JP2012217421A - Lna modified heptamer-type small guide nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的として切断するRNAを転写する遺伝子発現を効果的に抑制または消失させ、かつ生体内安定性に優れていることによって、その遺伝子発現等を原因とする疾患の治療または予防に有効なヘプタマー型スモールガイド核酸に関するものである。 The present invention effectively suppresses or eliminates the expression of a gene that transcribes RNA that is cleaved as a target, and is excellent in in vivo stability, so that it is effective in treating or preventing a disease caused by the gene expression or the like. It relates to a small heptamer type small guide nucleic acid.
本発明の発明者らは、TRUEジーンサイレンシング(tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing)と名付けた新しい遺伝子発現抑制技術を開発している(特許文献1、非特許文献1−4)。tRNase ZLは、tRNAの3’をプロセシングするエンドリボヌクレアーゼ(tRNase Zまたは3’tRNase)の分子量の大きい種類の酵素であり、前駆体tRNAの3’末端部を切除する(特許文献1、非特許文献5、6)。このTRUEジーンサイレンシングは、標的RNAと合成スモールガイド核酸とによって形成されるpre-tRNA様またはマイクロpre-tRNA様複合体を認識することによって、いかなるRNAの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物tRNase ZLのユニークな酵素的特性に基づいている(非特許文献7−13)。スモールガイド核酸(特にスモールガイドRNA)は、以下の4種:5’-half tRNA(非特許文献8)、〜12-16-nt直鎖RNA(非特許文献13)、ヘプタマー型RNA(非特許文献9)およびフック型RNA(非特許文献12)に分けられる(図1)。 The inventors of the present invention, TRUE gene silencing (tR Nase Z L - u tilizing ef ficacious gene silencing) is developing a new gene silencing technology named (Patent Document 1, Non-Patent Document 1-4) . tRNase Z L is an enzyme having a large molecular weight of endoribonuclease (tRNase Z or 3'tRNase) that processes 3 'of tRNA, and excises the 3' end of precursor tRNA (Patent Document 1, Non-patent) Literature 5, 6). This TRUE gene silencing can cleave any portion of RNA by recognizing the pre-tRNA-like or micro-pre-tRNA-like complex formed by the target RNA and the synthetic small guide nucleic acid Based on the unique enzymatic properties of mammalian tRNase Z L (Non-patent Documents 7-13). The small guide nucleic acid (especially small guide RNA) includes the following 4 types: 5′-half tRNA (Non-patent Document 8), ˜12-16-nt linear RNA (Non-patent Document 13), heptamer RNA (non-patent) Reference 9) and hook-type RNA (Non-patent Document 12) (FIG. 1).
発明者らは、様々なmRNAを標的とするスモールガイド核酸(以下、sg核酸と記載することがある)を、その発現プラスミドまたは2’-O-メチル RNAsを導入することによって、様々な哺乳動物細胞におけるTRUEジーンサイレンシングの有効性を実証している(非特許文献1−4)。例えば、Jurkat細胞におけるHIV-1発現は、5’-half tRNA型sgRNAによって18日間以上抑制され(非特許文献2)、マウス肝臓におけるルシフェラーゼ発現はヘプタマー型sg核酸によって抑制された(非特許文献3)。さらに、TRUEジーンサイレンシングの効果は、RNA干渉(RNA interference: RNAi)と同等であり(非特許文献3、14)、幾つかの場合ではRNAiの効果を凌ぐことも確認されている(非特許文献4)。 The inventors have introduced a small guide nucleic acid (hereinafter sometimes referred to as sg nucleic acid) targeting various mRNAs into various mammals by introducing its expression plasmid or 2′-O-methyl RNAs. It demonstrates the effectiveness of TRUE gene silencing in cells (Non-Patent Documents 1-4). For example, HIV-1 expression in Jurkat cells was suppressed by 5′-half tRNA-type sgRNA for 18 days or longer (Non-patent Document 2), and luciferase expression in mouse liver was suppressed by heptamer-type sg nucleic acid (Non-patent Document 3). ). Furthermore, the effect of TRUE gene silencing is equivalent to RNA interference (RNA interference: RNAi) (Non-Patent Documents 3 and 14), and in some cases, it has been confirmed that it exceeds the effect of RNAi (Non-Patent Documents). Reference 4).
また最近、発明者らは、tRNase ZLが核内だけでなくサイトゾルにも存在すること、そしてsg核酸として使用していたのと同一の5’-half tRNAが細胞質に存在することを見出している(非特許文献15)。また、発明者らは、ヒトサイトゾルtRNase ZLが、5’-half tRNAの指揮のもとでmRNAを切断することによって遺伝子発現を調節すること、そしてPPM1F mRNAがtRNase ZLの真の標的の一つであることを見出している(非特許文献15)。さらにまた、発明者らは、miR-103を含むマイクロRNAの一部がフック型sg核酸として働き、サイトゾルtRNase ZLによるmRNA切断を介して遺伝子発現を下方調節しえることを証明している(非特許文献16)。以上のことから、TRUEジーンサイレンシングは、細胞内の小さな非コードRNAによって作動されるサイトゾルtRNase ZLの新たに解明された生理学的役割を基礎として機能していることは明らかである。 Recently, the inventors have found that tRNase Z L is present not only in the nucleus but also in the cytosol, and that the same 5′-half tRNA used as sg nucleic acid is present in the cytoplasm. (Non-patent Document 15). We also found that human cytosolic tRNase Z L regulates gene expression by cleaving mRNA under the direction of 5'-half tRNA, and PPM1F mRNA is the true target of tRNase Z L (Non-patent Document 15). Furthermore, the inventors have demonstrated that part of the microRNA containing miR-103 acts as a hook-type sg nucleic acid and can down-regulate gene expression via mRNA cleavage by cytosolic tRNase Z L (Non-patent document 16). From the above, it is clear that TRUE gene silencing functions on the basis of the newly elucidated physiological role of cytosolic tRNase Z L operated by small non-coding RNA in cells.
