JP2012116826A - Titanium dioxide composite, dispersant thereof, and production method - Google Patents

Titanium dioxide composite, dispersant thereof, and production method Download PDF

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敦史 原田
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a titanium dioxide composite in which an organic compound is made complex with a titanium dioxide-containing carrier which is safe for living body and has satisfactory dispersiblity in a dispersion medium having pH close to neutrality, and the organic compound can be converted into an active type by excitation of the titanium dioxide in the carrier.SOLUTION: The titanium dioxide composite comprises an inactive organic compound composed to a carrier including a titanium dioxide fine particle and a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain, which is ion-bonded to the fine particle surface.

Description

本発明は、二酸化チタン微粒子と、該微粒子の分散性を向上させる高分子とからなる担体に、所定の有機化合物が複合化された二酸化チタンの複合体に関する。より詳細には、この複合体に紫外線または超音波を照射したときに、該二酸化チタン微粒子の励起を介して有機化合物を不活性型から活性型に変換し得ることを特徴とする、生体に投与するための二酸化チタン複合体に関する。
また、本発明は、上記の二酸化チタン複合体の分散液および製造方法に関する。
The present invention relates to a composite of titanium dioxide in which a predetermined organic compound is combined with a carrier composed of titanium dioxide fine particles and a polymer that improves the dispersibility of the fine particles. More specifically, when the complex is irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves, the organic compound can be converted from an inactive form to an active form through excitation of the titanium dioxide fine particles, and administered to a living body. The present invention relates to a titanium dioxide composite.
Moreover, this invention relates to the dispersion liquid and manufacturing method of said titanium dioxide composite.

二酸化チタンは、分散媒中において紫外線または超音波を照射されると、ヒドロキシラジカルや一重項酸素などの活性酸素種を発生する性質を有することが知られている。また、二酸化チタン自体は、生体に対して毒性がほとんどないことも知られている。そのため、二酸化チタン微粒子を生体に投与し、その活性酸素種を発生する性質を利用して、生体内の癌細胞や腫瘍組織など破壊することが試みられてきた。   Titanium dioxide is known to have a property of generating active oxygen species such as hydroxy radicals and singlet oxygen when irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves in a dispersion medium. Titanium dioxide itself is also known to have almost no toxicity to living bodies. For this reason, attempts have been made to destroy the cancer cells and tumor tissues in the living body by utilizing the property of generating the reactive oxygen species by administering titanium dioxide fine particles to the living body.

しかしながら、二酸化チタンの等電点はpH6前後であるので、中性付近のpHの分散媒中では、二酸化チタン微粒子は凝集し、沈殿してしまうという問題がある。このため、二酸化チタン微粒子自体を生体に投与することは困難であった。   However, since the isoelectric point of titanium dioxide is around pH 6, there is a problem that titanium dioxide fine particles aggregate and precipitate in a dispersion medium having a pH near neutral. For this reason, it was difficult to administer the titanium dioxide fine particles themselves to a living body.

そのような二酸化チタン微粒子の中性付近のpHでの分散性を改善することを目的として、様々な方法がこれまでに研究および開発されてきた。例えば、特許第3775432号公報(特許文献1)には、二酸化チタン微粒子の表面に親水性高分子をエステル結合させることにより、二酸化チタン微粒子を分散媒中に安定に分散させる方法が開示されている。
また、特許第4169078号公報(特許文献2)には、二酸化チタン微粒子の表面にノニオン性の水溶性高分子を結合させることにより、二酸化チタン微粒子を分散媒中に安定に分散させる方法が開示されている。
さらに、特許第4423677号公報(特許文献3)には、二酸化チタン微粒子の表面に親水性の高分子アミンを結合させて該表面を正に帯電させることにより、二酸化チタン微粒子を分散媒中に安定に分散させる方法が開示されている。
Various methods have been studied and developed so far in order to improve the dispersibility of the titanium dioxide fine particles near the neutral pH. For example, Japanese Patent No. 3775432 (Patent Document 1) discloses a method of stably dispersing titanium dioxide fine particles in a dispersion medium by esterifying a hydrophilic polymer to the surface of titanium dioxide fine particles. .
Japanese Patent No. 4169078 (Patent Document 2) discloses a method of stably dispersing titanium dioxide fine particles in a dispersion medium by bonding a nonionic water-soluble polymer to the surface of the titanium dioxide fine particles. ing.
Further, in Japanese Patent No. 443677 (Patent Document 3), titanium dioxide fine particles are stabilized in a dispersion medium by binding a hydrophilic polymer amine to the surface of titanium dioxide fine particles and positively charging the surface. A method of dispersing in is disclosed.

特開2007−63253号公報(特許文献4)には、上記のような親水性高分子を結合させた二酸化チタン微粒子に、該高分子の官能基を介して抗癌剤を結合させた二酸化チタン複合体が開示されている。なお、この二酸化チタン複合体においては、二酸化チタンの光励起により抗癌剤を分解して、その薬効を消失させることを目的としている。   Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-63253 (Patent Document 4) discloses a titanium dioxide composite in which an anticancer agent is bonded to titanium dioxide fine particles to which a hydrophilic polymer as described above is bonded via a functional group of the polymer. Is disclosed. In addition, in this titanium dioxide composite_body | complex, it aims at decomposing | disassembling an anticancer agent by the photoexcitation of titanium dioxide, and lose | disappearing the medicinal effect.

しかしながら、特許文献1および2に記載の方法により得られる二酸化チタン微粒子と高分子の複合体は、中性付近のpHの分散媒中において良好な分散性を示すものの、該複合体を得るための製造工程が煩雑であった。
特許文献3に記載の方法により得られる二酸化チタン微粒子と高分子アミンの複合体も、中性付近のpHの分散媒中において良好な分散性を示す。しかしながら、該複合体は、その表面の正電荷により、癌細胞のみならず正常細胞とも相互作用を起こし得るので、生体への安全性の点で懸念がある。
特許文献4に記載の二酸化チタン複合体も、その製造方法が煩雑である。また、該複合体においては、親水性高分子は二酸化チタン微粒子の表面にエステル結合により結合しているので、二酸化チタンの励起により該高分子が二酸化チタン微粒子から脱離するおそれがある。
However, although the composite of titanium dioxide fine particles and polymer obtained by the methods described in Patent Documents 1 and 2 shows good dispersibility in a dispersion medium having a pH near neutral, The manufacturing process was complicated.
The composite of titanium dioxide fine particles and polymer amine obtained by the method described in Patent Document 3 also exhibits good dispersibility in a dispersion medium having a pH near neutral. However, since the complex can interact with not only cancer cells but also normal cells due to the positive charge on the surface, there is a concern in terms of safety to living bodies.
The production method of the titanium dioxide composite described in Patent Document 4 is also complicated. In the composite, since the hydrophilic polymer is bonded to the surface of the titanium dioxide fine particles by an ester bond, the polymer may be detached from the titanium dioxide fine particles by excitation of titanium dioxide.

特許第3775432号公報Japanese Patent No. 3775432 特許第4169078号公報Japanese Patent No. 4169078 特許第4423677号公報Japanese Patent No. 4423676 特開2007−63253号公報JP 2007-63253 A

上記のような事情に鑑みて、本発明は、生体に安全で、中性付近のpHの分散媒中においても良好な分散性を示す、二酸化チタンを含む担体を得て、これに有機化合物を複合化させ、該有機化合物を担体中の二酸化チタンの励起により活性型に変換し得る二酸化チタン複合体を提供することを目的とする。また、本発明は、該複合体を含む分散液および該複合体を製造する方法を提供することを目的とする。   In view of the circumstances as described above, the present invention provides a carrier containing titanium dioxide that is safe for a living body and exhibits good dispersibility even in a dispersion medium having a pH near neutral, and an organic compound is added to the carrier. An object of the present invention is to provide a titanium dioxide composite which can be complexed and convert the organic compound into an active form by excitation of titanium dioxide in a carrier. Another object of the present invention is to provide a dispersion containing the complex and a method for producing the complex.

本発明者は、中性付近のpHの分散媒中では、二酸化チタン微粒子の表面が負に帯電していることに着目した。そして、該二酸化チタン微粒子の表面に、生体適合性に優れた親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子をイオン結合させることにより、中性付近のpHの分散媒中で良好な分散性を示し、かつ生体に安全に投与できる担体を得られることを見出した。
さらに、本発明者は、この担体に不活性型の有機化合物を担持させることができ、該担体中の二酸化チタン微粒子の励起により発生する活性酸素種によって、該有機化合物を活性型に変換できることを見出して、本発明を完成するに至った。
The present inventor has paid attention to the fact that the surface of titanium dioxide fine particles is negatively charged in a dispersion medium having a pH near neutral. And, by ionic bonding a cationic polymer having a hydrophilic graft chain excellent in biocompatibility on the surface of the titanium dioxide fine particles, it exhibits good dispersibility in a dispersion medium having a pH near neutrality, It was also found that a carrier that can be safely administered to a living body can be obtained.
Furthermore, the present inventor is able to support an inert organic compound on this carrier, and that the organic compound can be converted to an active type by the active oxygen species generated by the excitation of the titanium dioxide fine particles in the carrier. As a result, the present invention has been completed.

すなわち、本発明によれば、二酸化チタン微粒子と、その微粒子表面にイオン結合する、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とからなる担体に、不活性型の有機化合物が複合化されてなり、複合化された担体に紫外線または超音波を照射したときに、前記二酸化チタン微粒子の励起を介して前記有機化合物を活性型に変換し得ることを特徴とする、生体に投与するための二酸化チタン複合体が提供される。
また、本発明によれば、上記の二酸化チタン複合体の分散液および製造方法が提供される。
That is, according to the present invention, an inert organic compound is combined with a carrier composed of titanium dioxide fine particles and a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain ionically bonded to the surface of the fine particles. When the composite carrier is irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves, the organic compound can be converted into an active form through excitation of the titanium dioxide fine particles, for administration to a living body A titanium dioxide composite is provided.
Moreover, according to this invention, the dispersion liquid and manufacturing method of said titanium dioxide composite are provided.

本発明によれば、中性付近のpHの分散媒中においても良好な分散性を示し、また、生体適合性親水性グラフト鎖を有するので、生体に対して安全に投与できる二酸化チタン複合体を提供することができる。また、本発明によれば、この二酸化チタン複合体の分散液および該複合体の簡便な製造方法を提供することができる。   According to the present invention, a titanium dioxide composite which exhibits good dispersibility even in a dispersion medium having a pH near neutrality and has a biocompatible hydrophilic graft chain, can be safely administered to a living body. Can be provided. Further, according to the present invention, it is possible to provide a dispersion of the titanium dioxide composite and a simple method for producing the composite.

pHの異なる分散媒中に、二酸化チタン微粒子または本発明の二酸化チタン複合体に用いられる担体を分散させたときの分散液の写真である。2 is a photograph of a dispersion liquid when titanium dioxide fine particles or a carrier used in the titanium dioxide composite of the present invention is dispersed in dispersion media having different pHs. 塩濃度の異なる分散媒中に、本発明の二酸化チタン複合体に用いられる担体を分散させたときの分散液の写真である。It is a photograph of the dispersion liquid when the carrier used for the titanium dioxide composite of the present invention is dispersed in dispersion media having different salt concentrations. アミノフェニルフルオロセイン(APF)を含む、各担体の分散液に超音波を照射したときの、APFから生成されるフルオロセインの蛍光強度を示したグラフである。It is the graph which showed the fluorescence intensity of the fluorescein produced | generated from APF when an ultrasonic wave was irradiated to the dispersion liquid of each support | carrier containing aminophenyl fluorescein (APF). 各担体を培養細胞に投与したときの該細胞の生存率を示したグラフである。It is the graph which showed the survival rate of this cell when each support | carrier is administered to a cultured cell. 本発明の二酸化チタン複合体をゲル浸透クロマトグラフィーにより測定したときの溶出チャートである。It is an elution chart when the titanium dioxide composite of the present invention is measured by gel permeation chromatography. 二酸化チタン複合体(実施例1)を培養細胞に投与し、これに超音波を照射したときの細胞の写真である。It is a photograph of a cell when a titanium dioxide complex (Example 1) is administered to a cultured cell and this is irradiated with ultrasonic waves. 二酸化チタン複合体(実施例2)を培養細胞に投与し、これに超音波を照射したときの細胞の写真である。It is a photograph of a cell when a titanium dioxide complex (Example 2) is administered to a cultured cell and this is irradiated with ultrasonic waves. 二酸化チタン複合体(実施例3)または担体(製造例5)を培養細胞に投与し、これらに超音波を照射したときの各条件下での細胞の生存率を示したグラフである。It is the graph which showed the survival rate of the cell under each condition when a titanium dioxide complex (Example 3) or a support | carrier (manufacture example 5) is administered to a cultured cell and these are irradiated with an ultrasonic wave.

