JP2012228246A - Method of manufacturing sphingolipid - Google Patents
Method of manufacturing sphingolipid Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012228246A JP2012228246A JP2012090774A JP2012090774A JP2012228246A JP 2012228246 A JP2012228246 A JP 2012228246A JP 2012090774 A JP2012090774 A JP 2012090774A JP 2012090774 A JP2012090774 A JP 2012090774A JP 2012228246 A JP2012228246 A JP 2012228246A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- shochu
- aspergillus
- sphingolipid
- culture
- sphingolipids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 94
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 235000020083 shōchū Nutrition 0.000 claims abstract description 80
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims abstract description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims abstract description 14
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract description 14
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims abstract description 11
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 241000122821 Aspergillus kawachii Species 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 2
- 241001112078 Aspergillus usamii Species 0.000 abstract description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 10
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 10
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 10
- JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N (2r)-2-hydroxy-n-[(2s,3r,4e,8e)-3-hydroxy-9-methyl-1-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadeca-4,8-dien-2-yl]heptadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)\C=C\CC\C=C(/C)CCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N 0.000 description 9
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 9
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 9
- RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N cerebroside D Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 8
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 8
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 8
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 7
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 244000271379 Penicillium camembertii Species 0.000 description 4
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 2
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 2
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 2
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 description 2
- 241001123663 Penicillium expansum Species 0.000 description 2
- 240000000064 Penicillium roqueforti Species 0.000 description 2
- 235000002233 Penicillium roqueforti Nutrition 0.000 description 2
- 244000205939 Rhizopus oligosporus Species 0.000 description 2
- 235000000471 Rhizopus oligosporus Nutrition 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M potassium;methanol;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OC CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 244000247812 Amorphophallus rivieri Species 0.000 description 1
- 235000001206 Amorphophallus rivieri Nutrition 0.000 description 1
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 1
- 244000274847 Betula papyrifera Species 0.000 description 1
- 235000009113 Betula papyrifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 1
- 235000010928 Betula populifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000002992 Betula pubescens Nutrition 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 229920002752 Konjac Polymers 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000235545 Rhizopus niveus Species 0.000 description 1
- 241000235546 Rhizopus stolonifer Species 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000020279 black tea Nutrition 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000008294 cold cream Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000015071 dressings Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002101 electrospray ionisation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000013611 frozen food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002305 glucosylceramides Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000008269 hand cream Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 239000000252 konjac Substances 0.000 description 1
- 235000010485 konjac Nutrition 0.000 description 1
- 239000007934 lip balm Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020333 oolong tea Nutrition 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- -1 packs Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000011962 puddings Nutrition 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019685 rice crackers Nutrition 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 125000002657 sphingoid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003410 sphingosines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
Description
本発明は、焼酎粕からスフィンゴ脂質を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing sphingolipids from shochu.
スフィンゴ脂質は、長鎖アミノアルコールであるスフィンゴイド塩基を共通成分とする脂質の一群である。スフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、皮膚の角質層における主要な脂質成分として存在し、保湿機能を果たすことが知られている。セラミドは加齢とともに不足するため、補填を目的としてスキンケア化粧品の分野で大きな需要がある。
スフィンゴ脂質は脳白質に多く存在し、これまで牛脳から主に採取されてきたが、狂牛病発生のため牛脳からの分離が困難となり、現在は、植物又は微生物由来の新しい供給源が求められている。
Sphingolipids are a group of lipids having a sphingoid base, which is a long-chain amino alcohol, as a common component. Ceramide, a kind of sphingolipid, exists as a major lipid component in the stratum corneum of the skin and is known to perform a moisturizing function. Since ceramide is deficient with age, there is a great demand in the field of skin care cosmetics for the purpose of supplementation.
Sphingolipids are abundant in brain white matter and have been mainly collected from bovine brain until now, but it has become difficult to separate from bovine brain due to the occurrence of mad cow disease, and now there are new sources derived from plants or microorganisms. It has been demanded.
スフィンゴ脂質の新しい供給源として、すでに酵母や米、大豆、麦などの穀物が利用されている。また、こんにゃくからスフィンゴ脂質の一種であるセラミドを抽出する技術（非特許文献１：A rapid method of total lipid extraction and purification. BLIGH EG, DYER WJ. Can J Biochem Physiol. 1959 Aug;37(8):911-7.）、あるいは、清酒麹菌と味噌麹菌Aspergillus oryzae, Aspergillus sojaeからのスフィンゴ脂質を生産する方法も開発されている（特許文献１：特開2010-154788号公報、特許文献２：特開2010-41972号公報）。
しかしながら、穀物や酵母を含む焼酎粕からのスフィンゴ脂質の存在は明確ではない。
また、クロロホルム・メタノールを使用してスフィンゴ脂質を抽出した後、抽出物を高圧二酸化炭素で洗浄する方法が知られている（特許文献３：特開2003-119492号公報）。また、製麹時間を長くするとともに、湿度を高めてスフィンゴ脂質の量を高める方法も知られている（特許文献４：特開2010-22279号公報）。
しかし、従来の方法では、食用に供するスフィンゴ脂質を製造する場合には使用する有機溶媒に制限があり、また、抽出されたスフィンゴ脂質の処理に高価な機器が必要とされていたため、より簡易な手法によるスフィンゴ脂質の製法の開発が望まれていた。
As new sources of sphingolipids, grains such as yeast, rice, soybeans and wheat have already been used. In addition, a technique for extracting ceramide, a kind of sphingolipid from konjac (Non-patent Document 1: A rapid method of total lipid extraction and purification. BLIGH EG, DYER WJ. Can J Biochem Physiol. 1959 Aug; 37 (8): 911-7.), Or a method for producing sphingolipids from sake koji and miso bacteria Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae has also been developed (Patent Document 1: JP 2010-154788, Patent Document 2: JP 2010-41972 gazette).
However, the presence of sphingolipids from shochu containing grains and yeasts is not clear.
In addition, a method is known in which after extracting sphingolipids using chloroform / methanol, the extract is washed with high-pressure carbon dioxide (Patent Document 3: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-119492). Also known is a method for increasing the amount of sphingolipid by increasing the humidity and increasing the amount of sphingolipid (Patent Document 4: JP 2010-22279 A).
However, in the conventional method, there is a limit to the organic solvent to be used when producing sphingolipids for edible use, and more expensive equipment is required for processing the extracted sphingolipids. Development of a method for producing sphingolipids by a technique has been desired.
