JP2012502263A - クロマトグラムを用いて分子種の濃度を測定する方法 - Google Patents

Abstract

本発明によると、信号全体を用いて溶質の濃度を計算するために、クロマトグラフィーカラムの信号の発展の空間状態のモデルが形成され、測定された信号に基づいて変換される。このモデルは、再評価可能な多様な物理パラメータに基づいてカラム中の溶質の輸送を支配する方程式に基づいたものである。本発明は、体液サンプル中のタンパク質等の希少成分を探して測定するのに用いることができる。

Description

本方法は、クロマトグラムで分子種の濃度を決定する方法に関する。

混合物の分析のためには分離法に頼ることが多い。別の装置は、質量分析計に結合可能なクロマトグラフィーカラムを備え得る。異なる複数のタンパク質の濃度を測定することが求められる体液の特定の場合には、消化モジュールを上流に追加して、タンパク質をペプチドに分解して、その研究を簡単にすることができる。クロマトグラフィーカラムは、混合物の化学種がカラムを伝わるのに異なる速度をとること及びそれらの化学種の連続分離に基づいたものである。測定されたスペクトログラムは、質量分析計の出力に対応する二次元の信号である。一方の次元は、クロマトグラフィーカラムの異なる複数の種の保持時間に対して感度が高く、他方の次元は、各種に関連する質量電荷比に対応する。このデータは、連続するピークを備えたスペクトルによるものである。スペクトログラムを保持時間次元に投影することによって、又は所定の質量においてカットオフを設けることによって、測定されたクロマトグラム、つまりはクロマトグラフィーカラムの出力信号の画像が得られる。スペクトログラム又はクロマトグラムの研究によって、混合物の化学種及びその濃度を決定することができる。

しかしながら、特に二つの理由から正確な結果を得ることは難しい。ピークの表面積は、関係している化学種の濃度を表すが、これは、装置のノイズや、クロマトグラフィーカラムの物理パラメータの変動を考慮して評価するのが難しく； また、ピークの形状及び位置は、クロマトグラフィーカラムの異なる特性や、異なる測定条件、単純な統計的分散に起因して、実験のたびに異なる可能性がある。こうした欠点は全て、化学種が膨大でありその濃度が非常に低い場合により顕著になるが、これは、特定の希少タンパク質を探すことが多い体液中のタンパク質の場合である。これは、例えば癌血液マーカーの場合であり、プラズマ中に１から１０００ピコモル／リットルで、又はプラズマ中に１から１０００フェムトモル／ミリリットルで発見されるものである。

既知の方法において、最も単純なものは、各ピークを分離して、対応する溶出時間にわたるその高さの測定（クロマトグラムの軸に沿った）によって又は単一の高さ測定によって濃度を評価して、スペクトログラムに対するピークの位置によって含まれる化学種を決定することによるものである。この初歩的な方法においては、上述の得られる結果の不正確さの欠点及び複雑な混合物中に存在する化学種を正確に識別することの難しさが、特に顕著となる。

他の方法は、ピークを分離するために要因解析によるスペクトログラムの数値分解を用いることによるものである。対象のペプチドのピークは、既知の化合物のサンプルの較正から得られる。しかしながら、従来技術の欠点は、例えば評価及び補正することが難しい較正における測定条件及びサンプルの研究の間の不一致によって、十分には解消されない。非特許文献１のものはこの方法の変形例であり、溶出ピークが、等温式（クロマトグラフィーカラム中の溶質の動的相及び静的相の関係式をもたらす）からのシミュレーションによって得られる。その式は、本発明において想定される実施形態においてモデルを構築するのにも使用されるが、従来技術では、モデル化パラメータを調節することによってシミュレーションのピークと実験のピークを一致させることを提案しており、これは、多数の溶質のパラメータを多かれ少なかれ独立的に調節しなければならない場合には収束性の問題が生じ得て、また、パラメータの測定又は評価における不正確さをうまく考慮することが難しい。非特許文献２は、溶出ピークを独立的にシミュレーションするモデルを用いた同様の要因解析法を開示している。

Ｐ．Ｆｏｒｓｓｅｎ外、"Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｏｌｖｉｎｇ ｉｎｖｅｒｓｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、２００６年、第３０巻、第９号、ｐ．１３８１−１３９１ Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ外、"Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｏｌｖｉｎｇ ｉｎｖｅｒｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、第１０６３巻 Ｇｕｉｏｃｈｏｎ外著、"Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"、第２版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第３章及び第４章 Ｐｏｐｐｅ及びＫｒａａｋ、"Ｍａｓｓ ｌｏａｄａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｌｕｍｎｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８３年、第２５５巻、ｐ．３９５−４１４

