JP2012177686A - 細胞解析装置及び細胞解析方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Abstract
【解決手段】受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置の受光面に、試料中の細胞を捕捉可能なマイクロキャビティアレイを具備するマイクロ流路デバイスが構築された細胞解析装置。
【選択図】図1
Description
しかしながら、一つの撮像素子上に複数個の細胞が収容されてしまうことを避けること、全48,000撮像素子上に細胞を収容することは困難であった。
(1)受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置の受光面に、試料中の細胞を捕捉可能なマイクロキャビティアレイを具備するマイクロ流路デバイスが構築された細胞解析装置。
(2)前記マイクロ流路デバイスが、撮像装置の受光面に載置され、撮像装置の受光面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料貯留溝を形成するための開口窓が設けられた下部基板と、
前記下部基板の上面に積層載置され、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔と、試料溶液を供給排出するための貫通孔を有するマイクロキャビティアレイと、
前記マイクロキャビティアレイの上面にフレームシールを介して積層載置され、該マイクロキャビティアレイの上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部と、該マイクロキャビティアレイの下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部を備え、該マイクロキャビティアレイの微細貫通孔上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓が設けられた上部平板、を含む上記(1)の細胞解析装置。
(3)マイクロキャビティアレイの微細貫通孔の孔径が2〜20μmで、孔間隔が10〜100μmである上記(2)の細胞解析装置。
(4)上部平板が、プラスチック、ガラス又は金属製である上記(2)又は(3)の細胞解析装置。
(5)上記(1)〜(4)の細胞解析装置を用いて、試料中に含まれる細胞をマイクロキャビティアレイに捕捉し、光照射下、細胞由来のシグナルを撮像することを特徴とする細胞解析方法。
図1(A)及び図2(A)は、本発明の細胞解析装置の組立図であり、図1(B)及び図2(B)はその縦断面図である。この細胞解析装置は、図1及び図2に示すように、撮像装置と、下部基板2、マイクロキャビティアレイ3、フレームシール4、上部平板5を含むマイクロ流路デバイスとを備える。
本発明の細胞解析装置において、撮像装置の受光面に構築されるマイクロ流路デバイスについて以下に説明する。
すなわち、マイクロ流路デバイスは、撮像装置の受光面13に載置された下部基板2と、当該下部基板2の上面に積層載置されたマイクロキャビティアレイ3と、当該マイクロキャビティアレイ3の上面にフレームシール4を介して積層載置された上部平板5を含んで構築され、
前記下部基板2には、撮像装置の受光面13と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料液貯留溝を形成するための開口窓12が設けられ、
マイクロキャビティアレイ3には、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔9と、試料溶液を供給排出するための貫通孔8が設けられ、
前記上部平板5は、マイクロキャビティアレイ3の上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部6と、マイクロキャビティアレイ3の下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部7を備え、マイクロキャビティアレイ上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓11が設けられている。