一方、九州では年間数十万トンの焼酎粕が発生している。これまで焼酎粕は海洋投棄されていたが、環境問題への国際的な関心の高まりを受けて海洋汚染防止法の改正に伴い焼酎粕の海洋投棄が禁止されたため、その活用策が求められている。 On the other hand, hundreds of thousands of tons of shochu are generated annually in Kyushu. Up to now, shochu has been dumped into the ocean, but due to the increasing international interest in environmental issues, shochu from being dumped into the ocean has been banned along with the revision of the Marine Pollution Control Law. Yes.
本発明は、焼酎粕から効率良くスフィンゴ脂質を製造する方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the method of manufacturing a sphingolipid efficiently from shochu.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、焼酎粕中にスフィンゴ脂質が多量に含まれることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）水分が除去された焼酎粕からスフィンゴ脂質を抽出する工程を含む、スフィンゴ脂質の製造方法。
（２）焼酎粕が、穀類を原料とし、焼酎麹菌を用いた焼酎の製造工程において生じるものである、（１）に記載の方法
（３）穀類が米又は大麦である、（２）に記載の方法。
（４）焼酎麹菌が、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ナカザキ（Aspergillus nakazawai）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ルーチェンシス（Aspergillus luchensis）及び アスペリギルス・ニガー（Aspergillus niger）、並びにRhizopus属に属する微生物、Monuscus属に属する微生物及びPenicillium属に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１種である、（２）に記載の方法。
（５）焼酎麹菌を培養し、その培養物から水分を除去し、得られる水分除去品からスフィンゴ脂質を採取する工程を含む、スフィンゴ脂質の製造方法。
（６）焼酎麹菌が、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ナカザキ（Aspergillus nakazawai）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ルーチェンシス（Aspergillus luchensis）及び アスペリギルス・ニガー（Aspergillus niger）、並びにRhizopus属に属する微生物、Monuscus属に属する微生物及びPenicillium属に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１種である、（５）に記載の方法。
（７）培養温度が30〜50℃である（５）又は（６）に記載の方法。
（８）培養方法が液体培養又は固体培養である（５）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that a large amount of sphingolipid is contained in the shochu, and has completed the present invention.
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for producing sphingolipid, comprising a step of extracting sphingolipid from shochu from which moisture has been removed.
(2) The method according to (1), wherein the shochu is produced in the production process of shochu using shochu as a raw material, and (3) the cereal is rice or barley the method of.
(4) Aspergillus kawachii, Aspergillus saitoi, Aspergillus awamori, Aspergillus nakazawai, Aspergillus uslusi, spermus luslus, i (Aspergillus luchensis) and Aspergillus niger, and at least one selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Rhizopus, a microorganism belonging to the genus Monuscus and a microorganism belonging to the genus Penicillium, Method.
(5) A method for producing sphingolipid, comprising a step of culturing shochu bacteria, removing water from the culture, and collecting sphingolipid from the obtained water-removed product.
(6) Aspergillus kawachii, Aspergillus saitoi, Aspergillus awamori, Aspergillus nakazawai, Aspergillus gususi, Aspergillus sus (Aspergillus luchensis) and Aspergillus niger, and at least one selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Rhizopus, a microorganism belonging to the genus Monuscus and a microorganism belonging to the genus Penicillium, Method.
(7) The method according to (5) or (6), wherein the culture temperature is 30 to 50 ° C.
(8) The method according to any one of (5) to (7), wherein the culture method is liquid culture or solid culture.
本発明により、スフィンゴ脂質の製造方法が提供される。
本発明の方法により、焼酎粕からこれまでに知られているスフィンゴ脂質とは異なるスフィンゴ脂質を抽出することができる。また、本発明においては、焼酎麹菌を培養するだけで新たなスフィンゴ脂質を生産することができる。本発明によれば、安価で人体に無害なエタノールを使ってスフィンゴ脂質を抽出することができ、さらには、温度を高くして麹菌を培養することで、スフィンゴ脂質の生産量を増加させることができる。
According to the present invention, a method for producing a sphingolipid is provided.
According to the method of the present invention, a sphingolipid different from the conventionally known sphingolipid can be extracted from the shochu. In the present invention, new sphingolipids can be produced simply by culturing shochu bacteria. According to the present invention, it is possible to extract sphingolipids using ethanol that is inexpensive and harmless to the human body, and further, it is possible to increase the production amount of sphingolipids by culturing koji molds at a high temperature. it can.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、焼酎粕に新規スフィンゴ脂質が含まれているという知見により完成されたものであり、焼酎粕からスフィンゴ脂質を抽出することを特徴とする。また本発明は、焼酎麹菌を培養することにより、その培養物（水分が除去されたもの）からスフィンゴ脂質を抽出することを特徴とする。
本発明において、スフィンゴ脂質の抽出は所定の有機溶媒を用いて行なうことができるが、その際、焼酎粕原料から水分を除去することを特徴とする。すなわち、焼酎粕原料を遠心等により水分を除き、残った固形部分からスフィンゴ脂質を抽出する。
また、焼酎麹菌により新規スフィンゴ脂質を生産することができる。さらに、この新規スフィンゴ脂質は、焼酎麹由来であることも明らかにした。
本発明において、麹菌からスフィンゴ脂質を製造する場合は、30℃〜50℃、好ましくは30〜45℃、さらに好ましくは40℃で麹菌を培養することを特徴とする。一般的に製麹温度の温度は32〜37℃で行われるため、通常はこれ以上の温度では培養は行なわれない。これに対し、本発明においては、通常の培養温度で培養することもできるが、38℃〜50℃、好ましくは38〜45℃、さらに好ましくは40℃で培養することで、効率良くスフィンゴ脂質を生産することが可能となった。本発明の方法によれば、例えば40℃で培養して得られた培養物から水分を除去した後にスフィンゴ脂質の抽出作業を行うと、単位原料あたり4mgのスフィンゴ脂質を得ることができる。この量は、従来の方法で得られる量と比較して1.2〜1.5倍の量であり、本発明の方法が極めて優れていることを示すものである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Outline The present invention has been completed based on the finding that a novel sphingolipid is contained in shochu, and is characterized by extracting sphingolipid from the shochu. In addition, the present invention is characterized in that sphingolipids are extracted from the culture (from which water has been removed) by culturing shochu bacteria.
In the present invention, sphingolipids can be extracted using a predetermined organic solvent. At this time, water is removed from the shochu raw material. That is, water is removed from the shochu raw material by centrifugation or the like, and the sphingolipid is extracted from the remaining solid portion.
Moreover, a novel sphingolipid can be produced by shochu. Furthermore, it was also clarified that this novel sphingolipid is derived from shochu.