本明細書において「担体」とは、有機化合物を担持させて、生体に投与するための担体を意味する。そのような担体には、当該技術において、ドラッグデリバリーシステム(DDS)として用いられる、投与対象の組織、器官または病変部位などの標的部位にのみ薬剤を送達させるための担体も含まれる。   In the present specification, the “carrier” means a carrier for carrying an organic compound and administering it to a living body. Such carriers also include carriers used in the art as drug delivery systems (DDS) for delivering a drug only to a target site, such as a tissue, organ or lesion site to be administered.

本発明の二酸化チタン複合体の構成要素の一つである担体は、二酸化チタン微粒子と、その微粒子表面にイオン結合する、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とからなることを特徴とする。
本明細書において、上記の担体には、二酸化チタン微粒子の表面に、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子がイオン結合してなる担体のみならず、該高分子により二酸化チタン微粒子の表面が被覆または修飾されてなる担体も含まれる。
The carrier that is one of the components of the titanium dioxide composite of the present invention is characterized by comprising titanium dioxide fine particles and a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain that is ionically bonded to the surface of the fine particles. And
In the present specification, the carrier includes not only a carrier in which a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain is ionically bonded to the surface of the titanium dioxide fine particles, but also the titanium dioxide fine particles by the polymer. A carrier whose surface is coated or modified is also included.

上記の担体に含まれる二酸化チタン微粒子は、分散媒中で紫外線または超音波の照射により励起されるもの、すなわち、紫外線または超音波の照射により活性酸素種を発生するものであれば特に限定されない。なお、二酸化チタンの結晶型は、アナターゼ型、ルチル型およびブルッカイト型のいずれであってもよい。   The titanium dioxide fine particles contained in the carrier are not particularly limited as long as they are excited by irradiation with ultraviolet rays or ultrasonic waves in a dispersion medium, that is, generate active oxygen species by irradiation with ultraviolet rays or ultrasonic waves. The crystal form of titanium dioxide may be any of anatase type, rutile type and brookite type.

二酸化チタン微粒子の体積平均粒径は特に限定されないが、本発明の二酸化チタン複合体の組織、器官または病変部位への蓄積を考慮すれば、1〜50 nm、好ましくは5〜20 nmである。なお、二酸化チタン微粒子は、1つの粒子であってもよく、複数の粒子からなる塊であってもよい。   The volume average particle diameter of the titanium dioxide fine particles is not particularly limited, but it is 1 to 50 nm, preferably 5 to 20 nm in consideration of accumulation of the titanium dioxide composite of the present invention in a tissue, organ or lesion site. The titanium dioxide fine particles may be a single particle or a mass composed of a plurality of particles.

本明細書において、「生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子」とは、カチオン性高分子に生体適合性親水性グラフト鎖を結合させたグラフト共重合体を意味する。
また、本明細書において、「生体適合性親水性グラフト鎖」(以下、単に「グラフト鎖」ともいう)とは、生体の組織および細胞に対して低毒性であり、かつ生体において免疫反応や血栓形成反応などを引き起こさない親水性高分子で構成されるグラフト鎖を意味する。そのような親水性高分子の生体適合性は、当該技術においてそれ自体公知の方法や試験によって確認できる。そのような方法としては、例えば、該高分子の溶液を培養細胞に添加した後に、該細胞の生存数を計測すること、ELISA法により炎症性サイトカインなどの産生量を測定することなどが挙げられる。
In the present specification, the “cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain” means a graft copolymer obtained by binding a biocompatible hydrophilic graft chain to a cationic polymer.
Further, in this specification, “biocompatible hydrophilic graft chain” (hereinafter, also simply referred to as “graft chain”) is low toxic to living tissues and cells, and immune reactions and thrombi in the living body. It means a graft chain composed of a hydrophilic polymer that does not cause a formation reaction. The biocompatibility of such a hydrophilic polymer can be confirmed by a method or test known per se in the art. Examples of such a method include, after adding the polymer solution to cultured cells, measuring the number of surviving cells, and measuring the production amount of inflammatory cytokines by ELISA. .

上記のカチオン性高分子は、複数のアミノ基を有する高分子であれば特に限定されないが、好ましくは、アミノ基を含む側鎖を複数有する水溶性高分子である。そのようなカチオン性高分子としては、例えばポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミダゾール、またはカチオン性官能基を含む側鎖を有するポリアミノ酸、例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンなどが挙げられる。それらの中でも、ポリアリルアミンおよびポリリシンが好ましく、ポリアリルアミンがより好ましい。   The cationic polymer is not particularly limited as long as it has a plurality of amino groups, but is preferably a water-soluble polymer having a plurality of side chains containing amino groups. Examples of such cationic polymers include polyallylamine, polyethyleneimine, polyvinylamine, polyvinylamidazole, or polyamino acids having a side chain containing a cationic functional group, such as polylysine, polyarginine, and polyhistidine. . Among these, polyallylamine and polylysine are preferable, and polyallylamine is more preferable.

上記のカチオン性高分子の平均分子量は特に限定されないが、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)により測定した数平均分子量が1,000〜100,000、好ましくは、5,000〜50,000である。
また、本発明の二酸化チタン複合体中の担体において、カチオン性高分子と二酸化チタン微粒子との重量比(カチオン性高分子/二酸化チタン微粒子)は、好ましくは0.5〜5であり、より好ましくは1〜2である。
Although the average molecular weight of said cationic polymer is not specifically limited, For example, the number average molecular weight measured by gel permeation chromatography (GPC) is 1,000-100,000, Preferably, it is 5,000-50,000.
In the carrier in the titanium dioxide composite of the present invention, the weight ratio of the cationic polymer to the titanium dioxide fine particles (cationic polymer / titanium dioxide fine particles) is preferably 0.5 to 5, and more preferably 1. ~ 2.

上記のグラフト鎖に用い得る高分子としては、例えばエチレングリコール、グルコース、アクリルアミド誘導体、または2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンなどのメタクリルアミド誘導体をモノマー単位として有する(共)重合体が挙げられる。そのような(共)重合体の中でも、ポリエチレングリコール、デキストランおよびポリメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましく、ポリエチレングリコールがより好ましい。   Examples of the polymer that can be used for the graft chain include (co) polymers having, as monomer units, ethylene glycol, glucose, acrylamide derivatives, or methacrylamide derivatives such as 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Among such (co) polymers, polyethylene glycol, dextran and polymethacryloyloxyethyl phosphorylcholine are preferable, and polyethylene glycol is more preferable.

上記のグラフト鎖の平均分子量は特に限定されないが、例えば、GPCにより測定した数平均分子量が1,000〜20,000、好ましくは2,000〜10,000である。   The average molecular weight of the graft chain is not particularly limited. For example, the number average molecular weight measured by GPC is 1,000 to 20,000, preferably 2,000 to 10,000.

上記のグラフト鎖を有するカチオン性高分子は、例えば、カチオン性高分子に生体適合性親水性高分子をグラフト共重合させる方法によって得ることができる。そのような方法は特に限定されず、当該技術においてそれ自体公知の方法から適宜選択できるが、例えばGrafting-to法、Grafting-from法、Macromonomer法などが挙げられる。   The cationic polymer having the graft chain can be obtained, for example, by a method of graft copolymerizing a biocompatible hydrophilic polymer with the cationic polymer. Such a method is not particularly limited and can be appropriately selected from methods known per se in the art. Examples thereof include Grafting-to method, Grafting-from method, Macromonomer method and the like.

カチオン性高分子に対する生体適合性親水性グラフト鎖の導入比率は、通常1〜80%であり、好ましくは10〜40%である。
なお、本明細書において、「カチオン性高分子に対する生体適合性親水性グラフト鎖の導入比率」とは、1分子のカチオン性高分子を構成するモノマー単位のうち、生体適合性親水性グラフト鎖を結合しているモノマー単位の割合を百分率で示したものを意味する。
The introduction ratio of the biocompatible hydrophilic graft chain to the cationic polymer is usually 1 to 80%, preferably 10 to 40%.
In this specification, “introduction ratio of biocompatible hydrophilic graft chain to cationic polymer” refers to the biocompatible hydrophilic graft chain among the monomer units constituting one molecule of the cationic polymer. It means the percentage of monomer units bonded in percentage.

上記のグラフト鎖を共有結合によりカチオン性高分子に結合させる場合は、カチオン性高分子のアミノ基が1つ失われることになる。そのため、1分子のカチオン性高分子において、グラフト鎖の数が過剰であると、二酸化チタン微粒子とのイオン結合に影響を与え得る。したがって、上記の場合では、カチオン性高分子に対するグラフト鎖の導入比率は、好ましくは1〜50%であり、より好ましくは1〜40%である。   When the above graft chain is bonded to the cationic polymer by a covalent bond, one amino group of the cationic polymer is lost. Therefore, in one molecule of the cationic polymer, if the number of graft chains is excessive, ionic bonding with the titanium dioxide fine particles can be affected. Therefore, in the above case, the graft chain introduction ratio to the cationic polymer is preferably 1 to 50%, more preferably 1 to 40%.

グラフト鎖を有するカチオン性高分子は、そのアミノ基が有する正電荷により、負に帯電している二酸化チタン微粒子の表面にイオン結合することができる。両者のイオン結合は、当該技術においてそれ自体公知の分析方法により確認できる。
例えば、高濃度の塩化ナトリウムを含む、グラフト鎖を有するカチオン性高分子の水溶液と、二酸化チタン微粒子の酸性分散液とを混合し、得られた混合液のpHを中性に調整した際に、二酸化チタン微粒子の凝集および沈殿の発生を確認する方法が挙げられる。この方法では、高塩濃度の条件下に多量に存在するイオンにより、イオン結合の形成が阻害されるので、上記の高分子と二酸化チタン微粒子とがイオン結合していたことを確認できる。
The cationic polymer having a graft chain can be ionically bonded to the surface of the negatively charged titanium dioxide fine particles by the positive charge of the amino group. Both ionic bonds can be confirmed by analytical methods known per se in the art.
For example, when an aqueous solution of a cationic polymer having a graft chain containing a high concentration of sodium chloride and an acidic dispersion of titanium dioxide fine particles are mixed, and the pH of the resulting mixture is adjusted to neutral, A method for confirming the occurrence of aggregation and precipitation of titanium dioxide fine particles may be mentioned. In this method, since the formation of ionic bonds is inhibited by ions that are present in large amounts under high salt concentration conditions, it can be confirmed that the above-described polymer and titanium dioxide fine particles were ion-bonded.