本発明は、クロマトグラフィーカラム及び質量分析計を通過した溶液中の分子種の濃度を決定するための改良された方法に関する。溶液は、均一な混合物を意味するものとし、二つ以上の物体の単一の相を有する。これは、クロマトグラフィーカラムを介した分子の輸送の理論的な局所的空間‐時間モデルを使用することに基づいたものであり、経験的な較正よりも正確に複数の分子種のうち一つにそれぞれ関係するモデル化クロマトグラムを表す。更に、モデルは、状態空間表現の形で表されて、その一般的な形については、詳細な説明において述べる。特に、状態空間表現は、投入されるコマンドに従って物理システムの発展を予測するのに自動的に用いられるが、これが採用されるのは、極めて簡単で直接的な方法で結果及びモデルのパラメータを備えた方程式のシステムの変換が可能だからであり、クロマトグラムに対して、サンプルを構成する多様な化学種の寄与を区別して、最終的には個々の濃度が導出される。

厳密モデルを用いてモデル化クロマトグラムを表すので、研究対象のクロマトグラムのピークのより良い識別が予想され、サンプルの成分のより良い評価、濃度のより良い評価が予想されるが、これは、特に、システムの変換が単純な方法で行われるからである。他の重要な検討事項は、測定装置の物理パラメータが全て、モデルから導出される方程式において実験結果に関係していて、予め為された評価又は測定における不正確さを修正することによって、より良い分解能を得るために、未知数（決定される陽質の濃度）に加えてこれらの物理パラメータを変化させる性能によって数値的に分解される点である。

モデル化クロマトグラムを表す分子の輸送モデルは、各化学種に対して、時間に対して、クロマトグラフィーカラムに沿ったその種の分子の濃度の発展方程式を備え得る。この方程式は、カラムの固体に対する分子の吸着及び脱着の化学反応（単純で既知の法則に従う）に直接起因するものである。

この発展方程式は、係数によって重み付けされた単純な組み合わせによって、クロマトグラフィーカラムの各点における濃度をその点及びその隣の点の以前の濃度の関数として表すことが好ましい。

これらの係数は、解析的に又は経験的に決定可能である。これらの係数は、特に、クロマトグラフィーカラムのパラメータ、較正クロマトグラフィーピークのパラメータ及び調節パラメータを備えたパラメータの関数である。

クロマトグラフィーカラムのパラメータは、長さと、その多孔率の関数であるパラメータとを備え得る。較正クロマトグラフィーピークのパラメータは、較正によって経験的に決定されているピークの位置及びピークの形状の一つ以上のパラメータを備え得る。

調節パラメータは、クロマトグラフィーカラムに沿った空間のサンプリング間隔及び時間のサンプリング間隔を備え得る。

例えば、元々使用されていた溶媒よりも強い溶媒が徐々に導入される勾配モードにおいてクロマトグラフィーが行われる場合には、クロマトグラフィーカラム中の溶媒の速度や、時間に対する溶媒の組成の変化を記述するパラメータ等の他のパラメータがモデルに追加され得る。

機器を示す。 測定されたクロマトグラム信号及びモデル化されたクロマトグラム信号である。 本方法の論理図を示す。

以下、本発明を二つの主要な実施形態によって説明する。一つは、アイソクラティックモードとして知られるモードであり、クロマトグラフィーカラムを介するサンプルの移動に関与する溶媒の組成が一定であり、もう一つは、勾配モードとして知られるモードであり、より強い溶媒が徐々に初期溶媒を置き換えていき、溶媒の組成が変化する。

以下、本発明を図面を参照して説明する。

動作デバイスは図１のようなものであり得て、例えば、研究される血液サンプルが、タンパク質をペプチドに分解してその測定及び研究を容易にする消化モジュール１、クロマトグラフィーカラム２、質量分析計３を順に通過する。放出される信号は二次元スペクトログラムであり、処理モジュール４に供給される。処理モジュール４は、本発明によるスペクトル利用法を用いて、この信号からサンプルのペプチドの濃度を導出する。上述のように、スペクトログラムを保持時間次元に投影することによって、又は所定の質量においてカットオフを設けることによって、サンプルのクロマトグラフを決定することができる。しかしながら、本発明は、クロマトグラフィーカラムの出力において直接測定されたクロマトグラフにも当然に適用される。

