JP5745237B2 - Method for producing sugar and alcohol from cellulosic biomass - Google Patents
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Description
本発明は、セルラーゼ生産菌が生産する酵素を用いてセルロース系バイオマスを糖化することによる糖の製造方法、並びに、該方法により製造された糖を発酵することによるエタノールの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing sugar by saccharifying cellulosic biomass using an enzyme produced by a cellulase-producing bacterium, and a method for producing ethanol by fermenting the sugar produced by the method.
食糧や飼料と競合しない、農産廃棄物や木材などのセルロース系バイオマスから、エタノールなどの化学品を開発するための数多くの試みがなされてきた。例えば、木材などを硫酸で糖化し、グルコースやキシロースのような単糖類とした後に、この単糖類を酵母やバクテリアで発酵させ、エタノールを得る方法が開発されてきた（非特許文献１から３）。しかしながら、この方法には、使用した強酸を回収して再利用することが困難である点や、廃棄物処理する場合の環境性の点などにおいて問題があった。 Numerous attempts have been made to develop ethanol and other chemicals from cellulosic biomass such as agricultural waste and wood that do not compete with food and feed. For example, a method has been developed in which wood is saccharified with sulfuric acid to form a monosaccharide such as glucose or xylose, and then this monosaccharide is fermented with yeast or bacteria to obtain ethanol (Non-Patent Documents 1 to 3). . However, this method has a problem in that it is difficult to recover and reuse the strong acid used, and in terms of the environmental characteristics when treating waste.
そこで、より温和で環境に優しいバイオマスの糖化方法として、酵素を用いる方法も開発されてきた。この方法においては、一般的に、各種微生物が生産するセルラーゼやヘミセルラーゼが使用されている。セルラーゼは、種々の作用機作を有する酵素タンパク質から構成されている。バイオマス中のセルロースに作用する酵素としては、非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖に切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（EG）、並びに、結晶性および非結晶性のセルロース繊維の末端から、セロビオース単位で糖を切り出すセロビオヒドロラーゼ（CBH）がある。また、これら酵素の作用により生成したセロビオースを加水分解してグルコースを生成するβ-グルコシダーゼ（BGL）がある。一方、バイオマス構成成分であるヘミセルロースに作用するヘミセルラーゼとして、キシラナーゼやβ-キシロシダーゼなどがある。セルロース系バイオマスの糖化酵素には、以上のような酵素などが含まれるが、実際には、これらの各酵素は、さらに、糖質加水分解酵素ファミリーにより分類される多数の成分から構成されており、非常に複雑である。 Therefore, a method using an enzyme has been developed as a milder and more environmentally friendly method for saccharifying biomass. In this method, cellulase and hemicellulase produced by various microorganisms are generally used. Cellulase is composed of enzyme proteins having various mechanisms of action. Enzymes that act on cellulose in biomass include endoglucanase (EG) that acts on amorphous cellulose and breaks the cellulose chain, and sugars in cellobiose units from the ends of crystalline and amorphous cellulose fibers. There is cellobiohydrolase (CBH) to cut out There is also β-glucosidase (BGL) that hydrolyzes cellobiose produced by the action of these enzymes to produce glucose. On the other hand, examples of hemicellulases that act on hemicellulose, which is a biomass component, include xylanase and β-xylosidase. Cellulose biomass saccharifying enzymes include the above-mentioned enzymes, but in reality, each of these enzymes is further composed of a number of components classified by the carbohydrate hydrolase family. Is very complex.
セルラーゼ生産菌としては、Trichoderma属に属する菌株、例えば、Trichoderma reeseiやTrichoderma virideが有名であり、工業的に使用されてきた（非特許文献４）。しかしながら、Trichoderma属に属する菌株により生産されるセルラーゼを用いたバイオマス糖化に関する研究が進む中で、このセルラーゼの最大の欠点として、β-グルコシダーゼ活性が他の酵素活性（エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性など）に比べ相対的に低いことがクローズアップされてきた。これに伴い、β-グルコシダーゼ活性を強化した改良品として、例えば、Cellic CTec（Novozymes社）やAccellerase1500（Genencor社）が開発された。 The cellulase-producing bacteria, strains belonging to the genus Trichoderma, e.g., Trichoderma reesei or Trichoderma viride is famous, have been industrially used (Non-patent document 4). However, as research on biomass saccharification using cellulase produced by a strain belonging to the genus Trichoderma progresses, the biggest drawback of this cellulase is that β-glucosidase activity is related to other enzyme activities (endoglucanase activity, cellobiohydrolase activity) Etc.) has been closed up. Accordingly, Cellic CTec (Novozymes) and Accellerase1500 (Genencor) have been developed as improved products with enhanced β-glucosidase activity.
しかしながら、バイオエタノールの実用化のためには、その製造コストをさらに低減させる必要があり、この目的を達成するために、これら改良型酵素と比較して、より少量でバイオマス糖化を完結させることが可能な、新たな高機能糖化酵素の開発が強く望まれている。 However, in order to put bioethanol into practical use, it is necessary to further reduce its production cost. To achieve this purpose, biomass saccharification can be completed in a smaller amount than these improved enzymes. The development of a new high-performance saccharifying enzyme that is possible is strongly desired.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、セルロース系バイオマスに対して高い糖化能を有する酵素を生産する微生物を開発し、当該微生物の生産する酵素を用いて、効率的にセルロース系バイオマスを糖化しうる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、こうしてセルロース系バイオマスから得られた糖を発酵することによる、エタノールの製造方法を提供することにある。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective developed the microorganisms which produce the enzyme which has high saccharification ability with respect to cellulosic biomass, and uses the enzyme which the said microorganisms produce. An object of the present invention is to provide a method capable of efficiently saccharifying cellulosic biomass. It is a further object of the present invention to provide a method for producing ethanol by fermenting sugar thus obtained from cellulosic biomass.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、まず、高活性の糖化酵素を産生する微生物の開発を試みた。ここで、本発明者らは、Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼが、Trichoderma属に属する微生物が本来持っているβ-グルコシダーゼと比較して、セロビオースに対する比活性が極めて高いことに注目した。そして、Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子をTrichoderma属に属する微生物に導入することにより、当該微生物が生産する酵素の改良を行った。この形質転換においては、導入したβ-グルコシダーゼが効果的に発現しうるよう、セルロースにより誘導されるプロモーターを用いるなどの工夫を行った。 In order to solve the above problems, the present inventors first attempted to develop a microorganism that produces a highly active saccharifying enzyme. Here, the present inventors noted that β-glucosidase derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus has an extremely high specific activity against cellobiose as compared with β-glucosidase originally possessed by a microorganism belonging to the genus Trichoderma . . Then, by introducing a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus into a microorganism belonging to the genus Trichoderma , the enzyme produced by the microorganism was improved. In this transformation, contrivances such as using a promoter induced by cellulose were made so that the introduced β-glucosidase can be expressed effectively.
次いで、こうして作製した形質転換体を培養し、その培養上清に含まれる酵素の糖化能の検討を行った。この糖化能の検討に際しては、バイオマスの前処理が糖化に与える影響についても調査した。その結果、当該形質転換体により生産される酵素が、高いβ-グルコシダーゼ活性とともに、高いキシラナーゼ活性を示し、従来の各種糖化酵素と比較して、極めて高い糖化能を有することを見出した。 Subsequently, the transformant thus produced was cultured, and the saccharification ability of the enzyme contained in the culture supernatant was examined. In examining this saccharification ability, the effect of biomass pretreatment on saccharification was also investigated. As a result, it has been found that the enzyme produced by the transformant exhibits a high xylanase activity as well as a high β-glucosidase activity, and has an extremely high saccharifying ability as compared with various conventional saccharifying enzymes.
このように本発明者らは、Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子を導入して、Trichoderma属に属する微生物が生産する糖化酵素を改良することに成功し、こうして改良した糖化酵素を利用することにより、効率的に、セルロース系バイオマスから糖を製造することが可能であること、さらに、こうして得られた糖を発酵することにより、効率的に、エタノールを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As described above, the present inventors succeeded in improving the saccharifying enzyme produced by the microorganism belonging to the genus Trichoderma by introducing the β-glucosidase gene derived from the microorganism belonging to the genus Aspergillus , and thus utilizing the improved saccharifying enzyme. It is possible to efficiently produce sugar from cellulosic biomass, and it is possible to efficiently produce ethanol by fermenting the sugar thus obtained. As a result, the present invention has been completed.
本発明は、より詳しくは、下記の発明を提供するものである。 More specifically, the present invention provides the following inventions.
（１） Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物の形質転換体が生産するセルロース系バイオマスの糖化酵素で、セルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの糖の製造方法。 (1) Cellulose biomass saccharifying enzyme produced by a transformant of a microorganism belonging to the genus Trichoderma into which a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus has been introduced. For producing sugar from biomass.
（２） 形質転換体が下記の特徴を有する、（１）に記載の方法。
（ａ）その培養上清のセロビオースに対するβ-グルコシダーゼ比活性が、7.0U/mg以上である
（ｂ）その培養上清のキシラナーゼ比活性が、10.0U/mg以上である
(2) The method according to (1), wherein the transformant has the following characteristics.
(A) β-glucosidase specific activity for cellobiose in the culture supernatant is 7.0 U / mg or more (b) xylanase specific activity in the culture supernatant is 10.0 U / mg or more
（３） Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が、セルロースにより誘導されるプロモーターによって発現制御されている、（１）または（２）に記載の方法。 (3) The method according to (1) or (2), wherein expression of a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus is controlled by a promoter induced by cellulose.
（４） プロモーターがxyn3遺伝子のプロモーターである、（３）に記載の方法。 (4) The method according to (3), wherein the promoter is a promoter of the xyn3 gene.
（５） セルロース系バイオマスを糖化する前に、アルカリ処理する工程を含む、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。 (5) The method according to any one of (1) to (4), including a step of alkali treatment before saccharifying cellulosic biomass.
（６） Aspergillus属に属する微生物がAspergillus aculeatusである、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。 (6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the microorganism belonging to the genus Aspergillus is Aspergillus aculeatus .
（７） Trichoderma属に属する微生物がTrichoderma reesei（Hypocrea jecorina）である、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。 (7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the microorganism belonging to the genus Trichoderma is Trichoderma reesei ( Hypocrea jecorina ).
（８） （１）から（７）のいずれかの方法を実施することにより得られた糖を発酵する工程を含む、エタノールの製造方法。 (8) A method for producing ethanol, comprising a step of fermenting a sugar obtained by performing the method according to any one of (1) to (7).
