JP2012139211A - Method for producing ethanol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エタノールの生産方法に関する。より詳細には、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。 The present invention relates to a method for producing ethanol. More specifically, the present invention relates to a method for producing ethanol from biomass.
近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず(カーボンニュートラル)、地球温暖化防止に寄与できるからである。 In recent years, alternative fuels are being developed in the face of fear of exhaustion of fossil fuels. In particular, bioethanol derived from biomass has attracted attention. This is because biomass is a renewable resource, exists in large quantities on the earth, and does not increase carbon dioxide in the atmosphere even if it is used (carbon neutral), thereby contributing to the prevention of global warming.
しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。 However, currently produced bioethanol is mainly made from corn and sugarcane, and competition with food is a problem. Therefore, in the future, production of bioethanol using lignocellulosic biomass such as rice straw, wheat straw and waste wood that does not compete with food will be required.
リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの3種類の成分から構成される。このうちセルロースは、加水分解によりグルコースまで分解(糖化)されると、グルコースを資化できる酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などによるエタノール発酵に利用できる。 Lignocellulosic biomass is mainly composed of three components, cellulose, hemicellulose, and lignin. Among these, cellulose can be used for ethanol fermentation by yeast Saccharomyces cerevisiae that can assimilate glucose when it is degraded (saccharified) to glucose by hydrolysis.
従来、前処理法としては、水熱分解法、酸処理法、アルカリ処理法が知られている。酸処理法としては、高温(200℃以上)で希酸を用いる方法と、濃硫酸などを用いる方法とが知られている。しかし、水熱分解法や酸処理法は、過激な条件下でセルロースを部分分解するため、過分解物(副生成物)を生じ、グルコース収率(糖化率)が低いことや、エタノール発酵を阻害する物質をも生じ得ることが問題である。 Conventionally, hydrothermal decomposition methods, acid treatment methods, and alkali treatment methods are known as pretreatment methods. As an acid treatment method, a method using a dilute acid at a high temperature (200 ° C. or higher) and a method using concentrated sulfuric acid are known. However, the hydrothermal decomposition method and acid treatment method partially decompose cellulose under extreme conditions, resulting in excessive decomposition products (by-products), low glucose yield (saccharification rate), and ethanol fermentation. The problem is that it can also produce inhibiting substances.
リグノセルロース系バイオマスの前処理物は酵素処理に供される。酵素処理では、前処理物を構成するセルロース成分やヘミセルロース成分を加水分解し、オリゴ糖や単糖を生成する。しかしながら、糖化に使用する市販の酵素の力価が低いことにより十分な糖化には酵素を大量に必要とするので、コストが高くなるという問題がある。 The pretreated product of lignocellulosic biomass is subjected to enzyme treatment. In the enzyme treatment, the cellulose component and hemicellulose component constituting the pretreated product are hydrolyzed to generate oligosaccharides and monosaccharides. However, since the commercially available enzyme used for saccharification has a low titer, a large amount of enzyme is required for sufficient saccharification.
一方、セルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない酵母サッカロマイセス・セレビシエなどを、生物工学的手法を用いて改変することにより、バイオマスの前処理物から直接エタノールを生産させる試みがなされている。このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が利用されている。例えば、セルロースを加水分解する酵素群、すなわちエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどを表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている(特許文献1)。 On the other hand, attempts have been made to produce ethanol directly from pretreated biomass by modifying yeast Saccharomyces cerevisiae, which cannot inherently assimilate cellulose, hemicellulose, etc., using biotechnological techniques. A cell surface presentation technique is used as such a biotechnological technique. For example, an enzyme group that hydrolyzes cellulose, that is, yeast that surface-displays endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, and the like has been produced by a cell surface display technique (Patent Document 1).
工業上の実用性を鑑みると、上記方法を組み合わせることでエタノールの生産性を向上させるための検討が必要である。特に、酵素処理法によりリグノセルロース系バイオマス前処理物の糖化を一定程度進めつつ、セルロース加水分解酵素群を細胞表層提示した酵母を用いてエタノール発酵させる方法が有力技術として検討されている。しかし、酵素処理のコスト低減が課題となっている。 In view of industrial practicality, it is necessary to study to improve ethanol productivity by combining the above methods. In particular, a method in which ethanol fermentation is carried out using yeast that presents a cellulosic hydrolase group on the cell surface while proceeding to a certain extent with saccharification of lignocellulosic biomass pretreatment products by an enzyme treatment method has been studied as a promising technique. However, reducing the cost of enzyme treatment has become an issue.
本発明は、酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the method of producing ethanol from lignocellulosic biomass at low cost using yeast.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リグノセルロース系バイオマス前処理物を短時間酵素処理して上記酵母の発酵基質とすることにより、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have been able to reduce the cost of lignocellulosic biomass at low cost by subjecting the pretreated product of lignocellulosic biomass to a yeast fermentation substrate for a short time. The inventors have found that ethanol can be produced and completed the present invention.