In the present invention, when producing sphingolipids from koji molds, koji molds are cultured at 30 ° C. to 50 ° C., preferably 30 to 45 ° C., more preferably 40 ° C. Generally, since the temperature of the koji temperature is 32 to 37 ° C., the culture is not usually performed at a temperature higher than this. On the other hand, in the present invention, it can be cultured at a normal culture temperature, but it can be efficiently cultured by culturing at 38 ° C to 50 ° C, preferably 38 ° C to 45 ° C, more preferably 40 ° C. It became possible to produce. According to the method of the present invention, for example, 4 mg of sphingolipid per unit raw material can be obtained by extracting the sphingolipid after removing water from the culture obtained by culturing at 40 ° C. This amount is 1.2 to 1.5 times the amount obtained by the conventional method, which shows that the method of the present invention is extremely excellent.
焼酎粕にスフィンゴ脂質が含まれているかについて解析した研究例は、これまで見出されていない。そこで本発明においては、焼酎粕の活用策の一環として焼酎粕のスフィンゴ脂質の検出とその量の評価・解析を行った。
常法に従って焼酎粕からスフィンゴ脂質を抽出した後、シリカゲル薄層クロマトグラフィーで展開し、検出を行った。その結果、マーカーとして使用した精製牛脳セレブロシドと似た位置にスポットを検出することができた（図1）。次にその量の評価を行い、乾燥重量として焼酎粕1g中に4.2-6.3 mg のスフィンゴ脂質が含まれることを明らかにした。本結果により、焼酎粕にスフィンゴ脂質が含まれることが初めて明らかになった。
No research examples have been found that have analyzed whether sphingolipids are contained in shochu. Therefore, in the present invention, detection of sphingolipids in shochu and evaluation / analysis of the amount thereof were carried out as part of measures for utilizing shochu.
Sphingolipids were extracted from shochu according to a conventional method and then developed by silica gel thin layer chromatography for detection. As a result, it was possible to detect spots at positions similar to the purified bovine brain cerebroside used as a marker (Fig. 1). Next, the amount was evaluated, and it was clarified that 4.2-6.3 mg of sphingolipid was contained in 1 g of shochu as a dry weight. This result revealed for the first time that sphingolipids were contained in shochu.
２．焼酎粕からのスフィンゴ脂質の製造
本発明の方法で使用される原料は、麹菌を生やして麹にできる穀類や根菜であれば特に制限されるものではなく、例えば米、大麦、小麦、甘藷芋、黒糖、そば、男爵などを使用することができる。特に大麦を使用することが好ましい。
2. Production of Sphingolipid from Shochu The raw material used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a cereal or root vegetable that can be made into a koji by growing a koji mold, such as rice, barley, wheat, sweet potato, Brown sugar, buckwheat, baron, etc. can be used. It is particularly preferable to use barley.
製造の対象となるスフィンゴ脂質は、スフィンゴイドに脂肪酸が酸アミド結合したセラミドを共通構造とし、それに糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質と燐酸および塩基が結合したスフィンゴ燐脂質とに分類される。本発明において、スフィンゴ脂質としては、特に限定されるものではないが、例えばセラミド、糖結合型スフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴシン塩基が挙げられ、セラミドが好ましい。 The sphingolipids to be manufactured are classified into sphingophospholipids in which a ceramide having a fatty acid and an acid amide bond bonded to a sphingoid has a common structure and a sugar is glycoside bonded thereto, and a sphingophospholipid in which a phosphate and a base are bonded. In the present invention, the sphingolipid is not particularly limited, and examples thereof include ceramide, sugar-linked sphingolipid, sphingophospholipid, and sphingosine base, and ceramide is preferable.
本発明の方法に用いることができる麹菌は、スフィンゴ脂質を生産できるものであれば特に限定されるものではなく、アスペルギルス属に属する微生物が挙げられる。
例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ナカザキ（Aspergillus nakazawai）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ルーチェンシス（Aspergillus luchensis）、 アスペリギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが挙げられる。
また、本発明において使用できる微生物は、アスペルギルス属に属する微生物に限定されるものではなく、他の属、例えばRhizopus属に属する微生物、Monuscus属に属する微生物及びPenicillium属に属する微生物なども使用することができる。これらの属に属する微生物を以下に例示する。
リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物：リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、 リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス・ニヴェウス（Rhizopus niveus）、 リゾプス・ミクロスポラス（Rhizopus microspores）、リゾプス・ストロニファー （Rhizopus stolonifer）など
モナスカス（Monuscus）属に属する微生物：モナスカス・アンカ（Monuscus anka）、モナスカス・パープレウス（Monuscus purpureus）、 モナスカス・ルーバー（Monuscus ruber）、モナスカス・ピロサス（Monuscus pilosus）、 モナスカス・オーランチアクス（Monuscus aurantiacus）、モナスカス・カオリアン（Monuscus kaoliang）など
ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物：ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・グラウカム（Penicillium glaucum）、 ペニシリウム・カゼイコラム（Penicillium caseicolum）など
本発明においては、これらの麹菌を１種単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができるが、アスペルギルス・カワチが好ましい。
The koji mold that can be used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can produce sphingolipid, and includes microorganisms belonging to the genus Aspergillus.
For example, Aspergillus kawachii, Aspergillus saitoi, Aspergillus awamori, Aspergillus nakazawai, Aspergillus usgilis, Aspergillus usgisis Examples include Aspergillus niger.
In addition, the microorganisms that can be used in the present invention are not limited to microorganisms belonging to the genus Aspergillus, but other genera such as microorganisms belonging to the genus Rhizopus, microorganisms belonging to the genus Monuscus, microorganisms belonging to the genus Penicillium, etc. Can do. The microorganisms belonging to these genera are exemplified below.
Microorganisms belonging to the genus Rhizopus: Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus niveus, Rhizopus microspores, Ronzo pus Microbes belonging to the genus Monascus: Monuscus anka, Monuscus purpureus, Monuscus ruber, Monuscus pilosus, Monuscus aurantiacus ), Monuscus kaoliang, etc. Microbes belonging to the genus Penicillium: Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti, Penicillium -Graucum (Penicillium glaucum), Penicillium caseicolumn (Penicillium caseicolum), etc. In the present invention, these koji molds can be used singly or in combination, but Aspergillus kawachi is preferred.
具体的には、下記の市販品や寄託微生物を使用することができる。
A. kawachii：NRIB SC60
A. saitoi：NRIB2601
A. awamori： NIRB2013
A. nakazawai： NRIB2623
A. usamii：NIRB2004
Rhizopus属に属する微生物、Monuscus属に属する微生物及びPenicillium属に属する微生物は、食品の製造に使われる菌糸型の成長をする真菌という特徴を有することから、上記Aspergillus属菌と同様に本発明においても使用することができる。
Specifically, the following commercially available products and deposited microorganisms can be used.