本発明における、Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物は、高いβ-グルコシダーゼ活性および高いキシラナーゼ活性を示す酵素を産生することができる。本発明の形質転換体が産生する酵素を用いれば、従来のセルラーゼと比較して、極めて少量でセルロース系バイオマスの糖化を完結させることができる。さらに、こうしてセルロース系バイオマスから得られた糖を発酵させることにより、効率的にエタノールを製造することができる。 In the present invention, a microorganism belonging to the genus Trichoderma into which a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus has been introduced can produce an enzyme exhibiting high β-glucosidase activity and high xylanase activity. If an enzyme produced by the transformant of the present invention is used, saccharification of cellulosic biomass can be completed in an extremely small amount as compared with conventional cellulases. Furthermore, ethanol can be efficiently produced by fermenting the sugar thus obtained from cellulosic biomass.
本発明においては、Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物が生産するセルロース系バイオマスの糖化酵素が用いられる。 In the present invention, a saccharifying enzyme of cellulosic biomass produced by a microorganism belonging to the genus Trichoderma into which a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus is introduced is used.
一般的に、セルロースを分解する酵素をセルラーゼ、ヘミセルロースを分解する酵素をヘミセルラーゼと称するが、本発明における「セルロース系バイオマスの糖化酵素」は、これら酵素の双方を含む意である。 In general, an enzyme that degrades cellulose is referred to as cellulase, and an enzyme that degrades hemicellulose is referred to as hemicellulase. The “saccharifying enzyme of cellulosic biomass” in the present invention is meant to include both of these enzymes.
本発明に用いるβ-グルコシダーゼ遺伝子の由来する「Aspergillus属に属する微生物」としては、その産生するβ-グルコシダーゼのセロビオースに対する比活性が、Trichoderma属に属する微生物が産生するβ-グルコシダーゼの場合と比較して高い微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、Aspergillus aculeatusである。Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼI（BGL1）は、Trichoderma reesei由来のβ-グルコシダーゼI（BGL1）と比較して、セロビオースに対する比活性が極めて高いという特性を有する（本発明者らによる測定の結果、Trichoderma reesei由来のBGL1は、比活性が19U/mgであるのに対し、Aspergillus aculeatus由来のBGL1は、比活性が186U/mgであった）。本発明に用いるβ-グルコシダーゼ遺伝子は、目的の活性を有する限り、天然型の配列を有する遺伝子であってもよく、変異体であってもよい。なお、Aspergillus aculeatus由来のβ-グルコシダーゼ（BGL1）のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該cDNAがコードするアミノ酸配列を配列番号：２に示した。 As the “microbe belonging to the genus Aspergillus ” derived from the β-glucosidase gene used in the present invention, the specific activity of the produced β-glucosidase with respect to cellobiose is compared with the case of β-glucosidase produced by the microorganism belonging to the genus Trichoderma. As long as it is a high microorganism, there is no particular limitation, but Aspergillus aculeatus is preferable. Aspergillus aculeatus β-glucosidase I (BGL1) has a characteristic of extremely high specific activity against cellobiose as compared with β-glucosidase I (BGL1) derived from Trichoderma reesei (the results of the measurement by the present inventors show that Trichoderma BGL1 derived from reesei had a specific activity of 19 U / mg, whereas BGL1 derived from Aspergillus aculeatus had a specific activity of 186 U / mg). The β-glucosidase gene used in the present invention may be a gene having a natural sequence or a mutant as long as it has the desired activity. The base sequence of cDNA of β-glucosidase (BGL1) derived from Aspergillus aculeatus is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 2.
本発明において宿主として用いる「Trichoderma属に属する微生物」としては、Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子の導入により、セルロース系バイオマスの糖化能を高めることが可能なものであれば特に制限はない。好ましくは、Trichoderma reeseiであり、より好ましくはTrichoderma reeseiに由来する変異株であるPC-3-7株およびその派生株である。 The “microorganism belonging to the genus Trichoderma ” used as a host in the present invention is not particularly limited as long as it can increase the saccharification ability of cellulosic biomass by introducing a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus. There is no. Trichoderma reesei is preferable, and PC-3-7 strain that is a mutant derived from Trichoderma reesei and its derivatives are more preferable.
Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子によるTrichoderma属に属する微生物の形質転換においては、形質転換体の産生する酵素が優れた糖化活性を示すことができるよう、Trichoderma属に属する微生物が本来有する酵素活性を減少させることなく、外因性のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現させることが必要である。この目的のため、本発明においては、外因性のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現させるプロモーターとして、当該β-グルコシダーゼ遺伝子を、Trichoderma属に属する微生物が本来有するセルラーゼ遺伝子と同時に発現させることが可能なプロモーターを用いることが好ましい。このようなプロモーターとしては、例えば、セルロースにより誘導されるプロモーターが挙げられる。具体的には、xyn3遺伝子のプロモーターを好適に用いることができる。 When transforming a microorganism belonging to the genus Trichoderma with a β-glucosidase gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus , the microorganism belonging to the genus Trichoderma is inherently selected so that the enzyme produced by the transformant can exhibit excellent saccharification activity. It is necessary to express an exogenous β-glucosidase gene without reducing the enzymatic activity it has. For this purpose, in the present invention, as a promoter for expressing an exogenous β-glucosidase gene, a promoter capable of expressing the β-glucosidase gene simultaneously with a cellulase gene inherent in a microorganism belonging to the genus Trichoderma. It is preferable to use it. Examples of such a promoter include a promoter induced by cellulose. Specifically, a promoter of the xyn3 gene can be preferably used.
また、相同組み換えにより、β-グルコシダーゼ遺伝子をTrichoderma reeseiのゲノムDNAに導入する場合においては、xyn3遺伝子領域を標的領域とすることができる。Trichoderma reeseiは、キシラナーゼ遺伝子として、xyn3遺伝子以外に、xyn1遺伝子とxyn2遺伝子の2種の遺伝子を保有しており、この2種のキシラナーゼ（XYN IとXYN II）は、バイオマス中のヘミセルロースの糖化能力が高い。従って、相同組み換えによりxyn3遺伝子の機能が抑制されたとしても、バイオマス中のヘミセルラーゼの糖化に必要なキシラナーゼ量は十分確保されると考えられる。さらに、このxyn1遺伝子とxyn2遺伝子はキシランなどによっても誘導されるので、必要とあればセルロースなどにキシランなどを添加して培養すれば、キシラナーゼ活性は大幅に増強される（実施例５および実施例６にその一例を示した）。一方、セルロース分解に必須なセルラーゼ成分の遺伝子領域（例えば、エンドグルカナーゼ遺伝子やセロビオハイドラーゼ遺伝子などの遺伝子領域）を、相同組み換えの標的領域とした場合には、セルロースの分解に大きな負の影響を与えるため、好ましくない。 In addition, when the β-glucosidase gene is introduced into the genomic DNA of Trichoderma reesei by homologous recombination, the xyn3 gene region can be used as the target region. Trichoderma reesei as xylanase gene, in addition xyn3 gene, owns two genes of xyn1 gene and xyn2 gene, the two xylanases (xyn I and xyn II) is, hemicellulose saccharification ability of the biomass Is expensive. Therefore, even if the function of the xyn3 gene is suppressed by homologous recombination, it is considered that the amount of xylanase necessary for saccharification of hemicellulase in biomass is sufficiently ensured. Furthermore, since the xyn1 gene and the xyn2 gene are also induced by xylan and the like, if necessary, xylanase activity is greatly enhanced by adding xylan to cellulose or the like if necessary (Example 5 and Example). An example is shown in FIG. On the other hand, if the gene region of cellulase components essential for cellulose degradation (for example, gene regions such as endoglucanase gene and cellobiohydrase gene) is used as the target region for homologous recombination, it has a significant negative effect on cellulose degradation. Is not preferable.
xyn3遺伝子領域を相同組み換えの標的領域とする場合には、組み換えベクターは、「xyn3遺伝子のプロモーター領域-β-グルコシダーゼ遺伝子-xyn3遺伝子のターミネーター領域」からなる構造を含むことができる。本実施例に示した通り、xyn3配列とその上流下流3kbを含んでいるベクターである「pBxyn3ag-D0」において、そのxyn3領域とβ-グルコシダーゼ遺伝子（例えば、Aspergillus aculeatus由来bgl1 cDNA）を置き換えることにより、相同組み換えベクターを構築することができる。遺伝子組み換えや宿主へのベクターの導入などの一般的な遺伝子操作は、当業者に公知の手法を用いることができる。 When the xyn3 gene region is used as a target region for homologous recombination, the recombination vector can include a structure consisting of “promoter region of xyn3 gene-β-glucosidase gene-terminator region of xyn3 gene”. As shown in this Example, by replacing the xyn3 region and the β-glucosidase gene (for example, bgl1 cDNA derived from Aspergillus aculeatus ) in “pBxyn3ag-D0”, which is a vector containing the xyn3 sequence and 3 kb upstream and downstream thereof. A homologous recombination vector can be constructed. For general genetic manipulations such as gene recombination and introduction of a vector into a host, techniques known to those skilled in the art can be used.
こうして作製された形質転換体は、高いβ-グルコシダーゼ活性および高いキシラナーゼ活性を示す酵素を産生することができる。また、このような手法で作成された形質転換体は、ヘミセルラーゼの加水分解に必要なβ-キシロシダーゼの生産能も十分保持しており、この形質転換体が産生した酵素にはバイオマス糖化に十分と思われるβ-キシロシダーゼ活性が含まれている。 The transformant thus produced can produce an enzyme exhibiting high β-glucosidase activity and high xylanase activity. In addition, the transformant prepared by such a method has sufficient ability to produce β-xylosidase necessary for hydrolysis of hemicellulase, and the enzyme produced by this transformant is sufficient for biomass saccharification. It contains β-xylosidase activity that seems to be.
本発明における形質転換体は、好ましくは、（ａ）その培養上清のセロビオースに対するβ-グルコシダーゼ比活性が、7.0U/mg以上（好ましくは、8.0U/mg以上、9.0U/mg以上）であり、かつ、（ｂ）その培養上清のキシラナーゼ比活性が、10.0U/mg以上（好ましくは、15.0U/mg以上、20.0U/mg以上、24.0U/mg以上）、という特徴を有するものである。本発明における形質転換体は、さらに、好ましくは、（ｃ）その培養上清のFPU比活性が、1.7U/mg以上（好ましくは、2.0U/mg以上）であり、（ｄ）その培養上清のCMCase比活性が、45U/mg以上（好ましくは、50U/mg以上）であり、（ｅ）β-キシロシダーゼ比活性が0.2U/mg以上（好ましくは、0.4U/mg以上、0.8U/mg以上、1.5U/mg以上）である、という特徴をも有するものである。 The transformant in the present invention preferably has (a) a β-glucosidase specific activity for cellobiose in the culture supernatant of 7.0 U / mg or more (preferably 8.0 U / mg or more, 9.0 U / mg or more). And (b) the xylanase specific activity of the culture supernatant is 10.0 U / mg or more (preferably 15.0 U / mg or more, 20.0 U / mg or more, 24.0 U / mg or more) It is. In the transformant of the present invention, preferably, (c) the FPU specific activity of the culture supernatant is 1.7 U / mg or more (preferably 2.0 U / mg or more), and (d) Kiyoshi's CMCase specific activity is 45 U / mg or more (preferably 50 U / mg or more), (e) β-xylosidase specific activity is 0.2 U / mg or more (preferably 0.4 U / mg or more, 0.8 U / mg or more) mg or more and 1.5 U / mg or more).