本発明は、他のデバイスにも適用可能である。従って、親和性による枯渇又は捕捉のステージを備え得る濃縮モジュールを、消化モジュールの上流に追加して、対象のタンパク質の一次選択を行うことができる。また、消化モジュール１は任意的なものであり、処理モジュール４に到達する信号が、類似するものではあるが、ペプチドではなくてタンパク質を表すものとなり得て、本発明が、タンパク質の濃度を変更せずに適用可能となる。質量分析計３は、異なる動作モードを有し得るが、これは、モジュール４の処理には影響しない。ＭＳ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，質量分析）モードと称される従来のモード（様々な質量が研究される）は、ＭＳ‐ＭＳモード（特定の質量のペプチドの屈折率測定が行われる）や、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，マルチプルリアクションモニタリング）モード（複数の所定の質量についてのみ分析が行われる）に置換可能である。最後に、質量分析計３も任意的なものであり、処理モジュール４によって処理されるクロマトグラフィーカラム２からの信号が、同じように処理可能な単一次元スペクトルであり得る。

また、本発明は、他のタイプの測定されるサンプルや物にも適用可能である。

処理モジュール４は、受信する信号の数値変換を行って、ペプチド又は一般的にデバイスによって測定される物の濃度を与えることによって機能する。これは、異なる複数のパラメータの関数としての信号のモデル化に基づくものであり、濃度及び他のパラメータは、較正又は他の測定によって知られているか、又は未知である。

図３は、本方法の概略を示す。クロマトグラフィーカラム２のモデル（Ｅ１）、溶媒のモデル（Ｅ２）、及び溶質のモデル（Ｅ３）を作り上げて、クロマトグラフィーカラム２中の流れ、そのカラムによる溶質の吸着、及び溶媒の供給の法則を記述する。これらの特定のモデルの生成は、多様なパラメータの関数としてクロマトグラフィーカラム２からの信号を完全に記述する一般状態空間モデル（Ｅ４）を与え、これは、特定の較正、測定、仮説によって評価可能であるか（Ｅ５）、又は任意の選択に依存する多様なパラメータの関数としてクロマトグラフィーカラム２からの信号を完全に記述する。測定が未知の流体に対して行われて実験的なクロマトグラムを与える場合、その実験的なクロマトグラムがパラメータによって重み付けされたモデルに対応するシステムを記述するのに入れられ得る。数値変換によるこのシステムの分解能（Ｅ６）は、未知の流体の溶質の濃度（Ｅ７）を与える。しかしながら、パラメータは再判断され得るものであり、分解能は一般的に反復的なものである。

本方法のステップは、その提供順で多かれ少なかれ複雑になり得る。機会があれば、補足及び一般化が行われる。

如何にして信号の数値モデルが生成されるのかについてこれから説明する。

〈モデルのパラメータ〉
１） モデルの成分は、クロマトグラフィーカラム内のタンパク質等の溶質の連続的な輸送に起因するものである。その輸送は以下の式（１）によって表すことができ、この式（１）は、カラムの静的相（イオン交換樹脂）に吸着した溶質の濃度ｑを、同じスポット（横座標ｚ）及び同じ時刻（ｔ）における動的相中の溶質の濃度ｃと比較したものとして与える：

ここで、Ｆは、動的相及び静的相によって占められる体積の比（多孔率因子）であり、ｕ_ｓは、溶媒の伝播速度であり、Ｄ_ｉは、クロマトグラフィーピークの広がりに寄与する分散を表す因子（拡散因子と称される）である。

２） クロマトグラフィーカラムの状態の他の特性は、カラムの静的相に対する溶質の吸着、つまり、動的相の分子と静的相との相互作用に関する。モデル化は、例えば、平衡状態における静的な方法（等温線と称される）に対して行われ得る。単純な等温線の例はｑ^＊＝ｋ・ｃ^＊であり、アスタリスクは、濃度が平衡状態にあると見なされることを表し、ｋは定数であり反応収量と称される。線形等温線の一例は以下のように記述される
ｑ（ｚ，ｔ）＝ｋ・ｃ（ｚ，ｔ） （２）

３） 勾配モードの場合、溶媒の濃度の発展のモデル化も望ましい。典型的な実験では、弱溶媒は水であり、初めは支配的であるか又は唯一のものであり（溶液の全濃度の１００％）、また、強溶媒φはメタノール又はアセトニトリルであり、徐々に導入される。最も単純な場合、溶媒と静的相との間の相互作用は存在せず、溶媒の注入前面は、伝播遅延を除いては、カラムのはじめから終わりまで（その流量及び組成が）同一である。強溶媒φの濃度

の線形変化が、時刻ｔ_１における０と後の時刻ｔ_２における最大値との間で考慮されて、つまり、

となり、あらゆる反応時点において以下の関係が得られる。

４） 次に、溶質の振る舞いについて検討する。アイソクラティックモード（溶媒の定組成）では、２）で導入された保持因子ｋが、ｋ＝（ｔ_Ｒ−ｔ_０）／Ｆｔ_０として定義されて、ここでｔ_０は、保持されていない化合物を取り除くカラムのデッドタイム又は保持時間であり、ｔ_Ｒは、検討されている溶質の保持時間であり、Ｆは、静的相の多孔率パラメータ（ １）を参照）であり、溶媒とは無関係である。勾配モードでは、ｋは、

