Aタンパク質レベルは、大きくかつ迅速に低減した。ZnMPで処理していない9−13細胞におけるNS5Aタンパク質レベルもCHXにより減少したが、その程度ははるかに低かった。10μMの濃度のZnMPが、NS5Aタンパク質の半減期(t1/2)を19.8時間から1.2時間まで減少させた(図4C)。図4B及び図4Cでは、図4Aにおけるバンドの強度を、デンシトメトリーにより定量化した。非処理の試料(0時間)由来のNS5Aのバンド強度を1と設定した。
哺乳動物において、タンパク質分解に関する2つの異なる系(リソソーム系及びユビキチン−プロテアソーム系)が見出されている。プロテアソーム依存性の分解経路は、主要なタンパク質分解経路の1つである。ZnMPによるNS5Aタンパク質の分解がプロテアソーム依存性であるか否かを理解するために、9−13細胞を、ZnMP(5μM、10μM)、並びに選択したプロテアソーム阻害剤、エポキソミシン(5μM、10μM)及びMG132(10μM、20μM)で処理した。9−13細胞を、ZnMP処理の30分前に、表示した濃度のMG132又はエポキソミシンで処理した。その後細胞を、ZnMP、又は対照としての単独でのビヒクルに4時間曝露した。全タンパク質を抽出した。NS5A及びGAPDHのタンパク質レベルを、上で記載したようにウエスタンブロットにより測定した。
この実施例は、ZnMPがNS5Aタンパク質の分解を媒介するメカニズムについての洞察を得るために、ZnMPがNS5Aのポリユビキチン化を誘導するか否かを調査する。9−13細胞を、10μMのZnMPを用いずに又は用いて4時間処理した。全タンパク質を、その後のウエスタンブロット又は免疫沈降分析のために抽出した。免疫沈降を、抗HCV NS5A抗体を使用して実施した。NS5Aのユビキチン結合[ポリユビキチン化NS5A、(Ub)n−NS5A]を、抗HCV NS5A抗体を使用する免疫沈降、及び抗ユビキチン抗体を使用するイムノブロットにより検証した。免疫沈降前のNS5Aタンパク質レベルのウエスタンブロット分析により、ZnMPによるNS5Aのダウンレギュレーションが示される(図6A)。図6Bでは、ZnMP処理又はビヒクル(DMSO)のみによる処理の後のNS5Aのユビキチン化を比較した。分子量マーカーの位置(キロダルトン)を、ゲルの左に表示する。角括弧は、ポリユビキチン化NS5Aを示す。アスタリスクは、交差反応している免疫グロブリン重鎖を示す。図6Cは、抗NS5A抗体によるイムノブロット分析を示し、これはNS5Aタンパク質がパネルBにおいて免疫沈降したことを示している。角括弧は、NS5Aを含有する移動度がより低いバンドを示す。これらのバンドは、ポリユビキチン化NS5Aを表し得る。
ZnMPに媒介されるNS5Aの分解がHCV複製の阻害において役割を果たすことができるか否かを評価するために、Con1全長HCVレプリコンHuh−7.5細胞を、種々の濃度のZnMPで24時間処理した。全RNA及び全タンパク質を抽出した。HCVウイルスのRNAをqRT−PCRにより定量化し、HCVコア、NS5A及びGAPDHのタンパク質のレベルをウエスタンブロットにより測定した。データを、平均値±SEとして示す(n=3)。*は、ビヒクルのみと異なる(ZnMP、0μM)(P<0.05)。対照であるビヒクル単独は、HCVレプリコンRNAの量を変化させなかったが、ZnMPでの処理は、ウイルスRNAレベル(図7A)及びHCVタンパク質レベル(図7B)の用量依存的な低減をもたらし、ZnMPに媒介されるNS5Aの迅速な分解により、HCVのRNA複製の低減、及びその後のHCVタンパク質の発現の減少がもたらされ得ることを示唆した。その後本発明者らは、NS5AがZnMPの実際の標的であり、HCVのRNA複製、及びコアタンパク質レベルに対するZnMPの効果は、ZnMPに媒介されるNS5Aの迅速な分解に対する二次的なものであるか否かについて疑問を抱いた。この目的のために、本発明者らは、Huh−7/T7細胞においてDNAプラスミドpFK−Con1/GNDから発現されるHCVタンパク質(該タンパク質の発現は、ウイルスRNAポリメラーゼと関連せず、T7 RNAポリメラーゼのみと関連すると考えられる)を用いて並列実験を行った。24時間のZnMP処理後、ZnMPは、NS5Aタンパク質レベルを用量依存的に顕著に減少させたが、HCVコアタンパク質レベルは影響を受けないままであった(図7C)。本発明者らは、ZnMPが、Huh−7/T7細胞においてpFK−Con1/GDDからHCVタンパク質が発現される系(該系では該タンパク質の発現がウイルスRNAポリメラーゼと部分的に関連すると考えられる)においてコアの低減をもたらす(図7D)が、コアの低減は、Con1レプリコン系(該系では、HCVタンパク質の発現がウイルスRNAポリメラーゼと関連していた)における効果よりはるかに小さいことをさらに観察した。
この実施例は、ZnMPが、新規なJFH1ベースの(遺伝子型2a)HCV細胞培養系においてNS5Aタンパク質をダウンレギュレートし、抗ウイルス活性を示すか否かを調査する。Huh−7.5細胞に、2μg/ウェルのJ6/JFH1 RNAをLipofectamine2000によりトランスフェクトした。48時間後、細胞を、表示した濃度のZnMP、又は対照としてのDMSOで4時間又は24時間処理し、細胞を回収し、全RNA及び全タンパク質を抽出した。HCVのRNAをqRT−PCRにより定量化し、HCVコア、NS5A及びGAPDHのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。ZnMPにより、NS5Aタンパク質レベルの迅速かつ著しい減少がもたらされたが、コアタンパク質レベルは4時間のZnMP処理後には影響を受けず、24時間のZnMPへの曝露後に減少を示した(図8A〜図8D)。J6/JFH1をトランスフェクトした及び感染させた細胞培養系においてZnMPがHCVのRNAの複製/感染を阻害するか否かをさらに検証するために、本発明者らは、ZnMP処理後のHCVのRNAの発現を分析した。10μMのZnMPは、HCVのRNAレベルを、HCVをトランスフェクトした細胞では約70%HCVに感染した細胞では約90%、顕著に減少させた(図8E及び図8F)。