本発明は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、リグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得る工程、100g−乾燥質量/L以上の固形分含量の該セルロース画分をセルロース加水分解酵素製剤と混合し、0.5〜10時間酵素処理して糖化バイオマスを生成する工程、および酵母を該糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。 The present invention provides a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass, the method comprising a step of obtaining a cellulose fraction from lignocellulosic biomass, the cellulose fraction having a solid content of 100 g-dry mass / L or more. Is mixed with a cellulose hydrolase preparation, and subjected to an enzyme treatment for 0.5 to 10 hours to produce saccharified biomass, and a step of mixing yeast with the saccharified biomass and culturing.
1つの実施態様では、上記酵素処理する時間は、0.5〜8時間である。 In one embodiment, the enzyme treatment time is 0.5 to 8 hours.
1つの実施態様では、上記セルロース画分の固形分含量は、200g−乾燥質量/L以上である。 In one embodiment, the cellulose fraction has a solid content of 200 g-dry weight / L or more.
1つの実施態様では、上記セルロース加水分解酵素製剤は、1〜4FPU/g−乾燥バイオマス前処理物の酵素濃度である。 In one embodiment, the cellulose hydrolase preparation is an enzyme concentration of 1-4 FPU / g-dried biomass pretreatment product.
1つの実施態様では、上記酵母は、少なくとも2種のセルロース加水分解酵素を細胞表層に提示するように形質転換された酵母である。 In one embodiment, the yeast is a yeast transformed to present at least two cellulose hydrolases on the cell surface.
本発明の方法によれば、酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産することができる。 According to the method of the present invention, ethanol can be produced at low cost from lignocellulosic biomass using yeast.
バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜(廃糖蜜)が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスとは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの3種類の成分から構成されるバイオマスをいう。リグノセルロース系バイオマスの利用は、食糧と競合しない点で好ましい。リグノセルロース系バイオマスとしては、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材(パルプ)などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などが挙げられる。例えば、稲ワラ、麦ワラ、廃材が挙げられる。 Biomass refers to a carbohydrate material derived from biological resources. Examples thereof include starch obtained from corn and the like, and molasses (waste molasses) obtained from sugarcane and the like. Lignocellulosic biomass refers to biomass composed mainly of three types of components, cellulose, hemicellulose, and lignin. Use of lignocellulosic biomass is preferable because it does not compete with food. Examples of lignocellulosic biomass include wastes generated when processing biological materials such as rice, wheat, corn, sugarcane, and wood (pulp). For example, rice straw, wheat straw, and waste material are listed.
バイオマスの糖化とは、例えば、グルコース(単糖)を構成単位とするセルロース(多糖体)をグルコースまで分解することをいう。糖化法としては、例えば、水熱分解法、酸処理法、酵素処理法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。酵母サッカロマイセス・セレビシエなどは、グルコースを基質として発酵によりエタノールを生産する。 Saccharification of biomass refers to, for example, decomposing cellulose (polysaccharide) having glucose (monosaccharide) as a structural unit to glucose. Examples of the saccharification method include a hydrothermal decomposition method, an acid treatment method, and an enzyme treatment method. The dilute sulfuric acid method and hydrothermal decomposition method are preferable in terms of cost. Yeast Saccharomyces cerevisiae and the like produce ethanol by fermentation using glucose as a substrate.
糖化バイオマスとは、バイオマス前処理物を糖化処理して得られた組成物をいい、例えば、セルロース(多糖体)の分解により生成したグルコース(単糖)を主成分として含む。 The saccharified biomass refers to a composition obtained by saccharifying a biomass pretreatment product, and includes, for example, glucose (monosaccharide) produced by the decomposition of cellulose (polysaccharide) as a main component.
セルロースとは、β1,4−グルコシド結合によりグルコピラノース(グルコース)が連なった繊維状高分子をいう。 Cellulose refers to a fibrous polymer in which glucopyranose (glucose) is linked by β1,4-glucoside bonds.
セルロース加水分解酵素は、セルロースのβ1,4−グルコシド結合を加水分解する。セルロース加水分解酵素としては、代表的には、エンドβ1,4−グルカナーゼ(以下、単に「エンドグルカナーゼ」という)、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。 Cellulose hydrolase hydrolyzes the β1,4-glucoside bond of cellulose. Examples of cellulose hydrolase include, but are not limited to, endo β1,4-glucanase (hereinafter simply referred to as “endoglucanase”), cellobiohydrolase, and β-glucosidase.