糖化酵素を生産させるための形質転換体の培養は、当業者において、通常用いられる培養条件で実施することができる。培養に用いる糖源としては、各種セルロース、例えば、アビセル、濾紙粉末、セルロースを含むバイオマスなどが、窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、CSL、大豆かすなどが用いられる。その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。さらに、各種キシラン成分を培地に添加することで、キシラナーゼを増産することも可能である。これら菌株の培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、20℃〜35℃、好ましくは25℃〜31℃であり、培養時間は、通常、4〜10日、好ましくは4〜9日である。 Cultivation of a transformant for producing a saccharifying enzyme can be performed by those skilled in the art under commonly used culture conditions. Examples of the sugar source used for the culture include various celluloses such as Avicel, filter paper powder, and biomass containing cellulose, and examples of the nitrogen source include polypeptone, gravy, CSL, and soybean meal. In addition, components required for producing the target cellulase can be added to the medium. Further, xylanase can be increased by adding various xylan components to the medium. For the culture of these strains, various culture methods such as shaking culture, stirring culture, stirring shaking culture, stationary culture, and continuous culture can be adopted, and shaking culture or stirring culture is preferred. The culture temperature is usually 20 ° C to 35 ° C, preferably 25 ° C to 31 ° C, and the culture time is usually 4 to 10 days, preferably 4 to 9 days.
本発明においては、こうして形質転換体に産生させた糖化酵素を用いて、セルロース系バイオマスを糖化する。本発明において使用するセルロース系バイオマスとしては、草本植物であっても、木本植物であってもよく、また、それらの加工物や廃棄物であってもよい。草本植物としては、イネ、エリアンサス、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ、ソルガム、ネピアグラス、スイッチグラス、ミスカンサスなどを挙げることができ、一方、木本植物としては、スギ類、ユーカリ、ヒノキ、マツ類、米ツガ、ポプラ、シラカバ、ヤナギ、クヌギ、ナラ類、カシ、シイ、ブナ、アカシア、タケ、ササ、アブラヤシ、サゴヤシなどを挙げることができるが、これらに制限されない。 In the present invention, cellulosic biomass is saccharified using the saccharifying enzyme thus produced in the transformant. The cellulosic biomass used in the present invention may be a herbaceous plant, a woody plant, or a processed product or waste thereof. Examples of herbaceous plants include rice, Elianthus, wheat, sugarcane, reed, Japanese pampas grass, corn, sorghum, napiergrass, switchgrass, Miscanthus, etc., while woody plants include cedars, eucalyptus, Examples include, but are not limited to, cypress, pine, rice eel, poplar, birch, willow, squirrel, oak, oak, shii, beech, acacia, bamboo, sasa, oil palm and sago palm.
一般的に、バイオマスは、そのままの形では、セルラーゼによる糖化を受け難い。このため、セルラーゼによる糖化を行う前に、セルロース系バイオマスを、酵素による糖化を受けやすい形態へと変化させるための処理を行うことが好ましい。本発明における、セルロース系バイオマスの前処理方法としては、特に制限はないが、メカノケミカル粉砕法、水熱処理、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ（NaOH）、KOH、Ca(OH)2、Na2SO3、NaHCO3、NaHSO3、Mg(HSO3)2、Ca(HSO3)2、アンモニア類（NH3、NH4OH）など）、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理、ソルボリシス処理、微生物処理、またはこれらの複合処理が挙げられる。 Generally, biomass is difficult to undergo saccharification by cellulase as it is. For this reason, before performing saccharification by a cellulase, it is preferable to perform the process for changing a cellulosic biomass into the form which is easy to receive saccharification by an enzyme. The pretreatment method for cellulosic biomass in the present invention is not particularly limited, but is mechanochemical pulverization method, hydrothermal treatment, alkali treatment (for example, caustic soda (NaOH), KOH, Ca (OH) 2 , Na 2 SO 3 , NaHCO 3 , NaHSO 3 , Mg (HSO 3 ) 2 , Ca (HSO 3 ) 2 , ammonia (NH3, NH4OH), etc.), dilute sulfuric acid treatment, steam explosion treatment, solvolysis treatment, microbial treatment, or a combination of these Is mentioned.
このような前処理を行うことにより、原料バイオマス中に存在するセルロースおよびヘミセルロースが、処理方法や処理条件に依存して、固形分残渣側に残存したり、加水分解されて可溶化画分に移行したりする。ここで、前処理方法や条件の設定により、セルロースやヘミセルロースを加水分解し、オリゴ糖あるいは単糖として可溶化画分に回収する方法も検討されているが、一般的に前処理条件が過酷になると、バイオマス中の各種成分が過分解を受け、その結果として、酢酸、蟻酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、リグニン分解物などのアルコール発酵工程における阻害物質を生成し、好ましくない。従って、バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースを構成する糖分を糖化液中に高収率で単糖として回収するためには、(1)前処理による固形分残渣側にできるだけセルロースおよびヘミセルロースを残すことと、および(2)残したセルロースおよびヘミセルロースができるだけ酵素による糖化を受けやすい形態とすること、のバランスが重要である。 By performing such pretreatment, cellulose and hemicellulose present in the raw biomass remain on the solid residue side or are hydrolyzed and transferred to the solubilized fraction depending on the treatment method and treatment conditions. To do. Here, a method of hydrolyzing cellulose and hemicellulose and collecting it in a solubilized fraction as an oligosaccharide or monosaccharide by setting the pretreatment method and conditions has been studied, but the pretreatment conditions are generally severe. Then, various components in the biomass are subjected to excessive decomposition, and as a result, an inhibitory substance in the alcohol fermentation process such as acetic acid, formic acid, furfural, hydroxymethylfurfural, and lignin decomposition product is generated, which is not preferable. Therefore, in order to recover the sugar components constituting the cellulose and hemicellulose in the biomass as monosaccharides in a high yield in the saccharified solution, (1) leaving as much cellulose and hemicellulose as possible on the solid residue side by pretreatment, And (2) the balance between the remaining cellulose and hemicellulose being as susceptible to enzymatic saccharification as possible is important.
本発明における形質転換体から生産される糖化酵素は、高いキシラナーゼ活性および高いβ-キシロシダーゼ活性を有しており、ヘミセルロースをも効率的に糖化することが可能である。このため、セルロース系バイオマスの前処理によって、セルロースのみならず、ヘミセルロースを高収率で回収することができれば、最終的なエタノールの製造効率を顕著に向上させることができる。ヘミセルロースを高収率で回収するために好ましい前処理方法は、アルカリ処理である。 The saccharifying enzyme produced from the transformant in the present invention has high xylanase activity and high β-xylosidase activity, and can efficiently saccharify hemicellulose. For this reason, if not only cellulose but hemicellulose can be collect | recovered with a high yield by the pre-processing of cellulosic biomass, the manufacturing efficiency of final ethanol can be improved notably. A preferred pretreatment method for recovering hemicellulose in high yield is alkali treatment.
原料バイオマスの粉砕物を水熱処理、苛性ソーダ処理、希硫酸処理、アンモニア処理する際は、例えば、スラリー濃度として1〜30（w/v）％、好ましくは3〜20（w/v）％で耐圧性の反応容器（オートクレーブ）に仕込み、バッチワイズに所定温度で所定時間処理する。また、流通式装置により、同等な条件の基で連続的に処理することも可能である。 When hydrolyzing raw material biomass, hydrothermal treatment, caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment, or ammonia treatment, for example, the slurry concentration is 1 to 30 (w / v)%, preferably 3 to 20 (w / v)%. The reaction vessel (autoclave) is charged and batchwise processed at a predetermined temperature for a predetermined time. Moreover, it is also possible to process continuously on the basis of equivalent conditions with a flow-type apparatus.
ここで水熱処理の場合、温度は、通常、150〜250℃、より好ましくは200〜230℃である。処理時間は、通常、3〜60分、より好ましくは5〜30分である。 Here, in the case of hydrothermal treatment, the temperature is usually 150 to 250 ° C, more preferably 200 to 230 ° C. The treatment time is usually 3 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes.
苛性ソーダ処理の場合、苛性ソーダ濃度は、通常、0.1〜3(w/v)%、より好ましくは0.3〜1(w/v)%である。処理温度は、通常、50〜230℃、より好ましくは80〜210℃である。処理時間は、通常、3分〜1時間、より好ましくは5〜30分である。希硫酸処理の場合、硫酸濃度は、通常、0.3〜3(w/v)％、より好ましくは0.5〜1(w/v)％である。処理温度は、通常、100〜200℃、より好ましくは150〜180℃である。処理時間は、通常、3〜30分、より好ましくは3〜15分である。 In the case of caustic soda treatment, the caustic soda concentration is usually 0.1 to 3 (w / v)%, more preferably 0.3 to 1 (w / v)%. Processing temperature is 50-230 degreeC normally, More preferably, it is 80-210 degreeC. The treatment time is usually 3 minutes to 1 hour, more preferably 5 to 30 minutes. In the case of the dilute sulfuric acid treatment, the sulfuric acid concentration is usually 0.3 to 3 (w / v)%, more preferably 0.5 to 1 (w / v)%. The treatment temperature is usually 100 to 200 ° C, more preferably 150 to 180 ° C. The treatment time is usually 3 to 30 minutes, more preferably 3 to 15 minutes.
アンモニア処理の場合、アンモニア濃度は、通常、1〜10(w/v)％、より好ましくは3〜5(w/v)％である。処理温度は、通常、室温から170℃、より好ましくは50〜170℃である。処理時間は、通常、5分〜14日、より好ましくは3〜14日である。 In the case of ammonia treatment, the ammonia concentration is usually 1 to 10 (w / v)%, more preferably 3 to 5 (w / v)%. The treatment temperature is usually from room temperature to 170 ° C, more preferably from 50 to 170 ° C. The treatment time is usually 5 minutes to 14 days, more preferably 3 to 14 days.
水蒸気爆砕の条件は、1.25MPaの場合、通常、3〜30分、好ましくは5〜15分である。2.33MPaの場合、通常、3〜20分、より好ましくは5〜10分である。2.8MPaの場合、通常、1〜15分、より好ましくは3〜10分である。3.35MPaの場合、通常、1〜10分、より好ましくは3〜10分である。 The steam explosion condition is usually 3 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes in the case of 1.25 MPa. In the case of 2.33 MPa, it is usually 3 to 20 minutes, more preferably 5 to 10 minutes. In the case of 2.8 MPa, it is usually 1 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes. In the case of 3.35 MPa, it is usually 1 to 10 minutes, more preferably 3 to 10 minutes.