TRUEジーンサイレンシングの最終的な目的の一つは、特定遺伝子の発現を原因とする疾患治療剤または予防剤としてのsg核酸の使用である。例えば、発明者らは既に、ガン治療の分子標的として有望視されているBcl-2およびVEGFをコードする細胞内mRNAレベルが、5’-half tRNA型sg核酸、14-nt直鎖型sg核酸またはヘプタマー型sg核酸によって発現抑制されることを見出している(非特許文献1、4、17)。 One of the ultimate goals of TRUE gene silencing is the use of sg nucleic acid as a therapeutic or prophylactic agent for diseases caused by the expression of specific genes. For example, the inventors have already reported that intracellular mRNA levels encoding Bcl-2 and VEGF, which are regarded as promising molecular targets for cancer therapy, are 5′-half tRNA type sg nucleic acid, 14-nt linear type sg nucleic acid. Alternatively, it has been found that expression is suppressed by heptamer-type sg nucleic acid (Non-Patent Documents 1, 4, and 17).
sg核酸を薬剤成分とする場合、薬理学的な視点からは、ヘプタマー型sg核酸が最も好ましい。何故ならば、ヘプタマー(7塩基核酸)は長鎖のsg核酸よりも遙かに簡便かつ安価に合成することができる。また、ヘプタマー型sg核酸は、刺激剤(トランスフェクション試薬等)を用いることなく容易に細胞内に取込ませることができる(非特許文献18)。 When sg nucleic acid is used as a drug component, heptamer type sg nucleic acid is most preferable from a pharmacological viewpoint. This is because heptamers (7-base nucleic acids) can be synthesized much more easily and cheaply than long sg nucleic acids. In addition, heptamer-type sg nucleic acid can be easily taken into cells without using stimulants (such as transfection reagents) (Non-patent Document 18).
なお、ヘプタマー型sg核酸は、tRNase ZLによる標的RNAの切断誘導能や生体内での安定性の向上を目的として、様々な化学的修飾が検討されている。発明者らはかつて、2’-O-メチル RNA、ホスホロチオエートRNA、DNAおよびホスホロチオエートDNAについて調べた結果、酵素に対する各々の切断誘導能と安定性から、2’-O-メチル修飾したsg核酸がTRUEジーンサイレンシングのためには最も好ましいとの結論を得ている(非特許文献1)。 Various chemical modifications of heptamer-type sg nucleic acids have been studied for the purpose of improving the ability to induce cleavage of target RNA by tRNase Z L and in vivo stability. The inventors previously investigated 2′-O-methyl RNA, phosphorothioate RNA, DNA, and phosphorothioate DNA. As a result, the 2′-O-methyl-modified sg nucleic acid was found to be TRUE due to its ability to induce cleavage and stability to the enzyme. It has been concluded that it is most preferable for gene silencing (Non-patent Document 1).
一方、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid:LNA)の出現が、核酸研究に広範な影響を及ぼしている(非特許文献19、20)。すなわち、LNAは生体安定性と温度安定性の両方を核酸に付与するため、アンチセンスRNAやsiRNAの化学修飾として利用されている。
ヘプタマー型sg核酸を薬剤成分とする場合の一つの課題は、生体内に投与された場合にその主効果(tRNase ZLによる標的RNAの切断誘導)が持続的に発揮されるように、生体安定性および温度安定性を向上させることである。このような課題に対して、アンチセンスRNAやsiRNAに対する修飾として実績のあるLNA修飾は有望であると考えられる。 One challenge when using heptamer-type sg nucleic acid as a drug component is that the main effect (induction of target RNA cleavage by tRNase Z L ) is sustained when administered in vivo. And improve temperature stability. For such problems, LNA modification, which has been proven as a modification to antisense RNA and siRNA, is considered promising.
しかしながら、LNA修飾によってヘプタマー型sg核酸の主効果(tRNase ZLによる標的RNAの切断誘導)がどのように変容するかは一切知られていない。仮に、LNA修飾によってヘプタマー型sg核酸の主効果が大幅に損なわれることがあれば、LNA修飾による安定性の向上は薬剤成分としてのsg核酸においては好ましいものでない。 However, it is not known at all how the main effect of heptamer-type sg nucleic acid (induction of cleavage of target RNA by tRNase Z L ) is altered by LNA modification. If the main effect of the heptamer-type sg nucleic acid is greatly impaired by LNA modification, the stability improvement by LNA modification is not preferable for sg nucleic acid as a drug component.
本願発明は、ヘプタマー型sg核酸の主効果と安定性との観点から、ヘプタマー型sg核酸が生体内でその主効果を最大限に発揮することのできるLNA修飾条件を提供することによって、ヘプタマー型sg核酸の薬剤成分としての価値をさらに向上させることを課題としている。 The present invention provides a heptamer type sg nucleic acid from the viewpoint of the main effect and stability of the heptamer type sg nucleic acid by providing LNA modification conditions that allow the heptamer type sg nucleic acid to exert its main effect to the maximum in vivo. It is an object to further improve the value of sg nucleic acid as a drug component.