すなわち、細胞を含む試料溶液(細胞懸濁液)が試料注入・吸引部6に注入された場合、試料溶液はマイクロキャビティアレイ上面に供給され、試料注入・吸引部7に接続された吸引手段により吸引することにより、溶液はマイクロキャビティアレイの微細貫通孔9、試料液貯留溝、貫通孔8を順次経由して排出され、このときに細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の上端開口部に1個ずつ捕捉される(図1参照)。一方、細胞を含む試料が試料注入・吸引部7から注入された場合は、細胞を含む試料溶液は、下部基板2と撮像装置の受光面13で形成される試料液貯留溝に供給され、試料注入・吸引部6に接続された吸引手段により吸引することにより、細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の下端開口部に1個ずつ捕捉される(図2参照)。
また、当該吸引手段は、試料送出ラインを介して接続しておくことができる。
フレームシール4の形状は、前記上部平板5と同一の形状とすることが好ましいが、少なくともマイクロキャビティアレイ3の微細貫通孔部分と貫通孔8を含む周辺が液密にシールされれば特に限定されない。
微細貫通孔の形状は、反すり鉢状又は円筒状であり、これにより確実に細胞を1細胞レベルで分離・捕捉することが可能となる。
微細貫通孔の上端開口径は、捕捉する細胞の径よりも少し小さい径とされ、2〜20μmとすることができる。また、微細貫通孔の数は、100〜100000、好ましくは1000〜10000である。また、微細貫通孔の中心間の距離を10〜100μm、好ましくは15〜70μm、さらに好ましくは20〜60μmとすることで細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、100000個の微細貫通孔を備えたマイクロキャビティアレイの大きさは、0.8cm×2cm程度になる。
微細貫通孔の孔径及び微細貫通孔の中心間の距離は、各撮像素子のサイズと配列間隔に応じて決めるのが良く、例えば、撮像素子(30μm×30μm)が50μm間隔で整列している場合は、孔径2〜20μm、孔間隔50μmのものを用いるのが良い。
プラスチック製の平板を用いる場合、その材質は、マイクロキャビティアレイに比較して軟質のプラスチックとするのが好ましい。これにより、下部基板とマイクロキャビティアレイとの粘着性(密着性)を高められ、試料液の漏出を防止することができる。
尚、撮像装置に用いる撮像デバイスや照射光波長に応じて、最適なイメージコントラストが得られるように撮像装置上面とマイクロキャビティアレイ間の距離を調整すべく、下部平板の厚さ(高さ)は適宜変更することができる。例えば、25μm〜2000μm、とするのが好ましい。
本発明に用いられる撮像装置は、捕捉された細胞に対して光照射(白色光照射、UV照射等)した場合に、当該細胞由来の光シグナル又は影シグナルを撮像できるものであればよく、例えば、固体撮像デバイスとしてCCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)、ダブルゲート構造のTFT(Thin Film Transistor)等の撮像素子を用いたフォトセンサを用いることができる。
CMOSセンサを用いる場合、検出素子サイズが2〜8μm四方であり、素子数が30万〜1810万のものでカラーイメージングが可能なものが望ましく、例えばDFK130C02, Imaging Source, Germanyなどを挙げることができる。
また、CMOSセンサを用いた蛍光カラーイメージングの際には、センサ受光面へ到達する励起光をセンサ直上で遮蔽する機構を設ける必要がある。これは、マイクロキャビティアレイに捕捉した粒子または細胞に由来する蛍光シグナルのみをセンサで受光するためである。励起光遮蔽機構としては、UVカット薄膜フィルムの利用や酸化チタン膜コーティングを例示できる。
図3は、本発明の細胞解析装置80の構成を示すブロック図である。図3に示すように、細胞解析装置80は、固体撮像デバイスとこれに接続されるトップゲートドライバ74、ボトムゲートドライバ71及びドレインドライバ73と、トップゲートドライバ74、ボトムゲートドライバ71及びドレインドライバ73を介して撮像装置1を制御するコンピュータ81と、コンピュータ81から出力された信号により出力(表示又はプリント)を行う出力装置82と、コンピュータ81により制御される励起光照射装置83と、を備える。
励起光照射装置83は、蛍光色素を励起する励起光を撮像装置1に照射する。
図4は1つのダブルゲートトランジスタ20を示す平面図であり、図5は図4のIV−IV矢視断面図である。図4〜図5に示すように、固体撮像デバイス14は、透明基板17と、ボトムゲート絶縁膜22と、トップゲート絶縁膜29と、保護絶縁膜32と、平坦化膜35とを積層してなり、これらの層間に、複数のボトムゲートライン41、ソースライン42、ドレインライン43、トップゲートライン44、及び、ダブルゲートトランジスタ20を形成するボトムゲート電極21、半導体膜23、チャネル保護膜24、不純物半導体膜25,26、ソース電極27、ドレイン電極28、トップゲート電極31が適宜設けられている。