の関数であり、

のような関係が一般的に用いられ、ここで、ｋ_ｗは、水中での保持因子であり、Ｓは勾配の傾斜である。

５） 極性ピラー中の静的相を備えた特定のクロマトグラフィーカラムのようなより複雑なモデルを考えることもできる。液体はほとんど不動とされ、停滞相を形成する。溶質の移動は、動的相と静的相との間、停滞相と静的相との間、及び動的相と停滞相との間で生じ得る。分子拡散は、動的相中の軸方向拡散によるものであり得る。非線形等温線を導入して、動的相及び静的相中の溶質の濃度に従った交換効率に観測されることが多い変動を考慮することができる。最後に、式（２）と比較して、非線形等温線、又は代わりに溶媒と静的相との間の相互作用の場合に溶質と溶媒を関連付ける等温線を考えることができる。非線形等温線の記述は、非特許文献３及び非特許文献４に見出すことができる。最後に、非特許文献１で定義されるような非線形等温線が使用可能である。

〈内部較正の影響〉
本方法の残りの部分では、サンプル中の重み付けされたタンパク質について検討する。これは、クロマトグラフィーカラムの結果の変動、特にサンプルの化合物の保持時間を考慮するのに従来技術において一般的に使用されている較正タンパク質である。重み付けされたタンパク質は、調査されるタンパク質とほぼ同じであるが、重同位体が豊富であり、質量分析計３において容易に識別可能である。これが既知の濃度で導入されると、そのピークの高さ及び保持時間を測定することによって、同じ種の研究対象のタンパク質の測定のために、クロマトグラフィーカラムを較正することが可能になる。しかしながら、重み付けされたタンパク質の使用は実際には必須ではない点は強調しておきたい。

ｍ_{ｉ，ｊ，ｋ} ^（ｎ）は、時間ｎにおけるサンプルｊの研究対象のタンパク質ｋに属するペプチドｉのクロマトグラムを指称するものであり、ｍ^＊ _{ｉ，ｊ，ｋ} ^（ｎ）は同じクロマトグラムではあるが、重み付けされたタンパク質ｋに属するペプチドに対するものであり、ｍ_ｊ，ｋ（ｎ）は、研究対象のタンパク質ｋに属するＮ_ｐｅｐ個のペプチドのクロマトグラムの和であり、ｍ^＊ _ｊ，ｋ（ｎ）は重み付けされたタンパク質ｋに対する同様の和であり、つまり、

であり、また、ｍ_{ｉ，ｊ，ｋ} ^（ｎ）、ｍ^＊ _{ｉ，ｊ，ｋ} ^（ｎ）は以下のように表すことができる：

ここで、ｃ_ｊ，ｋはサンプルｊ中の研究対象のタンパク質ｋの濃度であり、ｃ^＊ _ｊ，ｋは重み付けされたタンパク質ｋの濃度であり、β_{ｉ，ｊ，ｋ}はタンパク質ｋのペプチドｉに対する測定鎖の較正利得（オペレータの既知の濃度ｃ^＊ _ｊ，ｋ及び信号に対する対応する測定のおかげで得られる）であり、α_ｉ，ｋは較正利得（既知の濃度ｃ_ｊ，ｋにおけるタンパク質のサンプルに対する外部較正を用いて得られる）であり、ｙ_ｉ，ｋ（ｎ，ｐ）は、以下の状態モデルに従ったタンパク質ｋに属するペプチドｉに対するクロマトグラム２の応答であり、ε_{ｉ，ｊ，ｋ}及びε^＊ _{ｉ，ｊ，ｋ}はノイズであり、独立的にモデル化可能であり、例えば、ゼロ平均ガウシアンランダムプロセス（ホワイトノイズに対応する）を行うことによるものであり、決定された変動のものである。これらのノイズは、例えば、化学反応における相互作用のランダム性によるノイズである。また、これらのノイズは電子ノイズでもあり得る。ｐはモデルのパラメータの全てに対応して、カラムに特有の、対（カラム‐ペプチド）に特有の、既知の、又は実験的に決定された物理パラメータであり得る。また、ｐは、モデルの安定性を確実にするように選択された数値パラメータも備える。これらのパラメータについては以下で定義する。

ｃ_ｊ，ｋ及びｃ^＊ _ｊ，ｋが既知であるＮｃ回の較正実験及びｃ^＊ _ｊ，ｋが既知でありｃ_ｊ，ｋ（得られる濃度）が未知であるＮｐ回の研究対象の実験を行うことが考えられる。