本発明は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
(1)標的RNAの少なくとも連続5塩基と相補的な塩基配列を含む7塩基からなり、その配列中の1から4塩基がLNA(locked nucleic acid)修飾されており、細胞内においてtTNaseZLの作用により標的RNAを切断することによってこの標的RNAを転写する遺伝子の活性を低下または消滅させるヘプタマー型スモールガイド核酸。
(2)LNA修飾された塩基以外の塩基が2’-Oメチル化修飾されている前記(1)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(3)標的RNAが疾患に関連する遺伝子から転写されたRNAである前記(1)または(2)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(4)疾患に関連する遺伝子がガンの発症に関連する遺伝子である前記(3)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(5)前記(3)または(4)のヘプタマー型スモールガイド核酸の有効量を含有する薬剤。
The present invention provides the following inventions for solving the above-mentioned problems.
(1) It consists of 7 bases including a base sequence complementary to at least 5 consecutive bases of the target RNA, and 1 to 4 bases in that sequence are LNA (locked nucleic acid) modified, and the action of tTNaseZ L in the cell A heptamer-type small guide nucleic acid that reduces or eliminates the activity of a gene that transcribes the target RNA by cleaving the target RNA.
(2) The heptamer type small guide nucleic acid according to (1), wherein a base other than the LNA-modified base is 2′-O methylated.
(3) The heptamer type small guide nucleic acid according to (1) or (2), wherein the target RNA is RNA transcribed from a gene associated with a disease.
(4) The heptamer type small guide nucleic acid according to (3) above, wherein the gene associated with the disease is a gene associated with the onset of cancer.
(5) A drug containing an effective amount of the heptamer type small guide nucleic acid of (3) or (4).
本発明(1)によれば、標的RNAの切断効率を許容範囲内に維持し、かつ、生体内での安定性に極めて優れてたヘプタマー型スモールガイド核酸が提供される。このヘプタマー型スモールガイド核酸は、薬剤成分として生体内に投与した場合に、その優れた安定性により標的RNAの切断効果を最大限に発揮することができる。 According to the present invention (1), a heptamer type small guide nucleic acid that maintains the target RNA cleavage efficiency within an allowable range and is extremely excellent in vivo stability is provided. When this heptamer type small guide nucleic acid is administered in vivo as a drug component, it is possible to maximize the target RNA cleavage effect due to its excellent stability.
本発明(2)によれば、LNA修飾塩基以外の塩基がさらに2’-Oメチル化修飾されているため、標的RNAの切断効率がさらに優れたヘプタマー型スモールガイド核酸が提供される。 According to the present invention (2), since a base other than the LNA-modified base is further 2'-O methylated, a heptamer-type small guide nucleic acid with further excellent target RNA cleavage efficiency is provided.
本発明(3)から(5)によれば、例えばガン等の疾患治療または予防のための手段が提供される。 According to the present invention (3) to (5), a means for treating or preventing a disease such as cancer is provided.
本発明(1)のヘプタマー型スモールガイド核酸は、標的RNAの少なくとも連続5塩基と相補的な塩基配列を含む7塩基からなり、その配列中の1から4塩基がLNA(locked nucleic acid)修飾されている。 The heptamer type small guide nucleic acid of the present invention (1) consists of 7 bases including a base sequence complementary to at least 5 consecutive bases of the target RNA, and 1 to 4 bases in the sequence are modified with LNA (locked nucleic acid). ing.
LNAは、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋した人工核酸であり、例えば、2′-O-4′C-methylene-β-D-ribofuranoseを含む核酸である。 LNA is an artificial nucleic acid in which 2'-position oxygen atom and 4'-position carbon atom are bridged via methylene, for example, nucleic acid containing 2'-O-4'C-methylene-β-D-ribofuranose. is there.
標的RNAは、その発現を抑制または消失させる対象となる遺伝子(標的遺伝子)の転写産物RNA、特にmRNAである。標的遺伝子の発現抑制とは、その遺伝子から転写合成されるタンパク質量が、25%以下、好ましくは50%以下、さらに好ましくは75%以下、特に好ましくは95%以下に低減することである。標的遺伝子は、その発現抑制または発現消失が産業上の利用価値を有する遺伝子であり、とくにその遺伝子の発現亢進が特定の疾患の原因となるような遺伝子(以下、病原遺伝子と記載することがある)。そのような病原遺伝子の例としては、例えば、ras、erbb2、myc、apc;brca1、rb、Bcl-2、BGEF癌遺伝子、レニンなどの高血圧に関与する遺伝子、インスリンなどの糖尿病関連遺伝子、LDLレセプターなどの高脂血症関連遺伝子、レプチンなどの肥満関連遺伝子、アンギオテンシンなどの動脈硬化疾患関連遺伝子、痴呆の原因として知られているアポリポタンパク質およびプレセリニン、老化に関連する遺伝子などが例示される。これらの遺伝子およびそのmRNA配列は公知のデータベース(NCBIヌクレオチドデータベース等)において公知である。 The target RNA is a transcript RNA of a gene (target gene) to be suppressed or eliminated, particularly mRNA. The expression suppression of the target gene means that the amount of protein transcribed and synthesized from the gene is reduced to 25% or less, preferably 50% or less, more preferably 75% or less, particularly preferably 95% or less. A target gene is a gene whose suppression or loss of expression has industrial utility value, and in particular, a gene whose enhanced expression causes a specific disease (hereinafter sometimes referred to as a pathogenic gene) ). Examples of such pathogenic genes include, for example, ras, erbb2, myc, apc; brca1, rb, Bcl-2, BGEF oncogene, genes involved in hypertension such as renin, diabetes-related genes such as insulin, LDL receptor Examples include hyperlipidemia-related genes such as leptin, obesity-related genes such as leptin, arteriosclerotic disease-related genes such as angiotensin, apolipoproteins and preserinin known to cause dementia, genes associated with aging, and the like. These genes and their mRNA sequences are known in known databases (such as the NCBI nucleotide database).