実施例1 細胞解析装置の構築
フォトリソグラフィー技術を用いて撮像装置1(TFTフォトセンサ)上に高さ25μmの下部基板2を作製した。次に、この下部基板上にマイクロキャビティアレイ3を設置した。この時、TFTフォトセンサの各撮像素子(30μm×30μm)が50μm間隔で整列していることを考慮し、孔径8μm、孔間隔50μmの微細貫通孔9を保持するマイクロキャビティアレイを用いた。続いて、フレームシール4(Frame-Seal Incubation Chambers for In Situ PCR and Hybridization; 9 mm × 9 mm; Bio-Rad)、PDMS製の上部平板5を設置した。最後に、PMMA製クランプを用いてこれら全てを挟み込むことで、細胞解析装置を構築した(図1参照)。
細胞模擬蛍光ビーズ (FluoSpheres Fluorescent Microspheres; 15 μm, ex/em = 365/424 nm; Invitrogen) を用いて、実施例1で構築した細胞解析装置の細胞プロファイリング解析への応用を検討した。
流路にシリンジポンプを接続後、超純水を用いて5倍希釈したBlockmaster CE510で上部平板5の開口窓11とマイクロキャビティアレイ3により形成されるチャンバーを満たし、60分間静置することでチャンバーの親水処理を行った。続いて、試料注入・吸引部7より50 μl/minの流速で溶液を吸引することで蛍光ビーズの導入、並びに微細貫通孔9への捕捉を行った。蛍光ビーズの捕捉後、白色LED (WTU-6060; NISSIN ELECTRONIC CO., LTD.) 光照射下でTFTフォトセンサを用いて光シグナル検出を行った。また、UV照射下 (バンドパスフィルタを設置した露光装置を使用; 292.5 nm; スポットキュア SP9-250DB; USHIO INC.) でもTFTフォトセンサを用いて光シグナル検出を行った(図6)。
白色光照射下での光シグナル検出においては、蛍光ビーズ捕捉前には確認されなかった影シグナルが確認された。また、UV照射下でも、蛍光シグナルが確認された。さらに、影シグナルパターンと蛍光シグナルパターンを比較したところ、ほぼ一致することが確認された(図7)。
以上より、マイクロキャビティアレイ上に捕捉された蛍光ビーズを、白色光照射下での影シグナル及びUV照射下での蛍光シグナルに基づき検出可能であることが確認され、TFTフォトセンサの細胞プロファイリング解析への応用が可能であると考えられた。
JM細胞に対し、一次抗体 (Mouse anti-CD8 IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) 及び二次抗体 (Goat HRP-labeled anti-mouse IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) を用いて免疫染色を行った。実施例1で構築した細胞解析装置を用いて、JM細胞の捕捉・発光検出を以下のように試みた。
まず、試料注入・吸引部7からSuperBlock T20 Blocking Buffer in PBSを注入し、撮像装置の受光面13と協働して形成された試料液貯留溝を当該溶液で満たし、30分間静置することで親水処理を行った。PBSで洗浄後、試料注入・吸引部6から50 μl/minの流速で吸引することで、HRP標識したJM細胞のマイクロキャビティアレイの微細貫通孔9の下端開口部への捕捉を行った(図2参照)。最後に、試料注入・吸引部7から50 μl/minの流速で基質溶液を導入し、TFTフォトセンサを用いて発光シグナル検出を行った。
その結果、局所的な化学発光シグナルが確認された(図8)。これより、細胞をマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の下端開口部に捕捉した場合でも、高効率な細胞の捕捉並びに解析が可能であることが示された。
(1)Micro-partitionを有するTFTフォトセンサを用いた血球細胞捕捉
血球細胞をPBS に懸濁し、細胞濃度を1×103 cells/μLに調製した。PBSで満たしたMicro-partitionを有するTFTフォトセンサを含む細胞解析装置(前記特許文献1)に対し10 μLの細胞懸濁液を導入し、シリンジポンプを用いて流速3 mL/minで3分間細胞懸濁液を送液し、細胞を捕捉した。