〈カラムのモデルの表現〉
上述の式（１）の一次導関数及び二次導関数を、以下の式（３）及び（４）によって有限差分法で与えることができる：

Δｚは距離のサンプリング間隔であり、ｏ（Δｚ^２）は無視可能な項であり、有限差分による導関数の近似において生じる残余分を表す。

更に、一次の時間の導関数を、有限差分法で式（５）

により得ることができて、ここで、Δｔは時間のサンプリング間隔であり、ｏ（Δｚ）は無視可能な項を示す。

そして、式（１）を以下の式（６）で置き換えることができる：

〈モデルの発展的記述〉
１） 初めに、アイソクラティックモードについて検討する。そのモデルは状態空間システムによって表すことができる：

ここで、ｘ（ｔ）は状態ベクトルであり、ｐはシステムの物理パラメータを表し、ｕはシステムの入力信号（注入関数）を表し、ｙ（ｔ）はシステムの出力（評価される所定のペプチドに対するクロマトグラフィーカラムのモデル）を表し、ｘ_０は状態ベクトルの初期条件である。状態空間システムに従ったモデルを表すことによって、動的モデルの標準形式で終わることができて、既存のツールを用いて分解可能である。関数ｆは状態の発展の関数と称され、関数ｈは観測関数と称される。離散的で静的で線形なシステムの場合、このシステムは以下のようになる：

ここで、ｎは１からｎｔまででサンプリングされる時間に対応し、Ａは状態行列であり、Ｂは入力行列であり、Ｃは出力行列であり、Ｄは直達行列である。

このシステムを以下のように展開することができる：

は、次元ｎｚ＝Ｌ／Δｚの列ベクトルであり、

は次元ｎｚの正方行列であり、Ｉ（ｐ）、Ｊ（ｐ）及びＫ（ｐ）はシステムが安定であるように正でなければならず、これは時間及び空間におけるサンプリング間隔に対する制限を意味する。

は、次元ｎｚの列ベクトルであり、

は次元ｎｚの行ベクトルであり、ｙ（ｎ）＝ｃ（Ｌ／Δｚ，ｎ）であり、ここでＤ（ｐ）は、任意又はゼロに選択される行列であり、ここではゼロとする。

２） これから、勾配モードにおいて状態空間システムが如何にして形成されるのかについて見ていく。システムは以下のようになり：

行列Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが時間ｎに依存するという点において先のものと異なる。そして、等温線が以下の式（７）によって定義され、勾配が、線形勾配の所定の仮説に対する式（８）及び（９）によって定義される

式（７）の導関数は以下の式（１０）を与え

また、式（１）、（８）及び（１０）から

が得られる。有限差分法の形式で表すと、以下の式（１２）となる：

これは、以下の（１３）の単純な方法で表すことができて、

係数Ｉ、Ｊ及びＫは、以前よりも複雑な形を有する：

そして、この問題は以下のシステムの形を有する：

ここで、ｘ、Ｂ、Ｃ及びＤは、アイソクラティックモードのものと同一であり、Ａは以下のように表される：

全ての場合において、これから、ｙ（ｎ）がｎ＝１からｎ＝ｎｔに対して導出されて、ｎｔがクロマトグラムの最大横座標（保持時間の点の数）であり、つまり、検討されているモード（アイソクラティック又は勾配）に対する所定のペプチドのクロマトグラフィーカラムの出力信号の状態モデルが導出される。このモデルは典型的には溶出ピークのものである。これは、時間の関数であり、設備の物理因子にも依存する。同一の測定条件下においてこのペプチドに対するクロマトグラフィーカラム２の出力において効果的に測定される信号が再現されるものとする。これは図２の参照符号５で示されている。

〈パラメータの一次評価〉
これから、物理パラメータｐが如何にして決定されるのかについて説明する。三つのカテゴリーが区別され得る：一部は測定によって決定可能な固定パラメータであり、カラムの長さＬや、相の係数Ｆ等であり、このＦは、Ｆ＝（１−ε）／εとの関係によってクロマトグラフィーカラムの多孔率εと相関している。第二のカテゴリーのパラメータは、実験的なクロマトグラムに対して実験的に決定される。これは、静的相と相互作用しないマーカーの保持時間ｔ_０を測定してｕ_ｓ＝Ｌ／ｔ_０との単純な関係式を適用することによる溶媒の速度ｕ_ｓである。同様に、ｋ＝（ｔ_Ｒ−ｔ_０）／（Ｆｔ_０）、Ｄ_ｉ＝（Ｌｕ_ｓσ^２）／（２ｔ_Ｒ ^２）であり、ｔ_Ｒは保持時間であり、σ^２は、クロマトグラムのペプチドピークの統計的分散（広がりを表す）である。これは線形等温線の場合を含む。非線形等温線の場合、その等温線を定義する他のパラメータが考慮され得る。他のパラメータは、ペプチドの濃度だけではなく、溶媒の成分であり得る。