A. kawachii: NRIB SC60
A. saitoi: NRIB2601
A. awamori: NIRB2013
A. nakazawai: NRIB2623
A. usamii: NIRB2004
Since the microorganism belonging to the genus Rhizopus, the microorganism belonging to the genus Monuscus and the microorganism belonging to the genus Penicillium have the characteristics of a fungus that grows in a mycelium type used in the production of foods, in the present invention as well as the above Aspergillus genus Can be used.
焼酎は以下の工程により製造される。すなわち、焼酎の麹の原料となる米を洗い、水に浸してさらに蒸す。この蒸米に上記麹菌を加えて麹を製造する。麹は、水及び酵母を混ぜて１〜３０日程度寝かせて一次仕込みを行う。これにより一次もろみができる。次に、一次もろみに原料の穀類（大麦、小麦、米、芋等）と水を混ぜ、さらに１〜３０日間寝かせて二次仕込みを行う。これにより二次もろみが製造される。一次もろみに混ぜる原料は、麦焼酎を製造する場合は麦を、米焼酎を製造する場合は米を使用する。続いて、二次もろみを単式蒸留器にかけて蒸留を行う。この蒸留工程では、アルコール分を蒸発させてから冷却して液体に戻すことで原酒が製造される。
蒸留によって得られた原酒をろ過により精製し、樽や甕などに貯蔵する。
上記工程において、焼酎粕は蒸留工程で蒸留された二次もろみの残りである。
本発明においては、焼酎の製造工程中の蒸留工程で発生した焼酎粕を使用することができる。
Shochu is produced by the following process. That is, the rice that is the raw material for shochu lees is washed, soaked in water, and steamed. The koji mold is added to this steamed rice to produce koji. The koji mixes water and yeast and lays it for about 1 to 30 days to make a primary charge. This makes primary moromi. Next, raw cereals (barley, wheat, rice, rice bran, etc.) and water are mixed with the primary mash and further laid for 1 to 30 days for secondary charging. Thereby, secondary mash is manufactured. As the raw material to be mixed with the primary mash, wheat is used when producing wheat shochu, and rice is used when producing rice shochu. Subsequently, the secondary mash is distilled through a single distiller. In this distillation step, raw alcohol is produced by evaporating the alcohol and then cooling it back to a liquid.
The raw sake obtained by distillation is purified by filtration and stored in barrels or bottles.
In the above process, shochu is the remainder of the secondary moromi distilled in the distillation process.
In the present invention, the shochu generated in the distillation process during the manufacturing process of shochu can be used.
焼酎粕には、多くの水分が含まれており、粕が水中に浮遊状態となっているか、あるいは含有率：30〜95％の状態で含水状態となっている。そこで本発明においては、このように多量の水分を含む焼酎粕から実質的に水分を除去する。「水分を除去する」とは、焼酎粕が水に浮遊しない状態であれば多少の水分が含まれていてもよい状態、焼酎粕がペースト状になった状態、あるいは水分が失われて固形又は粉末状の乾燥品となった状態のいずかの状態、すなわち、焼酎粕に含まれる水分含有率が20％以下にすることを意味する。水分を除去する方法は、特に限定されるものではなく、遠心分離、濾過などが挙げられるが、操作が簡易である点で遠心分離が好ましい。遠心分離の条件は、10〜10000×ｇ、好ましくは3,000×gで1〜50分、好ましくは5分である。
このようにして焼酎粕から実質的に水分を除去し、沈殿物を得る。
上記焼酎粕は、そのまま、又は沈殿物にして加熱、スプレードライ又は凍結乾燥若しくは減圧乾燥することにより乾燥してもよい。本発明においては、上記実質的に水分が除去された焼酎粕を「乾燥品」ともいう。
焼酎粕からのスフィンゴ脂質の抽出は、上記焼酎粕の乾燥品を抽出溶媒に溶解して以下の通り行なう。
抽出溶媒は、脂質の抽出に使用するものであれば特に限定されるものではなく、例えばクロロホルム/メタノール抽出液、エタノールなどが挙げられる。食品に供されるスフィンゴ脂質を抽出する場合は、エタノール等で抽出することが好ましい。その後、有機層を除去して抽出脂質を得る。
Shochu contains a lot of water, and the cocoon is suspended in water or is in a water-containing state with a content rate of 30 to 95%. Therefore, in the present invention, moisture is substantially removed from the shochu containing a large amount of moisture. “Removing moisture” means a state in which some moisture may be contained if the shochu is not suspended in water, a state in which the shochu is in a paste state, It means that the powder is in a dry state, that is, the water content contained in the shochu is 20% or less. The method for removing moisture is not particularly limited, and examples thereof include centrifugation and filtration. Centrifugation is preferable in terms of simple operation. Centrifugation conditions are 10 to 10,000 × g, preferably 3,000 × g for 1 to 50 minutes, preferably 5 minutes.
In this way, water is substantially removed from the shochu and a precipitate is obtained.
The above shochu may be dried as it is or as a precipitate by heating, spray drying, freeze drying or drying under reduced pressure. In the present invention, the shochu from which water has been substantially removed is also referred to as a “dried product”.
Extraction of sphingolipids from the shochu is performed as follows by dissolving the dried product of the shochu in an extraction solvent.
The extraction solvent is not particularly limited as long as it is used for lipid extraction, and examples thereof include chloroform / methanol extract and ethanol. When extracting sphingolipids for food, it is preferable to extract with ethanol or the like. Thereafter, the organic layer is removed to obtain an extracted lipid.
得られた抽出物の分析方法としては、例えば薄層クロマトグラフィーが挙げられる。スフィンゴ脂質は、グルコシルセラミドなどの市販標準品が存在するため、これを対照として分析することができる。市販のシリカゲル薄層プレートを用い、クロロホルム-メタノール系等の溶媒を用いて展開し、オルシノール試薬などを用いて発色させる。これにより、抽出物中のスフィンゴ脂質の定性分析を行うことができる。スフィンゴ脂質の定量分析及び構造解析は、高速液体クロマトグラフィー及び質量分析（LC/MS、GC/MS、HPLC 光散乱検出法）などを適宜組み合わせて行なうことができる。
また、得られたスフィンゴ糖脂質の組成物は、そのまま、凍結乾燥法、スプレードライなどの方法を用いて、固体化、粉末化して用いることができる。
本発明の方法（焼酎粕からの抽出）により得られたスフィンゴ脂質は、セラミド、糖結合型スフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴシン塩基等であり、その収量は、原料１ｇあたり２〜８mgである。
As an analysis method of the obtained extract, for example, thin layer chromatography can be mentioned. Sphingolipids can be analyzed as a control since there are commercial standards such as glucosylceramide. Using a commercially available silica gel thin layer plate, development is performed using a solvent such as chloroform-methanol, and color is developed using an orcinol reagent. Thereby, the qualitative analysis of the sphingolipid in an extract can be performed. Quantitative analysis and structural analysis of sphingolipid can be performed by appropriately combining high performance liquid chromatography and mass spectrometry (LC / MS, GC / MS, HPLC light scattering detection method).