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖(重合度が3以上であり、そして通常、10以下であるが、これに限定されない)を生じる。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解する酵素の代表例である。エンドグルカナーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ(特に、EGII)が挙げられるが、これに限定されない。 Endoglucanase is an enzyme usually called cellulase, which cleaves cellulose from the inside of the molecule, and glucose, cellobiose, and cellooligosaccharide (degree of polymerization is 3 or more, and usually 10 or less, Non-limiting). Endoglucanase is highly reactive to low crystallinity or amorphous cellulose, such as non-crystallized cellulose, soluble cellooligosaccharides, and cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC), but has a crystalline structure Reactivity to cellulose microfibrils is low. Endoglucanase is a representative example of an enzyme that hydrolyzes amorphous cellulose. Examples of endoglucanase include, but are not limited to, Trichoderma reesei-derived endoglucanase (particularly EGII).
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解するが、カルボキシメチルセルロース(CMC)のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する酵素の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅い。セロビオヒドロラーゼには2種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ1およびセロビオヒドロラーゼ2と称される。セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ(特に、CBH2)が挙げられるが、これに限定されない。
Cellobiohydrolase degrades from either the reducing end or non-reducing end of cellulose to release cellobiose. Cellobiohydrolase degrades crystalline cellulose such as cellulose microfibrils with a crystalline structure, but is not reactive to low crystallinity or amorphous cellulose such as cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC). Low. Cellobiohydrolase is a representative example of an enzyme that hydrolyzes crystalline cellulose. Hydrolysis of crystalline cellulose by cellobiohydrolase is slower than hydrolysis of amorphous cellulose by endoglucanase due to the strong structure due to the intermolecular and intramolecular dense hydrogen bonds of crystalline cellulose. . There are two types of cellobiohydrolase, which are called
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−D−グルコースとのβ1,4−グルコシド結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、1種類知られており、β−グルコシダーゼ1と称される。β−グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ(特に、BGL1)挙げられるが、これに限定されない。
β-glucosidase is an exo-type hydrolase that separates glucose units from non-reducing ends in cellulose. β-glucosidase cleaves a β1,4-glucoside bond between an aglycon or sugar chain and β-D-glucose, and hydrolyzes cellobiose or cellooligosaccharide to produce glucose. β-glucosidase is a representative example of an enzyme that hydrolyzes cellobiose or cellooligosaccharide. One type of β-glucosidase is currently known and is referred to as β-
本発明の方法では、まずリグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得る。 In the method of the present invention, a cellulose fraction is first obtained from lignocellulosic biomass.
リグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得る方法は、特に限定されない。例えば、水熱分解法が挙げられる。水熱分解法では、例えば、リグノセルロース系バイオマスを、必要に応じて粉砕し、例えば、約20質量%(乾燥質量)の含量となるように水と混合し、この混合物を熱処理する。熱処理は、120〜300℃、好ましくは150〜280℃、より好ましくは180〜250℃にて、15秒間〜1時間行われる。処理温度および時間は用いるバイオマスによって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、熱処理中に加圧してもよい。 The method for obtaining the cellulose fraction from lignocellulosic biomass is not particularly limited. An example is a hydrothermal decomposition method. In the hydrothermal decomposition method, for example, lignocellulosic biomass is pulverized as necessary, and mixed with water so as to have a content of, for example, about 20% by mass (dry mass), and this mixture is heat-treated. The heat treatment is performed at 120 to 300 ° C., preferably 150 to 280 ° C., more preferably 180 to 250 ° C., for 15 seconds to 1 hour. The treatment temperature and time can vary depending on the biomass used, and increasing the treatment temperature can shorten the treatment time. In addition, you may pressurize during heat processing.
リグノセルロース系バイオマスを水熱分解すると、水溶性のヘミセルロース画分と非水溶性のセルロース画分とが分離する。非水溶性のセルロース画分は、固形分として遠心分離法などにより容易に分離することができる。 When lignocellulosic biomass is hydrothermally decomposed, a water-soluble hemicellulose fraction and a water-insoluble cellulose fraction are separated. The water-insoluble cellulose fraction can be easily separated as a solid content by a centrifugal separation method or the like.
本発明の方法では、次いで100g−乾燥質量/L以上の固形分含量の上記セルロース画分をセルロース加水分解酵素製剤と混合し、0.5〜10時間酵素処理して糖化バイオマスを生成する。 In the method of the present invention, the above cellulose fraction having a solid content of 100 g-dry mass / L or more is then mixed with a cellulose hydrolase preparation and subjected to enzyme treatment for 0.5 to 10 hours to produce saccharified biomass.