本発明の二酸化チタン複合体を構成する担体においては、上記のグラフト鎖の存在により、該担体の表面が電気的に中性となる。すなわち、本発明の実施形態においては、該担体の表面電位(ゼータ電位)は、通常+10 mV以下、好ましくは+5mV以下、より好ましくは+2mV以下である。
本発明の二酸化チタン複合体を構成する担体の体積平均粒径は特に限定されないが、細胞、組織、器官または病変部位への蓄積を考慮すれば、通常10〜400 nm、好ましくは50〜300 nmである。
In the carrier constituting the titanium dioxide composite of the present invention, the presence of the graft chain makes the surface of the carrier electrically neutral. That is, in the embodiment of the present invention, the surface potential (zeta potential) of the carrier is usually +10 mV or less, preferably +5 mV or less, more preferably +2 mV or less.
The volume average particle diameter of the carrier constituting the titanium dioxide composite of the present invention is not particularly limited, but considering accumulation in cells, tissues, organs or lesion sites, it is usually 10 to 400 nm, preferably 50 to 300 nm. It is.

本発明の二酸化チタン複合体は、上記の担体に不活性型の有機化合物が複合化されてなることを特徴とする。ここで、「複合化」とは、上記の担体に不活性型の有機化合物が担持されている状態であれば特に限定されない。
本発明の二酸化チタン複合体において、不活性型の有機化合物が担体に複合化される原理は特に限定されない。例えば、該化合物は、その疎水性に起因する物理的吸着により担体の高分子層に複合化されていてもよく、また、担体の生体適合性親水性グラフト鎖を介して該化合物が保持されることにより複合化していてもよい。本発明の実施形態においては、不活性型の有機化合物がその疎水性に起因する物理的吸着により担体の高分子層に複合化されていることが好ましい。
The titanium dioxide composite of the present invention is characterized in that an inert organic compound is combined with the above carrier. Here, “composite” is not particularly limited as long as it is in a state where an inert organic compound is supported on the carrier.
In the titanium dioxide composite of the present invention, the principle by which the inert organic compound is combined with the carrier is not particularly limited. For example, the compound may be complexed to the polymer layer of the carrier by physical adsorption due to its hydrophobicity, and the compound is retained via the biocompatible hydrophilic graft chain of the carrier. It may be compounded by. In the embodiment of the present invention, it is preferable that the inactive organic compound is combined with the polymer layer of the carrier by physical adsorption due to its hydrophobicity.

なお、本明細書において、有機化合物の疎水性については「第14改正 日本薬局方解説書」(東京廣川書店、A-14、通則23(2001))に記載される「溶解性」の定義を参照する。すなわち、本明細書において、疎水性(溶解性)は、有機化合物を粉末にして水中に入れ、20±5℃で5分後ごとに30秒間強く振り混ぜるとき、30分以内に溶ける度合として定義される。この定義において、該有機化合物を1g溶かすために必要な水の量が100 ml以上1,000 ml未満である場合を「水に溶けにくい」、1,000 ml以上10,000 ml未満である場合を「水に極めて溶けにくい」、10,000 ml以上である場合を「水にほとんど溶けない」と表現する。本発明の実施形態において、不活性型の有機化合物としては、水に溶けにくいか若しくは極めて溶けにくいか、または水にほとんど溶けない有機化合物が好ましい。   In this specification, for the hydrophobicity of organic compounds, the definition of “solubility” described in “14th revised Japanese Pharmacopoeia Description” (Tokyo Yodogawa Shoten, A-14, General Rules 23 (2001)) is used. refer. That is, in this specification, hydrophobicity (solubility) is defined as the degree to which an organic compound dissolves within 30 minutes when put into water and shaken vigorously for 30 seconds every 20 minutes at 20 ± 5 ° C. Is done. In this definition, the case where the amount of water required to dissolve 1 g of the organic compound is 100 ml or more and less than 1,000 ml is “not easily soluble in water”, and the case where it is 1,000 ml or more and less than 10,000 ml is “very soluble in water” “It is difficult”, and the case of 10,000 ml or more is expressed as “almost insoluble in water”. In the embodiment of the present invention, the inactive organic compound is preferably an organic compound that is hardly soluble in water, extremely hardly soluble, or hardly soluble in water.

本発明の二酸化チタン複合体に含まれる不活性型の有機化合物の量は、該化合物の種類や性質によって異なるが、通常、二酸化チタン1gあたり1〜300 mg、好ましくは5〜200 mgである。   The amount of the inactive organic compound contained in the titanium dioxide composite of the present invention is usually 1 to 300 mg, preferably 5 to 200 mg per 1 g of titanium dioxide, although it varies depending on the type and properties of the compound.

本発明において「不活性型の有機化合物」は、活性酸素種と反応することにより、そのままの分子構造では所定の活性を発現しない不活型の形態から、該活性を発現できる活性型の形態へと分子構造が変換され得る有機化合物であれば特に限定されない。本発明の実施形態において、不活性型の有機化合物としては、水に溶けにくいか若しくは極めて溶けにくいか、または水にほとんど溶けない有機化合物が好ましい。また、本発明の実施形態において、不活性型の有機化合物には、医薬化合物および試薬も含まれる。
不活性型の有機化合物としては、例えば、本体の有機化合物に所定の活性を発現しないようにするための修飾基が結合されており、該修飾基が活性酸素種の作用によって脱離されることにより、該活性を発現し得る化合物が挙げられる。当該技術において、活性酸素種はエステル結合およびエーテル結合を切断することが知られているので、不活性型の有機化合物においては、上記の修飾基がエステル結合またはエーテル結合を介して本体の有機化合物に結合されていることが好ましい。なお、有機化合物の所定の活性を発現しないようにするための修飾基は、本体の有機化合物の分子構造や性質などに基づいて、当該技術において公知のものから適宜選択できる。
In the present invention, an “inactive organic compound” is reacted with an active oxygen species to change from an inactive form that does not express a predetermined activity in its intact molecular structure to an active form that can express the activity. If it is an organic compound which can convert a molecular structure, it will not specifically limit. In the embodiment of the present invention, the inactive organic compound is preferably an organic compound that is hardly soluble in water, extremely hardly soluble, or hardly soluble in water. In the embodiment of the present invention, the inactive organic compound includes a pharmaceutical compound and a reagent.
As an inactive type organic compound, for example, a modifying group for preventing a predetermined activity from being bonded to the organic compound of the main body is bonded, and the modifying group is eliminated by the action of reactive oxygen species. And compounds capable of expressing the activity. In the art, it is known that reactive oxygen species cleave ester bonds and ether bonds. Therefore, in an inactive organic compound, the above-mentioned modifying group is bonded to the main organic compound via an ester bond or an ether bond. It is preferable that it is couple | bonded with. The modifying group for preventing the predetermined activity of the organic compound from being expressed can be appropriately selected from those known in the art based on the molecular structure and properties of the organic compound of the main body.

本発明の二酸化チタン複合体をDDSの手段として用いる場合、不活性型の有機化合物としては、紫外線または超音波による二酸化チタン微粒子の励起によって発生する活性酸素種と反応することにより、そのままの分子構造では生体内において所定の薬理活性を発現しない不活型の形態から、該薬理活性を発現できる活性型の形態へと分子構造が変換され得る医薬化合物(以下、「医薬化合物前駆体」ともいう)が好ましい。そのような医薬化合物前駆体は疎水性であることがより好ましい。
上記の医薬化合物前駆体は、本体の医薬化合物に、生体内で所定の薬理活性を発現しないようにするための修飾基が結合されており、該修飾基が活性酸素種の作用によって脱離されることにより、該薬理活性を発現し得る有機化合物であれば特に限定されない。医薬化合物前駆体においては、例えば、上記の修飾基がエステル結合またはエーテル結合を介して本体の医薬化合物に結合されていることが好ましい。そのような医薬化合物前駆体は、当該技術において公知の方法により、興味対象の医薬化合物に適当な修飾基を導入することにより合成してもよい。また、市販のプロドラッグを用いることもできる。
When the titanium dioxide composite of the present invention is used as a means of DDS, the inactive organic compound is a molecular structure as it is by reacting with active oxygen species generated by excitation of titanium dioxide fine particles by ultraviolet rays or ultrasonic waves. Then, a pharmaceutical compound whose molecular structure can be converted from an inactive form that does not express a predetermined pharmacological activity in vivo to an active form that can express the pharmacological activity (hereinafter also referred to as “pharmaceutical compound precursor”) Is preferred. More preferably, such pharmaceutical compound precursors are hydrophobic.
In the above-described pharmaceutical compound precursor, a modifying group for preventing a predetermined pharmacological activity from being expressed in vivo is bonded to the pharmaceutical compound of the main body, and the modifying group is eliminated by the action of reactive oxygen species. Therefore, there is no particular limitation as long as it is an organic compound that can express the pharmacological activity. In the pharmaceutical compound precursor, for example, the above-described modifying group is preferably bound to the pharmaceutical compound of the main body via an ester bond or an ether bond. Such pharmaceutical compound precursors may be synthesized by introducing appropriate modifying groups into the pharmaceutical compound of interest by methods known in the art. Commercially available prodrugs can also be used.

具体的な医薬化合物前駆体としては、例えばカルモフール、テガフール、シンバスタチン、サラゾスルファピリジン、アシクロビル、インドメタシンファルネシル、オセルタミビル、カリソプロドール、エナラプリル、バラシクロビル、ホスアンプレナビル、レボドパ、クロラムフェニコールコハク酸エステル、シロシビン、コデイン、モルシドミン、パリペリドン、プリミドン、ジピベフリン、リスデキサンフェタミン、ドコサヘキサエン酸パクリタキセルなどが挙げられる。   Specific pharmaceutical compound precursors include, for example, carmofur, tegafur, simvastatin, salazosulfapyridine, acyclovir, indomethacin farnesyl, oseltamivir, carisoprodol, enalapril, valacyclovir, phosamprenavir, levodopa, chloramphenicol Acid esters, sirocibin, codeine, molsidomine, paliperidone, primidone, dipivefrin, risdexamphetamine, docosahexaenoic acid paclitaxel, and the like.

本発明の二酸化チタン複合体は、上記の不活性型の有機化合物が複合化された担体に紫外線または超音波を照射したときに、二酸化チタン微粒子の励起を介して上記の不活性型の有機化合物を活性型に変換し得ることを特徴とする。
すなわち、本発明の実施形態においては、本発明の二酸化チタン複合体に紫外線または超音波を照射することにより、該複合体中の二酸化チタン微粒子が励起されて活性酸素種が発生する。そして、この活性酸素種と、二酸化チタン複合体中の不活性型の有機化合物とが反応することにより、該化合物を活性型に変換することができる。
したがって、本発明の二酸化チタン複合体によれば、外部からの紫外線または超音波の照射により、複合化している有機化合物の活性を調節することができる。
The titanium dioxide composite according to the present invention is the above-mentioned inactive organic compound through excitation of titanium dioxide fine particles when the support in which the inactive organic compound is combined is irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves. Can be converted into an active form.
That is, in the embodiment of the present invention, by irradiating the titanium dioxide composite of the present invention with ultraviolet rays or ultrasonic waves, the titanium dioxide fine particles in the composite are excited to generate active oxygen species. Then, this active oxygen species reacts with the inactive organic compound in the titanium dioxide complex, whereby the compound can be converted into an active form.
Therefore, according to the titanium dioxide composite of the present invention, the activity of the combined organic compound can be adjusted by irradiation with ultraviolet rays or ultrasonic waves from the outside.