ヘプタマー型sg核酸は、塩基対合を介して標的RNAとtRNAアクセプターステム様二重鎖を形成することによって、tRNase ZLによる標的RNAの特異的切断を可能とするため、ヘプタマー型sg核酸の標的部位は、tRNA T-armに類似する安定したヘアピン構造領域の直下となり、ヘプタマー型sg核酸はその7塩基だけでなく、安定したヘアピン構造を形成する約12塩基の特異性によって効果的にRNAを切断する。従って、ヘプタマー型sg核酸の塩基配列は、これらの標的遺伝子のmRNA配列情報から決定することができる。 The heptamer-type sg nucleic acid forms a tRNA acceptor stem-like duplex with the target RNA through base pairing, thereby enabling specific cleavage of the target RNA by tRNase Z L. The target site is directly under the stable hairpin structure region similar to tRNA T-arm, and the heptamer-type sg nucleic acid is not only 7 bases, but also RNA by the specificity of about 12 bases forming a stable hairpin structure. Disconnect. Therefore, the base sequence of heptamer type sg nucleic acid can be determined from the mRNA sequence information of these target genes.
配列を決定したヘプタマー型sg核酸は、公知の化学合成を用いる方法、あるいは酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)やNTS H-6核酸合成機(日本テクノサービス社製)、Oligoilot10核酸合成機(GEヘルスケア製)により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有するプラスミドまたはDNAを鋳型として、T7、T3、SP6RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。合成法または転写法により製造したヘプタマー型sg核酸は、次いでHPLC等にて精製する。例えばHPLC精製時には、triethylammonium acetate (TEAA)またはhexylammonium acetate(HAA)とacetonitrileの混合溶液を用いて、ヘプタマー型sg核酸をカラムから溶出する。その後、溶出体積の1000倍量の蒸留水で溶出溶液を10時間透析し、透析溶液を凍結乾燥した後、使用時まで冷凍保存する。使用時には蒸留水で最終濃度が100 μM程度になるように溶解する。 The heptamer-type sg nucleic acid whose sequence has been determined can be produced by a method using known chemical synthesis, an enzymatic transcription method or the like. Known methods using chemical synthesis include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, and the like. For example, ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesizer (Applied Biosystems) or NTS H- 6Nucleic acid synthesizer (manufactured by Nippon Techno Service), Oligolot 10 nucleic acid synthesizer (GE Healthcare) Examples of the enzymatic transcription method include transcription using RNA polymerase such as T7, T3, and SP6 RNA polymerase using a plasmid or DNA having a target base sequence as a template. The heptamer sg nucleic acid produced by the synthesis method or transcription method is then purified by HPLC or the like. For example, during HPLC purification, heptamer-type sg nucleic acid is eluted from the column using a mixed solution of triethylammonium acetate (TEAA) or hexalamonium acetate (HAA) and acetonitrile. Then, the elution solution is dialyzed for 10 hours with distilled water 1000 times the elution volume, and the dialysis solution is freeze-dried and stored frozen until use. When used, dissolve in distilled water to a final concentration of about 100 μM.
本発明のヘプタマー型sg核酸に用いられるLNA修飾核酸以外の核酸としては、ヌクレオチドまたはそのヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよい。ヌクレオチドとしては、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAおよびDNAが混合した重合体、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体が、それぞれあげられる。特にRNAが好ましい。 The nucleic acid other than the LNA-modified nucleic acid used for the heptamer-type sg nucleic acid of the present invention may be any molecule as long as it is a polymer of nucleotides or molecules having functions equivalent to those of the nucleotides. Examples of nucleotides include RNA, which is a polymer of ribonucleotides, DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotides, a polymer in which RNA and DNA are mixed, and a nucleotide polymer containing nucleotide analogs. RNA is particularly preferable.
ヌクレオチド類似体としては、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、RNAまたはDNAに修飾を施した分子を挙げるこことができる。例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。 Nucleotide analogs include, for example, ribonucleotides to improve or stabilize nuclease resistance, to increase affinity with complementary strand nucleic acids, to increase cell permeability, or to be visualized compared to RNA or DNA. , Deoxyribonucleotides, RNA or DNA modified molecules. Examples thereof include sugar moiety-modified nucleotide analogs and phosphodiester bond-modified nucleotide analogs.