最後に、第三のカテゴリーのパラメータΔｔ及びΔｚは、時間及び長さのサンプリング間隔であり、数値システムの分解能の安定性の制限に対して適切に選択される。

勾配モードでは、他のカテゴリーのパラメータを考慮しなければならない。特定のパラメータはまず時間の関数として強溶媒の濃度をモデル化するのに役立つが、その濃度がオペレータに依存するので、そのパラメータは既知である。係数ｋ_ｗ及びＳは、決定されたペプチドを利用する追加の較正によって決定される。

〈システムの分解能及び結果の取得〉
次に、誤差関数の最小値に対して連続的な探索を行って、未知数及びモデル化のパラメータの関数として信号を表す複雑なシステムを変換する。更に、システムが実験のたびに再現が簡単なものである場合、予めわかっているパラメータを再調節して、より良い結果を得ることができる。最小二乗法等の決定論的最小化アルゴリズムではなくて、ベイズ型の確率論的最小化アルゴリズム等の、測定とモデルとの間の他のフィッティング基準を用いることができることには留意されたい。

１） 機器の利得を表す較正因子α_ｉ，ｋ及びβ_{ｉ，ｊ，ｋ}を決定しなければならない。計算によって、各実験（研究対象の実験又は較正実験）に対して因子β_{ｉ，ｊ，ｋ}を評価することから始めて、その計算では、物理パラメータｐ及び較正因子β_{ｉ，ｊ，ｋ}の両方が最小値を探すように調節されて、つまり、

となり、ここで、ｍ^＊ _{ｉ，ｊ，ｋ}は重み付けされたペプチドを備えた較正サンプルのスペクトログラムの測定値であり、ｃ^＊ _ｊ，ｋはそのペプチドの既知の濃度であり、ｙ_ｉ，ｋ（ｐ）はｘ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの関数としてのモデルの発展的記述に対応し、λは任意の最小化係数であり、ｐ_０はモデルの物理パラメータｐの初期値であり、予め得られている。この最小化係数は、初期物理パラメータｐ_０に入れることができる信頼度に従って決定し得て、初期パラメータｐ_０の決定においてより高い信頼度が存在するほど、この係数λが高くなり、最小化ステップ中の物理パラメータｐの変動が最小化される。従って、この最小化ステップは主に較正因子β_{ｉ，ｊ，ｋ}の調節に作用する。評価の不正確さに悩まされる物理パラメータｐのみが再評価されて、正確に決定された物理パラメータが固定される。しかしながら、この計算は、較正ペプチドが存在しない場合には行うことができず、係数β_{ｉ，ｊ，ｋ}は全て１に等しいとされる。

研究実験、つまり研究されるサンプル（濃度を決定することが求められている分子種を備える）を用いた実験を可能にするものとして知られている実験中に、内部標準として知られている標準が用いられ、つまり研究されるサンプル中に存在している。その標準は、一般的に重み付けされたタンパク質や重み付けされたペプチドを含む。

較正実験として知られている実験中に、外部標準として知られている標準が、一つ又は好ましくはそれ以上用いられて、つまり、モデルのパラメータの識別を可能にするために、研究されるサンプルの多様な較正サンプルが使用される。こうした較正サンプルは、分子種（例えば、タンパク質、ペプチド）、既知である濃度を備える。

内部標準を用いることで、サンプルの研究に対して、係数β_{ｉ，ｊ，ｋ}又はカラムのパラメータｐの全て又は一部を同時に調節することが可能になる。これは、不安定デバイスとして知られているデバイスが使用されている場合、つまり、係数β_{ｉ，ｊ，ｋ}又はカラムのパラメータｐが実験のたびに変化し得る場合に特に適している。従って、本発明は、測定実験の実施と同時にクロマトグラフィーカラムに特有のパラメータ（パラメータｐ）並びにペプチドｉに対する較正利得（係数β_{ｉ，ｊ，ｋ}）を評価することを可能にし、これは本発明の利点の一つである。これは特に、状態空間システムによるモデルの表現によって可能となり、その状態空間システムの分解能は、クロマトグラフィーカラムのパラメータｐの関数としてシステムの出力関数（関数ｙ）を評価することを可能にする。