一般に、糖化バイオマスの調製において、高含量のリグノセルロース系バイオマス前処理物をセルロース加水分解酵素製剤と混合しても加水分解反応が進まないため、リグノセルロース系バイオマス前処理物を糖化する際の固形分含量は、通常、10〜50g−乾燥質量/Lとする。しかし、本発明の方法では、高含量のリグノセルロース系バイオマス前処理物を用いても糖化および後の工程のエタノール発酵に支障がなく、むしろコスト低減の観点から高含量のリグノセルロース系バイオマス前処理物を用いることが好ましい。リグノセルロース系バイオマス前処理物の固形分含量は、100g−乾燥質量/L以上、好ましくは200g−乾燥質量/L以上である。 Generally, in the preparation of saccharified biomass, the hydrolysis reaction does not proceed even if a high-content lignocellulosic biomass pretreatment product is mixed with a cellulose hydrolase preparation. The content is usually 10 to 50 g-dry mass / L. However, in the method of the present invention, even if a high content lignocellulosic biomass pretreatment product is used, there is no hindrance to saccharification and ethanol fermentation in the subsequent process, but rather a high content lignocellulosic biomass pretreatment from the viewpoint of cost reduction. It is preferable to use a product. The solid content of the lignocellulosic biomass pretreatment product is 100 g-dry mass / L or more, preferably 200 g-dry mass / L or more.
本発明で用いるセルロース加水分解酵素製剤は、上記セルロース加水分解酵素を含む製剤であれば、特に限定されない。市販の酵素製剤が用いられるが、酵素産生微生物などを培養して調製したものを用いてもよい。セルロース加水分解酵素の活性は、1分間にろ紙(Filter Papar:ワットマン社製No.1フィルター)から1μmolのグルコースを遊離する酵素量(1FPU)で表される。一般に、糖化バイオマスの調製において、セルロースの加水分解に用いる酵素製剤は、セルロースを効率よく加水分解するために、30FPU/g−乾燥バイオマス前処理物以上の高酵素濃度で用いる必要がある。しかし、本発明の方法では、必要なセルロース加水分解酵素の濃度は、1〜4FPU/g−乾燥バイオマス前処理物である。 The cellulose hydrolase preparation used in the present invention is not particularly limited as long as it is a preparation containing the cellulose hydrolase. Commercially available enzyme preparations are used, but those prepared by culturing enzyme-producing microorganisms or the like may be used. The activity of cellulose hydrolase is expressed as the amount of enzyme (1 FPU) that liberates 1 μmol of glucose from filter paper (Filter Paper: No. 1 filter manufactured by Whatman) per minute. In general, in preparation of saccharified biomass, an enzyme preparation used for hydrolysis of cellulose needs to be used at a higher enzyme concentration than 30 FPU / g-dried biomass pretreatment product in order to efficiently hydrolyze cellulose. However, in the method of the present invention, the required cellulose hydrolase concentration is 1 to 4 FPU / g-dried biomass pretreatment product.
一般に、糖化バイオマスの調製において、酵素処理には、セルロースをグルコースまで完全に加水分解するために、2日間〜数日間要する。しかし、本発明の方法では、0.5〜10時間、好ましくは0.5〜8時間、より好ましくは0.5〜6時間である。酵素処理の温度は、酵素が働く温度であれば、特に限定されない。好ましくは、40〜80℃である。本発明では、酵素処理によりセルロース画分がスラリー状になる。 In general, in the preparation of saccharified biomass, the enzyme treatment requires 2 days to several days in order to completely hydrolyze cellulose to glucose. However, in the method of the present invention, it is 0.5 to 10 hours, preferably 0.5 to 8 hours, more preferably 0.5 to 6 hours. The temperature of the enzyme treatment is not particularly limited as long as the enzyme works. Preferably, it is 40-80 degreeC. In the present invention, the cellulose fraction becomes a slurry by enzyme treatment.
本発明では、次いで酵母を上記糖化バイオマスと混合し、培養する。酵母は、グルコースを基質としてエタノール発酵し得る限り、特に限定されない。野生株酵母であってもよく、好ましくはセルロース加水分解酵素を細胞表層に提示するように形質転換された酵母であり、より好ましくは上記エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼの3種のセルロース加水分解酵素のうち、少なくとも2種のセルロース加水分解酵素を細胞表層に提示するように形質転換された酵母であり、さらに好ましくは3種のセルロース加水分解酵素を細胞表層に提示するように形質転換された酵母である。酵素処理が、上記セルロース加水分解酵素を含む製剤を用いて行われる限り、上記3種のセルロース加水分解酵素のうち、細胞表層に提示する酵素は特に限定されない。 In the present invention, the yeast is then mixed with the saccharified biomass and cultured. Yeast is not particularly limited as long as ethanol can be fermented with glucose as a substrate. It may be a wild-type yeast, preferably a yeast transformed so as to present cellulose hydrolase on the cell surface, more preferably three kinds of celluloses of the endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase. Among the hydrolases, the yeast is transformed so as to present at least two types of cellulose hydrolase on the cell surface, and more preferably transformed so as to present the three types of cellulose hydrolase on the cell surface. Yeast. As long as the enzyme treatment is performed using a preparation containing the cellulose hydrolase, the enzyme presented on the cell surface layer among the three types of cellulose hydrolase is not particularly limited.