本発明の好ましい実施形態においては、ある疾患の患者に該疾患に対応する医薬化合物前駆体を複合化した本発明の二酸化チタン複合体を投与した場合、該患者の所定の部位に紫外線または超音波を照射することにより、その部位において該前駆体を本体の医薬化合物に変換できる。すなわち、該患者の特定の組織、器官または病変部位にのみ、医薬化合物の薬理活性を発現させることができる。
したがって、本発明の二酸化チタン複合体は、必要な部位でのみ薬理活性を発現させることができるので、上記の医薬化合物の副作用を低減し得る。
In a preferred embodiment of the present invention, when a titanium dioxide complex of the present invention in which a pharmaceutical compound precursor corresponding to the disease is complexed is administered to a patient with a certain disease, ultraviolet rays or ultrasonic waves are applied to a predetermined site of the patient. , The precursor can be converted into the main body pharmaceutical compound at that site. That is, the pharmacological activity of the pharmaceutical compound can be expressed only in a specific tissue, organ or lesion site of the patient.
Therefore, since the titanium dioxide complex of the present invention can express pharmacological activity only at a necessary site, side effects of the above-mentioned pharmaceutical compound can be reduced.

本発明の二酸化チタン複合体を投与された生体において、該複合体中の不活性型の有機化合物が活性型に変換されたか否かは、当該技術においてそれ自体公知の方法により確認することができる。例えば、本発明の二酸化チタン複合体を培養細胞に投与した場合、該細胞に超音波を照射した後に該細胞の抽出液を調製し、この抽出液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に供することにより活性型に変換された有機化合物をより検出することができる。同様に、本発明の二酸化チタン複合体をヒトに投与した場合、該ヒトの特定部位に超音波を照射した後に該ヒトから血液を採取し、この血液をHPLCに供することにより活性型に変換された有機化合物をより検出することができる。   Whether or not the inactive organic compound in the complex is converted into the active form in the living body administered with the titanium dioxide complex of the present invention can be confirmed by a method known per se in the art. . For example, when the titanium dioxide complex of the present invention is administered to cultured cells, an extract of the cells is prepared after irradiating the cells with ultrasonic waves, and the extract is subjected to high performance liquid chromatography (HPLC). The organic compound converted into the active form can be detected more. Similarly, when the titanium dioxide complex of the present invention is administered to a human, blood is collected from the human after irradiating the specific site of the human, and the blood is converted into an active form by subjecting the blood to HPLC. More organic compounds can be detected.

本発明の二酸化チタン複合体は、中性付近のpHの分散媒中においても良好に分散し、また生体適合性高分子の存在により生体に安全であるので、水、生理食塩水または生理学的に許容される緩衝液などの分散媒中に均一に分散させた、生体に投与するための分散液の形態とすることができる(以下、「本発明の分散液」という)。   The titanium dioxide composite of the present invention is well dispersed in a dispersion medium having a pH near neutral, and is safe for the living body due to the presence of the biocompatible polymer. It can be in the form of a dispersion for uniform administration in a dispersion medium such as an acceptable buffer solution (hereinafter referred to as “dispersion of the present invention”).

本発明の分散液の投与方法としては、注射(静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、脊髄内、腹腔内など)、経口、局所塗布、点眼などのいずれであってもよいが、上記の医薬化合物前駆体が担体に複合化されている場合は、生体の病変部位に本発明の二酸化チタン複合体を蓄積し得る投与方法が好ましい。   The administration method of the dispersion of the present invention may be any of injection (intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intrathecal, intraperitoneal, etc.), oral, topical application, eye drop, etc. When the above-mentioned pharmaceutical compound precursor is complexed with a carrier, an administration method capable of accumulating the titanium dioxide complex of the present invention at a lesion site in a living body is preferable.

不活性型の有機化合物が医薬化合物前駆体である場合、本発明の分散液をそのままの形態で生体に投与できるが、該前駆体の種類、投与される対象が罹患している疾患および病変部位などを考慮して、種々の剤形から適宜選択される、本発明の分散液を含む製剤とすることもできる。この製剤は、本発明の二酸化チタン複合体の分散性を阻害しない限り、医薬的に許容される添加物をさらに含んでいてもよい。   When the inactive organic compound is a pharmaceutical compound precursor, the dispersion of the present invention can be administered to a living body as it is, but the type of the precursor, the disease to be administered, and the lesion site In consideration of the above, it is also possible to obtain a preparation containing the dispersion of the present invention, which is appropriately selected from various dosage forms. This preparation may further contain a pharmaceutically acceptable additive as long as it does not inhibit the dispersibility of the titanium dioxide composite of the present invention.

本発明の分散液またはこれを含む製剤を生体に投与し、本発明の二酸化チタン複合体が生体の組織、器官または病変部位への蓄積された後、これらの部位へ紫外線または超音波を照射することにより、複合体中の二酸化チタン微粒子を介して活性酸素種を発生させ、担持している不活性型の有機化合物を活性型に変換することができる。この場合において、紫外線または超音波を照射するための装置もしくは器具としては、紫外線または超音波を生体の表面および内部に照射できるものであれば特に限定されない。
本発明の二酸化チタン複合体をヒトに投与した場合は、紫外線の照射には、例えば紫外線ランプ、紫外線ファイバーを装着した内視鏡などを用いることができる。また、超音波の照射には、例えば局所的に超音波を照射するためのプローブを有する超音波診断装置などを用いることができる。
The dispersion of the present invention or a preparation containing the dispersion is administered to a living body, and after the titanium dioxide complex of the present invention is accumulated in a tissue, organ or lesion part of the living body, these parts are irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves. Thus, the active oxygen species can be generated through the titanium dioxide fine particles in the composite, and the inactive organic compound carried can be converted into the active type. In this case, the apparatus or instrument for irradiating ultraviolet rays or ultrasonic waves is not particularly limited as long as it can irradiate ultraviolet rays or ultrasonic waves on the surface and inside of the living body.
When the titanium dioxide composite of the present invention is administered to a human, for example, an ultraviolet lamp or an endoscope equipped with an ultraviolet fiber can be used for ultraviolet irradiation. In addition, for example, an ultrasonic diagnostic apparatus having a probe for locally irradiating ultrasonic waves can be used for ultrasonic irradiation.

照射する紫外線または超音波の強度および照射時間は、生体に悪影響を及ぼさず、且つ不活性型の有機化合物を活性型に変換することができる程度であれば特に限定されない。例えば、紫外線の波長としては、通常200〜400 nm、好ましくは240〜280 nmである。超音波の周波数としては、通常10 kHz〜3MHz、好ましくは40 kHz〜2MHzである。また、紫外線または超音波の照射時間は、通常5秒〜10分、好ましくは10秒〜5分である。なお、本発明においては、超音波の方が紫外線よりも生体組織透過性が高いことから、超音波を照射することが好ましい。   The intensity of ultraviolet rays or ultrasonic waves to be irradiated and the irradiation time are not particularly limited as long as they do not adversely affect the living body and can convert an inactive organic compound into an active form. For example, the wavelength of ultraviolet light is usually 200 to 400 nm, preferably 240 to 280 nm. The frequency of the ultrasonic wave is usually 10 kHz to 3 MHz, preferably 40 kHz to 2 MHz. Moreover, the irradiation time of an ultraviolet-ray or an ultrasonic wave is 5 seconds-10 minutes normally, Preferably it is 10 seconds-5 minutes. In the present invention, since ultrasonic waves have higher biological tissue permeability than ultraviolet rays, it is preferable to irradiate ultrasonic waves.

本発明の二酸化チタン複合体の製造方法(以下、「本発明の製造方法」という)は、
(1)二酸化チタン微粒子の酸性分散液と、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子の溶液とを、pH1〜4で混合する工程と、
(2)前記工程(1)で得られた混合液のpHを7〜8に調整し、二酸化チタン微粒子と生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とをイオン結合させることにより、担体を得る工程と、
(3)前記工程(2)で得られた担体を精製する工程と、
(4)前記工程(3)で精製した担体と不活性型の有機化合物とを混合することにより、上記の担体と不活性型の有機化合物とを複合化させる工程と
を含む。
本発明の製造方法によれば、本発明の薬物送達用担体を簡便に得ることができる。
The production method of the titanium dioxide composite of the present invention (hereinafter referred to as “the production method of the present invention”)
(1) A step of mixing an acidic dispersion of fine titanium dioxide particles and a solution of a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain at pH 1 to 4,
(2) The carrier obtained by adjusting the pH of the mixed solution obtained in the step (1) to 7 to 8 and ion-bonding the titanium dioxide fine particles and the cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain. Obtaining
(3) a step of purifying the carrier obtained in the step (2);
(4) including a step of combining the carrier and the inactive organic compound by mixing the carrier purified in the step (3) and the inactive organic compound.
According to the production method of the present invention, the drug delivery carrier of the present invention can be easily obtained.

本発明の製造方法に用いられる二酸化チタン微粒子の酸性分散液は、二酸化チタン微粒子が、酸性の分散媒中に均一に分散された液であれば特に限定されない。そのような酸性分散液は、例えば、四塩化チタン水溶液または硫酸チタン水溶液を加熱し、加水分解して得られた含水二酸化チタンを硝酸、塩酸などの無機酸により解膠することにより得ることができる。また、市販の酸性二酸化チタンゾルを用いてもよい。   The acidic dispersion of titanium dioxide fine particles used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the titanium dioxide fine particles are uniformly dispersed in an acidic dispersion medium. Such an acidic dispersion can be obtained, for example, by heating a titanium tetrachloride aqueous solution or a titanium sulfate aqueous solution and peptizing hydrous titanium dioxide obtained by hydrolysis with an inorganic acid such as nitric acid or hydrochloric acid. . A commercially available acidic titanium dioxide sol may also be used.

二酸化チタン微粒子の酸性分散液の濃度は特に限定されないが、該酸性分散液に含まれる二酸化チタン微粒子の体積平均粒径が5nmの場合、通常1〜50 mg/ml、好ましくは5〜30 mg/mlである。   The concentration of the titanium dioxide fine particle acidic dispersion is not particularly limited, but when the volume average particle size of the titanium dioxide fine particles contained in the acidic dispersion is 5 nm, it is usually 1 to 50 mg / ml, preferably 5 to 30 mg / ml. ml.

本発明の製造方法に用いる生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子の溶液は、該高分子を適切な水系溶媒で溶解した溶液である。そのような水系溶媒は、続く第2工程において該高分子と二酸化チタン微粒子との複合化(イオン結合)を妨げない塩濃度の水系溶媒であれば特に限定されない。そのような水系溶媒としては、例えば水、生理食塩水などが挙げられる。   The solution of the cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain used in the production method of the present invention is a solution obtained by dissolving the polymer in an appropriate aqueous solvent. Such an aqueous solvent is not particularly limited as long as it is an aqueous solvent having a salt concentration that does not hinder the composite (ion bond) of the polymer and titanium dioxide fine particles in the subsequent second step. Examples of such an aqueous solvent include water and physiological saline.

溶液中の生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子の濃度は、特に限定されないが、カチオン性高分子と二酸化チタン微粒子との重量比(カチオン性高分子/二酸化チタン微粒子)が0.5〜5.0、好ましくは1.0〜2.0となる濃度であればよい。   The concentration of the cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain in the solution is not particularly limited, but the weight ratio of the cationic polymer to the titanium dioxide fine particles (cationic polymer / titanium dioxide fine particles) is 0.5 to The concentration may be 5.0, preferably 1.0 to 2.0.