このようにして原料バイオマスを前処理した後、ろ過、遠心分離などにより固液分離し、前処理固形物とろ液を得る。ここで、原料バイオマスおよび前処理固形物中のセルロースおよびヘミセルロースを定量分析する方法としては種々の方法を採用できるが、世界的に標準処方として使用される米国NREL（NationalRenewable Energy Laboratory）のLaboratory Analytical Procedure(LAP) Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomassに準拠した方法が好適である。この方法は、原料バイオマス、および前処理固形物を硫酸で加水分解した後に、これらサンプルに含まれるグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースなどの構成糖の含量をHPLC法で分析定量し含有率を求める方法である。この方法において、求められたグルコースは、セルロースに由来するもの、それ以外のキシロース、マンノース、ガラクトースなどの成分はヘミセルロースに由来のものとみなして各々の含有率を求める。 Thus, after pre-processing raw material biomass, it solid-liquid-separates by filtration, centrifugation, etc., and a pre-processing solid substance and filtrate are obtained. Here, various methods can be adopted for quantitative analysis of cellulose and hemicellulose in raw biomass and pretreated solids, but the Laboratory Analytical Procedure of the National Renewable Energy Laboratory (NREL) used as a standard formulation worldwide. A method based on (LAP) Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass is preferred. In this method, raw material biomass and pretreated solids are hydrolyzed with sulfuric acid, and the content of constituent sugars such as glucose, xylose, mannose, galactose, etc. contained in these samples are analyzed and quantified by the HPLC method to determine the content rate. It is. In this method, the obtained glucose is regarded as derived from cellulose, and other components such as xylose, mannose, galactose and the like are derived from hemicellulose, and each content is determined.
こうして前処理したセルロース系バイオマスを、本発明の形質転換体から産生された糖化酵素により糖化する場合の条件は、次の通りである。基質濃度は、通常、1〜20（w/v）％、好ましくは、5〜10（w/v）％程度である。pHは、通常、3〜9、好ましくは、4〜6の範囲である。温度は、10〜80℃、好ましくは、40〜60℃である。酵素濃度は、バイオマス前処理物の乾物重量当りのタンパク質量基準で、1〜20mg/g-バイオマス重量、好ましくは1〜10mg/g-バイオマス重量である。これら条件下、例えば、振とう、または静置で、糖化反応を進行させることができる。また、この糖化反応において、雑菌汚染を防止する目的でアジ化ナトリウムなどの殺菌剤を添加することもできる。この際は、後の糖化液の発酵工程に悪影響を及ぼさない化合物と濃度を選択することが好ましい。糖化率は、糖化液中の生成物を各種還元糖定量法やHPLC法で分析することにより求めることができる。 The conditions for saccharifying the cellulosic biomass thus pretreated with the saccharifying enzyme produced from the transformant of the present invention are as follows. The substrate concentration is usually about 1 to 20 (w / v)%, preferably about 5 to 10 (w / v)%. The pH is usually in the range of 3-9, preferably 4-6. The temperature is 10-80 ° C, preferably 40-60 ° C. The enzyme concentration is 1 to 20 mg / g-biomass weight, preferably 1 to 10 mg / g-biomass weight, based on the amount of protein per dry matter weight of the biomass pretreated product. Under these conditions, for example, the saccharification reaction can proceed under shaking or standing. In this saccharification reaction, a bactericidal agent such as sodium azide may be added for the purpose of preventing contamination with various bacteria. In this case, it is preferable to select a compound and a concentration that do not adversely affect the subsequent fermentation process of the saccharified solution. The saccharification rate can be determined by analyzing the product in the saccharified solution by various reducing sugar quantitative methods or HPLC methods.
こうして得られた糖化液を発酵させることにより、エタノールを製造することができる。糖化液からのエタノールの製造は、一般的な方法を適用することができる。エタノールの製造に用いる微生物としては、例えば、Saccharomyces属、Zymomonas属、Pichia属、Zymobacter属、Corynebacterium属、Kluyveromyces属、およびEscherichia属に属する微生物が挙げられるが、これらに制限されない。糖をエタノールに変換するための代謝系に関連する遺伝子を組み込んだ微生物あるいはこれらの変異株を利用することも可能である。糖化液に、これら微生物を植菌して培養することにより、エタノールを製造することが可能である。用いる糖化液は、糖濃度が3〜15％で、pHは3〜7が好ましい。培養温度は、20〜40℃が好ましい。エタノール発酵は、回分法でも連続法でも行うことが可能である。エタノール発酵は、上記のセルロース系バイオマスの糖化反応と同時に行うことができる（並行複発酵）。この場合は、糖化反応の条件とエタノール発酵の条件を組みあわせ、全体として生産性が最も高くなる糖濃度、温度、pHなどの条件が適宜選択すればよい。 By fermenting the saccharified solution thus obtained, ethanol can be produced. A general method can be applied to the production of ethanol from the saccharified solution. Examples of the microorganism used for producing ethanol include, but are not limited to, microorganisms belonging to the genus Saccharomyces , Zymomonas , Pichia , Zymobacter , Corynebacterium , Kluyveromyces , and Escherichia . It is also possible to use a microorganism incorporating a gene related to a metabolic system for converting sugar to ethanol, or a mutant thereof. By inoculating and culturing these microorganisms in a saccharified solution, ethanol can be produced. The saccharified solution used preferably has a sugar concentration of 3 to 15% and a pH of 3 to 7. The culture temperature is preferably 20 to 40 ° C. Ethanol fermentation can be carried out either batchwise or continuously. Ethanol fermentation can be performed simultaneously with the saccharification reaction of the above-mentioned cellulosic biomass (parallel double fermentation). In this case, the saccharification reaction conditions and the ethanol fermentation conditions may be combined, and conditions such as sugar concentration, temperature, pH, etc. that will give the highest productivity as a whole may be appropriately selected.
以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］
下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマー「X3aabgl1-s:5’-tgagtttcaattgaggcggacaatATGAAGCTCAGTTGGCTTGAG-3’（配列番号：３）」および「X3aabgl1-a:5’-ctgccatacccatgtagcagagcatTCATTGCACCTTCGGGAGCG-3’（配列番号：４）」を用いて、Aspergillus aculeatusのBGLIのcDNAの挿入されたプラスミドベクター「pABG7」を鋳型に、PCRを行った。
[Example 1]
Using the oligonucleotide primers “X3aabgl1-s: 5′-tgagtttcaattgaggcggacaatATGAAGCTCAGTTGGCTTGAG-3 ′” (SEQ ID NO: 3) and “X3aabgl1-a: 5′-ctgccatacccatgtagcagagcatTCATTGCACCTTCGGGAGCG-3 ′” (SEQ ID NO: 4) described below PCR was performed using the plasmid vector “pABG7” into which BGLI cDNA of Aspergillus aculeatus was inserted as a template.
In-fusion PCR反応を使用してpBxyn3ag-D0のxyn3遺伝子部分とPCR産物であるAspergillus aculeatus由来のbgl1遺伝子とを置換えるために、プライマーにおいては、PCR産物の両末端に、pXyn3aq-D0と24bpの相同領域が付加するように設計した（図１）。 To replace the bgl1 gene from Aspergillus aculeatus is xyn3 gene portion and PCR product pBxyn3ag-D0 using an In-fusion PCR reaction, in the primer, at both ends of the PCR products, pXyn3aq-D0 and 24bp The homologous region was designed to be added (FIG. 1).
PCRの反応条件は、98℃10秒、55℃5秒、72℃3分の3段階の反応を1サイクルとし、これを30サイクル繰返した。また、PCR反応には、PrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社）を使用した。 PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, and 72 ° C for 3 minutes. One cycle was repeated for 30 cycles. In addition, PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction.
[実施例２]
得られたPCR増幅断片(bgl1cDNA, 2583bp)を、Inverse PCRによって、オリゴヌクレオチドプライマー「SX3inverse:5’-ATGCTCTGCTACATGGGTATGGCAGGGTCGG-3’（配列番号：５）」および「AX3inverse:5’-ATTGTCCGCCTCAATTGAAACTCAGTGGAAAGATGGTAG-3’（配列番号：６）」を用いて増幅したべクターに連結した。
[Example 2]
The obtained PCR amplified fragment ( bgl1 cDNA, 2583 bp) was subjected to oligonucleotide primer “SX3inverse: 5′-ATGCTCTGCTACATGGGTATGGCAGGGTCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 5)” and “AX3inverse: 5′-ATTGTCCGCCTCAATTGAAACTCAGTGGAAAGATGGTAG-3 ′ ( SEQ ID NO: 6) ”was used to amplify the vector.
Inverse PCRの条件は、98℃で1分の後、「98℃で10秒、68℃で10分」の2段階の反応を1サイクルとし、これを40サイクル繰返した。PCR反応には、PrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ社）を使用した。 Inverse PCR was performed at 98 ° C. for 1 minute, followed by a two-stage reaction of “98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 10 minutes” as one cycle, and this was repeated 40 cycles. PrimeSTAR GXL DNA polymerase (Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction.
PCR増幅断片のべクターへの連結には、In-fusion kit(TaKaRa社)を使用した。In-fusion反応は、100ngのPCR産物、400ngの増幅ベクター、5×In-fusion buffer 2μL、水2μL、In-fusion enzyme 1μLを混和し、37℃で30分保温した後、50℃で15分保温することにより行った。得られたT.reesei発現カセットのxyn3上流配列、bgl1cDNA配列、マーカー配列（amdS:3089bp）の塩基配列決定を行い、PCRエラーがないことを確認した。塩基配列の決定には、CEQTM2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER社）を使用し、操作の詳細は、付属の取扱説明書に従った。 An In-fusion kit (TaKaRa) was used for linking the PCR amplified fragment to the vector. In-fusion reaction was performed by mixing 100 ng PCR product, 400 ng amplification vector, 5 × In-fusion buffer 2 μL, water 2 μL, In-fusion enzyme 1 μL, incubating at 37 ° C. for 30 minutes, and then at 50 ° C. for 15 minutes. Performed by keeping warm. The obtained T. reesei expression cassette was sequenced on the xyn3 upstream sequence, bgl1 cDNA sequence, and marker sequence ( amdS : 3089 bp) to confirm that there were no PCR errors. The base sequence was determined using CEQ ™ 2000XL DNA Analysis System (BECKMAN COULTER), and the details of the operation were in accordance with the attached instruction manual.
[実施例３]
実施例２で構築したベクターを、それぞれTrichoderma reesei PC-3-7株（WT）に導入した。導入は、プロトプラストPEG法で行った。形質転換体をアセトアミド資化能用選択培地で選抜した。培地の組成は次の通りである。
[Example 3]
The vectors constructed in Example 2 were introduced into Trichoderma reesei PC-3-7 strain (WT), respectively. The introduction was performed by the protoplast PEG method. The transformant was selected with a selective medium for acetamide utilization ability. The composition of the medium is as follows.
