JP2012223197A - 核酸分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法のためには、総プローブ数が一定であることと、光学分解能以上の距離に最低限の数の反応場がある必要がある。従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、1個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を10倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、90%以上の標的核酸は反応場に1個だけハイブリし、複数の標的核酸が1つの反応場にハイブリする確率は10%以下となる。
【選択図】図1
Description
従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、1個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を10倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、90%以上の標的核酸は反応場に1個だけハイブリし、複数の標的核酸が1つの反応場にハイブリする確率は10%以下となる。
の条件を満足することにより、前記反応場に1個の標的核酸を捕捉する核酸分析デバイス;
ただし、
であり;
[X]はプローブと標的核酸の複合体濃度、[A]は複合体形成前のプローブ濃度、[B]は複合体形成前の標的核酸濃度であり;
プローブ数をa、標的核酸数をb、反応場数をc、プローブと標的核酸との平衡定数をK、アボガドロ数をNA、反応液量をv(ml)とするものを説明する。
反応場の比を10倍以上にすることにより、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、90%以上の標的核酸は反応場に1個だけハイブリし、複数の標的核酸が1つの反応場にハイブリする確率は10%以下となるからである。例えば、1細胞中のmRNAは40万個であることから、反応場数は400万個以上あると良い。仮に反応場数を4000万個として、1反応場あたりのプローブ数を10,100,1000個とすると、ハイブリ効率は39.7%,86.8%,98.5%と計算される。また、1標的核酸/反応場となる標的核酸の割合、つまり有効ハイブリ効率は、それぞれ39.5%,86.1%,97.5%となる。
102〜104 反応場
105 プローブ
106〜108 プローブにハイブリした標的核酸
109 プローブにハイブリしていない標的核酸
601 カバープレート
602 検出窓
603 注入口
604 排出口
605 デバイス
606 YAGレーザ光源(波長532nm,出力20mW)
607 YAGレーザ光源(波長355nm,出力20mW)
608,609 レーザ光
610 λ/4板
611 ダイクロイックミラー
612 レンズ
613 プリズム
614 対物レンズ
615 光学フィルタ
616 結像レンズ
617 2次元CCDカメラ
Claims (6)
- 複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、400万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の10倍以上であり、
プローブの数は、1反応場あたり100〜1000個であることを特徴とする、核酸分析方法。 - 請求項1において、
各反応場間の距離が200nm以上であることを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項1において、
前記標的核酸が、mRNA,miRNA,cDNA,DNAのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項1において、
前記標的核酸が、非増幅の核酸であることを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項1において、
前記プローブが、オリゴヌクレオチド,DNA断片,RNA断片,PNA,抗体,ペプチドのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。 - 複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、発光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた発光色素の発光を測定する発光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、400万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の10倍以上であり、
プローブの数は、1反応場あたり100〜1000個であることを特徴とする、核酸分析方法。
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---|---|---|---|---|
WO2018185871A1 (ja) * | 2017-04-05 | 2018-10-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸増幅方法および核酸解析用装置 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007525977A (ja) * | 2004-02-18 | 2007-09-13 | インテル・コーポレーション | 単一分子の分離、配置、およびシークエンシング |
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- 2012-07-23 JP JP2012162257A patent/JP5651643B2/ja not_active Expired - Fee Related
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WO2018185871A1 (ja) * | 2017-04-05 | 2018-10-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸増幅方法および核酸解析用装置 |
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