この時、細胞捕捉効率は9.5%であり、細胞が収容された全撮像素子の5.4 %は複数の二細胞以上が一素子上に収容されていた。
血球細胞をPBS に懸濁し、細胞濃度を1×103 cells/μLに調製した。マイクロキャビティアレイ3として、10,000 孔の微細貫通孔を持つマイクロキャビティアレイと、250,000孔の微細貫通孔を持つマイクロキャビティアレイを用意し、上部平板5の開口窓11とマイクロキャビティアレイ3により形成されるチャンバーを、10 μLの細胞懸濁液をPBS で満たした。
10,000 孔マイクロキャビティアレイの場合、ペリスタルティックポンプを用いて流速180 μL/minで60秒間、250,000孔アレイの場合、流速450 μL/min で90秒間にわたって細胞捕捉操作を行った。
<結果>
10,000孔マイクロキャビティアレイを用いた場合、細胞捕捉は60秒以内に完了し、単一細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔上に捕捉されていた(図8)。図9は、細胞集積化デバイスへの導入細胞数とマイクロキャビティアレイの微細貫通孔上に捕捉された細胞数との関係を示した図である。1,000 〜 9,000細胞の導入条件では、捕捉効率は76〜94%の間で安定して得られた (r2 = 0.99)。このことから、10,000 孔の微細貫通孔を配したマイクロキャビティアレイを用いることで、103オーダーの細胞数を捕捉することが可能であった。
また、250,000孔マイクロキャビティアレイを用いた場合、細胞捕捉は90秒以内に完了し、導入した血球細胞の80〜90%を捕捉し、等間隔に配列化させることが可能であった(図10)。
さらに、いずれのマイクロキャビティアレイを用いた場合にも、二個以上細胞が捕捉された孔は1%以下であった。
撮像装置として、3.2μm四方の検出素子2048×1536個から構成されるCMOSセンサ (DFK130C02, Imaging Source, Germany) を使用し、この上に下部基板を介してマイクロキャビティアレイを設置した。
マイクロキャビティアレイは直径8μm、孔間距離60μmの貫通孔を保持するもの、又は直径3μm、孔間距離25μmの貫通孔を保持するものを用いた。下部基板はマイクロキャビティアレイとCMOSセンサ保護ガラスの間に、フレームシールにより高さ50μmの間隙を設けるように作製した。さらに、PDMS製の細胞導入用のウェルチャンバー(上部平板)をマイクロキャビティアレイの上に設置した。紫外光源としてはDEEP UVランプ (SPOTCURE SP-9, USHIO, Japan) を使用し、細胞解析装置の上方に設置した。CMOSセンサによる撮像はImaging Source社の制御用ソフトウェア (IC Capture 2.1) を利用して行った。
センサ‐マイクロキャビティアレイ基板間距離及び照射光波長の画像コントラストへの影響を評価するために、蛍光標識細胞模擬粒子 (Flowcheck fluorosphere, Beckman Coulter, USA)を捕捉しUV照射下でイメージングを行った。
はじめにマイクロキャビティアレイをセンサ表面から1100, 1300, 1550, 1800, 2050 μm離した位置に設置した。続いて、細胞導入用ウェルチャンバー(上部平板)に粒子懸濁液を導入し吸引することで粒子をマイクロキャビティアレイに捕捉した。波長を365 nmとした光照射下で、CMOSセンサイメージングを行った。つぎに、HeLa細胞懸濁液200 μlをマイクロキャビティアレイ上に導入した。細胞懸濁液を吸引し、CMOSセンサイメージングを行った。また、同基板上を蛍光顕微鏡観察し、実際の捕捉細胞数を確認した。
CMOSセンサ上に統合したマイクロキャビティアレイに対し、上方から光を照射することで、貫通孔を通過した照射光同士の干渉により生じる格子パターンが可視化された。さらに、細胞が捕捉された貫通孔においては、通過光量の減少により暗く可視化された。同基板表面の蛍光顕微鏡観察像と比較すると、粒子配置と黒色パターン配置が一致していることが確認できた(図12)。種々の検討を行った所、センサ‐マイクロキャビティアレイ基板間距離が短くなるにつれて、黒色パターンのコントラストが増し、S/N比が高くなることが示された(図13)。また、照射光の波長が短いほど、S/N比は高くなった(図14)。従って、この後の実験は距離1100 μm、波長365 nmとして行った。