2％ グルコース、1.1M ソルビトール、2％ agar、0.2％ KH2PO4(pH5.5)、0.06％ CaCl2・2H2O、0.06％ CsCl2、0.06％ MgSO4・7H2O、0.06％ Acetamide solution、0.1％ Trace element
得られた9株の形質転換体のBGL1の発現を確認するために、胞子106個を、Trichoderma reesei用液体培地5mLを含むφ20試験管に植菌した。培地の組成は次の通りである。
2% glucose, 1.1M sorbitol, 2% agar, 0.2% KH 2 PO 4 (pH 5.5), 0.06% CaCl 2 · 2H 2 O, 0.06% CsCl 2 , 0.06% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.06% Acetamide solution, 0.1% Trace element
To confirm the expression of BGL1 transformants obtained 9 strain, 10 6 spores were inoculated into φ20 tubes containing liquid medium 5mL for Trichoderma reesei. The composition of the medium is as follows.
1％ Avicel、0.14％ (NH4)2SO4、0.2％ KH2PO4、0.03％ CaCl2・2H2O、0.03％ MgSO4・7H2O、0.1％ Bacto Polypepton、0.05％ Bacto Yeast extract、0.1％ Tween 80、0.1％ Trace element、pH4.0 終濃度で50mM Tartrate buffer
なお、Trace elementの組成は次の通りである。
1% Avicel, 0.14% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.2% KH 2 PO 4 , 0.03% CaCl 2 · 2H 2 O, 0.03% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.1% Bacto Polypepton, 0.05% Bacto Yeast extract, 0.1% Tween 80, 0.1% Trace element, 50mM Tartrate buffer at pH4.0 final concentration
The composition of the trace element is as follows.
6mg H3BO3、26mg (NH4)6MO7O24・4H2O、100mg FeCl3・6H2O、40mg、CuSO4・5H2O、8mg MnCl2・4H2O、200mg ZnCl2を蒸留水で100ml
120spm、28℃で3日間培養した培養液を、10000rpm、5分、4℃で遠心分離し、培養上清10μLを採取し、SDS-PAGEに供した。その結果を図２に示す。形質転換体には、PC-3-7株に見られない130kDa程度の分子量のややスメアなタンパク質バンドが認められたことから、A.aculeatus由来BGL1が発現していることが判明した。
6 mg H 3 BO 3 , 26 mg (NH 4 ) 6 MO 7 O 24・ 4H 2 O, 100 mg FeCl 3・ 6H 2 O, 40 mg, CuSO 4・ 5H 2 O, 8 mg MnCl 2・ 4H 2 O, 200 mg ZnCl 2 100ml with distilled water
The culture solution cultured at 120 spm for 3 days at 28 ° C. was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and 10 μL of the culture supernatant was collected and subjected to SDS-PAGE. The result is shown in FIG. In the transformant, a slightly smeared protein band with a molecular weight of about 130 kDa that was not found in the PC-3-7 strain was observed, indicating that BGL1 derived from A. aculeatus was expressed.
また、8番の形質転換体では、XYNIIIのタンパク質を示すバンドが消失していることから、相同組換えが生じたと考えられ、一方、6番の形質転換体では、このバンドが存在していることから、非相同組換えが生じたと考えられた。それぞれの形質転換体からゲノムDNAを調製して、PCRを行った結果、実際に、8番の形質転換体では、相同組換えが生じており、一方、6番の形質転換体では、非相同組換えが生じていることが、確認された。 In addition, in the transformant No. 8, the band indicating the protein of XYNIII disappeared, so it is considered that homologous recombination occurred, whereas in the transformant No. 6, this band was present. Therefore, it was considered that non-homologous recombination occurred. As a result of preparing genomic DNA from each transformant and performing PCR, in fact, homologous recombination occurred in the transformant of No. 8, whereas non-homologous in the transformant of No.6. It was confirmed that recombination had occurred.
[実施例４]
Trichoderma reesei PC-3-7株（WT）と実施例３で作製された、相同組換えが生じた形質転換体および非相同組換えが生じた形質転換体のそれぞれの胞子107個をTrichoderma reesei用液体培地（実施例３と同様）50mLを含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらに、Miracloth(コスモバイオ社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。
[Example 4]
Trichoderma reesei PC-3-7 strain (WT) as in fabricated in Example 3, a phase each of spores 10 7 to Trichoderma reesei transformants homologous recombination is the transformants and non-homologous recombination occurred occurred Inoculated into a 300 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of liquid medium (same as Example 3). After culturing at 220 rpm and 28 ° C. for 7 days, the culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes, the separated culture supernatant was further filtered with Miracloth (Cosmo Bio), and the obtained filtrate was used as an enzyme solution.
［実施例５］
実施例３で作製した相同組換えの形質転換体の胞子107個を、Trichoderma reesei用液体培地（実施例３と同様）に0.5％バーチウッドキシランを添加した培地を50mL含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらに、Miracloth(コスモバイオ社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。
[Example 5]
10 7 spores of the transformant of homologous recombination prepared in Example 3 were planted in a 300 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of a medium supplemented with 0.5% birchwood xylan in a liquid medium for Trichoderma reesei (similar to Example 3). Fungus. After culturing at 220 rpm and 28 ° C. for 7 days, the culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes, the separated culture supernatant was further filtered with Miracloth (Cosmo Bio), and the obtained filtrate was used as an enzyme solution.
［実施例６］
実施例４および５で得られた酵素液について、FPU活性、CMC分解活性、セロビオースを基質としたBGL活性、キシラナーゼ活性、およびβ-キシロシダーゼ活性を測定した（表１）。比較例として、Accellerase1500（Genencor社）とCellic CTec（Novozymes社）について同様に活性測定した。ここで、FPU活性は、NREL(National Renewable Energy Laboratory:USA)のMeasurment of Cellulase Activities Laboratory Analytical Procedure(LAP)に準拠して測定した。CMC分解活性は、Sigma社のカルボキシメチルセルロース（Low viscosity）を用い、基質濃度1(w/v)％、pH5.0、50℃、15分間の反応により生成した還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸を用いる定量法(DNS法)でグルコースを標準にして定量し測定した。BGL活性は、基質セロビオース濃度20mM、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成したグルコースを酵素法（和光純薬：グルコースCIIテストワコー）で定量し測定した。キシラナーゼ活性は、Sigma社のBirchwood xylanを用い、基質濃度1(w/v)％、pH5.0、37℃、10分間の反応により生成したキシロースをDNS法によりキシロースを標準にして定量し測定した。β-キシロシダーゼ活性は、Sigma社の4-Nitrophenyl β-D-xylopyranosaideを用い、基質濃度1mM、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成した4-Nitrophenylを定量し測定した。また、タンパク質量は、Bio-rad Laboratories, Inc.のQuick Start Bradford Protein Assay キットによりBovine Gamma Globulinを標準として定量した。これらの酵素活性の値とタンパク質量から比活性（U/mg）を求めた。得られた結果を表１に示した。
[Example 6]
The enzyme solutions obtained in Examples 4 and 5 were measured for FPU activity, CMC degradation activity, BGL activity using cellobiose as a substrate, xylanase activity, and β-xylosidase activity (Table 1). As comparative examples, Accellerase 1500 (Genencor) and Cellic CTec (Novozymes) were similarly measured for activity. Here, FPU activity was measured in accordance with NREL (National Renewable Energy Laboratory: USA) Measurment of Cellulase Activities Laboratory Analytical Procedure (LAP). CMC degradation activity uses 3,5-dinitrosalicylic acid as a reducing sugar produced by reaction with Sigma's carboxymethylcellulose (Low viscosity) at a substrate concentration of 1 (w / v)%, pH 5.0, 50 ° C. for 15 minutes. Quantitative measurement using glucose (DNS method) with glucose as standard. BGL activity was measured by quantifying glucose produced by the reaction of substrate cellobiose concentration 20 mM, pH 5.0, 50 ° C. for 10 minutes by the enzymatic method (Wako Pure Chemical Industries: Glucose CII Test Wako). The xylanase activity was measured using a Sigma Birchwood xylan, and the xylose produced by the reaction at a substrate concentration of 1 (w / v)%, pH 5.0, 37 ° C. for 10 minutes was quantified by the DNS method using xylose as a standard. . β-xylosidase activity was determined by quantifying 4-Nitrophenyl produced by a reaction at a substrate concentration of 1 mM, pH 5.0, 50 ° C. for 10 minutes using Sigma 4-Nitrophenyl β-D-xylopyranosaide. The amount of protein was quantified using Biovine Laboratories, Inc.'s Quick Start Bradford Protein Assay Kit with Bovine Gamma Globulin as a standard. Specific activity (U / mg) was determined from these enzyme activity values and protein content. The obtained results are shown in Table 1.
［実施例７］
稲わら（多収穫米K226）粉砕物（100〜200μm）21gを0.5(w/v)％苛性ソーダ溶液700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で100℃で5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた処理物（サンプルNo.K107）の組成は、セルロース52.6（w/w）％、ヘミセルロース24.2(w/w)％、リグニン3.8(w/w)％、灰分5.4(w/w)％であった。
[Example 7]
21g of rice straw (multi-harvest rice K226) pulverized product (100-200μm) is suspended in 700ml of 0.5 (w / v)% caustic soda solution so that the slurry concentration becomes 3% (w / v). And heat-treated at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the processed product thus obtained (Sample No. K107) is composed of cellulose 52.6 (w / w)%, hemicellulose 24.2 (w / w)%, lignin 3.8 (w / w)%, ash content 5.4 (w / w) %Met.