２） 第二ステップは、Ｎｃ回の較正実験に対して他の較正係数α_ｉ，ｋを計算することによるものである。ｉ＝１からＮ_ｐｅｐ（全ペプチド）に対して

であり、物理パラメータｐが再評価され得る。しかしながら、この計算は、較正実験が存在しない場合には行うことができず、係数α_ｉ，ｋは全て１であるとされる。ここでも係数λは最小化係数であり、初期パラメータｐ_０の決定に入れられる信頼度の関数として調節される。

３） 最終的な分解能は、Ｎｐ回の研究実験における研究対象のタンパク質ｋの濃度ｃ_ｊ，ｋを決定することができるものであり、各実験ｊにおいて

に従って新たに最小値を探すことによるものであり、ここで、ｍ_ｊ，ｋは、上述のようにｍ_{ｉ，ｊ，ｋ}の和を表す。

これらの計算はコンピュータで容易に行うことができる。得られた結果の例が図２に示されていて、モデル化された信号５（ｙ（ｔ））が、計算によって明らかになった較正利得及び濃度ｃによって重み付けされた後に、また、モデル５におけるピークの形状（広がり）又は位置の評価の誤りを修正することができる物理パラメータｐのｐ_０からの再評価の後に、実際に測定された信号６に重ねられていて、その一致は優れたものである。

この応用において説明した方法は、体液、特に血液の分析において応用することができる。しかしながら、プロテオームによるバクテリアの特性評価においても使用することができる。

〈本発明の他の実施形態 カラムのモデルの表現〉
上述の式（１）の一次導関数及び二次導関数を、式（３）及び（４）の代わりに、以下の式（３’）、（４’）で与えることができる：

これは、上流型有限差分法によってｚにおいて１次の導関数に近付けることによる上流型で非中心型の陽公式を使用することを提案している。このようにする動機は、このような公式は、中心型の陽公式と比較して安定性の制限を緩和することができることによる。安定性の制限が低くなると、時間のサンプリング間隔Δｔ及び空間のサンプリング間隔Δｚを大きく選択することができて、アルゴリズムの全計算時間が顕著に減少する。

溶媒の速度ｕ_ｓが正であるので、上流型で非中心型の公式が選択される。そうでなければ、下流型で非中心型の公式が選択されて、その目的は、“流れに逆らって”情報を探すこととなる。

式（６）はここでも

となるが、その係数は以下のようになり：

式（１２）の代わりに、若干変形された以下の式（１２’）となり：

上述のものと同一の以下の式（１３）において、

係数Ｉ、Ｊ、Ｋは次のように記述される：

この方法の残りの部分、特にシステムのモデルの変換について変更はない。

１ 消化モジュール
２ クロマトグラフィーカラム
３ 質量分析計
４ 処理モジュール

Claims (21)

1. 溶液の溶質の分子の濃度を決定する方法であって、クロマトグラフィーカラム（２）を備えた機器に前記溶液を通して、前記溶液のクロマトグラムを得ることによる方法であり、
   複数の分子種のうち一つにそれぞれ関係したモデル化クロマトグラムを、前記クロマトグラフィーカラムを介する分子の輸送の局所的な空間時間のモデルを用いて表して、該モデルは状態空間システムの形で表され、前記溶液のクロマトグラムの値（ｍ）及び前記モデル化クロマトグラムの値（ｙ）を含む数値変換演算によって前記濃度（ｃ）を決定することを特徴とする方法。
2. 前記モデルが、前記分子種のそれぞれに対して、前記分子種の分子の濃度の発展方程式、及び動的相の分子と静的相との相互作用方程式を備えることを特徴とする請求項１に記載の分子の濃度を決定する方法。
3. 前記発展方程式が、前記クロマトグラフィーカラムの各点に対する濃度を、該点及び隣接する点における以前の濃度の関数として表し、該以前の濃度が係数によって重み付けされることを特徴とする請求項２に記載の分子の濃度を決定する方法。
4. 前記係数が、前記クロマトグラフィーカラムのパラメータと、前記化学種の較正クロマトグラフィーピークのパラメータと、調節パラメータとを備えた複数のパラメータの関数であることを特徴とする請求項３に記載の分子の濃度を決定する方法。
5. 前記クロマトグラフィーカラムのパラメータが、長さ（Ｌ）と、該クロマトグラフィーカラムの多孔率の関数であるパラメータ（Ｆ）とを備えることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
6. 前記較正クロマトグラフィーピークのパラメータが、前記溶質の分子の拡散のパラメータ（Ｄ_ｉ）を備えることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
7. 前記複数のパラメータが、前記クロマトグラフィーカラム中の溶媒の速度に関係するパラメータを更に備えることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
8. 前記調節パラメータが、前記クロマトグラフィーカラムに沿った空間のサンプリング間隔（Δｚ）と時間のサンプリング間隔（Δｔ）とを備えることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
9. 前記複数のパラメータが、時間に対する溶媒の組成の変化を記述するパラメータを更に備えることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
10. 前記発展方程式が
    