本発明の製造方法の第1工程においては、上記の二酸化チタン微粒子の酸性分散液と、上記の高分子の溶液とを、pH2〜4で混合して原料の混合液を得る。
なお、この工程においては、pH範囲を2〜4に保つために、混合前および/または混合中に、塩酸や硝酸などの酸を、上記の混合液中に適宜添加してもよい。また、この工程は、常温および常圧の条件下で行うことができるので、上記の混合液を加熱および/または加圧することを必要としない。
In the first step of the production method of the present invention, the acidic dispersion of the titanium dioxide fine particles and the polymer solution are mixed at pH 2 to 4 to obtain a raw material mixture.
In this step, an acid such as hydrochloric acid or nitric acid may be appropriately added to the above mixed solution before and / or during mixing in order to keep the pH range from 2 to 4. Further, since this step can be performed under normal temperature and normal pressure conditions, it is not necessary to heat and / or pressurize the above-mentioned mixed solution.

次いで、本発明の製造方法の第2工程においては、上記の第1工程で得られた混合液のpHを7〜8に調整し、二酸化チタン微粒子と生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とをイオン結合させる。   Next, in the second step of the production method of the present invention, the pH of the mixed solution obtained in the first step is adjusted to 7 to 8, and the cationic property having titanium dioxide fine particles and biocompatible hydrophilic graft chains is obtained. The polymer is ionically bonded.

この工程においては、上記の混合液に、例えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリの固体または水溶液を適量添加して混合することにより、該混合液のpHを7〜8に調整する。これにより、混合液中の二酸化チタン微粒子の表面が負に帯電する。そして、グラフト鎖を有するカチオン性高分子が、イオン結合を介して該微粒子と複合化することにより、本発明の二酸化チタン複合体を構成する担体が形成される。
なお、第2工程は、常温および常圧の条件下で行うことができるので、pH調整の前後において、上記の混合液を加熱および/または加圧することを必要としない。
In this step, the pH of the mixed solution is adjusted to 7 to 8 by adding an appropriate amount of an alkali solid or aqueous solution such as sodium hydroxide or potassium hydroxide to the above mixed solution and mixing. Thereby, the surface of the titanium dioxide fine particles in the mixed solution is negatively charged. And the support | carrier which comprises the titanium dioxide composite of this invention is formed when the cationic polymer which has a graft chain combines with this microparticles | fine-particles via an ionic bond.
In addition, since the second step can be performed under conditions of normal temperature and normal pressure, it is not necessary to heat and / or pressurize the above mixed solution before and after pH adjustment.

本発明の製造方法の第3工程においては、上記の第2工程で得られた担体を精製する。精製方法としては、該担体を、二酸化チタン微粒子と複合化されなかった高分子から分離できる方法であれば特に限定されないが、例えば透析法、限外ろ過法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などが挙げられる。   In the third step of the production method of the present invention, the carrier obtained in the second step is purified. The purification method is not particularly limited as long as the carrier can be separated from the polymer that has not been complexed with the titanium dioxide fine particles, and examples thereof include dialysis, ultrafiltration, and gel filtration chromatography. .

本発明の製造方法の第4工程においては、上記の第3工程で精製した担体と不活性型の有機化合物とを混合することにより、該担体と該有機化合物とを複合化させて本発明の二酸化チタン複合体を得る。
この工程では、担体の分散液と不活性型の有機化合物の溶液とを混合することにより、両者を複合化させることが好ましい。
担体の分散液に含まれる二酸化チタンの濃度は特に限定されないが、通常0.01〜20 mg/ml、好ましくは0.1〜10 mg/mlである。また、不活性型の有機化合物の濃度は特に限定されず、適宜決定できる。なお、該有機化合物を溶解するため溶媒は、上記の複合化を妨げない性質のものであれば特に限定されない。本発明においては、上述のように、不活性型の有機化合物は疎水性の有機化合物であることが好ましいので、溶媒としては、例えばDMSO、エタノールなどの有機溶媒から適宜選択できる。
In the fourth step of the production method of the present invention, the carrier purified in the third step and the inactive organic compound are mixed to form a composite of the carrier and the organic compound. A titanium dioxide composite is obtained.
In this step, it is preferable that the carrier dispersion and the inert organic compound solution are mixed to form a composite of both.
The concentration of titanium dioxide contained in the carrier dispersion is not particularly limited, but is usually 0.01 to 20 mg / ml, preferably 0.1 to 10 mg / ml. The concentration of the inactive organic compound is not particularly limited and can be determined as appropriate. The solvent for dissolving the organic compound is not particularly limited as long as it has a property that does not hinder the above-described complexation. In the present invention, as described above, the inactive organic compound is preferably a hydrophobic organic compound, and therefore the solvent can be appropriately selected from organic solvents such as DMSO and ethanol.

第4工程において、不活性型の有機化合物の溶液の量と担体の分散液の量との割合は特に限定されないが、通常、体積比で1:1〜100であり、好ましくは1:2〜50である。
この工程においては、上記の担体と有機化合物は拡散により混合されるので、特に撹拌などを行う必要はないが、撹拌する場合の速度は特に限定されず適宜決定できる。また、混合時間は特に限定されないが、通常1〜10分であれば十分である。
第4工程においては、両者の混合が終了した後、得られた混合液を静置することが好ましい。静置する時間は特に限定されず、10分以上であれば充分である。また、一晩静置することもできる。
なお、第4工程は、常温および常圧の条件下で行うことができるので、混合および静置の際に混合液を加熱および/または加圧することを必要としない。
In the fourth step, the ratio between the amount of the inactive organic compound solution and the amount of the carrier dispersion is not particularly limited, but is usually 1: 1 to 100, preferably 1: 2 in volume ratio. 50.
In this step, since the carrier and the organic compound are mixed by diffusion, it is not necessary to perform stirring or the like. However, the speed for stirring is not particularly limited and can be appropriately determined. The mixing time is not particularly limited, but usually 1 to 10 minutes is sufficient.
In the fourth step, it is preferable that the obtained mixed solution is allowed to stand after the mixing of the two ends. The time for standing still is not particularly limited, and 10 minutes or more is sufficient. It can also be left overnight.
In addition, since the fourth step can be performed under conditions of normal temperature and normal pressure, it is not necessary to heat and / or pressurize the mixed solution during mixing and standing.

第4工程の後、必要に応じて、得られた二酸化チタン複合体を精製してもよい。精製方法は、担体に複合化されなかった不活性型の有機化合物を除去できる方法であれば特に限定されないが、例えば透析法、限外ろ過法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などが挙げられる。   After the fourth step, the obtained titanium dioxide composite may be purified as necessary. The purification method is not particularly limited as long as it can remove the inactive organic compound that has not been complexed to the carrier, and examples thereof include a dialysis method, an ultrafiltration method, and a gel filtration chromatography method.

上記の精製方法のうち、透析法、限外ろ過法またはゲルろ過クロマトグラフィー法により精製した場合、二酸化チタン複合体は水または緩衝液中に均一に分散している。この分散液から分散媒を、凍結乾燥、再沈殿法などの方法を用いて除去することにより、本発明の二酸化チタン複合体の粉体を得ることができる。
得られた粉体を、水、生理食塩水または生理学的に許容される緩衝液などの生体に投与可能な分散媒中に均一に分散させることにより、本発明の分散液を得ることができる。
さらに、本発明の実施形態においては、上記の不活性型の有機化合物が医薬化合物前駆体である場合、上記のようにして得られた二酸化チタン複合体の粉体と、当該技術において公知の医薬的に許容される添加物とを混合することにより、本発明の二酸化チタン複合体を含む医薬組成物とすることができる。
Among the above purification methods, when purified by a dialysis method, an ultrafiltration method or a gel filtration chromatography method, the titanium dioxide complex is uniformly dispersed in water or a buffer solution. By removing the dispersion medium from the dispersion using a method such as freeze drying or reprecipitation, the titanium dioxide composite powder of the present invention can be obtained.
The dispersion of the present invention can be obtained by uniformly dispersing the obtained powder in a dispersion medium that can be administered to a living body, such as water, physiological saline, or a physiologically acceptable buffer.
Furthermore, in the embodiment of the present invention, when the inactive organic compound is a pharmaceutical compound precursor, the titanium dioxide composite powder obtained as described above and a pharmaceutical known in the art are used. It can be set as the pharmaceutical composition containing the titanium dioxide composite_body | complex of this invention by mixing with a pharmaceutically acceptable additive.

以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described in detail below by examples, but the present invention is not limited to these examples.

1.本発明の二酸化チタン複合体に用いられる担体(製造例1〜4)の製造
(1)ポリアリルアミン(PAA)の脱プロトン化
ポリアリルアミン塩酸塩(1g)(数平均分子量15000:日東紡績株式会社)を1M水酸化ナトリウム水溶液(16 ml)に加え、3時間撹拌してPAA溶液を得た。次いで、該溶液を透析膜Spectra/P Membrane(分子量分画2000:SPECTRUM社)に入れ、該溶液のpHが7〜8になるまで、純水中にて24時間透析を行った。その後、透析膜から内容液を回収し、これを凍結乾燥させて、脱プロトン化されたPAA(0.58 g)を得た。以下に、このPAAの1H NMR測定値を示す。
1H NMR (400 MHz, D2O) : d 1.22, 1.53 (s, -CH2CH-), 2.61 (s, -CH2NH2-)
1. Production of carrier (Production Examples 1 to 4) used in the titanium dioxide composite of the present invention (1) Deprotonation of polyallylamine (PAA) Polyallylamine hydrochloride (1 g) (number average molecular weight 15000: Nittobo Co., Ltd.) Was added to 1M aqueous sodium hydroxide solution (16 ml) and stirred for 3 hours to obtain a PAA solution. Next, the solution was put into a dialysis membrane Spectra / P Membrane (molecular weight fraction 2000: SPECTRUM), and dialyzed in pure water for 24 hours until the pH of the solution became 7-8. Thereafter, the content liquid was recovered from the dialysis membrane and freeze-dried to obtain deprotonated PAA (0.58 g). The 1 H NMR measurement value of this PAA is shown below.
1 H NMR (400 MHz, D 2 O): d 1.22, 1.53 (s, -CH 2 CH-), 2.61 (s, -CH 2 NH 2- )

(2)ポリエチレングリコール(PEG)の活性化
アルゴン雰囲気下で、PEG(30 g)(数平均分子量2000:シグマアルドリッチ社)をTHF(400 ml)に溶解させて、PEG溶液を得た。また、アルゴン雰囲気下で、クロロギ酸(9.0
g)をTHF(20 ml)に溶解させて、クロロギ酸溶液を得た。上記のPEG溶液に、アルゴン雰囲気下でトリエチルアミン(9.4 g)を加え、さらに上記のクロロギ酸溶液を滴下した後、3日間静置した。その後、沈殿物をろ過し、得られたろ液から、溶媒を減圧留去させることにより濃縮し、クロロホルム(200 ml)に加えた後、飽和食塩水(600 ml)を用いて分液を3回行った。そして、クロロホルム層をジエチルエーテル(2000 ml)に滴下して、沈殿物を得た。この沈殿物を吸引ろ過し、ろ過物を真空条件下で乾燥させて白色固体を回収した。この固体をベンゼン(100 ml)に溶解させた後、凍結乾燥させて、再び白色固体(22.0 g)を得た。以下に、この固体の1H NMR測定値を示す。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : d 1.79 (s, THF), 3.38(s, -OCH3), 3.66 (t, -OCH2-), 4.44 (s, -CH2OCO-), 7.40 (t, -CHCNO2), 8.27 (t, -COOCCH-)
(2) Activation of polyethylene glycol (PEG) Under an argon atmosphere, PEG (30 g) (number average molecular weight 2000: Sigma-Aldrich) was dissolved in THF (400 ml) to obtain a PEG solution. Also, under an argon atmosphere, chloroformate (9.0
g) was dissolved in THF (20 ml) to obtain a chloroformate solution. Triethylamine (9.4 g) was added to the above PEG solution under an argon atmosphere, and the above chloroformate solution was further added dropwise, followed by standing for 3 days. Then, the precipitate was filtered, and the solvent was concentrated from the obtained filtrate by distilling off the solvent under reduced pressure. After adding to chloroform (200 ml), the solution was separated three times using saturated saline (600 ml). went. And the chloroform layer was dripped at diethyl ether (2000 ml), and the deposit was obtained. The precipitate was suction filtered, and the filtrate was dried under vacuum to collect a white solid. This solid was dissolved in benzene (100 ml) and then lyophilized to obtain a white solid (22.0 g) again. The 1 H NMR measurement value of this solid is shown below.
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): d 1.79 (s, THF), 3.38 (s, -OCH 3 ), 3.66 (t, -OCH 2- ), 4.44 (s, -CH 2 OCO-), 7.40 (t, -CHCNO 2 ), 8.27 (t, -COOCCH-)