また、同じ稲わら粉砕物21gを1(w/v)％希硫酸溶液700ｍｌにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、同様に、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で170℃、5分間加熱処理し、同様な処理物(サンプルNo.K11)を調製した。この前処理物の組成は、セルロース49.4(w/w)％、ヘミセルロース0.3(w/w)％、リグニン20.9(w/w)％、灰分23.9(w/w)％であった。このようにして調製した稲わら前処理物K107およびK11を用いて、夫々基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例５で調製した各種酵素液を、種々の酵素濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。その後、HPLC法によって、生成したグルコースおよびキシロースを定量し、糖化率を求めた。基質としたバイオマス前処理物に含まれるセルロースおよびヘミセルロースを単糖に換算し、それらに対する遊離生成糖の割合として糖化率を算出した。次に、このようにして求めた糖化率を反応に用いた酵素量に対してプロットし、80％糖化率を示す酵素量を算出した。その結果を表２および表３にまとめた。ヘミセルラーゼが大部分残存しているアルカリ処理稲わらでは、本発明の形質転換体から生産されるセルラーゼは、最新型市販酵素と比較して、2.9〜8.9倍高機能であることが判明した。ヘミセルロースがほとんど残存していない希硫酸前処理稲わらでは、最新型市販酵素と比較して、0.95〜2.4倍であった。 In addition, 21 g of the same rice straw pulverized product was suspended in 700 ml of 1 (w / v)% dilute sulfuric acid solution to a slurry concentration of 3% (w / v). ) At 170 ° C. for 5 minutes to prepare a similar processed product (sample No. K11). The composition of the pretreated product was cellulose 49.4 (w / w)%, hemicellulose 0.3 (w / w)%, lignin 20.9 (w / w)%, and ash content 23.9 (w / w)%. Using the rice straw pretreated products K107 and K11 prepared in this way, the substrate concentration was 5 (w / v)%, the final sodium azide concentration was 0.02 (w / v)%, and the final acetate buffer concentration was 100 mM (pH 5). ) Reaction system was constructed. To this reaction system, various enzyme solutions prepared in Example 5 were added at various enzyme concentrations, and a saccharification reaction was performed at 50 ° C. for 72 hours while shaking. Then, produced | generated glucose and xylose were quantified by HPLC method and the saccharification rate was calculated | required. Cellulose and hemicellulose contained in the biomass pre-treated product as a substrate were converted to monosaccharides, and the saccharification rate was calculated as the ratio of free product sugar to them. Next, the saccharification rate thus obtained was plotted against the amount of enzyme used in the reaction, and the amount of enzyme showing an 80% saccharification rate was calculated. The results are summarized in Tables 2 and 3. In the alkali-treated rice straw in which hemicellulase remains mostly, the cellulase produced from the transformant of the present invention was found to be 2.9 to 8.9 times more functional than the latest commercial enzyme. In the dilute sulfuric acid pretreated rice straw in which almost no hemicellulose remained, it was 0.95 to 2.4 times that of the latest commercial enzyme.
なお、ここで得られた前処理物の分析は、NRELのLAP法に準拠して以下の方法で行った。前処理物を恒温乾燥機にて水分含量がおよそ10％以下になるように乾燥し、100μmのメッシュを通る程度にミルミキサーなどで粉砕した。この粉砕物を水分含量計にかけて水分を測定した。この粉砕物約100mgを耐圧ガラス管に秤り取り、72％硫酸を1mL加え、ガラス棒で1分間よく混合し、恒温水槽で30℃にて60分間インキュベートした。インキュベート中に、時々、ガラス棒で混合した。60分後、28mLの純水を加えてよく混合し、オートクレーブで121℃にて1時間処理した。よく冷めた後、絶乾したガラスフィルター（Whattman、ポアサイズ1.0mm）でろ過し、残渣をガラスフィルターごと絶乾した秤量ビンに移した。残渣は、一旦、70〜80℃で乾燥させて水分を蒸発させた後、105℃にて3時間以上乾燥し、乾燥重量を測定した。ろ液に、炭酸カルシウムを少しずつ加え、pH試験紙で確認しながら、pHを5-6に調整した。これを遠心分離（2000rpm、5分間）し、その上清を0.2μmのシリンジフィルターに通し、ポストカラム法による蛍光検出器を用い、HPLC法（カラム：Asahipak NH2P-50 4E、4mmx250mm、Lot:080806、Shodex)にて、サンプル中の糖類を定量分析した。得られた定量値から、グルコースについてはセルロース由来と、キシロース、マンノース、およびガラクトースなどはヘミセルラーゼ由来とみなし、含有率(w/w)を求めた。以下の実施例におけるセルロースおよびヘミセルロースの定量もこの方法で行った。 The pretreated product obtained here was analyzed by the following method in accordance with NREL's LAP method. The pretreated product was dried with a constant temperature dryer so that the water content was about 10% or less, and pulverized with a mill mixer or the like to pass through a 100 μm mesh. The pulverized product was subjected to a moisture content meter to measure moisture. About 100 mg of this pulverized product was weighed into a pressure-resistant glass tube, 1 mL of 72% sulfuric acid was added, mixed well with a glass rod for 1 minute, and incubated at 30 ° C. for 60 minutes in a constant temperature water bath. During incubation, occasionally mixed with a glass rod. After 60 minutes, 28 mL of pure water was added and mixed well, and the mixture was treated in an autoclave at 121 ° C. for 1 hour. After cooling well, the mixture was filtered through a completely dry glass filter (Whattman, pore size 1.0 mm), and the residue was transferred to a completely dry weighing bottle together with the glass filter. The residue was once dried at 70 to 80 ° C. to evaporate water, then dried at 105 ° C. for 3 hours or more, and the dry weight was measured. Calcium carbonate was added little by little to the filtrate, and the pH was adjusted to 5-6 while checking with pH test paper. This was centrifuged (2000 rpm, 5 minutes), the supernatant was passed through a 0.2 μm syringe filter, and a HPLC method (column: Asahipak NH2P-50 4E, 4 mm x 250 mm, Lot: 080806) using a post-column fluorescence detector. The saccharides in the sample were quantitatively analyzed by Shodex). From the obtained quantitative value, glucose was derived from cellulose, xylose, mannose, galactose and the like were regarded as derived from hemicellulase, and the content (w / w) was determined. The cellulose and hemicellulose in the following examples were also quantified by this method.
［実施例８］
ユーカリ粉砕物21gを1％(w/v)希硫酸溶液700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で180℃、5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.Y42）の組成は、セルロース57.8(w/w)％、ヘミセルロース0.2(w/w)％、リグニン36.4(w/w)％、灰分0.4(w/w)％であった。
[Example 8]
21 g of eucalyptus pulverized product was suspended in 700 ml of 1% (w / v) dilute sulfuric acid solution to a slurry concentration of 3% (w / v). Heat-treated. Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (sample No. Y42) was as follows: cellulose 57.8 (w / w)%, hemicellulose 0.2 (w / w)%, lignin 36.4 (w / w)%, ash content 0.4 (w / w) )%Met.
また、ユーカリ粉砕物21gを水700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で220℃、15分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.Y44）の組成は、セルロース60.9(w/w)％、ヘミセルロース0.6(w/w)％、リグニン34.1(w/w)％、灰分0.3(w/w)％であった。 Further, 21 g of eucalyptus pulverized product was suspended in 700 ml of water so as to have a slurry concentration of 3% (w / v), and heat-treated at 220 ° C. for 15 minutes with a batch type pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (sample No. Y44) was as follows: cellulose 60.9 (w / w)%, hemicellulose 0.6 (w / w)%, lignin 34.1 (w / w)%, ash content 0.3 (w / w) )%Met.
このようにして調製したユーカリ前処理物Y42およびY44を用いて、夫々基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例５で調製した各種酵素液を、種々の酵素濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。その後、HPLC法によって、生成したグルコースおよびキシロースを定量し、糖化率を求めた。基質としたバイオマス前処理物に含まれるセルロースおよびヘミセルロースを単糖に換算し、それらに対する遊離生成糖の割合として糖化率を算出した。次に、このようにして求めた糖化率を反応に用いた酵素量に対してプロットし、80％糖化率を示す酵素量を算出した。その結果を表４および表５にまとめた。希硫酸処理ユーカリ前処理物では、本発明の形質転換体から生産されるセルラーゼは、最新型市販酵素と比較して、1.8〜2.0倍高機能であることが判明した。水熱処理ユーカリ前処理物では、最新型市販酵素と比較して、2.0倍であった。 Using the eucalyptus pretreated products Y42 and Y44 thus prepared, the substrate concentration was 5 (w / v)%, the final sodium azide concentration was 0.02 (w / v)%, and the final acetate buffer concentration was 100 mM (pH 5). The reaction system of was constructed. To this reaction system, various enzyme solutions prepared in Example 5 were added at various enzyme concentrations, and a saccharification reaction was performed at 50 ° C. for 72 hours while shaking. Then, produced | generated glucose and xylose were quantified by HPLC method and the saccharification rate was calculated | required. Cellulose and hemicellulose contained in the biomass pre-treated product as a substrate were converted to monosaccharides, and the saccharification rate was calculated as the ratio of free product sugar to them. Next, the saccharification rate thus obtained was plotted against the amount of enzyme used in the reaction, and the amount of enzyme showing an 80% saccharification rate was calculated. The results are summarized in Tables 4 and 5. In the dilute sulfuric acid-treated eucalyptus pretreated product, the cellulase produced from the transformant of the present invention was found to be 1.8 to 2.0 times more functional than the latest commercial enzyme. The hydrothermally treated eucalyptus pre-treated product was 2.0 times as compared with the latest commercial enzyme.
［実施例９］
スギチップを2L容の水蒸気爆砕装置（月島機械製）に200ｇ充填し、240℃(3.35MPa)にて10分間水蒸気にて過熱処理した。その後、爆砕処理して前処理物を調製した。この前処理物（サンプルNo.EC11）の組成は、セルロース40.1(w/w)％、ヘミセルロース0.4(w/w)％、リグニン53.4(w/w)％、灰分0.1(w/w)％であった。
[Example 9]
200 g of a 2 liter steam explosion apparatus (manufactured by Tsukishima Kikai Co., Ltd.) was filled with cedar chips, and the mixture was overheated with steam at 240 ° C. (3.35 MPa) for 10 minutes. Thereafter, a pretreatment product was prepared by blasting treatment. The composition of this pre-treated product (sample No. EC11) is cellulose 40.1 (w / w)%, hemicellulose 0.4 (w / w)%, lignin 53.4 (w / w)%, ash content 0.1 (w / w)% there were.
このようにして調製したスギ前処理物EC11を用いて、夫々基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例５で調製した各種酵素液を、種々の酵素濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。その後、HPLC法によって、生成したグルコースおよびキシロースを定量し、糖化率を求めた。基質としたバイオマス前処理物に含まれるセルロースおよびヘミセルロースを単糖に換算し、それらに対する遊離生成糖の割合として糖化率を算出した。次に、このようにして求めた糖化率を反応に用いた酵素量に対してプロットし、80％糖化率を示す酵素量を算出した。その結果を表６にまとめた。爆砕処理スギ前処理物では、本発明の形質転換体から生産されるセルラーゼは、最新型市販酵素と比較して、1.7〜2.2倍高機能であることが判明した。 Using the cedar pretreatment EC11 prepared in this way, reactions with a substrate concentration of 5 (w / v)%, a final sodium azide concentration of 0.02 (w / v)%, and a final acetate buffer concentration of 100 mM (pH 5), respectively. A system was constructed. To this reaction system, various enzyme solutions prepared in Example 5 were added at various enzyme concentrations, and a saccharification reaction was performed at 50 ° C. for 72 hours while shaking. Then, produced | generated glucose and xylose were quantified by HPLC method and the saccharification rate was calculated | required. Cellulose and hemicellulose contained in the biomass pre-treated product as a substrate were converted to monosaccharides, and the saccharification rate was calculated as the ratio of free product sugar to them. Next, the saccharification rate thus obtained was plotted against the amount of enzyme used in the reaction, and the amount of enzyme showing an 80% saccharification rate was calculated. The results are summarized in Table 6. It was found that cellulase produced from the transformant of the present invention was 1.7 to 2.2 times more functional than the latest commercial enzyme in the blast-treated cedar pre-treated product.