このような形質転換酵母の作製法は、特に限定されない。例えば、特許文献1に示される方法が挙げられる。より簡潔に記載すると、グルコースを基質としてエタノール発酵し得る酵母サッカロマイセス・セレビシエなどの野生株に、上記エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼの遺伝子を導入することにより作製される。
A method for producing such a transformed yeast is not particularly limited. For example, the method shown by
上記糖化バイオマスと混合する際の、酵母の菌体濃度は、特に限定されない。好ましくは、25〜100g−湿重量/L程度である。酵母の培養条件は、特に限定されない。通常、グルコースを基質としてエタノール発酵する際の条件でよい。培養温度は、例えば、30〜35℃である。 The concentration of yeast cells when mixed with the saccharified biomass is not particularly limited. Preferably, it is about 25-100 g-wet weight / L. Yeast culture conditions are not particularly limited. Usually, the conditions for ethanol fermentation using glucose as a substrate may be used. The culture temperature is, for example, 30 to 35 ° C.
本発明の方法では、短時間で発酵を終了させることができるため、培養時間は、通常、2〜3日間である。 In the method of the present invention, since the fermentation can be completed in a short time, the culture time is usually 2 to 3 days.
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
(実施例1)
(工程1:稲ワラの水熱処理)
稲ワラを約20質量%(乾燥質量)の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置(三菱重工業株式会社製)に入れ、約180℃および約3MPaにて5〜20分間処理した。次いで、固形分を分離し、発酵基質として用いた。
Example 1
(Process 1: Hydrothermal treatment of rice straw)
Rice straw is mixed with water to a content of about 20% by mass (dry mass), and this is put into a hydrothermal treatment apparatus (manufactured by Mitsubishi Heavy Industries, Ltd.) and treated at about 180 ° C. and about 3 MPa for 5 to 20 minutes. did. The solid was then separated and used as a fermentation substrate.
(工程2:酵素処理)
工程1で得られた稲ワラ水熱処理固形分を含む酵素処理液を調製した。その組成を表1に示す。
(Step 2: Enzyme treatment)
The enzyme treatment liquid containing the rice bran hydrothermal solid content obtained in
この酵素処理液を50mL容量のプラスチック製試験管(コーニング社製)に入れ、サーモブロックローテーター(株式会社日伸理化製SN−06BN)を用いて、50℃にて35rpmの回転速度で酵素処理を行った。 This enzyme treatment solution is put into a 50 mL capacity plastic test tube (Corning), and the enzyme treatment is performed at a rotation speed of 35 rpm at 50 ° C. using a thermoblock rotator (SN-06BN manufactured by Nisshin Rika Corporation). went.
(工程3:エタノール発酵1)
発酵には、酵母サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株(野生株)、ならびにセルロース加水分解酵素、すなわちエンドグルカナーゼ(EG)、セロビオヒドラーゼ(CBH2)およびβグルコシダーゼ(BGL)を細胞表層提示した形質転換酵母(NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL:特許文献1)を用いた。NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGLの染色体には、3コピーのエンドグルカナーゼII、3コピーのセロビオヒドロラーゼ2、および1コピーのβ−グルコシダーゼ1の遺伝子が組み込まれている。
(Process 3: Ethanol fermentation 1)
For fermentation, yeast Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 strain (wild strain), and transformed yeast displaying cell surface layers of cellulose hydrolases, ie, endoglucanase (EG), cellobiohydrase (CBH2) and β-glucosidase (BGL) ( NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL: Patent Document 1) was used. The NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL chromosome incorporates 3 copies of endoglucanase II, 3 copies of
上記酵母について、5mLのYPD液体培地(酵母エキス10g/L,ポリペプトン20g/L,グルコース20g/L)を含む試験官で種培養を一晩行い、次いで培養液を500mLのYPD液体培地を含むフラスコに移し、本培養を2日間行った。この培養液を遠心分離し(3000rpm,4℃,10分間)、酵母菌体を滅菌蒸留水により2度洗浄後、500g−湿重量/Lの菌体濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁した。 For the above yeast, seed culture is performed overnight in a tester containing 5 mL of YPD liquid medium (yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, glucose 20 g / L), and then the culture solution is a flask containing 500 mL of YPD liquid medium. The main culture was performed for 2 days. This culture solution is centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), the yeast cells are washed twice with sterilized distilled water, and then suspended in sterilized distilled water to a cell concentration of 500 g-wet weight / L. did.