    

    であることを特徴とする請求項２又は３に記載の分子の濃度を決定する方法。
11. 前記モデルが
    

    

    によって表され、ｎが１からｎｔまでの時間のサンプリングに対応し、Ａが状態行列であり、Ｂが入力行列であり、Ｃが出力行列であり、Ｄは直達行列であり、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが時間に依存し、
    

    

    が次元ｎｚ＝Ｌ／Δｚの列ベクトルであり、
    

    

    が次元ｎｚの正方行列であり、
    

    

    が次元ｎｚの列ベクトルであり、
    

    

    が次元ｎｚの行ベクトルであり、ｙ（ｎ）＝ｃ（Ｌ／Δｚ，ｎ）であり、Ｄ（ｐ）が任意で選択され、Ｉ（ｉ）、Ｊ（ｎ）及びＫ（ｐ）が係数であることを特徴とする請求項４に記載の分子の濃度を決定する方法。
12. 

    であり、Ｆが前記クロマトグラフィーカラムの多孔率因子であり、Ｄ_ｉがクロマトグラフィー拡散因子であり、Δｔが前記モデルの時間のサンプリング間隔であり、Δｚが前記モデルの空間のサンプリング間隔であることを特徴とする請求項１１に記載の分子の濃度を決定する方法。
13. 前記モデルが
    

    

    によって表され、ｎが１からｎｔまでの時間のサンプリングに対応し、Ａが状態行列であり、Ｂが入力行列であり、Ｃが出力行列であり、Ｄは直達行列であり、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが時間に依存し、
    

    

    が次元ｎｚ＝Ｌ／Δｚの列ベクトルであり、
    

    

    が次元ｎｚの正方行列であり、
    

    

    が次元ｎｚの列ベクトルであり、
    

    

    が次元ｎｚの行ベクトルであり、ｙ（ｎ）＝ｃ（Ｌ／Δｚ，ｎ）であり、Ｄ（ｐ）が任意で選択され、Ｉ（ｉ，ｎ，ｐ）、Ｊ（ｉ，ｎ，ｐ）及びＫ（ｉ，ｎ，ｐ）が係数であることを特徴とする請求項９に記載の分子の濃度を決定する方法。
14. 

    であり、Ｆが前記クロマトグラフィーカラムの多孔率パラメータであり、ｋ_ｗが保持因子であり、Ｓが勾配の傾斜であり、
    

    

    が濃度であり、
    Ｄ_ｉがクロマトグラフィー拡散因子であり、Δｚが前記モデルの空間のサンプリング間隔であり、Δｔが前記モデルの時間のサンプリング間隔であることを特徴とする請求項１３に記載の分子の濃度を決定する方法。
15. 前記機器の利得パラメータ（α，β）が、既知の濃度の分子に対して測定された信号と、該利得パラメータが前記モデル及び該既知の濃度に干渉する表現との間の差の関数の最小値を探すことによって、導出されることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の分子の濃度を決定する方法。
16. 前記濃度が、前記分子に対して測定された信号と、利得パラメータが前記モデル及び該濃度に干渉する表現との間の差の関数の最小値を探すことによって、得られることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の分子の濃度を決定する方法。
17. 前記複数のパラメータの一部が最小値を探している間に再評価されることを特徴とする請求項４及び１５に記載の分子の濃度を決定する方法。
18. 測定値とモデルの値との間のフィッティングを得るために、少なくとも一つのベイズ型の確率論的最小化アルゴリズムを使用することを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項に記載の分子の濃度を決定する方法。
19. 

    であり、Ｆが前記クロマトグラフィーカラムの多孔率因子であり、Ｄ_ｉがクロマトグラフィー拡散因子であり、Δｔが前記モデルの時間のサンプリング間隔であり、Δｚが前記モデルの空間のサンプリング間隔であることを特徴とする請求項１１に記載の分子の濃度を決定する方法。
20. 

    であり、Ｆが前記クロマトグラフィーカラムの多孔率パラメータであり、ｋ_ｗが保持因子であり、Ｓが勾配の傾斜であり、
    

    

    が濃度であり、
    Ｄ_ｉがクロマトグラフィー拡散因子であり、Δｚが前記モデルの空間のサンプリング間隔であり、Δｔが前記モデルの時間のサンプリング間隔であることを特徴とする請求項１３に記載の分子の濃度を決定する方法。
21. 前記クロマトグラムがスペクトログラムから得られることを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載に分子の濃度を決定する方法。

Images