(3)PEGグラフト鎖を有するPAA(PAA-g-PEG)の合成
塩化リチウム(265 mg)をメタノール(250 ml)に溶解させて、塩化リチウム溶液を得た。該溶液(110 ml)に、上記(1)で得たPAA(100 mg)を溶解させて、PAA溶液を得た。また、上記の塩化リチウム溶液(110 ml)に、上記(2)で得たPEG(535 mgまたは1070 mg)溶解させて、それぞれPEG溶液1およびPEG溶液2を得た。
(3) Synthesis of PAA having PEG graft chain (PAA-g-PEG) Lithium chloride (265 mg) was dissolved in methanol (250 ml) to obtain a lithium chloride solution. The PAA (100 mg) obtained in (1) above was dissolved in the solution (110 ml) to obtain a PAA solution. Further, PEG (535 mg or 1070 mg) obtained in (2) above was dissolved in the above lithium chloride solution (110 ml) to obtain PEG solution 1 and PEG solution 2, respectively.

上記のPAA溶液に、PEG溶液1を滴下した後、3日静置した。この溶液を透析膜Spectra/R Membrane(分子量分画15000;SPECTRUM社)に入れ、純水に対して48時間透析を行った。その後、透析膜から内容液を回収し、これに1 M HClを添加してpHを4.5に調整した。そして、この溶液を陽イオン交換カラム(SP Sepharose;アマシャム・バイオサイエンス社製)に通した後、減圧蒸留によって溶媒を蒸発させ、さらに凍結乾燥を行ってPAA-g-PEGの固体(490 mg:以下「PAA-g-PEG1」という)を得た。また、上記のPEG溶液1に代えて、PEG溶液2を用いて、同様にしてPAA-g-PEGの固体(892 mg:以下「PAA-g-PEG2」という)を得た。ここで、PAA-g-PEG1およびPAA-g-PEG2における、PAAに対するPEGグラフト鎖の導入比率は、それぞれ20%および40%であった。
また、得られた各PAA-g-PEGの分子量分布をゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)により測定した。その結果、PAA-g-PEG1およびPAA-g-PEG2の数平均分子量は、それぞれ79000および143000であった。以下に、各PAA-g-PEGの1H NMR測定値を示す。
After the PEG solution 1 was added dropwise to the PAA solution, it was allowed to stand for 3 days. This solution was put into a dialysis membrane Spectra / R Membrane (molecular weight fraction 15000; SPECTRUM) and dialyzed against pure water for 48 hours. Thereafter, the content liquid was recovered from the dialysis membrane, and 1 M HCl was added thereto to adjust the pH to 4.5. The solution was passed through a cation exchange column (SP Sepharose; manufactured by Amersham Biosciences), the solvent was evaporated by distillation under reduced pressure, and freeze-dried to obtain a PAA-g-PEG solid (490 mg: (Hereinafter referred to as “PAA-g-PEG1”). Further, in place of the PEG solution 1 described above, a PEG solution 2 was used to obtain a PAA-g-PEG solid (892 mg: hereinafter referred to as “PAA-g-PEG2”). Here, in PAA-g-PEG1 and PAA-g-PEG2, the introduction ratio of the PEG graft chain to PAA was 20% and 40%, respectively.
Moreover, the molecular weight distribution of each obtained PAA-g-PEG was measured by gel permeation chromatography (GPC). As a result, the number average molecular weights of PAA-g-PEG1 and PAA-g-PEG2 were 79000 and 143000, respectively. The 1 H NMR measurement value of each PAA-g-PEG is shown below.

(PAA-g-PEG1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) : d 1.18, 1.50 (s, -CH2CH-), 2.57 (s, -CH2NH2-), ,3.71 (t, -OCH2-), 4.21 (s, -CH2NHCOO-)
(PAA-g-PEG2)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) : d 1.19, 1.38 (s, -CH2CH-), 2.97 (s, -CH2NH2-), ,3.71 (t, -OCH2-), 4.24 (s, -CH2NHCOO-)
(PAA-g-PEG1)
1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): d 1.18, 1.50 (s, -CH 2 CH-), 2.57 (s, -CH 2 NH 2- ),, 3.71 (t, -OCH 2- ), 4.21 (s, -CH 2 NHCOO-)
(PAA-g-PEG2)
1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): d 1.19, 1.38 (s, -CH 2 CH-), 2.97 (s, -CH 2 NH 2- ),, 3.71 (t, -OCH 2- ), 4.24 (s, -CH 2 NHCOO-)

(4)二酸化チタン微粒子とPAA-g-PEGとの複合化
室温かつ大気圧下において、二酸化チタンゾルSTS-100(2.0 ml、平均粒径5nm、濃度25 mg/ml、pH1.5;石原産業株式会社製)と、各濃度のPAA-g-PEG1水溶液(23.0 ml)とを混合して、混合液を得た。なお、PAA-g-PEG1水溶液の濃度を、以下の表1に示す。
次いで、得られた混合液に0.02 M水酸化ナトリウム水溶液(5.0 ml)を滴下し、該混合液のpHを7〜8に調整することにより、担体(製造例1および2)を得た。
(4) Composite of titanium dioxide fine particles and PAA-g-PEG Titanium dioxide sol STS-100 (2.0 ml, average particle size 5 nm, concentration 25 mg / ml, pH 1.5; Ishihara Sangyo Co., Ltd.) at room temperature and atmospheric pressure And a PAA-g-PEG1 aqueous solution (23.0 ml) with each concentration were mixed to obtain a mixed solution. The concentration of the PAA-g-PEG1 aqueous solution is shown in Table 1 below.
Subsequently, 0.02 M sodium hydroxide aqueous solution (5.0 ml) was dripped at the obtained liquid mixture, and the support | carrier (manufacture example 1 and 2) was obtained by adjusting pH of this liquid mixture to 7-8.

上記のPAA-g-PEG1の水溶液にかえて、各濃度のPAA-g-PEG2の水溶液(23.0 ml)またはPAAの水溶液(23.0 ml)を用いて、上記と同様にして、それぞれ担体(製造例3および4)および比較用担体(比較例1および2)を得た。なお、用いたPAA-g-PEG2およびPAAの各水溶液の濃度を、以下の表1に示す。   Instead of the above-mentioned PAA-g-PEG1 aqueous solution, each concentration of PAA-g-PEG2 aqueous solution (23.0 ml) or PAA aqueous solution (23.0 ml) was used, respectively, in the same manner as described above. 3 and 4) and a comparative carrier (Comparative Examples 1 and 2) were obtained. The concentration of each aqueous solution of PAA-g-PEG2 and PAA used is shown in Table 1 below.

得られた各担体におけるPAAと二酸化チタン微粒子との重量比および各担体の平均粒径を、表1に示す。なお、各担体の平均粒径は動的光散乱法により測定した。また、各担体の分散液(2.0 ml)を凍結乾燥により粉体とし、これに水(2.0 ml)または生理食塩水(2.0 ml)を加えて再分散させた分散液についても平均粒径を測定した。また、製造例2および4の担体の表面電位(ゼータ電位)を測定した結果、それぞれ0.68 mVおよび0.93 mVであった。すなわち、これらの担体は、電気的に中性なPEGによってその表面が覆われていることが示された。   Table 1 shows the weight ratio of PAA to titanium dioxide fine particles and the average particle diameter of each carrier in the obtained carriers. The average particle size of each carrier was measured by a dynamic light scattering method. Also, measure the average particle size of the dispersion of each carrier (2.0 ml) that was freeze-dried and then re-dispersed with water (2.0 ml) or physiological saline (2.0 ml). did. Further, the surface potentials (zeta potentials) of the carriers of Production Examples 2 and 4 were measured and found to be 0.68 mV and 0.93 mV, respectively. That is, it was shown that the surface of these carriers was covered with electrically neutral PEG.

2.中性のpHの分散媒における担体の分散性
上記の1.で用いた二酸化チタンゾルに純水を添加して、二酸化チタン微粒子自体の水分散液(pH2.5)を得た(図1のチューブ1)。この分散液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを7.4に調整すると、二酸化チタン微粒子が凝集して白濁を生じた(図1のチューブ2)。一方、上記の1.で得られた製造例1〜4ならびに比較例1および比較例2の各担体は、pH7.4の分散媒中においても良好に分散していた(一例として、製造例2の担体の分散液を、図1のチューブ3として示す)。
図1より、二酸化チタン微粒子のみでは、中性付近のpHの分散媒中において凝集するが、二酸化チタン微粒子を高分子で複合化して得た担体は、該分散媒中でも良好に分散できることがわかる。
2. Dispersibility of carrier in dispersion medium at neutral pH Pure water was added to the titanium dioxide sol used in step 1 to obtain an aqueous dispersion (pH 2.5) of titanium dioxide fine particles themselves (tube 1 in FIG. 1). When an aqueous sodium hydroxide solution was added to this dispersion to adjust the pH to 7.4, the titanium dioxide fine particles aggregated to form white turbidity (tube 2 in FIG. 1). On the other hand, the above 1. Each of the carriers of Production Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 and 2 obtained in Example 1 was well dispersed even in a dispersion medium having a pH of 7.4 (for example, the carrier dispersion of Production Example 2 was dispersed. , Shown as tube 3 in FIG. 1).
From FIG. 1, it can be seen that only the titanium dioxide fine particles aggregate in a dispersion medium having a pH near neutral, but the carrier obtained by combining the titanium dioxide fine particles with a polymer can be well dispersed in the dispersion medium.

3.担体における二酸化チタン微粒子とグラフト鎖を有するカチオン性高分子とのイオン結合の確認
上記の製造例2の担体の製造において、二酸化チタンゾルと混合するPAA-g-PEG1溶液として、PAA-g-PEG1の水溶液(溶液Aという)を用いた場合と、PAA-g-PEG1を1M塩化トリウム水溶液に溶解させた溶液(溶液Bという)を用いた場合とを比較することにより、二酸化チタン微粒子とPAA-g-PEGとがイオン結合により複合化しているか否かを検討した。
各溶液と二酸化チタンゾルとを混合した後、24時間静置した。そして、各混合液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて、pHを7.4に調整した。その結果、溶液Aを用いた場合は、担体は分散していたが、溶液Bを用いた場合は、二酸化チタン微粒子が凝集して白濁を生じた。この結果を図2に示す。
これは、高塩濃度ではPAA-g-PEGと二酸化チタン微粒子とのイオン性相互作用が遮蔽されることによる。したがって、本発明の二酸化チタン複合体に用いられる担体においては、二酸化チタン微粒子とPAA-g-PEGとがイオン結合を介して複合化していることがわかる。
3. Confirmation of ionic bond between titanium dioxide fine particles and cationic polymer having graft chain in carrier In the production of the carrier of Production Example 2 above, as a PAA-g-PEG1 solution mixed with titanium dioxide sol, PAA-g-PEG1 By comparing the case of using an aqueous solution (referred to as Solution A) with the case of using a solution (referred to as Solution B) in which PAA-g-PEG1 is dissolved in 1M aqueous solution of thorium chloride, titanium dioxide fine particles and PAA-g We examined whether or not -PEG was complexed by ionic bonding.
Each solution and titanium dioxide sol were mixed and then allowed to stand for 24 hours. And sodium hydroxide aqueous solution was added to each liquid mixture, and pH was adjusted to 7.4. As a result, when the solution A was used, the carrier was dispersed, but when the solution B was used, the titanium dioxide fine particles aggregated to cause white turbidity. The result is shown in FIG.
This is because ionic interaction between PAA-g-PEG and titanium dioxide fine particles is shielded at high salt concentration. Therefore, it can be seen that in the carrier used in the titanium dioxide composite of the present invention, the titanium dioxide fine particles and PAA-g-PEG are complexed through ionic bonds.