工程2の酵素処理開始から2時間経過後、酵素処理液に上記酵母懸濁液2mLを添加して、菌体濃度を100g−湿重量/Lとした。酵母添加後、35℃にて発酵を開始した。発酵開始の際に、上記プラスチック製試験管の蓋を、ガス排出孔(0.6×32mm)を設けたシリコン栓(アズワン株式会社,9号)に変えた。 After 2 hours from the start of the enzyme treatment in Step 2, 2 mL of the yeast suspension was added to the enzyme treatment solution to adjust the cell concentration to 100 g-wet weight / L. After yeast addition, fermentation was started at 35 ° C. At the start of fermentation, the lid of the plastic test tube was changed to a silicon stopper (ASONE Corporation, No. 9) provided with a gas discharge hole (0.6 × 32 mm).
発酵液中のグルコース濃度および生産されたエタノール濃度を、HPLC(High performance liquid chromatographyシステム;株式会社島津製作所製10Aシステム)により経時的に定量した。HPLCの分離用カラムにはShim−pack,SPR−Pb(株式会社島津製作所製,250L×7.8)を用い、移動相には超純水(日本ミリポア株式会社製Milli−Qによる精製水)を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。HPLCの条件は、送液量0.6mL/分およびカラム温度80℃とした。その結果を図1に示す。 The glucose concentration in the fermentation broth and the ethanol concentration produced were quantified over time by HPLC (High performance liquid chromatography system; Shimadzu Corporation 10A system). Shim-pack, SPR-Pb (manufactured by Shimadzu Corporation, 250 L × 7.8) is used as the HPLC separation column, and ultrapure water (purified water using Milli-Q from Nippon Millipore Corporation) as the mobile phase. And a refractive index detector was used as the detector. The HPLC conditions were a transfer rate of 0.6 mL / min and a column temperature of 80 ° C. The result is shown in FIG.
図1から明らかなように、200g−乾燥質量/Lという高濃度のバイオマス前処理物から、酵素処理開始から48時間という短時間で、野生株酵母では、35g/Lのエタノール収量(72%の対バイオマス全糖エタノール収率)を達成でき、セルロース加水分解分解酵素を細胞表層提示した形質転換酵母では、42g/Lのエタノール収量(86%の対バイオマス全糖エタノール収率)を達成できた。1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物というセルロース加水分解酵素製剤の添加量は従来の1/100程度の量に相当し、酵素製剤の添加量を大幅に低減できることがわかった。 As is clear from FIG. 1, from a biomass pre-treatment product having a high concentration of 200 g-dry mass / L, in a short time of 48 hours from the start of the enzyme treatment, in a wild-type yeast, an ethanol yield of 35 g / L (72% (Yield to biomass total sugar ethanol) was achieved, and in the transformed yeast in which cellulose hydrolyzing enzyme was displayed on the cell surface, an ethanol yield of 42 g / L (86% yield of biomass total sugar ethanol) was achieved. The amount of cellulose hydrolase preparation added as 1FPU / g-dried biomass pretreatment product corresponds to about 1/100 of the conventional amount, and it was found that the amount of enzyme preparation added can be greatly reduced.
(比較例1:酵素処理/発酵同時開始)
実施例1の200g−乾燥質量/Lの稲ワラ水熱処理固形分に代えて50g−乾燥質量/Lの稲ワラ水熱処理固形分を用いたこと以外、表1と同様の組成の酵素処理液を調製し、これを200mL容量のねじ口びん(デュラン社製)に入れ、さらに実施例1と同様に調製した酵母懸濁液2mLを添加して、実施例1と同様に菌体濃度を100g−湿重量/Lとした。酵母添加後、35℃にて液を攪拌しながら酵素処理/発酵を開始した。酵素処理/発酵開始から6時間後、24時間後、および48時間後にそれぞれ50g−乾燥質量/Lの稲ワラ水熱処理固形分を添加し(最終的に200g−乾燥質量/Lの稲ワラ水熱処理固形分)、発酵を継続した。実施例1と同様にして定量した発酵液中の生産されたエタノール濃度の経時変化を図2に示す。
(Comparative Example 1: Simultaneous start of enzyme treatment / fermentation)
An enzyme-treated solution having the same composition as in Table 1 except that 50 g-dry mass / L of rice bran hydrothermally treated solid content was used instead of 200 g-dry mass / L of rice straw hydrothermally treated solid content of Example 1. This was put into a 200 mL capacity screw mouth bottle (manufactured by Duran), 2 mL of yeast suspension prepared in the same manner as in Example 1 was added, and the bacterial cell concentration was adjusted to 100 g- Wet weight / L. After yeast addition, enzyme treatment / fermentation was started while stirring the liquid at 35 ° C. 50 g-dry mass / L of rice straw hydrothermal treatment solid content was added 6 hours, 24 hours and 48 hours after the start of enzyme treatment / fermentation (finally 200 g-dry mass / L of rice straw hydrothermal treatment). Solids) and continued fermentation. FIG. 2 shows the change over time of the ethanol concentration produced in the fermentation broth determined in the same manner as in Example 1.