［実施例１０］
実施例７で用いた稲わら粉砕物15gを1(w/v)%希硫酸溶液700ｍｌに懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で170℃で5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.K135）の組成はセルロース49.6(w/w)％、ヘミセルロース0.6(w/w)％、リグニン22.6(w/w)％、灰分24.4(w/w)％であった。また、同じ稲わら粉砕物150gを水５Lにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、流通式前処理装置（東洋高圧社製）で210℃で10分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.K143）の組成は、セルロース47.5(w/w)％、ヘミセルロース9.6(w/w)％、リグニン14.7(w/w)％、灰分14.8(w/w)％であった。
[Example 10]
15 g of the crushed rice straw used in Example 7 was suspended in 700 ml of 1 (w / v)% dilute sulfuric acid solution, and heat-treated at 170 ° C. for 5 minutes with a batch pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (Sample No. K135) is cellulose 49.6 (w / w)%, hemicellulose 0.6 (w / w)%, lignin 22.6 (w / w)%, ash content 24.4 (w / w) %Met. Further, 150 g of the same rice straw pulverized product was suspended in 5 L of water so as to have a slurry concentration of 3% (w / v), and heat-treated at 210 ° C. for 10 minutes with a flow-type pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (Sample No. K143) was as follows: cellulose 47.5 (w / w)%, hemicellulose 9.6 (w / w)%, lignin 14.7 (w / w)%, ash content 14.8 (w / w) )%Met.
実施例７記載のK107およびここで調製したK135、K143の3種のサンプルを基質として用い、糖化試験を行った。即ち、調製した稲わら前処理物3種（K107,K135,K143）のそれぞれ100mg(乾燥物基準)を20ml容ポリ瓶に秤量した。ポリ瓶に、400mM酢酸緩衝液（pH5.0）0.5ml、2（w/v）％アジ化ナトリウム溶液0.02ml、実施例4、5で調製した2種の酵素（T.reesei株PC-3-7（WT）、BGL相同組換え体）と2種の市販酵素（Accellerase1500:Genencor社、Cellic CTec:Novozymes社）のそれぞれタンパク質量3mgに相当する量を加え、最終的に水で2mlとした。これを50℃で72時間、150ストローク往復振とうで反応させた。反応終了後、反応液を沸騰水中で5分間加熱し、その後、遠心分離（13,000rpm,5分）を行い、上清液を得た。この上清液における生成還元糖を、グルコースを標準としてDNS法で定量した。その後、反応に供した前処理物中のホロセルロース含量に対する生成還元糖量を計算し、糖化率（％）とした。得られた結果を表７に示した。 A saccharification test was conducted using K107 described in Example 7 and three types of samples K135 and K143 prepared here as substrates. That is, 100 mg (based on dry matter) of each of the three types of pretreated rice straw (K107, K135, K143) was weighed into a 20 ml plastic bottle. In a plastic bottle, 0.5 ml of 400 mM acetate buffer (pH 5.0), 0.02 ml of 2 (w / v)% sodium azide solution, the two enzymes prepared in Examples 4 and 5 ( T. reesei strain PC-3 -7 (WT), BGL homologous recombinant) and 2 types of commercially available enzymes (Accellerase1500: Genencor, Cellic CTec: Novozymes), each was added in an amount corresponding to 3 mg of protein, and finally made up to 2 ml with water . This was reacted at 50 ° C. for 72 hours with 150 stroke reciprocal shaking. After completion of the reaction, the reaction solution was heated in boiling water for 5 minutes, and then centrifuged (13,000 rpm, 5 minutes) to obtain a supernatant. The produced reducing sugar in the supernatant was quantified by the DNS method using glucose as a standard. Thereafter, the amount of reducing sugar produced relative to the content of holocellulose in the pretreated product subjected to the reaction was calculated and used as the saccharification rate (%). The results obtained are shown in Table 7.
以上の結果より、T.reeseiBGL組換え株の酵素は、苛性ソーダ処理、希硫酸処理、水熱処理のいずれの前処理物を用いても、最新の市販糖化酵素に比べ極めて高い糖化性能を示すことが判明した。 From the above results, the enzyme of T. reesei BGL recombinant strain shows extremely high saccharification performance compared to the latest commercial saccharification enzyme, regardless of the pre-treatment product of caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment, or hydrothermal treatment. There was found.
[実施例１１]
エリアンサス粉砕物（100-200μm）150gを0.5％(w/v)苛性ソーダ溶液5Lにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、流通式前処理装置（東洋高圧社製）で140℃で12分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.E70）の組成は、セルロース55.6(w/w)％、ヘミセルロース23.2(w/w)％、リグニン8.8(w/w)％、灰分2.0(w/w)％であった。
[Example 11]
150g of Elianthus pulverized product (100-200μm) is suspended in 5L of 0.5% (w / v) caustic soda solution so that the slurry concentration becomes 3% (w / v). Heat treatment was performed at 140 ° C. for 12 minutes. Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (sample No. E70) was as follows: cellulose 55.6 (w / w)%, hemicellulose 23.2 (w / w)%, lignin 8.8 (w / w)%, ash content 2.0 (w / w) )%Met.
また、エリアンサス粉砕物21gを1％(w/v)希硫酸溶液700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で170℃、5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.E82）の組成は、セルロース51.6(w/w)％、ヘミセルロース2.2(w/w)％、リグニン35.4(w/w)％、灰分5.5(w/w)％であった。 In addition, 21g of Elianthus pulverized product was suspended in 700ml of 1% (w / v) dilute sulfuric acid solution to a slurry concentration of 3% (w / v), and 170 ° C using a batch pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). For 5 minutes. Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (sample No. E82) is as follows: cellulose 51.6 (w / w)%, hemicellulose 2.2 (w / w)%, lignin 35.4 (w / w)%, ash content 5.5 (w / w) )%Met.
また、エリアンサス粉砕物21gを水700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で200℃、15分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.E81）の組成は、セルロース50.9(w/w)％、ヘミセルロース7.2(w/w)％、リグニン29.8(w/w)％、灰分2.2(w/w)％であった。 In addition, 21 g of Elianthus pulverized product was suspended in 700 ml of water so as to have a slurry concentration of 3% (w / v), and heat-treated at 200 ° C. for 15 minutes with a batch type pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (sample No. E81) is as follows: cellulose 50.9 (w / w)%, hemicellulose 7.2 (w / w)%, lignin 29.8 (w / w)%, ash content 2.2 (w / w) )%Met.
こうして調製した3種のエリアンサスの前処理サンプルを用い、実施例10と同様に、4種の酵素（T.reesei株PC-3-7（WT）、BGL相同組換え体、Accellerase1500（Genencor社）、Cellic CTec（Novozymes社）の糖化性能を比較評価した。得られた結果を表８に示した。 Using the three types of pretreated samples of Elianthus prepared in this manner, as in Example 10, four types of enzymes ( T. reesei strain PC-3-7 (WT), BGL homologous recombinant, Accellerase 1500 (Genencor) The saccharification performance of Cellic CTec (Novozymes) was comparatively evaluated, and the results obtained are shown in Table 8.
この結果から、エリアンサスの場合においても、T.reeseiBGL組換え株の酵素は、苛性ソーダ処理、希硫酸処理、水熱処理のいずれの前処理物を用いても、最新の市販糖化酵素に比べ極めて高い糖化性能を示すことが判明した。 From this result, even in the case of Elianthus , the enzyme of the T. reesei BGL recombinant strain is extremely superior to the latest commercially available saccharifying enzyme, regardless of the pre-treatment product of caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment, or hydrothermal treatment. It was found to show high saccharification performance.
なお、エリアンサスについては上記の３方法、即ち、苛性ソーダ処理、希硫酸処理、水熱処理および、その他、アンモニア処理、爆砕処理を行い前処理物を調製した。その際の苛性ソーダ処理、希硫酸処理、水熱処理、アンモニア処理については実施例７記載の前処理方法に準拠し、薬品濃度、処理温度、処理時間を変えて行った。また、爆砕処理については同様に実施例９記載の方法に準拠して行った。 For Elianthus, pretreatment was prepared by performing the above three methods, that is, caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment, hydrothermal treatment, and in addition, ammonia treatment and explosion treatment. Caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment, hydrothermal treatment, and ammonia treatment at that time were carried out in accordance with the pretreatment method described in Example 7 while changing the chemical concentration, treatment temperature, and treatment time. Further, the blasting treatment was similarly performed according to the method described in Example 9.
（１）水熱処理
水熱処理で得られた結果を表９に示した。
(1) Hydrothermal treatment Table 9 shows the results obtained by the hydrothermal treatment.
苛性ソーダ処理で得られた結果を表１０に示した。
（３）希硫酸処理
希硫酸処理で得られた結果を表１１に示した。
(3) Dilute sulfuric acid treatment Table 11 shows the results obtained by the dilute sulfuric acid treatment.
（４）アンモニア処理
アンモニア処理で得られた結果を表１４に示す。尚、アンモニア処理の場合、サンプルNo.39,40,41,42,43,44についてはサンプルを１L容ポリ瓶に入れ密栓後、所定温度で処理した。No.45,46については実施例７記載のオートクレーブを用いて処理した。得られた結果を表１２に示した。
(4) Ammonia treatment Table 14 shows the results obtained by the ammonia treatment. In the case of ammonia treatment, samples No. 39, 40, 41, 42, 43, and 44 were placed in a 1 L plastic bottle and sealed at a predetermined temperature. Nos. 45 and 46 were processed using the autoclave described in Example 7. The obtained results are shown in Table 12.
（５）爆砕処理
爆砕処理で得られた結果を表１３に示した。
(5) Explosive treatment Table 13 shows the results obtained by the explosive treatment.
[実施例１２]
ユーカリ粉砕物（100-200μm）21gを0.5％(w/v)苛性ソーダ溶液700ｍｌに懸濁し、流通式前処理装置（東洋高圧社製）で200℃で10分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.Y24）の組成は、セルロース64.8（w/w）％、ヘミセルロース12.1(w/w)％、リグニン9.7(w/w)％、灰分1.6(w/w)％であった。
[Example 12]
21 g of eucalyptus ground product (100-200 μm) was suspended in 700 ml of 0.5% (w / v) caustic soda solution, and heat-treated at 200 ° C. for 10 minutes with a flow pretreatment device (manufactured by Toyo Koatsu Co., Ltd.). Thereafter, the treated product was filtered and washed with water. The composition of the pre-treated product thus obtained (Sample No. Y24) is: cellulose 64.8 (w / w)%, hemicellulose 12.1 (w / w)%, lignin 9.7 (w / w)%, ash content 1.6 (w / w) )%Met.