糖部修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’−O−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−[2−(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid:ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、およびペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等をあげることができる。特に、2’−O−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体(2’-Oメチル化修飾された核酸)が好ましい。 The sugar moiety-modified nucleotide analog may be any one obtained by adding or substituting any chemical structural substance to a part or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide. For example, 2'-O-methyl Nucleotide analogues substituted with ribose, nucleotide analogues substituted with 2'-O-propylribose, nucleotide analogues substituted with 2'-methoxyethoxyribose, substituted with 2'-O-methoxyethylribose Nucleotide analogs, nucleotide analogs substituted with 2'-O- [2- (guanidinium) ethyl] ribose, nucleotide analogs substituted with 2'-O-fluororibose, Ethylene bridged structure artificial nucleic acid (Ethylene bridged nucleic acid: ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], and peptide nucleic acids (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 ( 1999)], oxypeptide nucleic acid (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], and peptide ribonucleic acid (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000 )] Etc. In particular, nucleotide analogs substituted with 2'-O-methylribose (nucleic acids modified with 2'-O methylation) are preferred.
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、N3'-P5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる[細胞工学, 16, 1463-1473 (1997)][RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)]。 The phosphodiester bond-modified nucleotide analog may be any one obtained by adding or substituting an arbitrary chemical substance to a part or all of the chemical structure of a phosphodiester bond of a nucleotide. Examples include nucleotide analogues substituted with thioate linkages, nucleotide analogues substituted with N3'-P5 'phosphoramidate linkages [Cell engineering, 16, 1463-1473 (1997)] [RNAi method And Antisense, Kodansha (2005)].
ヌクレオチド類似体としては、その他に、核酸の塩基部分、リボース部分、リン酸ジエステル結合部分等の原子(例えば、水素原子、酸素原子)もしくは官能基(例えば、水酸基、アミノ基)が他の原子(例えば、水素原子、硫黄原子)、官能基(例えば、アミノ基)、もしくは炭素数1〜6のアルキル基で置換されたものまたは保護基(例えばメチル基またはアシル基)で保護されたもの、核酸に、例えば脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加した分子等を用いてもよい。 Other nucleotide analogues include atoms (for example, hydrogen atoms, oxygen atoms) or functional groups (for example, hydroxyl groups, amino groups) of nucleic acid base moieties, ribose moieties, phosphodiester bond moieties, etc. For example, a hydrogen atom, a sulfur atom), a functional group (for example, an amino group), a group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a group protected with a protecting group (for example, a methyl group or an acyl group), a nucleic acid In addition, for example, a molecule to which another chemical substance is added such as lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, and a dye may be used.
核酸に別の化学物質を付加した分子としては、例えば、5’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6−FAM付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等をあげることができる。 Examples of molecules obtained by adding another chemical substance to nucleic acid include 5′-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, Cy3 addition derivatives, and 6-FAM. Examples include addition derivatives, biotin addition derivatives, and the like.
本発明(5)は、前記のヘプタマー型ガイド核酸の有効量を含有する薬剤である。この薬剤は、本発明のヘプタマー型ガイド核酸それ単独で製剤化することもできるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。 The present invention (5) is a drug containing an effective amount of the above heptamer type guide nucleic acid. This drug can be formulated with the heptamer-type guide nucleic acid of the present invention alone, but it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and used in the technical field of pharmaceutics. It is desirable to administer it as a pharmaceutical formulation produced by any well-known method.
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。 It is desirable to use the most effective route for treatment, and oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous is desirable. Can be given intravenously.
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。 Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like. Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives. For capsules, tablets, powders, granules, etc., excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin can be used as additives.
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。 Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like. The injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both. Suppositories are prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid. The spray is prepared using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that facilitates absorption by dispersing the active ingredient as fine particles.
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明で用いる核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。 Specific examples of the carrier include lactose and glycerin. Depending on the nature of the nucleic acid used in the present invention and the carrier used, preparations such as aerosols and dry powders are possible. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10 μg/kg〜20 mg/kgである。 The dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 μg / kg to 20 mg / kg per day for an adult.
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail and concretely, this invention is not limited to the following examples.
LNA修飾したヘプタマー型sgRNAの試験管内での切断活性と安定性試験
(1)材料と方法
(1-1)組換えヒトtRNase ZLの調製
ヒスチジン標識したヒトΔ30 tRNase ZLを、E. coli株Rosetta (DE3) pLysS(Novagen)において発現プラスミドpQE-80L(Quigen)から過剰発現させ、ニッケル−アガロースビーズを用いて精製した(非特許文献15)。
(1-2)RNA合成
標的RNA、T3H:
5’-GAUCAGAAGAUUCCAGGUUCGACUCCUGGCUGGCUCGGUGUAAGCAGGGUCGUUUU-3:配列番号1
はT7 RNAポリメラーゼ(Promega)を用い、対応する合成DNAから合成した(非特許文献8)。転写反応は製造者(Promega)が推奨する条件の下で行ない、RNAは変性ゲル電気泳動で精製した。次いで、T3HのRNA転写産物は製造者(Amersham Pharmacia Biotech)のプロトコールに従い蛍光色素で標識した(非特許文献13)。すなわち、バクテリアアルカリホスファターゼ(Takara Shuzo)でRNA転写産物の5’リン酸を除去したのち、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Takara Shuzo)およびATPγSを用いてRNAをリン酸化した。次いで、単一の蛍光色素部分を5’リン酸化部位に付加し、この蛍光色素標識したRNAをゲル精製した使用した。
Cleavage activity and stability test of LNA-modified heptamer sgRNA in vitro (1) Materials and methods (1-1) Preparation of recombinant human tRNase Z L Histidine-labeled human Δ30 tRNase Z L It was overexpressed from the expression plasmid pQE-80L (Quigen) in Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) and purified using nickel-agarose beads (Non-patent Document 15).