4.担体の活性酸素種の発生能の検討
上記で得た担体の活性酸素種の発生能を、アミノフェニルフルオレセイン(APF:積水メディカル株式会社製)を用いて検討した。APFはそのままの分子構造では蛍光を発しないが、活性酸素種のヒドロキシラジカルと反応することにより、その修飾基が脱離してフルオレセインに変換されて、その蛍光強度が増加することが知られている試薬である。
製造例2の担体の水分散液(2991μl、二酸化チタン濃度4.0 mg/ml)に、APFのDMF溶液(9μl、5mmol/l)を添加した。そして、分散液を撹拌しながら、遮光条件下で超音波(40 kHz;AS ONE社製、1MHz;ネッパジーン社製)を照射した後、分散液について485 nmで励起したときの515 nmでの蛍光強度をマルチプレートリーダー(ARVO SX;パーキンエルマー社製)により測定した。また、製造例2の担体にかえて、比較例2の担体の水分散液を用いて同様にして、蛍光強度を測定した。これらの結果を図3に示す。
4). Examination of the ability of the carrier to generate reactive oxygen species The ability of the carrier to generate reactive oxygen species was examined using aminophenylfluorescein (APF: manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). It is known that APF does not fluoresce in its original molecular structure, but reacts with the hydroxyl radical of reactive oxygen species, so that its modifying group is eliminated and converted to fluorescein, increasing its fluorescence intensity. It is a reagent.
A DMF solution of APF (9 μl, 5 mmol / l) was added to the aqueous dispersion of the carrier of Production Example 2 (2991 μl, titanium dioxide concentration 4.0 mg / ml). Then, while stirring the dispersion, after irradiating ultrasonic waves (40 kHz; manufactured by AS ONE, 1 MHz; manufactured by Nepagene) under light-shielding conditions, the dispersion was excited at 485 nm, and the fluorescence at 515 nm was obtained. The strength was measured with a multiplate reader (ARVO SX; manufactured by PerkinElmer). Further, the fluorescence intensity was measured in the same manner using an aqueous dispersion of the carrier of Comparative Example 2 instead of the carrier of Production Example 2. These results are shown in FIG.

製造例2の担体の水分散液では、超音波の照射時間に依存した蛍光強度の増加が認められたことから、該担体は、超音波照射により活性酸素種を発生できることがわかる。また、この担体は、40 kHzおよび1MHzの超音波の照射により活性酸素種を発生できたことから、広い周波数範囲で活性酸素種を発生できると考えられる。   In the aqueous dispersion of the carrier of Production Example 2, an increase in fluorescence intensity depending on the ultrasonic irradiation time was observed, indicating that the carrier can generate reactive oxygen species by ultrasonic irradiation. In addition, since this carrier can generate reactive oxygen species by irradiation with ultrasonic waves of 40 kHz and 1 MHz, it is considered that it can generate reactive oxygen species in a wide frequency range.

5.担体の細胞に対する毒性の検討
上記で得られた担体の細胞に対する毒性の有無を、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを用いて検討した。
製造例2、製造例4および比較例2の各担体を生理食塩水に分散させて、二酸化チタン濃度が4.0 mg/mlの各分散液を得た。HeLa細胞を24ウェルプレート(NUNK社製)に5×104個/ウェルで播種し、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM培地(日水製薬株式会社)中で、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。24時間の培養後、調製した各分散液を、二酸化チタン終濃度が0.04 mg/mlとなるように各ウェルに添加して、さらに4時間培養した。そして、培地を除き、細胞を洗浄した後、10%FBSを含むDMEM培地を加え、さらに24時間培養した。その後、MTT Cell Proliferation Assay Kit(フナコシ株式会社)をキットに添付の使用説明書に従って用いて、各ウェルの吸光度を測定した。分散液を添加しなかった細胞の測定値との比較により、各担体の分散液を添加した場合の細胞生存率を算出した。この結果を図4に示す。
5. Examination of Toxicity of Carrier to Cells The presence or absence of toxicity of the carrier obtained above to cells was examined using the human cervical cancer cell line HeLa.
Each carrier of Production Example 2, Production Example 4 and Comparative Example 2 was dispersed in physiological saline to obtain each dispersion having a titanium dioxide concentration of 4.0 mg / ml. HeLa cells are seeded at 5 × 10 4 cells / well in a 24-well plate (manufactured by NUNK), and in DMEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal calf serum (FBS), 37 ° C., 5% Culturing was performed in a CO 2 atmosphere. After culturing for 24 hours, the prepared dispersions were added to each well so that the final concentration of titanium dioxide was 0.04 mg / ml, and further cultured for 4 hours. Then, after removing the medium and washing the cells, DMEM medium containing 10% FBS was added and further cultured for 24 hours. Then, the absorbance of each well was measured using MTT Cell Proliferation Assay Kit (Funakoshi Co., Ltd.) according to the instruction manual attached to the kit. The cell viability when each carrier dispersion was added was calculated by comparison with the measured value of the cells to which no dispersion was added. The result is shown in FIG.

図4より、比較例2の担体の分散液を添加した場合では、細胞の生存率は50%以下にまで低下することがわかる。すなわち、この結果は、カチオン性高分子であるPAAのみと複合化させた二酸化チタン微粒子の担体が生体に対して毒性を有することを示している。
これに対して、製造例2および4の担体の分散液を添加した場合では、細胞の生存率はほとんど低下していなかった。これは、生体適合性に優れた親水性高分子であるPEGグラフト鎖により、PAAの細胞毒性が低減されたためであると考えられる。
これらの結果より、本発明の二酸化チタン複合体に用いられる担体を、生体に対して安全に投与できることが示唆された。
FIG. 4 shows that when the carrier dispersion of Comparative Example 2 is added, the cell viability is reduced to 50% or less. That is, this result shows that the carrier of titanium dioxide fine particles complexed only with the cationic polymer PAA is toxic to the living body.
On the other hand, when the dispersions of the carriers of Production Examples 2 and 4 were added, the cell viability was hardly reduced. This is thought to be because the cytotoxicity of PAA was reduced by the PEG graft chain, which is a hydrophilic polymer excellent in biocompatibility.
From these results, it was suggested that the carrier used in the titanium dioxide composite of the present invention can be safely administered to a living body.

6.本発明の二酸化チタン複合体(実施例1および2)の製造
上記の製造例2の担体の分散液(200μl、二酸化チタン濃度4.0 mg/ml)に、0.5 mMのSinglet Oxygene Sensor Green(SOSG:Molecular Probes社製)メタノール溶液(40μl)を加えて一晩静置することにより、SOSGが担体に複合化されてなる本発明の二酸化チタン複合体(実施例1)を得た。なお、SOSGは通常、弱い青色蛍光を発する試薬であるが、一重項酸素と反応することにより、フルオロセインと同様の緑色蛍光を発することが知られている。
また、SOSG水溶液にかえて、5mMのアミノフェニルフルオレセイン(APF:積水メディカル株式会社製)DMF溶液(4μl)に生理食塩水(36μl)を混合して40μlとした溶液を用いて、同様にして、APFが担体に複合化されてなる本発明の二酸化チタン複合体(実施例2)を得た。
なお、これらの複合体において、SOSGおよびAPFが担体に担持されていることを、GPC測定を利用して確認した。具体的には、これらの分散液についてTSK Gel PW5000カラムを用いてGPC測定を行った。この測定において、二酸化チタンについては300 nm、SOSGについては514 nm、APFについては494 nmにおける吸収により検出した。この結果を図5に示す。
6). Production of Titanium Dioxide Complexes of the Present Invention (Examples 1 and 2) 0.5 mM Singlet Oxygene Sensor Green (SOSG: Molecular) was added to the carrier dispersion (200 μl, titanium dioxide concentration 4.0 mg / ml) of Production Example 2 above. Probes) methanol solution (40 μl) was added and allowed to stand overnight to obtain a titanium dioxide composite (Example 1) of the present invention in which SOSG was combined with a carrier. Note that SOSG is usually a reagent that emits weak blue fluorescence, but is known to emit green fluorescence similar to fluorescein by reacting with singlet oxygen.
In addition, in place of the SOSG aqueous solution, a physiological saline (36 μl) was mixed with 5 mM aminophenylfluorescein (APF: Sekisui Medical Co., Ltd.) DMF solution (4 μl) to make 40 μl, A titanium dioxide composite of the present invention (Example 2) obtained by combining APF with a support was obtained.
In these complexes, it was confirmed using GPC measurement that SOSG and APF were supported on the carrier. Specifically, GPC measurement was performed on these dispersions using a TSK Gel PW5000 column. In this measurement, detection was performed by absorption at 300 nm for titanium dioxide, 514 nm for SOSG, and 494 nm for APF. The result is shown in FIG.

図5に示されるように、二酸化チタンの検出チャート(300 nm)と各試薬の検出のチャート(SOSG:514 nm、APF:494 nm)において、同一溶出体積に各ピークが認められた。通常、SOSGおよびAPFをそれぞれ単独でGPC測定した場合には、このような溶出体積においてピークは認めらない。
したがって、図5より、実施例1および2の各複合体中の担体が、それぞれSOSGおよびAPFを担持していることが確認された。なお、SOSGおよびAPFは、水への溶解度が低い疎水性の試薬であるので、担体の高分子層と複合化することにより担持されていると考えられる。
As shown in FIG. 5, in the detection chart of titanium dioxide (300 nm) and the detection chart of each reagent (SOSG: 514 nm, APF: 494 nm), each peak was observed in the same elution volume. Normally, when SOSG and APF are separately measured by GPC, no peak is observed in such elution volume.
Therefore, from FIG. 5, it was confirmed that the carriers in the complexes of Examples 1 and 2 carry SOSG and APF, respectively. Since SOSG and APF are hydrophobic reagents with low solubility in water, it is considered that they are supported by being combined with the polymer layer of the carrier.

7.二酸化チタン複合体の細胞内への送達および超音波照射による細胞内での有機化合物の活性型への変換の検討
実施例1および2の二酸化チタン複合体を細胞内へ送達させ、該細胞への超音波照射によりSOSGおよびAPFが緑色蛍光を発する活性型に変換されるか否かを検討した。
実施例1および2の二酸化チタン複合体の分散液(240μl)と、DMEM培地(1760μl:日水製薬社製)とを混合して、混合液を調製した。ガラスボトムディッシュ(松並社製)にHeLa細胞(2×105個)を播種し、48時間培養した。そして、このディッシュに調製した混合液を添加して、さらに4時間培養した。その後、遮光条件下で細胞に超音波(1MHz:ネッパジーン社製)を10分間照射し、レーザー共焦点顕微鏡(ZEISS社製)により細胞を観察した。この結果を図6および図7に示す。
7). Examination of intracellular delivery of titanium dioxide complex and conversion of organic compound into active form in cells by ultrasonic irradiation Delivering the titanium dioxide complex of Examples 1 and 2 into cells, We examined whether SOSG and APF were converted to active forms emitting green fluorescence by ultrasonic irradiation.
A dispersion (240 μl) of the titanium dioxide composites of Examples 1 and 2 was mixed with a DMEM medium (1760 μl: manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) to prepare a mixed solution. A glass bottom dish (manufactured by Matsunami) was seeded with HeLa cells (2 × 10 5 cells) and cultured for 48 hours. And the liquid mixture prepared in this dish was added, and it culture | cultivated for further 4 hours. Thereafter, the cells were irradiated with ultrasonic waves (1 MHz: manufactured by Nepagene) for 10 minutes under light-shielding conditions, and the cells were observed with a laser confocal microscope (manufactured by ZEISS). The results are shown in FIG. 6 and FIG.