実施例８記載のY42、Y44およびここで調製したY24を基質として用い、実施例１０と同様な反応系を組み、4種の酵素（T.reesei株PC-3-7（WT）、BGL相同組換え体、Accellerase1500:Genencor社、Cellic CTec:Novozymes社）を作用させた。24、48、72時間目に反応液各250μｌを採取して、加熱処理および遠心分離を行った。遠心分離後の上清液中の還元糖をDNS法で定量し、糖化の変化パターンを比較した。得られた結果を図３から５に示した。 Using Y42 and Y44 described in Example 8 and Y24 prepared here as a substrate, a reaction system similar to that in Example 10 was assembled, and four enzymes ( T. reesei strain PC-3-7 (WT), BGL homology) were combined. Recombinants, Accellerase 1500: Genencor, Cellic CTec: Novozymes) were allowed to act. At 24, 48 and 72 hours, 250 μl of each reaction solution was sampled and subjected to heat treatment and centrifugation. The reducing sugars in the supernatant after centrifugation were quantified by the DNS method and the change patterns of saccharification were compared. The obtained results are shown in FIGS.
この結果から、ユーカリの場合においても、本発明の酵素、T.reeseiBGL組換え株の酵素は苛性ソーダ処理、希硫酸処理、水熱処理の何れの前処理物においても、最新の市販糖化酵素に比べ極めて高い糖化性能を示した。 From this result, even in the case of eucalyptus, the enzyme of the present invention, the enzyme of the T. reesei BGL recombinant strain, was compared with the latest commercially available saccharifying enzyme in any pre-treated product of caustic soda treatment, dilute sulfuric acid treatment and hydrothermal treatment. It showed extremely high saccharification performance.
[実施例１３]
実施例９記載のEC11を基質に用い、実施例１０と同様に、4種の酵素（T.reesei株PC-3-7（WT）、BGL相同組換え体、Accellerase1500(Genencor社)、Cellic CTec(Novozymes社）の糖化性能を比較評価した。得られた結果を表１４に示した。
[Example 13]
Using EC11 described in Example 9 as a substrate, four enzymes (T. reesei strain PC-3-7 (WT), BGL homologous recombinant, Accellerase 1500 (Genencor), Cellic CTec, as in Example 10) The saccharification performance of (Novozymes) was compared and the results obtained are shown in Table 14.
この結果から、杉の場合においても、T.reeseiBGL組換え株の酵素は、爆砕前処理物を用いた場合、最新の市販糖化酵素に比べ極めて高い糖化性能を示すことが判明した。 From these results, it was found that, even in the case of cedar, the enzyme of the T. reesei BGL recombinant strain showed extremely high saccharification performance compared to the latest commercial saccharifying enzyme when the pre-explosion treated product was used.
[実施例１４]
Sigma社のCellulose Powderを基質として用い、実施例８記載の方法で4種の酵素について糖化性能を比較評価した。得られた結果を表１５に示した。
[Example 14]
Using Sigma Cellulose Powder as a substrate, the saccharification performance of the four enzymes was compared and evaluated by the method described in Example 8. The results obtained are shown in Table 15.
この結果から、セルロースパウダーの場合においても、T.reeseiBGL組換え株の酵素は、最新の市販糖化酵素に比べ極めて高い糖化性能を示すことが判明した。 From this result, it was found that even in the case of cellulose powder, the enzyme of the T. reesei BGL recombinant strain showed extremely high saccharification performance compared to the latest commercial saccharification enzyme.
[実施例１５]
実施例７記載の稲わらの前処理物K107の10g（乾燥重量基準）を、500ml容ポリ瓶に秤採った。ポリ瓶に、50ｍM酢酸緩衝液（ｐH5.0）を160ml、2(w/v)％アジ化ナトリウム溶液を2ml、実施例４で調製したT.reeseiのBGL相同組換え株の酵素をタンパク質量80mg相当分、を加え、さらに水分が合計で200mlになるように水を添加した。この反応液を50℃、100ストローク往復振とうで72時間反応させた。この反応液を沸騰水中で5分加熱処理した後、遠心分離（13000rpm、5分）し、上清液180mlを得た。このサンプルについて、HPLC法で生成物を定量したところ、グルコースが28.9mg/ml、キシロースが12.0mg/mlであった。この結果から稲わら前処理物K107、10g(乾燥重量基準)からグルコースが5.20ｇ、キシロースが2.16gが調製できた。
[Example 15]
10 g (based on dry weight) of the pretreated rice straw K107 described in Example 7 was weighed into a 500 ml plastic bottle. In a plastic bottle, 160 ml of 50 mM acetate buffer (pH 5.0), 2 ml of 2 (w / v)% sodium azide solution, and the amount of the T. reesei BGL homologous recombination strain prepared in Example 4 A portion corresponding to 80 mg was added, and water was further added so that the total amount of water was 200 ml. This reaction solution was reacted at 50 ° C. with 100 stroke reciprocal shaking for 72 hours. This reaction solution was heated in boiling water for 5 minutes and then centrifuged (13000 rpm, 5 minutes) to obtain 180 ml of a supernatant. About this sample, when the product was quantified by HPLC method, glucose was 28.9 mg / ml and xylose was 12.0 mg / ml. From these results, 5.20 g of glucose and 2.16 g of xylose could be prepared from 10 g (dry weight basis) of the pretreated rice straw K107.
[実施例１６]
実施例１０記載のユーカリの水熱処理物Y44、7g（乾燥重量基準）を200ml容ポリ瓶に秤り採った。ポリ瓶に、50ｍM酢酸緩衝液（pH5.0）を80ml、2(w/v)％アジ化ナトリウム溶液を1ml、実施例４で調製したT.reeseiのBGL相同組換え株の酵素をタンパク質量50mg相当分、を加え、さらに水分が合計で100mlになるように水を添加した。この反応液を50℃、100ストローク往復振とうで72時間反応させた。この反応液を沸騰水中で5分加熱処理した後、遠心分離（13000rpm、5分）し、上清液93mlを得た。このサンプルについて、HPLC法で生成物を定量したところ、グルコースが42.5mg/mlとなった。この結果から、ユーカリ前処理物7gからグルコースが3.95g調製できた。
[Example 16]
Eucalyptus hydrothermally processed product Y44 described in Example 10 (7 g, based on dry weight) was weighed into a 200 ml plastic bottle. In a plastic bottle, 80 ml of 50 mM acetate buffer (pH 5.0), 1 ml of 2 (w / v)% sodium azide solution, and the amount of T. reesei BGL homologous recombination enzyme prepared in Example 4 An amount equivalent to 50 mg was added, and water was further added so that the total amount of water was 100 ml. This reaction solution was reacted at 50 ° C. with 100 stroke reciprocal shaking for 72 hours. The reaction solution was heated in boiling water for 5 minutes and then centrifuged (13000 rpm, 5 minutes) to obtain 93 ml of a supernatant. About this sample, when the product was quantified by HPLC method, glucose became 42.5 mg / ml. From this result, 3.95 g of glucose could be prepared from 7 g of the eucalyptus pretreated product.
[実施例１７]
実施例１５で調製した苛性ソーダ処理稲わら（K107）の酵素糖化液180mlをロータリーエバポレーターにて濃縮し、得られた濃縮液34mlを滅菌吸引濾過装置により無菌濾過し31mlの無菌濾液を得た。この濾液の糖組成はHPLC法による分析からグルコース153mg/ml、キシロース64mg/mlであった。
[Example 17]
180 ml of enzymatic saccharified solution of caustic soda-treated rice straw (K107) prepared in Example 15 was concentrated with a rotary evaporator, and 34 ml of the resulting concentrated solution was aseptically filtered with a sterile suction filtration device to obtain 31 ml of sterile filtrate. The sugar composition of this filtrate was 153 mg / ml glucose and 64 mg / ml xylose as analyzed by HPLC.
300mlの三角フラスコに20mlの培地溶液を入れ滅菌し、ここに25 mlの無菌濾液を無菌的に添加した。糖以外の培地成分（終濃度）は、酵母エキス（0.45％）とペプトン（0.75％）であり、培地溶液のpHは5.0に調整した。ここに、5mlの別途種培養（2％グルコース、0.45％酵母エキスおよび0.75％ペプトン、pH5.0、48時間）した酵母Kluyveromyces cellobiovorus（ATCC60381）の培養液を5ml添加し、アルコール発酵（フラスコを100rpmで振とうさせ、28℃で72時間）を行わせた。 培養後、上清液を分析したところ、グルコースとキシロースはすべて消失しており、エタノール濃度は4.4％（w/v）であった。このアルコール収率は理論量の80％であった。 A 300 ml Erlenmeyer flask was sterilized with 20 ml of the medium solution, and 25 ml of sterile filtrate was aseptically added thereto. Medium components (final concentration) other than sugar were yeast extract (0.45%) and peptone (0.75%), and the pH of the medium solution was adjusted to 5.0. To this, add 5 ml of 5 ml of the yeast Kluyveromyces cellobiovorus (ATCC60381) culture solution separately (2% glucose, 0.45% yeast extract and 0.75% peptone, pH 5.0, 48 hours) and alcohol fermentation (flask 100 rpm) And allowed to shake at 28 ° C. for 72 hours. When the supernatant was analyzed after the culture, all glucose and xylose disappeared, and the ethanol concentration was 4.4% (w / v). The alcohol yield was 80% of theory.
本発明の形質転換体が産生するセルラーゼは、高いβ-グルコシダーゼ活性および高いキシラナーゼ活性を示すため、これを用いることにより、少量でセルロース系バイオマスの糖化を完結させることができる。さらに、こうして糖化したセルロース系バイオマスを発酵させることにより、エタノールを製造することができる。本発明によれば、低価格でバイオエタノールを製造することが可能となるため、バイオエタノールの産業化に大きく貢献しうるものである。 Since the cellulase produced by the transformant of the present invention shows high β-glucosidase activity and high xylanase activity, saccharification of cellulosic biomass can be completed in a small amount by using this. Furthermore, ethanol can be produced by fermenting the saccharified cellulosic biomass. According to the present invention, it is possible to produce bioethanol at a low price, which can greatly contribute to the industrialization of bioethanol.
Claims (6)
（ａ）その培養上清のセロビオースに対するβ-グルコシダーゼ比活性が、7.0U/mg以上である
（ｂ）その培養上清のキシラナーゼ比活性が、10.0U/mg以上である The method according to claim 1, wherein the transformant has the following characteristics.
(A) β-glucosidase specific activity for cellobiose in the culture supernatant is 7.0 U / mg or more (b) xylanase specific activity in the culture supernatant is 10.0 U / mg or more
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