(1-2) RNA synthesis Target RNA, T3H:
5'-GAUCAGAAGAUUCCAGGUUCGACUCCUGGCUGGCUCGGUGUAAGCAGGGUCGUUUU-3: SEQ ID NO: 1
Was synthesized from the corresponding synthetic DNA using T7 RNA polymerase (Promega) (Non-patent Document 8). The transcription reaction was performed under the conditions recommended by the manufacturer (Promega), and RNA was purified by denaturing gel electrophoresis. The T3H RNA transcript was then labeled with a fluorescent dye according to the manufacturer's protocol (Amersham Pharmacia Biotech) (Non-patent Document 13). That is, after removing 5′-phosphate of RNA transcripts with bacterial alkaline phosphatase (Takara Shuzo), RNA was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) and ATPγS. Subsequently, a single fluorescent dye moiety was added to the 5 ′ phosphorylation site, and this fluorescent dye-labeled RNA was used after gel purification.
以下の、5’をリン酸化し、2’-Oメチル化および/またはLNA修飾したsgRNAを化学的に合成した。
hepL0:5′-pGGGCCAG-3′(配列番号2)
hepL2:5′-pGgGCCaG-3′(配列番号3)
hepL3a:5′-pgGgCcAG-3′(配列番号4)
hepL3b:5′-pGgGcCaG-3′(配列番号5)
hepL4:5′-pGgGcCag-3′(配列番号6)
hepL7:5′-pgggccag-3′(配列番号7)
上記の各sgRNAにおいて、大文字は2’-Oメチル化修飾塩基、小文字はLNA修飾塩基を示す。
(1-3)In vitro RNA切断アッセイ
10 mM Tris-HCl(pH 7.5)および15 mM MgCl2を含有する溶液(6 μl)に非標識RNAと組換えヒトΔ30 tRNase ZLを混合し、蛍光色素で標識した標的RNAのin vitro切断アッセイを行なった(非特許文献15、16)。5%または10%のポリアクリルアミド-8 M尿素ゲル上で反応産物を分解した後、Typhoon 9210 (Amersham Pharmacia Biotech)でゲルを分析した。
(1-4)Kd定量のためのゲルシフトアッセイ
ヘプタマー/標的RNA複合体の解離定数を決定するため、蛍光標識したT3H(0.1pmol)を、無標識の各sgRNA(hepL0、hepL2、hepL3a、hepL3b、hepL4、hepL7:各4-100pmol)と37℃で10分間インキュベートした。反応溶液(6 μl)は10 mM Tris-HCl(pH 7.5)および10 mM MgCl2を含む。インキュベーションの後、サンプルは等量のローディングバッファー(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol FF, 50% glycerol)と混合し、次いで、TBEバッファー(90 mM Tris base, 90 mM boric acid, 1.5 mM EDTA, pH 8.3)を用い、8%非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。電気泳動の後、Typhoon 9210を用いて標識化RNAを定量した。同様にして、基質/tRNase ZL複合体の乖離定数をゲルシフトアッセイにより測定した(非特許文献13)。蛍光標識したT3H (0.1 pmol)と各sgRNA(10 pmol)とのRNA複合体は、様々な量(0.5-2 μg)の組換えヒトΔ30 tRNase ZLにより、前記バッファー中で4℃、10分間インキュベートし、前記と同様の方法で分析した。
(2)結果
LNA修飾を含むヘプタマー型sgRNAがヒトtRNase ZLによる標的RNAの切断を誘導するかどうかを調べるため、2から7箇所のLNA修飾核酸を有する5個のヘプタマー型sgRNAを調製し、それぞれの切断誘導能を調べた(図2)。この目的のため、micro-pre-tRNAと類似するヘプタマー/T3H RNA複合体を試験基質として用いた(非特許文献8、13)。ヘプタマー型sgRNAのhepL2、hepL3a、hepL3bおよびhepL4は、それぞれ2-、3-、3-および4-核酸位置がLNA修飾されており、他の核酸の2’リボース炭素はO-メリル化修飾されている(図2A)。hepL7は全核酸がLNA修飾されており、コントロール(hepL0)は全核酸が2′-Oメチル化修飾されている。
The following 5 'phosphorylated, 2'-O methylated and / or LNA modified sgRNA was chemically synthesized.
hepL0: 5'-pGGGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
hepL2: 5'-pGgGCCaG-3 '(SEQ ID NO: 3)
hepL3a: 5′-pgGgCcAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
hepL3b: 5'-pGgGcCaG-3 '(SEQ ID NO: 5)
hepL4: 5′-pGgGcCag-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
hepL7: 5′-pgggccag-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
In each of the above sgRNAs, a capital letter indicates a 2′-O methylation modified base, and a small letter indicates an LNA modified base.
(1-3) In vitro RNA cleavage assay
In vitro cleavage assay of target RNA labeled with fluorescent dye by mixing unlabeled RNA and recombinant human Δ30 tRNase Z L in a solution (6 μl) containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 15 mM MgCl2. (Non-Patent Documents 15 and 16). After digesting the reaction products on a 5% or 10% polyacrylamide-8 M urea gel, the gel was analyzed with Typhoon 9210 (Amersham Pharmacia Biotech).