図2から明らかなように、酵素処理と発酵とを同時に開始すると、200g−乾燥質量/Lのバイオマス前処理物から35g/Lのエタノール収量を達成するのに酵素処理/発酵開始から96時間以上要した。 As is apparent from FIG. 2, when the enzyme treatment and fermentation are started simultaneously, 96 hours or more from the start of enzyme treatment / fermentation to achieve an ethanol yield of 35 g / L from a biomass pretreatment product of 200 g-dry mass / L. It cost.
(実施例2:エタノール発酵2)
実施例1の酵素処理開始から2時間経過後に代えて4時間経過後または6時間経過後、酵素処理液に上記酵母懸濁液2mLを添加したこと以外、実施例1と同様に発酵を行った。実施例1と同様にして定量した発酵開始から72時間経過後の発酵液中の生産されたエタノール濃度を実施例1の結果と併せて図3に示す。
(Example 2: Ethanol fermentation 2)
Fermentation was carried out in the same manner as in Example 1 except that 2 hours after the start of enzyme treatment in Example 1 and 4 hours or 6 hours later, 2 mL of the yeast suspension was added to the enzyme treatment solution. . The ethanol concentration produced in the fermentation broth after 72 hours from the start of fermentation determined in the same manner as in Example 1 is shown in FIG.
図3から明らかなように、野生株酵母では、6時間の酵素処理時間で最もエタノール収量が高く、セルロース加水分解分解酵素を細胞表層提示した形質転換酵母では、2時間の酵素処理時間で最もエタノール収量が高いことがわかった。 As is apparent from FIG. 3, the wild-type yeast has the highest ethanol yield after 6 hours of enzyme treatment, and the transformed yeast presenting cellulolytic enzyme on the cell surface shows the highest ethanol after 2 hours of enzyme treatment. The yield was found to be high.
(実施例3:エタノール発酵3)
実施例1の1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤に代えて4FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤を用いたこと以外、実施例1と同様にして発酵を行った。実施例1と同様にして定量した発酵液中の生産されたエタノール濃度の経時変化を図4に示す。
(Example 3: Ethanol fermentation 3)
In the same manner as in Example 1, except that the cellulose hydrolase preparation of 4 FPU / g-dried biomass pretreatment product was used instead of the cellulose hydrolase preparation of 1 FPU / g-dry biomass pretreatment product of Example 1. Fermentation was performed. FIG. 4 shows the change over time in the ethanol concentration produced in the fermentation broth determined in the same manner as in Example 1.
図1および4から明らかなように、野生株酵母またはセルロース加水分解分解酵素を細胞表層提示した形質転換酵母のいずれを用いても、4FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤と1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤とでエタノール収量にほとんど差がなく、酵素製剤の添加量を1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物程度まで低減できることがわかった。 As is clear from FIGS. 1 and 4, 4FPU / g-dried biomass pre-treated cellulose hydrolase preparation can be obtained by using either wild-type yeast or transformed yeast displaying cellulosic hydrolase. It was found that there was almost no difference in ethanol yield between the cellulose hydrolase preparation of 1FPU / g-dried biomass pretreatment product, and the amount of enzyme preparation added could be reduced to about 1 FPU / g-dry biomass pretreatment product.
(実施例4:エタノール発酵4)
実施例1の酵素処理時間または/および酵素添加量を変えて、実施例1と同様に発酵を行った。実施例1と同様にして定量した発酵液中の生産されたエタノール濃度の経時変化を図5(b)〜(d)に示す。図5(a)は、比較のために、実施例1と同様にして行った発酵の結果を示す。図5(b)は、実施例1の1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤に代えて10FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤を用いたこと以外、実施例1と同様にして行った発酵の結果を示し、図5(c)は、実施例1の酵素処理開始から2時間経過後に代えて24時間経過後、酵素処理液に上記酵母懸濁液2mLを添加したこと以外、実施例1と同様にして行った発酵の結果を示し、そして図5(d)は、実施例1の1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤に代えて10FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤を用い、実施例1の酵素処理開始から2時間経過後に代えて24時間経過後、酵素処理液に上記酵母懸濁液2mLを添加したこと以外、実施例1と同様にして行った発酵の結果を示す。
(Example 4: Ethanol fermentation 4)
Fermentation was carried out in the same manner as in Example 1, except that the enzyme treatment time or / and the amount of enzyme added in Example 1 were changed. The time-dependent change of the ethanol concentration produced in the fermented liquid quantified in the same manner as in Example 1 is shown in FIGS. FIG. 5 (a) shows the results of fermentation performed in the same manner as in Example 1 for comparison. FIG. 5 (b) shows that, in place of the cellulose hydrolase preparation of 10 FPU / g-dried biomass pretreatment product in Example 1 except that the cellulose hydrolase preparation of 10 FPU / g-dry biomass pretreatment product was used, The result of the fermentation performed in the same manner as in Example 1 is shown, and FIG. 5 (c) shows the yeast suspension in the enzyme treatment solution after 24 hours instead of 2 hours from the start of the enzyme treatment in Example 1. The result of the fermentation performed in the same manner as in Example 1 except that 2 mL was added is shown, and FIG. 5 (d) shows the cellulose hydrolase preparation of 1 FPU / g-dried biomass pretreatment product of Example 1. Instead, using a cellulose hydrolase preparation of 10 FPU / g-dried biomass pretreatment product, after 2 hours from the start of enzyme treatment in Example 1, after 24 hours, 2 mL of the above yeast suspension in the enzyme treatment liquid Except for adding, it shows the results of fermentation carried out in the same manner as in Example 1.