細胞解析装置のマイクロキャビティアレイ上にHeLa細胞を捕捉して影シグナルイメージングを行ったところ、細胞捕捉位置は黒色パターンで可視化された(図15)。このパターンの配置は、蛍光顕微鏡観察下で確認した細胞局在位置と一致した。さらに、黒色パターンの数をCMOSセンサによる細胞数カウントとして定義し、顕微鏡によるカウントと比較したところ、両者の間に相関関係が得られた。以上より、マイクロキャビティアレイ統合CMOSセンサを用いて、細胞数計測が可能であることが示された。
CMOSセンサの保護ガラスを除去し、センサ受光面を露出させた。マイクロキャビティアレイは直径3 μm、孔間距離25 μmの貫通孔を保持するものを用いた。マイクロキャビティアレイの細胞捕捉面を、UVカットフィルム (T-UV film, TOCHISEN, 厚さ:50 μm) を介して、センサ受光面に接することで蛍光検出系を構築した。また、マイクロキャビティアレイ の35 mm上方に紫外光源を設置し、バンドパスフィルター (FF01-292/15-25, Semrock) を用いて励起光波長を292 nmとした。蛍光標識細胞模擬粒子 (Ex / Em = 488 nm / 586 nm) 懸濁液、Hoechst33342 (Ex / Em = 350 nm / 461 nm) 染色JM細胞懸濁液各200 μLをマイクロキャビティアレイ上に滴下し、溶液を吸引した。粒子または細胞を捕捉したマイクロキャビティアレイを用いて蛍光検出系を構築し、励起光照射下でCMOSセンサイメージングを行った。
蛍光標識粒子またはHoechst33342染色細胞捕捉後のマイクロキャビティアレイに対し、励起光照射下でCMOSセンサイメージングを行ったところ、それぞれ黄色、青色の円形カラーイメージが得られた(図16)。また、円形イメージを横断する直線上におけるシグナル強度の推移を計測した。
その結果、蛍光標識粒子においては赤チャンネル、緑チャンネルのシグナル強度に、Hoechst33342染色細胞においては青チャンネルのシグナル強度にそれぞれピークが確認された。これより、構築した検出系を用いて、粒子及び染色細胞はその蛍光波長に対応したカラーイメージとして撮像可能であることが確認された。
2 下部基板
3 マイクロキャビティアレイ
4 フレームシール
5 上部平板
6 試料注入・吸引部
7 試料注入・吸引部
8 貫通孔
9 微細貫通孔
11 開口窓
12 開口窓
13 受光面
14 固体撮像デバイス
17 透明基板
20 ダブルゲートトランジスタ(光電変換素子)
21 ボトムゲート電極
27 ソース電極
28 ドレイン電極
31 トップゲート電極
32 絶縁膜
41 ボトムゲートライン
42 ソースライン
43 ドレインライン
44 トップゲートライン
Claims (5)
- 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置の受光面に、試料中の細胞を捕捉可能なマイクロキャビティアレイを具備するマイクロ流路デバイスが構築された細胞解析装置。
- 前記マイクロ流路デバイスが、撮像装置の受光面に載置され、撮像装置の受光面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料貯留溝を形成するための開口窓が設けられた下部基板と、
前記下部基板の上面に積層載置され、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔と、試料溶液を供給排出するための貫通孔を有するマイクロキャビティアレイと、
前記マイクロキャビティアレイの上面にフレームシールを介して積層載置され、該マイクロキャビティアレイの上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部と、該マイクロキャビティアレイの下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部を備え、該マイクロキャビティアレイの微細貫通孔上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓が設けられた上部平板、を含む請求項1記載の細胞解析装置。 - マイクロキャビティアレイの微細貫通孔の孔径が2〜20μmで、孔間隔が10〜100μmである請求項2記載の細胞解析装置。
- 上部平板が、プラスチック、ガラス又は金属製である請求項2又は3記載の細胞解析装置。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の細胞解析装置を用いて、試料中に含まれる細胞をマイクロキャビティアレイに捕捉し、光照射下、細胞由来のシグナルを撮像することを特徴とする細胞解析方法。
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