(1-4) Gel shift assay for Kd quantification To determine the dissociation constant of the heptamer / target RNA complex, fluorescently labeled T3H (0.1 pmol) was added to each unlabeled sgRNA (hepL0, hepL2, hepL3a, hepL3b, hepL4, hepL7: 4-100 pmol each) and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction solution (6 μl) contains 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM MgCl2. After incubation, the sample was mixed with an equal volume of loading buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol FF, 50% glycerol), then TBE buffer (90 Electrophoresis was performed on 8% non-denaturing polyacrylamide gel using mM Tris base, 90 mM boric acid, 1.5 mM EDTA, pH 8.3). After electrophoresis, the labeled RNA was quantified using Typhoon 9210. Similarly, the detachment constant of the substrate / tRNase Z L complex was measured by gel shift assay (Non-patent Document 13). RNA complexes of fluorescently labeled T3H (0.1 pmol) and each sgRNA (10 pmol) were treated with various amounts (0.5-2 μg) of recombinant human Δ30 tRNase Z L in the buffer at 4 ° C. for 10 minutes. Incubated and analyzed in the same manner as described above.
(2) Results
To examine whether heptamer-type sgRNA containing LNA modification induces cleavage of target RNA by human tRNase Z L, 5 heptamer-type sgRNAs having 2 to 7 LNA-modified nucleic acids were prepared, and each cleavage induction The ability was examined (FIG. 2). For this purpose, a heptamer / T3H RNA complex similar to micro-pre-tRNA was used as a test substrate (Non-patent Documents 8 and 13). The heptamer-type sgRNAs hepL2, hepL3a, hepL3b and hepL4 are LNA-modified at the 2-, 3-, 3- and 4-nucleic acid positions, respectively, and the 2 'ribose carbon of other nucleic acids is O-merylated. (FIG. 2A). In hepL7, all nucleic acids are LNA-modified, and in the control (hepL0), all nucleic acids are modified by 2′-O methylation.
RNA切断アッセイは、組換えヒトtRNase ZLを用いて、単一ターンオーバー条件で行なった。hepL2による標的RNA T3Hの切断が観察されたが、その切断率は、hepL0の56%であった(図2B)。全体として、切断率はLNA修飾核酸の増加に伴い減少し、hepL7の切断率はhepL0のわずか8%であった(図2B)。 RNA cleavage assays were performed with recombinant human tRNase Z L under single turnover conditions. Although cleavage of the target RNA T3H by hepL2 was observed, the cleavage rate was 56% of hepL0 (FIG. 2B). Overall, the cleavage rate decreased with increasing LNA modified nucleic acid, and the cleavage rate of hepL7 was only 8% of hepL0 (FIG. 2B).
次に、全反応中の各ステップがどのように切断効率に影響するかを明らかにするため、ヘプタマー型sgRNA/標的RNA複合体の解離定数、および基質/tRNase ZL複合体の解離定数を決定し、切断効率定数を調べた。ヘプタマー型sgRNA/標的RNA複合体の解離定数はゲルシフトアッセイにより決定し、これら複合体の有効濃度はそれらの推定された解離定数を用いた算出した。観察された切断効率定数は、基質の推定された有効濃度に基づき、単一ターンオーバー条件で得た。基質/tRNase ZL複合体の解離定数はまた、ヘプタマー型sgRNA/標的RNA複合体の推定された乖離定数を用いて、ゲルシフトアッセイにより決定した。 Next, in order to clarify how each step in the entire reaction affects the cleavage efficiency, the dissociation constant of the heptamer sgRNA / target RNA complex and the dissociation constant of the substrate / tRNase Z L complex were determined. Then, the cutting efficiency constant was examined. The dissociation constants of heptamer-type sgRNA / target RNA complexes were determined by gel shift assay, and the effective concentrations of these complexes were calculated using their estimated dissociation constants. Observed cleavage efficiency constants were obtained under single turnover conditions based on the estimated effective concentration of the substrate. The dissociation constant of the substrate / tRNase Z L complex was also determined by gel shift assay using the estimated dissociation constant of the heptamer sgRNA / target RNA complex.
hepL2/T3H複合体に対するKd値(0.39 μM)はhepL0/T3H複合体に対するそれ(0.44 μM)と比肩するものであった。全体として、ヘプタマー型sgRNA/標的RNA複合体のKd値はLNA修飾の数が増加するに従って増加し、hepL7/T3H複合体では3.43 μM以上であった(表1)。同様に、hepL2-T3H/tRNase ZL複合体のKd値(0.40μM)はhepL0-T3H/tRNase ZL複合体のそれ(0.32 μM)と比肩するものでった。基質/酵素複合体のKd値は、LNA修飾の数が増加するに従って増加し、hepL7-T3H/tRNase ZLでは2.89 μM以上であった(表1)。hepL0/T3H複合体のkobs値は0.40 min-1であり、hepL2/T3H複合体は0.20 min-1であるのに対して、他の複合体のkobs値は0.05 min-1以下に低下した(表1)。 The Kd value (0.39 μM) for the hepL2 / T3H complex was comparable to that for the hepL0 / T3H complex (0.44 μM). Overall, the Kd value of the heptamer sgRNA / target RNA complex increased as the number of LNA modifications increased and was greater than 3.43 μM for the hepL7 / T3H complex (Table 1). Similarly, hepL2-T3H / tRNase Z L Kd value of the complex (0.40) was De' those comparable with that of hepL0-T3H / tRNase Z L complex (0.32 [mu] M). The Kd value of the substrate / enzyme complex increased as the number of LNA modifications increased, and was 2.89 μM or more for hepL7-T3H / tRNase Z L (Table 1). The hepsL0 / T3H complex has a kobs value of 0.40 min -1 and the hepL2 / T3H complex has a value of 0.20 min -1 , whereas the kobs value of other complexes has decreased below 0.05 min -1 ( Table 1).