Further, the obtained glycosphingolipid composition can be used as it is by solidifying and powdering it using a method such as freeze-drying or spray-drying.
The sphingolipid obtained by the method of the present invention (extraction from shochu) is ceramide, sugar-linked sphingolipid, sphingophospholipid, sphingosine base and the like, and the yield is 2 to 8 mg per 1 g of the raw material.
３．麹菌からのスフィンゴ脂質の製造
本発明においては、焼酎麹菌を培養し、得られる培養物から水を除き、その後、水分除去品からスフィンゴ脂質を採取することを特徴とするスフィンゴ脂質の製造方法も提供する。「培養物」とは、培養された麹菌の菌体、培養上清液、菌体破砕物のいずれをも意味するものである。
麹菌は、前記と同様、以下に示す微生物を、単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。
アスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物：アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ナカザキ（Aspergillus nakazawai）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ルーチェンシス（Aspergillus luchensis）、 アスペリギルス・ニガー（Aspergillus niger）など
リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物：リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、 リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス・ニヴェウス（Rhizopus niveus）、 リゾプス・ミクロスポラス（Rhizopus microspores）、リゾプス・ストロニファー （Rhizopus stolonifer）など
モナスカス（Monuscus）属に属する微生物：モナスカス・アンカ（Monuscus anka）、モナスカス・パープレウス（Monuscus purpureus）、 モナスカス・ルーバー（Monuscus ruber）、モナスカス・ピロサス（Monuscus pilosus）、 モナスカス・オーランチアクス（Monuscus aurantiacus）、モナスカス・カオリアン（Monuscus kaoliang）など
ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物：ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・グラウカム（Penicillium glaucum）、 ペニシリウム・カゼイコラム（Penicillium caseicolum）など
3. Production of sphingolipids from Aspergillus in the present invention The present invention also provides a method for producing sphingolipids characterized by culturing shochu bacteria, removing water from the resulting culture, and then collecting the sphingolipids from the water-removed product To do. “Culture” means any of the cultured gonococcal cells, culture supernatant, and crushed cells.
As for the koji mold, the microorganisms shown below can be used singly or in appropriate combination as described above.
Microorganisms belonging to the genus Aspergillus: Aspergillus kawachii, Aspergillus saitoi, Aspergillus awamori, Aspergillus usperi, Aspergillus usperi, Aspergillus usperi・ Aspergillus luchensis, Aspergillus niger, etc. Microbes belonging to the genus Rhizopus: Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus rizopus, Rhizopus Microbes belonging to the genus Monuscus, such as Rhizopus microspores and Rhizopus stolonifer: Monuscus anka, Monascus Microbes belonging to the genus Penicillium such as Monuscus purpureus, Monuscus ruber, Monuscus pilosus, Monuscus aurantiacus, Monuscus kaoliang, etc.・ Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti, Penicillium glaucum, Penicillium caseicolum, etc.
麹菌の培養は、固体培養及び液体培養のいずれを採用することもできる。
固体培養の場合は、培地として蒸米や蒸麦などを用い、培養温度は２０〜５０℃で１日〜５日培養する。本発明においては、培養温度は30℃〜50℃が好ましく、30℃〜45℃がさらに好ましく、40℃が最も好ましい。培養温度が40℃のときの培養期間は、好ましくは1〜20日である。
液体培養の場合は、培地としてmodified Czapek-Dox medium (3% soluble starch or glucose, 0.1% NaNO3, 0.05% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4/7H2O, 0.001% FeSO4, pH 6.0)などを用い、培養温度は２０〜５０℃で１日〜５日培養する。本発明においては、培養温度は20℃〜50℃が好ましく、35℃〜45℃がさらに好ましく、40℃が最も好ましい。培養温度が40℃のときの培養期間は、好ましくは1〜20日である。
続いて、培養物からスフィンゴ脂質を抽出し、採取する。その際、特に液体培養の場合は培養物を遠心又は濾過することにより適宜濃縮する。これにより、培養物から実質的に水分が除去された水分除去品（乾燥品）を得ることができる。
抽出後のスフィンゴ脂質の分析は、前記の通り薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー及び質量分析（LC/MS、GC/MS、CE-MS MS、HPLC 光散乱検出法）などを適宜組み合わせて行なうことができる。
本発明の方法（麹菌の培養）により得られたスフィンゴ脂質としては、セラミド、糖結合型スフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴシン塩基等であり、その収量は、原料1ｇあたり1〜10mgである。
As the culture of koji mold, either solid culture or liquid culture can be adopted.
In the case of solid culture, steamed rice, steamed barley, or the like is used as the medium, and the culture temperature is 20 to 50 ° C. for 1 to 5 days. In the present invention, the culture temperature is preferably 30 ° C to 50 ° C, more preferably 30 ° C to 45 ° C, and most preferably 40 ° C. The culture period when the culture temperature is 40 ° C. is preferably 1 to 20 days.
For liquid culture, modified Czapek-Dox medium (3% soluble starch or glucose, 0.1% NaNO 3 , 0.05% KCl, 0.1% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 / 7H 2 O, 0.001% FeSO 4 , pH 6.0) and the like, and culture at a temperature of 20 to 50 ° C. for 1 to 5 days. In the present invention, the culture temperature is preferably 20 ° C to 50 ° C, more preferably 35 ° C to 45 ° C, and most preferably 40 ° C. The culture period when the culture temperature is 40 ° C. is preferably 1 to 20 days.
Subsequently, sphingolipids are extracted from the culture and collected. At that time, particularly in the case of liquid culture, the culture is concentrated as appropriate by centrifugation or filtration. Thereby, a moisture-removed product (dried product) from which the moisture has been substantially removed from the culture can be obtained.