図5から明らかなように、野生株酵母またはセルロース加水分解分解酵素を細胞表層提示した形質転換酵母のいずれを用いても、24時間の酵素処理時間と2時間の酵素処理時間とでエタノール収量にほとんど差がなく、酵素処理時間を2時間程度まで短縮できることがわかった。また、10FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤と1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物のセルロース加水分解酵素製剤とでエタノール収量にほとんど差がなく、酵素製剤の添加量を1FPU/g−乾燥バイオマス前処理物程度まで低減できることがわかった。特に、セルロース加水分解酵素を細胞表層提示した形質転換酵母を用いると、1FPU/g−乾燥バイオマスの前処理物のセルロース加水分解酵素製剤の2時間の酵素処理時間で最もエタノール収量が高いことがわかった。 As is clear from FIG. 5, using either a wild-type yeast or a transformed yeast on which cellulosic hydrolase is displayed on the cell surface, the ethanol yield can be increased with an enzyme treatment time of 24 hours and an enzyme treatment time of 2 hours. It was found that there was almost no difference and the enzyme treatment time could be shortened to about 2 hours. Moreover, there is almost no difference in ethanol yield between the cellulose hydrolase preparation of 10 FPU / g-dried biomass pretreatment and the cellulose hydrolase preparation of 1 FPU / g-dry biomass pretreatment, and the amount of enzyme preparation added is 1 FPU. It was found that the amount could be reduced to about / g-dried biomass pretreatment product. In particular, when transformed yeast with cellulosic hydrolase displayed on the cell surface was used, it was found that the ethanol yield was the highest in the 2-hour enzyme treatment time of the cellulose hydrolase preparation pretreated from 1 FPU / g-dried biomass. It was.
(実施例5:エタノール発酵5)
野生株酵母を用いて、実施例1の酵素処理時間または/および酵素添加量を変えて、実施例1と同様に発酵を行った。実施例1と同様にして定量した発酵液中の生産されたエタノール濃度の経時変化を図6(a)および(b)に示す。
(Example 5: Ethanol fermentation 5)
Fermentation was carried out in the same manner as in Example 1 using the wild-type yeast while changing the enzyme treatment time and / or the amount of enzyme added in Example 1. 6A and 6B show the change over time of the ethanol concentration produced in the fermentation broth determined in the same manner as in Example 1. FIG.
図6から明らかなように、野生株酵母では、6時間の酵素処理時間および2FPU/g−乾燥バイオマス前処理物で最もエタノール収量が高いことがわかった。 As is clear from FIG. 6, it was found that the wild-type yeast had the highest ethanol yield at the enzyme treatment time of 6 hours and the 2FPU / g-dried biomass pretreatment product.
本発明の方法によれば、酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産することができる。すなわち、初期発酵基質濃度を高濃度にでき、糖化のための酵素製剤の添加量を低減でき、エタノール収量が大幅に上昇する。 According to the method of the present invention, ethanol can be produced at low cost from lignocellulosic biomass using yeast. That is, the initial fermentation substrate concentration can be increased, the amount of enzyme preparation added for saccharification can be reduced, and the ethanol yield is significantly increased.
Claims (5)
リグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得る工程、
100g−乾燥質量/L以上の固形分含量の該セルロース画分をセルロース加水分解酵素製剤と混合し、0.5〜10時間酵素処理して糖化バイオマスを生成する工程、および
酵母を該糖化バイオマスと混合し、培養する工程
を含む、方法。 A method for producing ethanol from lignocellulosic biomass,
Obtaining a cellulose fraction from lignocellulosic biomass,
The step of mixing the cellulose fraction having a solid content of 100 g-dry mass / L or more with a cellulose hydrolase preparation, and performing enzyme treatment for 0.5 to 10 hours to produce saccharified biomass, and yeast as the saccharified biomass A method comprising the steps of mixing and culturing.
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