この実施例は、ZnMP単独又はIFN単独に関する結果と比較して、ZnMPと組み合わせたインターフェロン(IFN)の相加効果又は相乗効果が存在するか否かを決定するために、ZnMPをインターフェロンと組み合せることの効果を探求した。9−13細胞を、10μMのZnMP若しくはIFNα、又は両方の組合せで種々の時間(0時間、2時間、4時間、6時間、10時間、24時間)処理し、その後細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する回収用緩衝液を使用して回収した。50μgのタンパク質を、4〜15%SDS−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、PVDF膜に移し、抗NS5A抗体及び抗GAPDH特異的抗体で探索し、その後ECL Plus試薬により発色させた。NS5Aタンパク質の相対量を、処理により変化しないGAPDHの量に対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を1に設定した。データを、三連の試料からの平均値±SEとして示す。*はビヒクルのみと異なり(P<0.05)、#はIFN単独又はZnMP単独と異なる(P<0.05)。
この実施例では、金属ポルフィリンの細胞毒性を評価した。9−13細胞を、処理の24時間前に96ウェルプレート中に播種した。細胞を、表示した濃度のZnMPと共に0時間、2時間、6時間、24時間インキュベートし、CellTiter−Glo(登録商標)試薬を、積分時間を0.25〜1秒間に設定したSynergy HTマイクロプレートリーダーにおけるCellTiter−Glo発光細胞生存度アッセイのために添加した。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。*は、ビヒクルと異なり(P<0.05)、データは三連の測定値の平均値±SEを表す。図10に見ることができるように、2〜24時間のZnMP(1〜10μM)、又は2〜6時間のZnMP(20μM)は、細胞生存度に対して有意な効果を有しなかったが、24時間の20μMの濃度のZnMPは、9−13細胞において有意な細胞毒性を引き起こした(p<0.05)。したがって、6時間までについては20μMを超えないZnMP濃度、又は24時間までについては最大10μMのZnMP濃度を使用した。
Claims (19)
- C型肝炎ウイルス(HCV)に感染した細胞におけるNS5Aタンパク質レベルを低減させる工程を含むC型肝炎ウイルス感染症に罹患している哺乳動物を治療する方法。
- 前記NS5Aタンパク質のポリユビキチン化を増強する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記感染した細胞を金属ポルフィリンで処理することによりHCVを抑制する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項3に記載の方法。
- 前記NS5Aタンパク質が、約0.5〜3時間に低減した半減期を有する請求項3に記載の方法。
- 前記NS5Aタンパク質が、約1〜1.2時間に低減した半減期を有する請求項3に記載の方法。
- 治療を必要とする宿主におけるC型肝炎ウイルス感染症の治療のための方法であって、治療的に有効な量の金属ポルフィリンを前記宿主に投与する工程を含む方法。
- 前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される請求項7に記載の方法。
- HCVに感染した細胞におけるNS5Aタンパク質の量を約60〜95%低減させる、請求項7に記載の方法。
- 前記金属ポルフィリンがアルブミン複合体を含む請求項7に記載の方法。
- インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項7に記載の方法。
- HCVに感染した細胞におけるNS5Aタンパク質の半減期を約1〜1.2時間に低減させる工程をさらに含む請求項7に記載の方法。
- 投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記宿主の体重1キログラム当たり約0.1〜20ミリグラムである請求項7に記載の方法。
- 前記金属ポルフィリンを経口投与する工程をさらに含む請求項7に記載の方法。
- 治療を必要とする患者におけるHCV感染症を治療するための方法であって、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される活性成分の治療的に有効な量を前記宿主に投与する工程を含む方法。
- インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項15に記載の方法。
- HCVに感染した細胞におけるNS5Aタンパク質の半減期を約1〜1.2時間に低減させる工程をさらに含む請求項15に記載の方法。
- 投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記患者の体重1キログラム当たり約0.1〜20ミリグラムである請求項15に記載の方法。
- 約10:1〜1:1のモル比でヒト血清アルブミンと結合した亜鉛プロトポルフィリンを約10〜80ミリグラム含むHCV感染症の治療のための医薬製剤。
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