Analysis of sphingolipids after extraction is performed by appropriately combining thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and mass spectrometry (LC / MS, GC / MS, CE-MS MS, HPLC light scattering detection method) as described above. be able to.
Examples of the sphingolipid obtained by the method of the present invention (culture of Aspergillus) include ceramide, sugar-linked sphingolipid, sphingophospholipid, sphingosine base, and the like, and the yield is 1 to 10 mg per 1 g of the raw material.
４．スフィンゴ脂質及びその用途
本発明の方法によって得られたスフィンゴ脂質は、飲食品、化粧品又は保湿剤の添加物として用いることができ、飲食品、化粧品又は保湿剤の製造工程又は製造後に添加又は配合することにより得ることができる。
このような飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などとして提供される。
4). Sphingolipids and uses thereof Sphingolipids obtained by the method of the present invention can be used as additives for foods, drinks, cosmetics or moisturizers, and are added or blended after the production process or production of foods, drinks, cosmetics or moisturizers. Can be obtained.
Such foods and drinks are provided as health foods, functional foods, foods for specified health use, dietary supplements, and the like.
飲料としては特に制限されず、例えば、茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、ジュース、スポーツ飲料、牛乳、ヨーグルトなどが挙げられる。
食品としては特に制限されず、例えば、麺類（うどん、そば等）、パン類、菓子類（クッキー、スナック菓子類、煎餅、チョコレート、アイスクリーム、プリン、ゼリー、飴、ガム等）、乳製品（チーズ等）、冷凍食品、魚肉練り製品（ハム、ソーセージ、かまぼこ等）、調味料（味噌、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ等）、各種総菜類などが挙げられる。
但し、飲食品は上記例示品に限定されるものではない。
The beverage is not particularly limited, and examples thereof include tea, black tea, oolong tea, coffee, juice, sports beverage, milk, yogurt and the like.
The food is not particularly limited. For example, noodles (udon, soba, etc.), breads, confectionery (cookies, snacks, rice crackers, chocolate, ice cream, pudding, jelly, rice cake, gum, etc.), dairy products (cheese) Etc.), frozen foods, fish paste products (ham, sausage, kamaboko, etc.), seasonings (miso, soy sauce, dressing, mayonnaise, etc.), various prepared vegetables and the like.
However, the food and drink are not limited to the above-described examples.
また、化粧品としては、ファンデーション、メイクアップ化粧品、パック、クリーム（コールドクリーム、ナイトクリーム、バニシングクリーム、ハイゼニッククリーム、栄養クリーム、ホルモンクリーム、クレンジングクリーム、ハンドクリーム、リップクリーム等）、乳液、化粧水などが挙げられる。
飲食品や化粧品中に含めるスフィンゴ脂質の量は特に限定されるものではないが、例えば300mgあたり1μg〜 100μg、好ましくは30μg〜80μg、さらに好ましくは60μgである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
Cosmetics include foundations, makeup cosmetics, packs, creams (cold cream, night cream, burnishing cream, hyzenic cream, nutritional cream, hormone cream, cleansing cream, hand cream, lip balm, etc.), milky lotion, lotion Etc.
The amount of sphingolipid to be included in the food / beverage products and cosmetics is not particularly limited, but is, for example, 1 μg to 100 μg, preferably 30 μg to 80 μg, more preferably 60 μg per 300 mg.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
試料は大麦焼酎粕を用いた。
焼酎粕を100℃で加熱することにより水分を除去（乾燥）した0.3gの試料（水分含量：０％）を得た。この試料を2.0mlのchloroform/methanol (1:1)で抽出し、2.0mlの0.8M KOH-methanolと混ぜ、42℃で30分incubateし、さらに5mlのchloroformと2.25mlの蒸留水と混ぜて2000rpm, 5min遠心し下層のorganic phaseを取り、これを抽出脂質とした。
抽出されたスフィンゴ脂質を、Silica gel TLCで展開し、orcinol-sulfateで検出した。位置の確認にはスフィンゴ糖脂質の一種である精製牛脳セレブロシドを用いた。
その結果、セレブロシドとほぼ同じ位置にスポットを検出することができ（図１）、得られたスフィンゴ脂質をHPLC (Inertsil SIL 100A 5 μm, 4.6 ( 250 mm; GL science Inc, Japan) chloroform:95%methanol (0min 100:0, 15min 75:25, 20min 10:90, 40min 100:0)で精製し、その主要なピークをBruker ESI-MS/MSのm/z(736.6)及びMS/MS (162.0, 254.3, 416.3, 416.3)によりセレブロシドのひとつであるD-Glucosyl-b-1,1’-N-2-hydroxylpalmitoyl-4,8-sphingadienineと同定した。
Barley shochu was used as a sample.
A 0.3 g sample (water content: 0%) from which moisture was removed (dried) by heating the shochu at 100 ° C. was obtained. Extract this sample with 2.0ml chloroform / methanol (1: 1), mix with 2.0ml 0.8M KOH-methanol, incubate at 42 ℃ for 30 minutes, and then mix with 5ml chloroform and 2.25ml distilled water. Centrifugation was performed at 2000 rpm for 5 min to take the lower organic phase, which was used as extracted lipid.
The extracted sphingolipid was developed with Silica gel TLC and detected with orcinol-sulfate. To confirm the position, purified bovine brain cerebroside, a kind of glycosphingolipid, was used.
As a result, it was possible to detect a spot at almost the same position as cerebroside (Fig. 1), and the resulting sphingolipid was HPLC (Inertsil SIL 100A 5 μm, 4.6 (250 mm; GL science Inc, Japan) chloroform: 95% Purified with methanol (0min 100: 0, 15min 75:25, 20min 10:90, 40min 100: 0), and the major peaks were analyzed using Bruker ESI-MS / MS m / z (736.6) and MS / MS (162.0 , 254.3, 416.3, 416.3), it was identified as D-Glucosyl-b-1,1'-N-2-hydroxylpalmitoyl-4,8-sphingadienine, which is one of cerebrosides.
次にその量の評価を行ったところ、乾燥重量として焼酎粕1g中に4.2-6.3 mgのスフィンゴ脂質が含まれることを明らかにした。
本結果により、焼酎粕にスフィンゴ脂質が含まれることが初めて明らかになり、さらにそれは大豆などこれまで報告されているスフィンゴ脂質源よりも多いスフィンゴ脂質を含んでいることが明らかとなった（図2）。
Next, when the amount was evaluated, it was clarified that 4.2 to 6.3 mg of sphingolipid was contained in 1 g of shochu as a dry weight.
The results revealed for the first time that shochu contains sphingolipids, and that it contains more sphingolipids than so far reported sphingolipid sources such as soybean (Fig. 2). ).