以上の詳細な分析に基づけば、各ステップがどのように切断効率に影響するかを理解することができる(図2B)。hepL2によるT3Hの切断効率が、hepL0による切断効率の56%に減少したことは、kobs値が50%に減少したことに依存していると思われる(表1)。hepL3a、hepL3bおよびhepL4によるT3H切断効率が18-22%に減少したことは、ヘプタマー/T3H複合体のKd値が32〜70%に増加した、基質/tRNase ZL複合体のKd値が3倍以上に増加したこと、そしてkobs値が10%以下に減少したことが原因であると考えられる(表1)。hepL7による切断効率が8%まで劇的に減少したことは、hepL7/T3H複合体のKd値が8倍に増加し、基質/tRNase ZL複合体のKd値が9倍に増加し、そしてKobs値が13%に減少したことが原因であると考えられる(表1)。 Based on the above detailed analysis, we can understand how each step affects cutting efficiency (Figure 2B). The decrease in the cleavage efficiency of T3H by hepL2 to 56% of the cleavage efficiency by hepL0 seems to depend on the decrease in kobs value to 50% (Table 1). The decrease in T3H cleavage efficiency by hepL3a, hepL3b and hepL4 to 18-22% means that the Kd value of the heptamer / T3H complex has increased to 32-70%, and the Kd value of the substrate / tRNase Z L complex has tripled. This is thought to be due to the increase above and the kobs value decreasing to 10% or less (Table 1). The dramatic reduction in cleavage efficiency by hepL7 by 8% increased the Kd value of the hepL7 / T3H complex by 8 times, the Kd value of the substrate / tRNase Z L complex by 9 times, and Kobs It is thought that this is because the value decreased to 13% (Table 1).
以上のとおり、LNA修飾したヘプタマー型RNAは、tRNase ZL用のsgRNAとして機能することが示された。ただし、切断効率としてみたそれらの有効性は、全体として、LNA修飾数の増加とともに減少し、ヘプタマー型sgRNA/標的RNA複合体のKd値、基質/tRNase ZL複合体のKd値、およびKobs値に影響を及ぼした(図2、表1)。 As described above, it was shown that LNA-modified heptamer RNA functions as sgRNA for tRNase Z L. However, their effectiveness in terms of cleavage efficiency generally decreases with increasing number of LNA modifications, Kd value of heptamer sgRNA / target RNA complex, Kd value of substrate / tRNase Z L complex, and Kobs value. (Fig. 2, Table 1).
しかしながら、血清および生細胞におけるLNA修飾化ヘプタマー型RNAの高い安定性を考慮すれば、試験した2〜4 LNA修飾したヘプタマー型sgRNAの切断効率が18〜56%に減少することは、それらを薬剤成分として使用する場合に十分な許容範囲である。 However, considering the high stability of LNA-modified heptamer RNA in serum and living cells, the cleavage efficiency of the tested 2-4 LNA-modified heptamer sgRNA is reduced to 18-56%, which When used as a component, the tolerance is sufficient.
LNA修飾したヘプタマー型sgRNAの細胞内安定性試験
(1)方法
ヒト293細胞、KMM-1細胞、またはHeLa細胞(0.8-1 X 105細胞/ウエル)を、24ウエルプレートにてheptamer型sgRNA(1 μM)を加えた培地で培養した。ヘプタマー型sgRNAは、いずれも3’末端をFITC標識した、
hepL0:5′-pGGGCCAG-3′(配列番号2)
hepL3b:5′-pGgGcCaG-3′(配列番号5)
を用いた。
LNA modified heptamer type SgRNA intracellular stability test (1) Methods Human 293 cells, KMM-1 cells or HeLa cells (0.8-1 X 10 5 cells / well), Heptamer type in 24-well plates SgRNA, ( 1 μM) was added to the medium. All heptamer-type sgRNAs are FITC-labeled at the 3 ′ end,
hepL0: 5'-pGGGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
hepL3b: 5'-pGgGcCaG-3 '(SEQ ID NO: 5)
Was used.
培養24時間後に細胞を集めPBSにて4回洗浄した。その後、細胞から全RNAをISOGENを用いて抽出し、20%ポリアクリルアミドー8 Mウレアゲル上で分離した。ゲルはTyphoon9210にて解析した。
(2)結果
図3に示されているように、LNA修飾されたヘプタマー型sgRNA(LNA)は、2′-O-メチル化のみのものよりも細胞内でより安定に存在できることが確認された。
After 24 hours of culture, the cells were collected and washed 4 times with PBS. Thereafter, total RNA was extracted from the cells using ISOGEN and separated on a 20% polyacrylamide-8 M urea gel. The gel was analyzed with Typhoon9210.
(2) Results As shown in FIG. 3, it was confirmed that LNA-modified heptamer-type sgRNA (LNA) can exist more stably in cells than those of only 2′-O-methylation. .
本発明によって、例えば、特定遺伝子の過剰発現を原因とする疾患の有効な治療薬剤の有効成分としの安定性に優れたヘプタマー型sg核酸が提供される。 According to the present invention, for example, a heptamer-type sg nucleic acid having excellent stability as an active ingredient of an effective therapeutic agent for a disease caused by overexpression of a specific gene is provided.
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