図6および図7より、SOSGおよびAPFのいずれを含む二酸化チタン複合体も細胞に取り込まれ、超音波照射によって該細胞内で緑色蛍光を発することが観察された。このことから、SOSGおよびAPFは二酸化チタン複合体として細胞内へ送達され、超音波照射による二酸化チタン微粒子の励起を介して、SOSGおよびAPFが蛍光を発する活性型へと変換されたことが確認された。   From FIG. 6 and FIG. 7, it was observed that the titanium dioxide complex containing both SOSG and APF was taken into the cells and emitted green fluorescence in the cells by ultrasonic irradiation. This confirms that SOSG and APF were delivered into the cell as a titanium dioxide complex, and that SOSG and APF were converted to active forms that fluoresce via excitation of titanium dioxide fine particles by ultrasonic irradiation. It was.

8.医薬化合物前駆体を含む二酸化チタン複合体(実施例3)の製造
医薬化合物前駆体と担体とを複合化した二酸化チタン複合体を製造し、これを細胞に投与して、該細胞に超音波照射した際の医薬化合物の薬効を検討する。医薬化合物前駆体として、抗癌剤の一種であるフルオロウラシルのプロドラッグである、カルモフール(1-ヘキシルカルバモイル-5-フルオロウラシル)を用いた。
(1)プロドラッグを含む本発明の二酸化チタン複合体の製造
室温かつ大気圧下において、二酸化チタンゾル(1.0 ml、平均粒径5nm、濃度2.675 mg/ml、pH1.5;石原産業株式会社)と、PAA-g-PEG1水溶液(4.0 ml、23.75 ml/ml)とを混合して、混合液を得た。得られた混合液に0.02 M水酸化ナトリウム水溶液を滴下して該混合液のpHを7〜8に調整することにより、担体(二酸化チタン濃度0.445 mg/ml)を得た。さらに、得られた担体を限外ろ過(ウルトラフィルターユニットUSY-20:東洋濾紙株式会社)に付して、溶媒をリン酸緩衝液に置換するとともに濃縮し、担体(製造例5:二酸化チタン濃度1.78 mg/ml)を得た。
8). Production of Titanium Dioxide Composite Containing Pharmaceutical Compound Precursor (Example 3) A titanium dioxide composite comprising a pharmaceutical compound precursor and a carrier is produced and administered to a cell, and the cell is irradiated with ultrasonic waves. To examine the efficacy of the pharmaceutical compound. As a pharmaceutical compound precursor, carmofur (1-hexylcarbamoyl-5-fluorouracil), a prodrug of fluorouracil, which is a kind of anticancer agent, was used.
(1) Production of titanium dioxide complex of the present invention containing a prodrug Titanium dioxide sol (1.0 ml, average particle size 5 nm, concentration 2.675 mg / ml, pH 1.5; Ishihara Sangyo Co., Ltd.) at room temperature and atmospheric pressure , PAA-g-PEG1 aqueous solution (4.0 ml, 23.75 ml / ml) was mixed to obtain a mixed solution. A carrier (titanium dioxide concentration: 0.445 mg / ml) was obtained by adding 0.02 M aqueous sodium hydroxide solution dropwise to the obtained mixture to adjust the pH of the mixture to 7-8. Furthermore, the obtained carrier is subjected to ultrafiltration (Ultra Filter Unit USY-20: Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), the solvent is replaced with a phosphate buffer and concentrated, and the carrier (Production Example 5: Titanium dioxide concentration) is obtained. 1.78 mg / ml) was obtained.

カルモフール(和光純薬株式会社)のDMSO溶液(3.56μl、10 mg/ml)を、上記の製造例5の担体(200μl)に加えて一晩静置することにより、カルモフールが担体に複合化されてなる本発明の二酸化チタン複合体(実施例3)を得た。
カルモフールは、リン酸緩衝液などの水性溶媒には溶けない化合物であるが、本発明の二酸化チタン複合体の形態とすることにより、カルモフールを水性溶媒中に分散させることができた。
Carmofur is combined with the carrier by adding the DMSO solution (3.56 μl, 10 mg / ml) of Carmofur (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the carrier of Preparation Example 5 (200 μl) and allowing to stand overnight. The titanium dioxide composite of the present invention (Example 3) was obtained.
Carmofur is a compound that is insoluble in an aqueous solvent such as a phosphate buffer, but by using the titanium dioxide composite of the present invention, it was possible to disperse carmofur in the aqueous solvent.

(2)二酸化チタン複合体を投与した細胞への超音波照射によるプロドラッグの薬効の検討
実施例3の二酸化チタン複合体と10%FBS含有DMEM培地とを1:9(体積比)で混合して、二酸化チタン複合体の分散液を調製した。6ウェルプレートにHeLa細胞(2×105個/ウェル)を播種して48時間培養した。培養後、ウェルから培地を除き、調製した分散液(2.0 ml/ウェル)を添加して、さらに4時間培養した。その後、細胞をリン酸緩衝液で2回洗浄して、10%FBS含有DMEM培地(5.0 ml/ウェル)加えて、細胞に超音波(1MHz、0.5 W/cm2)を1分間照射した。その後、細胞を48時間培養し、細胞をリン酸緩衝液で2回洗浄した後、MTT試薬(120μl/ウェル、10 mg/mL in PBS:和光純薬工業株式会社)と10%FBS含有DMEM培地(2.0 ml/ウェル)を加え、さらに3時間培養した。その後、細胞をリン酸緩衝液で2回洗浄し、ウェルに0.1N HCl含有イソプロパノール溶液(2.0 ml/ウェル)を加えた。そして、Wallac 1420 ARVOSXマルチラベルカウンタ(パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社)により各ウェルの吸光度を測定し、得られた測定値から細胞生存率を算出した。
また、上記の実施例3の二酸化チタン複合体に代えて、製造例5の担体を用いて同様の操作を行った。結果を図8に示す。
図8より、カルモフールを複合化させた二酸化チタン複合体を投与した細胞に、超音波照射することにより、照射しなかった場合よりも細胞生存率が減少することが示された。
(2) Examination of prodrug efficacy by ultrasonic irradiation to cells administered with titanium dioxide complex The titanium dioxide complex of Example 3 and 10% FBS-containing DMEM medium were mixed at 1: 9 (volume ratio). Thus, a dispersion of the titanium dioxide composite was prepared. HeLa cells (2 × 10 5 cells / well) were seeded in a 6-well plate and cultured for 48 hours. After the culture, the medium was removed from the well, the prepared dispersion (2.0 ml / well) was added, and the mixture was further cultured for 4 hours. Thereafter, the cells were washed twice with a phosphate buffer, 10% FBS-containing DMEM medium (5.0 ml / well) was added, and the cells were irradiated with ultrasound (1 MHz, 0.5 W / cm 2 ) for 1 minute. The cells were then cultured for 48 hours, washed twice with phosphate buffer, and then MTT reagent (120 μl / well, 10 mg / mL in PBS: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 10% FBS-containing DMEM medium (2.0 ml / well) was added and further cultured for 3 hours. Thereafter, the cells were washed twice with phosphate buffer, and 0.1N HCl-containing isopropanol solution (2.0 ml / well) was added to the wells. Then, the absorbance of each well was measured with a Wallac 1420 ARVO SX multi-label counter (Perkin Elmer Life Science Japan Co., Ltd.), and the cell viability was calculated from the obtained measured values.
Moreover, it replaced with the titanium dioxide composite of said Example 3, and performed the same operation using the support | carrier of manufacture example 5. FIG. The results are shown in FIG.
From FIG. 8, it was shown that the cell viability is reduced by irradiating the cells administered with the titanium dioxide complex combined with carmofur by sonication compared to the case where the cells were not irradiated.

Claims (7)

二酸化チタン微粒子と、その微粒子表面にイオン結合する、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とからなる担体に、不活性型の有機化合物が複合化されてなり、
複合化された担体に紫外線または超音波を照射したときに、前記二酸化チタン微粒子の励起を介して前記有機化合物を活性型に変換し得ることを特徴とする、
生体に投与するための二酸化チタン複合体。
An inert organic compound is combined with a carrier composed of titanium dioxide fine particles and a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain ionically bonded to the surface of the fine particles.
When the composite carrier is irradiated with ultraviolet rays or ultrasonic waves, the organic compound can be converted into an active form through excitation of the titanium dioxide fine particles,
A titanium dioxide composite for administration to a living body.
前記不活性型の有機化合物が、前記二酸化チタン微粒子の励起により発生する活性酸素種と反応することにより活性型に変換される有機化合物である、請求項1に記載の二酸化チタン複合体。   The titanium dioxide composite according to claim 1, wherein the inactive organic compound is an organic compound that is converted to an active type by reacting with active oxygen species generated by excitation of the titanium dioxide fine particles. 前記不活性型の有機化合物が、前記二酸化チタン微粒子の励起により発生する活性酸素種と反応することにより活性型に変換される医薬化合物である、請求項1または2に記載の二酸化チタン複合体。   The titanium dioxide composite according to claim 1 or 2, wherein the inactive organic compound is a pharmaceutical compound that is converted to an active form by reacting with an active oxygen species generated by excitation of the titanium dioxide fine particles. 前記担体の体積平均粒径が50〜300 nmである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二酸化チタン複合体。   The titanium dioxide composite according to any one of claims 1 to 3, wherein the carrier has a volume average particle diameter of 50 to 300 nm. 前記複合化された担体の表面電位が+10 mV以下である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二酸化チタン複合体。   The titanium dioxide composite according to any one of claims 1 to 4, wherein a surface potential of the composite carrier is +10 mV or less. 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二酸化チタン複合体を含む、生体に投与するための分散液。   The dispersion liquid for administering to a biological body containing the titanium dioxide composite of any one of Claims 1-5. (1)二酸化チタン微粒子の酸性分散液と、生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子の溶液とを、pH1〜4で混合する工程と、
(2)前記工程(1)で得られた混合液のpHを7〜8に調整して、二酸化チタン微粒子と生体適合性親水性グラフト鎖を有するカチオン性高分子とをイオン結合させることにより、担体を得る工程と、
(3)前記工程(2)で得られた担体を精製する工程と、
(4)前記工程(3)で精製した担体と不活性型の有機化合物とを混合することにより、前記担体と前記有機化合物とを複合化させる工程と
を含む、生体に投与するための二酸化チタン複合体の製造方法。
(1) A step of mixing an acidic dispersion of fine titanium dioxide particles and a solution of a cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain at pH 1 to 4,
(2) By adjusting the pH of the mixed solution obtained in the step (1) to 7 to 8 and ion-bonding the titanium dioxide fine particles and the cationic polymer having a biocompatible hydrophilic graft chain, Obtaining a carrier;
(3) a step of purifying the carrier obtained in the step (2);
(4) Titanium dioxide for administration to a living body, which comprises the step of combining the carrier and the organic compound by mixing the carrier purified in the step (3) with an inert organic compound. A method for producing a composite.
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