現在スフィンゴ脂質源として利用されている大豆のスフィンゴ脂質含有量は約1.7 mg/gである(cerebroside相当量、Vesper et al., J. Nutrition, 1239-1250, 1999)。従って、焼酎粕には大豆に含まれるスフィンゴ脂質の約3.1倍のスフィンゴ脂質が含まれており、焼酎粕はスフィンゴ脂質の好適な供給源となることが示された。 The sphingolipid content of soybean currently used as a sphingolipid source is about 1.7 mg / g (corresponding to cerebroside, Vesper et al., J. Nutrition, 1239-1250, 1999). Therefore, shochu contains about 3.1 times the amount of sphingolipids contained in soybean, indicating that shochu is a suitable source of sphingolipids.
本実施例では、大麦焼酎粕の原料である麦、麦麹及び焼酎酵母を用いて、大麦焼酎粕における脂質源の探索を行った。
実施例１と同様の方法で麦、麦麹及び焼酎酵母の乾燥試料（水分含量：0%）よりスフィンゴ脂質を抽出し、展開及び検出を行った。なお、麦麹作製の際には焼酎製造に用いられる白麹菌（Aspergillus kawachii）を使用し、焼酎酵母は協会焼酎用酵母２号を用いた。
結果を図３に示す。
図３より、焼酎粕に見られたスフィンゴ脂質はセレブロシドであり、主に麹菌由来であることが判明した。
In this example, the search for a lipid source in barley shochu was conducted using barley, wheat straw and shochu yeast, which are raw materials for barley shochu.
Sphingolipids were extracted from dried samples of barley, wheat straw and shochu yeast (water content: 0%) in the same manner as in Example 1, and developed and detected. In addition, when producing wheat straw, white birch (Aspergillus kawachii) used for shochu production was used, and association shochu yeast 2 was used as shochu yeast.
The results are shown in FIG.
From FIG. 3, it was found that the sphingolipid found in the shochu was cerebroside and was mainly derived from Aspergillus.
本実施例は、焼酎麹菌を培養してスフィンゴ脂質を製造した例である。
米または麦にその重さの３０％分を吸水させ、30分蒸し、室温まで放冷した後に麹菌（Aspergillus kawachii）を接種して３０℃で３日培養した。
培養後、培養物を遠心（3000×ｇ、5分）し、沈殿物を100℃で加熱することにより水分を除去し、乾燥させた。乾燥した0.3gの試料（水分含量：０％）を2.0mlのchloroform/methanol (1:1)で抽出し、2.0mlの0.8M KOH-methanolと混ぜ、42℃で30分incubateし、さらに5mlのchloroformと2.25mlの蒸留水と混ぜて2000rpm, 5min遠心し下層のorganic phaseを取り、これを抽出脂質とした。
抽出されたスフィンゴ脂質を、Silica gel TLCで展開し、orcinol-sulfateで検出した。
位置の確認にはスフィンゴ糖脂質の一種である精製牛脳セレブロシドを用いた。
その結果、セレブロシドと似た位置にスポットを検出することができ（図４）、採取されたスフィンゴ脂質はcerebrosideであることが判明した。
In this example, sphingolipids were produced by culturing shochu bacteria.
Rice or wheat was allowed to absorb 30% of its weight, steamed for 30 minutes, allowed to cool to room temperature, inoculated with Aspergillus kawachii, and cultured at 30 ° C. for 3 days.
After the culture, the culture was centrifuged (3000 × g, 5 minutes), and the precipitate was heated at 100 ° C. to remove moisture and dried. Extract 0.3g of dried sample (water content: 0%) with 2.0ml of chloroform / methanol (1: 1), mix with 2.0ml of 0.8M KOH-methanol, incubate at 42 ℃ for 30 minutes, and further 5ml Chloroform and 2.25 ml of distilled water were mixed and centrifuged at 2000 rpm for 5 min to take the organic phase of the lower layer, which was used as the extracted lipid.
The extracted sphingolipid was developed with Silica gel TLC and detected with orcinol-sulfate.
To confirm the position, purified bovine brain cerebroside, a kind of glycosphingolipid, was used.
As a result, a spot could be detected at a position similar to cerebroside (FIG. 4), and the collected sphingolipid was found to be cerebroside.
本実施例では、試料は大麦焼酎粕を用いた。
焼酎粕を遠心分離（3000rpm, 5min）で液体と固体に分け、水分含有量を２０％にまで低めた。その後エタノールで固体部を5分間撹拌し、1日室温で置いた。エタノール分を乾固しTLC解析に供した。
結果を図５に示す。
図５において、レーン4は水分を除去してからエタノール抽出してエタノール部分を乾固したもの、レーン「大麦焼酎かす」はクロロホルム・メタノールで抽出したものを表す。Rf値5.5付近（赤丸で囲まれた部分）にcerebrosideに相当するバンドが認められた。
図５の結果は、焼酎粕を水分除去し、エタノール抽出することにより効率的にスフィンゴ脂質を抽出できることを示している。
In this example, barley shochu was used as the sample.
The shochu was separated into liquid and solid by centrifugation (3000 rpm, 5 min), and the water content was reduced to 20%. The solid portion was then stirred for 5 minutes with ethanol and left at room temperature for 1 day. The ethanol content was dried and subjected to TLC analysis.
The results are shown in FIG.
In FIG. 5, lane 4 is obtained by removing water and then extracting with ethanol to dry the ethanol portion, and lane “barley shochu lees” is extracted with chloroform / methanol. A band corresponding to cerebroside was observed near the Rf value of 5.5 (the part surrounded by a red circle).
The result of FIG. 5 shows that sphingolipid can be extracted efficiently by removing water from the shochu and extracting with ethanol.
本発明は、飲食品、化粧品又は保湿剤としての用途を有するスフィンゴ脂質の製造に有用である。 The present invention is useful for the production of sphingolipids having uses as foods and drinks, cosmetics or moisturizers.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012090774A JP6085847B2 (en) | 2011-04-15 | 2012-04-12 | Method for producing sphingolipid |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011091384 | 2011-04-15 | ||
| JP2011091384 | 2011-04-15 | ||
| JP2012090774A JP6085847B2 (en) | 2011-04-15 | 2012-04-12 | Method for producing sphingolipid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012228246A true JP2012228246A (en) | 2012-11-22 |
| JP6085847B2 JP6085847B2 (en) | 2017-03-01 |
Family
ID=47430378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012090774A Active JP6085847B2 (en) | 2011-04-15 | 2012-04-12 | Method for producing sphingolipid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6085847B2 (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014147348A (en) * | 2013-02-01 | 2014-08-21 | Saga Univ | Sphingolipid and its production method |
| JP2014205634A (en) * | 2013-04-12 | 2014-10-30 | ニチモウ株式会社 | External preparation for skin |
| JP2015140325A (en) * | 2014-01-30 | 2015-08-03 | 福岡県 | Collagenase inhibitor, and cosmetic composition and functional food which contain collagenase inhibitor |
| JP2015232072A (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-24 | 共栄化学工業株式会社 | Cosmetic |
| JP2016042803A (en) * | 2014-08-20 | 2016-04-04 | 宮崎県 | Method for producing sphingolipid by koji mold culture using shochu lees as culture medium |
| JP2016220617A (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-28 | 丸善製薬株式会社 | Method for producing ceramide-containing composition |
| JP2019129737A (en) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | 学校法人金沢工業大学 | Production method of resistant protein and glucosylceramide containing object |
| JP2020172544A (en) * | 2020-07-22 | 2020-10-22 | 丸善製薬株式会社 | Method for producing ceramide-containing composition |
| JP2021013355A (en) * | 2019-07-16 | 2021-02-12 | 株式会社ファーメンステーション | Method for producing cosmetic raw material, food raw material or supplement raw material, and cosmetic raw material, food raw material or supplement raw material produced by the same |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3142737B2 (en) * | 1995-04-17 | 2001-03-07 | ミサワホーム株式会社 | Rising frame |
| JP2012041518A (en) * | 2010-07-23 | 2012-03-01 | Miyanabe Masakatsu | Sphingolipid and method for obtaining sphingolipid |
-
2012
- 2012-04-12 JP JP2012090774A patent/JP6085847B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3142737B2 (en) * | 1995-04-17 | 2001-03-07 | ミサワホーム株式会社 | Rising frame |
| JP2012041518A (en) * | 2010-07-23 | 2012-03-01 | Miyanabe Masakatsu | Sphingolipid and method for obtaining sphingolipid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6016012108; ニューフードインダストリー、２０１０年、５２巻、４号、４９〜５６頁 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014147348A (en) * | 2013-02-01 | 2014-08-21 | Saga Univ | Sphingolipid and its production method |
| JP2014205634A (en) * | 2013-04-12 | 2014-10-30 | ニチモウ株式会社 | External preparation for skin |
| JP2015140325A (en) * | 2014-01-30 | 2015-08-03 | 福岡県 | Collagenase inhibitor, and cosmetic composition and functional food which contain collagenase inhibitor |
| JP2015232072A (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-24 | 共栄化学工業株式会社 | Cosmetic |
| JP2016042803A (en) * | 2014-08-20 | 2016-04-04 | 宮崎県 | Method for producing sphingolipid by koji mold culture using shochu lees as culture medium |
| JP2016220617A (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-28 | 丸善製薬株式会社 | Method for producing ceramide-containing composition |
| JP2019129737A (en) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | 学校法人金沢工業大学 | Production method of resistant protein and glucosylceramide containing object |
| JP2021013355A (en) * | 2019-07-16 | 2021-02-12 | 株式会社ファーメンステーション | Method for producing cosmetic raw material, food raw material or supplement raw material, and cosmetic raw material, food raw material or supplement raw material produced by the same |
| JP2020172544A (en) * | 2020-07-22 | 2020-10-22 | 丸善製薬株式会社 | Method for producing ceramide-containing composition |
| JP7029825B2 (en) | 2020-07-22 | 2022-03-04 | 丸善製薬株式会社 | Method for Producing Ceramide-Containing Composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6085847B2 (en) | 2017-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6085847B2 (en) | Method for producing sphingolipid | |
| Chua et al. | Evaluation of five commercial non-Saccharomyces yeasts in fermentation of soy (tofu) whey into an alcoholic beverage | |
| Zhao et al. | Potential use of peanut by-products in food processing: a review | |
| Jacob et al. | Comparison of various industrially applicable disruption methods to produce yeast extract using spent yeast from top-fermenting beer production: influence on amino acid and protein content | |
| Panesar et al. | Production of microbial pigments utilizing agro-industrial waste: a review | |
| Namgung et al. | Metabolite profiling of doenjang, fermented soybean paste, during fermentation | |
| Cai et al. | Evaluation of γ-aminobutyric acid, phytate and antioxidant activity of tempeh-like fermented oats (Avena sativa L.) prepared with different filamentous fungi | |
| Li et al. | A systematic review to identify biomarkers of intake for fermented food products | |
| Bartkiene et al. | Changes of bioactive compounds in barley industry by‐products during submerged and solid state fermentation with antimicrobial Pediococcus acidilactici strain LUHS29 | |
| US20140148504A1 (en) | Novel use of flavone-based compound | |
| Sahin et al. | Fermented Spirulina products with Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts: Special reference to their microbial, physico-chemical and sensory characterizations | |
| US9376416B2 (en) | Composition containing scirpusin B, and process for producing composition containing scirpusin B | |
| Di Cagno et al. | Novel fermented fruit and vegetable-based products | |
| Takakuwa et al. | Determination of glucosylceramide contents in crop tissues and by-products from their processing | |
| Kurt et al. | Influence of different bacteria species in chemical composition and sensory properties of fermented Spirulina | |
| Sharma et al. | Characterization and cytotoxic activity of pigment extracted from Rhodotorula mucilaginosa to assess its potential as bio-functional additive in confectionary products | |
| Lee et al. | Metabolomics reveal optimal grain preprocessing (milling) toward rice koji fermentation | |
| Singh et al. | Spent coffee ground: transformation from environmental burden into valuable bioactive metabolites | |
| JP2011042628A (en) | Aquaporin production promoter | |
| Dhar et al. | Pineapple waste-based-biorefinery for sustainable generation of value-added products | |
| Peñas et al. | Microwave-assisted extraction of plant proteins | |
| Sun et al. | Volatile compound dynamics in oats solid-state fermentation: A comparative study of Saccharomyces cerevisiae A3, Lactococcus lactis 4355, and Lactobacillus plantarum 2329 inoculations | |
| KR100418687B1 (en) | METHOD FOR PREPARING KIMCHI CONTAINING γ- AMINO BUTYLIC ACID IN GREAT QUANTITIES | |
| Zhao et al. | Development of gamma-aminobutyric acid–enriched germinated rice products | |
| Grumezescu et al. | Soft chemistry and food fermentation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120516 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120605 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150401 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20150401 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150406 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160404 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160603 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160926 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161110 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161219 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170113 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6085847 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |