KR101323102B1 - Nanoparticles formed by encapsulating an anticancer drug into glycolchitosan-cholanic acid complex and a process for the preparation thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글리콜키토산에 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid)이 공유결합되어 수중에서 자기 집합체(self-aggregates)를 형성하는 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자로서,
상기 글리콜키토산 단량체는 10 내지 20 KDa이고, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산이 10 내지 20 치환도(%)로 결합되고, 상기 복합체 내부에 9 내지 15 중량%의 함량으로 항암제가 봉입되며, 직경이 100 내지 200 nm인 나노입자, 그 나노입자를 포함하는 주사제, 및 그 나노입자의 제조방법을 제공한다.According to the present invention, a nano hydrophobic anticancer agent is encapsulated inside a glycol chitosan-bile acid complex in which 5-β-cholanic acid is covalently bonded to glycol chitosan to form self-aggregates in water. As a particle,
The glycol chitosan monomer is 10 to 20 KDa, 5-β-cholanic acid is bound by 10 to 20 substitution degree (%) to the glycol chitosan monomer, and the anticancer agent is encapsulated in the content of 9 to 15% by weight in the complex. The present invention provides nanoparticles having a diameter of 100 to 200 nm, injections containing the nanoparticles, and methods for producing the nanoparticles.
Description
본 발명은 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 물에 대한 용해도가 우수하고 독성이 적고 고효율로 항암제를 봉입시킬 수 있고 멸균여과 처리가 가능하며, 암세포에 대한 타겟팅 효과가 우수한 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a nanoparticle having a hydrophobic anticancer agent encapsulated in a glycol chitosan-bile acid complex and a method for preparing the same. More specifically, the present invention is capable of encapsulating an anticancer agent with high solubility in water, low toxicity and high efficiency, and sterilizing filtration. The present invention relates to a nanoparticle having a hydrophobic anticancer agent encapsulated in a glycol chitosan-bile acid complex which can be treated and has an excellent targeting effect on cancer cells, and a method of manufacturing the same.
항암제는 세포내 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로써 효과를 나타낸다. 그러나 이들 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장관 점막손상, 탈모 등의 부작용을 보인다. 이러한 부작용을 해결하기 위하여 DDS(Drug Delivery System) 분야에서는 인체 내의 약물이 필요한 부분에만 전달되도록 하여 약물의 효율을 높이고 부작용을 줄일 수 있는 표적 지향적 전달법이 연구되고 있다. 최근에는 DDS 분야에서 나노기술을 이용한 나노입자가 개발되어 나노약물전달체, 나노진단시약, 나노바이오물질 등이 다양하게 활용되고 있다. Anticancer agents have effects by inhibiting the synthesis of intracellular nucleic acids or by binding directly to the nucleic acids and impairing their function. However, these anticancer drugs damage not only cancer cells but also normal cells, particularly tissue cells with active cell division, and thus have side effects such as bone marrow dysfunction, gastrointestinal mucosal damage, and hair loss. In order to solve these side effects, in the field of DDS (Drug Delivery System), a target-oriented delivery method for improving drug efficiency and reducing side effects is being researched so that drugs in the human body are delivered only to necessary parts. Recently, nanoparticles using nanotechnology have been developed in the field of DDS, and nanopharmaceuticals, nanodiagnostic reagents, nanobiomaterials, etc. have been utilized in various ways.
나노입자를 이용한 대표적인 표적 지향 전달은 암조직 주변의 느슨해진 혈관벽의 높은 투과성으로 인한 EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 이용한 방법이 사용된다. 인체 내의 나노입자는 혈액을 따라 계속적으로 이동하다가 암 조직 주변의 느슨한 혈관의 높은 투과성에 의해서 암 조직에 축적되고 일단 축적된 다음에는 혈액으로 잘 유출되지 않아, 암 조직에 축적된 나노입자에 봉입된 항암제가 서서히 방출되어 최종적으로 암조직만 선택적으로 치료될 수 있다. 이러한 나노입자의 제어방출과 EPR 효과를 이용한 암치료 방법은 현재 가장 많이 연구되고 있는 방법이며, 다양한 나노입자들이 개발되어 사용되고 있다. Representative target-directed delivery using nanoparticles is a method using enhanced permeation and retention (EPR) effects due to the high permeability of the loosened blood vessel wall around cancer tissue. Nanoparticles in the human body continue to move along the blood and accumulate in cancer tissues due to the high permeability of loose blood vessels around cancer tissues, and once accumulated, they do not leak well into the blood. The anticancer drug is released slowly so that only cancer tissue can be treated finally. Cancer treatment method using the controlled release of these nanoparticles and EPR effect is currently the most researched method, various nanoparticles have been developed and used.
키토산은 게나 새우 등의 갑각류의 외피에 존재하는 키틴을 염기성 조건에서 탈아세틸화시켜 얻어지는 물질로서 단량체인 글루코사민이 β-1,4로 결합된 천연고분자이다. 이러한 키토산은 그 자체로서 혈중 콜레스테롤 감소 및 지방 흡수 저해 효과, 항암효과, 면역력 강화 효과, 항 당뇨 효과, 상처 치료효과, 그리고 항균활성 등의 다양한 생리활성을 갖는다. 특히, 구강, 비강 및 장강 등의 점액질 층에 결합하여 약물의 흡수를 촉진시키는 효과를 나타내기 때문에 단백질 약물이나 난흡수성 약물의 경구 제형의 흡수 촉진제로의 응용이 활발하게 연구되고 있다. 또한, 수용액 하에서 양이온성을 띄기 때문에 음이온성을 띄는 유전자 물질과 복합체를 형성할 수 있고, 이를 이용하는 키토산 또는 키토산 유도체의 유전자 전달체로의 연구가 활발히 진행되고 있다. Chitosan is a natural polymer obtained by deacetylating chitin present in the shells of shellfish such as crabs and shrimps under basic conditions. Such chitosan has various physiological activities such as blood cholesterol reduction and fat absorption inhibition effect, anticancer effect, immune enhancing effect, antidiabetic effect, wound healing effect, and antibacterial activity. In particular, since it shows the effect of promoting the absorption of the drug by binding to the mucous layer of the oral cavity, nasal cavity and intestinal cavities, the application of oral formulations of protein drugs and non-absorbable drugs as absorption accelerators has been actively studied. In addition, since it is cationic under aqueous solution, it is possible to form a complex with an anionic genetic material, and research into the gene carrier of chitosan or chitosan derivative using the same is being actively conducted.
한국 특허공개 2006-0083147은 자기집합체(self-aggregates)를 형성하는 담즙산-키토산 복합체 및 그 제조방법을 개시하고 있다. 상기 특허문헌은 평균 분자량이 103 내지 106 Da인 친수성 키토산에 소수성 담즙산을 1-70 중량부로 결합시킨 담즙산-키토산 복합체를 형성시키고, 소수성기 및 친수성기의 공존으로 인해 수중에서 자기집합체를 형성하는 담즙산-키토산 복합체 내에 소수성 항암제를 봉입시킨 1-2,000, 바람직하게는 10-800 nm의 나노입자를 개시하고 있다. 그러나, 상기 나노입자는 물에 대한 용해도가 떨어지는 단점이 발견되었으며, 수용해도가 떨어지면 주사제로서의 상업적 이용 가능성이 떨어지게 된다. 또한, 상기 나노입자는 고분자량의 키토산의 사용으로 독성의 우려가 있다. 더욱이, 상기 나노입자는 200 nm 초과의 직경으로 만들어져, 0.25 um 공극의 필터로 멸균여과가 불가능하고, 오토클레이빙과 같은 멸균방법을 이용하여야 하며 이러한 멸균방법은 제조된 나노입자와 항암제의 안정성에 문제가 있을 수 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2006-0083147 discloses a bile acid-chitosan complex forming self-aggregates and a method of manufacturing the same. The patent document forms bile acid-chitosan complexes in which hydrophobic bile acids are bonded 1-70 parts by weight to hydrophilic chitosan having an average molecular weight of 10 3 to 10 6 Da, and bile acids forming self-assembly in water due to the coexistence of hydrophobic groups and hydrophilic groups. Disclosed are 1-2,000, preferably 10-800 nm nanoparticles encapsulated with a hydrophobic anticancer agent in the -chitosan complex. However, it has been found that the nanoparticles have a poor solubility in water, and if the water solubility is lowered, the commercial availability as an injection is reduced. In addition, the nanoparticles may be toxic due to the use of high molecular weight chitosan. Moreover, the nanoparticles are made to a diameter of more than 200 nm, sterile filtration is not possible with a filter of 0.25 um pore, the sterilization method such as autoclaving should be used, such sterilization method is a problem in the stability of the prepared nanoparticles and anticancer agent There can be.
이에 본 발명자들은 물에 대한 용해도가 높아 주사제로서 사용 가능하며 직경이 약 200 nm 이하여서 멸균여과에 의해 주사제로 제조할 수 있어 안정성을 확보할 수 있으면서도 독성의 우려가 낮은 항암제가 봉입된 나노입자를 개발하기 위해 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors have high solubility in water, which can be used as an injection, and can be manufactured as an injection by sterile filtration with a diameter of about 200 nm or less. As a result of research for development, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 물에 대한 용해도가 우수하고 독성이 적고 멸균여과 처리가 가능하며 암세포에 대한 타겟팅 효과가 우수한 항암제가 봉입된 나노입자를 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a nanoparticle encapsulated with an anticancer agent having excellent solubility in water, low toxicity, sterile filtration and excellent targeting effect on cancer cells.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an injection comprising the nanoparticles according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a method for producing nanoparticles according to the present invention.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은 In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is
글리콜키토산에 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid)이 공유결합되어 수중에서 자기 집합체(self-aggregates)를 형성하는 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자로서, A nanoparticle having a hydrophobic anticancer agent encapsulated inside a glycol chitosan-bile acid complex in which 5-β-cholanic acid is covalently bonded to glycol chitosan to form self-aggregates in water,
상기 글리콜키토산 단량체는 10 내지 20 KDa이고, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산이 10 내지 20 치환도(%)로 결합되고, 상기 복합체 내부에 9 내지 15 중량%의 함량으로 항암제가 봉입되며, 직경이 100 내지 200 nm인 나노입자를 제공한다. The glycol chitosan monomer is 10 to 20 KDa, 5-β-cholanic acid is bound by 10 to 20 substitution degree (%) to the glycol chitosan monomer, and the anticancer agent is encapsulated in the content of 9 to 15% by weight in the complex. , Nanoparticles having a diameter of 100 to 200 nm are provided.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다. In addition, another aspect of the present invention provides an injection comprising the nanoparticles according to the present invention.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 In addition, another aspect of the present invention
(a) 저분자량의 글리콜키토산을 유기용매에 녹여 글리콜키토산 용액을 제조하는 단계;(a) dissolving a low molecular weight glycol chitosan in an organic solvent to prepare a glycol chitosan solution;
(b) 5-β-콜란산을 유기용매에 용해시켜 담즙산 용액을 제조하는 단계;(b) dissolving 5-β-cholanic acid in an organic solvent to prepare a bile acid solution;
(c) 상기 글리콜키토산 용액에 상기 담즙산 용액을 적하 및 교반하여 글리콜키토산-담즙산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;(c) dropping and stirring the bile acid solution to the glycol chitosan solution to prepare a reaction solution in which a glycol chitosan-bile acid complex is formed;
(d) 상기 반응액을 유기용매 중에서 석출하여 글리콜키토산-담즙산 복합체를 획득하는 단계; 및(d) precipitating the reaction solution in an organic solvent to obtain a glycol chitosan-bile acid complex; And
(e) 유기 용매 중에 용해시킨 소수성 항암제 용액을 상기 획득한 글리콜키토산-담즙산 복합체의 수용액과 혼합하여 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제를 봉입하는 단계를 포함하는 상기 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법을 제공한다. (e) mixing the hydrophobic anticancer agent dissolved in the organic solvent with the aqueous solution of the glycolchitosan-bile acid complex obtained above, and encapsulating the hydrophobic anticancer agent in the glycolchitosan-bile acid complex. It provides a manufacturing method.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서는 종래 항암제를 봉입한 글리콜키토산-담즙산 복합체의 자기집합에 의해 형성된 나노입자의 문제점을 극복하기 위해 연구한 결과, 글리콜키토산-담즙산 복합체의 제조 시 10 내지 20 KDa의 저분자량 글리콜키토산에 담즙산으로서 5-β-콜란산을 글리콜키토산 단량체에 대해 10 내지 20의 치환도(%)로 결합시켜, 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하고 항암제를 9 내지 15 중량%의 함량으로 봉입시킬 경우, 수용성이 높아 주사제로서 사용 가능하고, 약 200 nm 이하의 직경을 가져 멸균여과가 가능하므로 항암제 및 나노입자의 안정성을 보장할 수 있으며, 키토산의 독성에 의한 부작용 우려를 해소할 수 있음을 발견하게 되었다. In the present invention, as a result of studying to overcome the problems of the nanoparticles formed by the self-assembly of the glycol chitosan-bile acid complex encapsulated with a conventional anticancer agent, bile acid in a low molecular weight glycol chitosan of 10 to 20 KDa when preparing the glycol chitosan-bile acid complex When 5-β-cholanic acid is combined with a degree of substitution of 10 to 20% based on the glycol chitosan monomer to prepare a glycol chitosan-bile acid complex and encapsulating the anticancer agent in an amount of 9 to 15% by weight, It is found that it can be used as an injection and has a diameter of about 200 nm or less, so that sterile filtration can ensure the stability of anticancer drugs and nanoparticles, and can solve side effects caused by the toxicity of chitosan.
따라서, 본 발명의 일 측면은 Thus, one aspect of the present invention
글리콜키토산에 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid)이 공유결합되어 수중에서 자기 집합체(self-aggregates)를 형성하는 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자로서, A nanoparticle having a hydrophobic anticancer agent encapsulated inside a glycol chitosan-bile acid complex in which 5-β-cholanic acid is covalently bonded to glycol chitosan to form self-aggregates in water,
상기 글리콜키토산 단량체는 10 내지 20 KDa이고, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산이 10 내지 20 치환도(%)로 결합되고, 상기 복합체 내부에 9 내지 15 중량%의 함량으로 항암제가 봉입되며, 직경이 100 내지 200 nm인 나노입자를 제공한다.The glycol chitosan monomer is 10 to 20 KDa, 5-β-cholanic acid is bound by 10 to 20 substitution degree (%) to the glycol chitosan monomer, and the anticancer agent is encapsulated in the content of 9 to 15% by weight in the complex. , Nanoparticles having a diameter of 100 to 200 nm are provided.
상기 글리콜키토산은 글리콜기가 도입되어 수용성이 높고, 생체 적합성이 높으며, 10 내지 20 KDa의 분자량을 가질 경우 수용해도가 높은 글리콜키토산-담즙산 복합체를 형성할 수 있다. 상기 범위보다 큰 고분자량의 글리콜키토산을 사용할 경우에는 점성이 커서 주사제로 제제화하기 어려운 문제가 있으며, 상기 범위보다 낮은 분자량의 글리콜키토산을 사용할 경우에는 나노입자가 형성되지 않을 수 있다. 또한, 낮은 분자량의 글리콜키토산의 사용으로 인해 고분자량의 키토산이 갖는 독성을 회피할 수 있다. 상기 10 내지 20 KDa의 저분자량의 글리콜키토산은 시판되고 있는 250 KDa의 글리콜키토산(Wako)을 염산으로 분해하여 획득할 수 있다. The glycol chitosan may form a glycol chitosan-bile acid complex having high water solubility when a glycol group is introduced to have high water solubility, high biocompatibility, and a molecular weight of 10 to 20 KDa. When using a higher molecular weight glycol chitosan than the above range, there is a problem in that it is difficult to be formulated into an injection because the viscosity is large, nanoparticles may not be formed when using a glycol chitosan of a lower molecular weight than the above range. In addition, the use of low molecular weight glycol chitosan can avoid the toxicity of high molecular weight chitosan. The low molecular weight glycol chitosan of 10 to 20 KDa can be obtained by decomposing commercially available glycol chitosan (Wako) of 250 KDa with hydrochloric acid.
상기 5-β-콜란산은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. The 5-β-cholanic acid has a structure of Formula 1 below.
[화학식 1][Formula 1]
상기 5-β-콜란산은 상기 글리콜키토산-담즙산 복합체에서 저분자량의 친수성 글리콜키토산 단량체에 대해 10 내지 20 KDa의 치환도(%)로 결합되며, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산의 치환도가 20% 초과일 경우에는 키토산-담즙산 복합체가 젤을 형성할 수 있어 수용해도가 매우 낮아질 수 있을 뿐만 아니라 나노입자의 크기가 200 nm를 초과하게 되어 멸균여과에 의한 멸균이 불가능한 문제점이 있으며, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산의 치환도가 5 % 미만일 경우에는 소수성 부분의 응집력이 적어 나노입자의 형성이 이루어지지 않을 수 있다. The 5-β-cholanic acid is bound at a degree of substitution (%) of 10 to 20 KDa for the low molecular weight hydrophilic glycol chitosan monomer in the glycol chitosan-bile acid complex, and the substitution of 5-β-cholanic acid for the glycolchitosan monomer. If the degree is more than 20%, the chitosan-bile acid complex can form a gel, so that the water solubility can be very low, and the size of the nanoparticles exceeds 200 nm, which makes it impossible to sterilize by sterile filtration. When the degree of substitution of 5-β-cholanic acid for the glycol chitosan monomer is less than 5%, the cohesive force of the hydrophobic portion may be low, thereby preventing the formation of nanoparticles.
상기 본 발명에 따른 나노입자는 글리콜키토산 단량체가 20 KDa이면서 5-β-콜란산의 치환도가 20%인 경우는 제외되는 것이 바람직하다. 글리콜키토산 단량체가 20 KDa이면서 5-β-콜란산의 치환도가 20%인 경우에는 생성되는 글리콜키토산-담즙산 복합체의 점도가 높아 주사제로 제제화하기 적절하지 않을 수 있으며, 항암제를 봉입 시 나노입자의 직경이 200 nm 를 초과하여 여과에 의한 멸균 처리가 불가능해질 수 있다. The nanoparticles according to the present invention are preferably excluded when the glycol chitosan monomer is 20 KDa and the substitution degree of 5-β-cholanic acid is 20%. If the glycol chitosan monomer is 20 KDa and the substitution degree of 5-β-cholanic acid is 20%, the resulting viscosity of the glycol chitosan-bile acid complex may not be suitable for formulation as an injection. It may be impossible to sterilize by filtration because the diameter exceeds 200 nm.
상기 글리콜키토산-담즙산 복합체는 키토산의 아미노기에 담즙산의 카르복실기가 아미드 결합에 의한 공유결합의 형성으로 제조될 수 있으며, 이러한 글리콜키토산-담즙산 복합체는 담즙산의 소수성 기와 글리콜키토산의 친수성 기에 의한 양친성으로 인해 수중에서 마이셀과 유사한 구형의 자기집합체를 형성함으로써 나노입자를 이룰 수 있다. The glycol chitosan-bile acid complex may be prepared by the formation of a covalent bond by amide bond of carboxyl group of bile acid to amino group of chitosan, and such glycol chitosan-bile acid complex is due to amphipathy by hydrophobic group of bile acid and hydrophilic group of glycol chitosan. Nanoparticles can be formed by forming spherical self-assembly similar to micelles in water.
상기 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 봉입되는 소수성 항암제는 그 내부에 봉입될 수 있는 임의의 소수성 항암제일 수 있으며, 예를 들어 아드리아마이신, 독시탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴, 미토마이신-C 및 5-플루오로우라실로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 대표적으로는 독시탁셀이 이용될 수 있다. 상기 소수성 항암제는 글리콜키토산-담즙산 복합체 내부에 약 9 내지 15 중량%의 함량으로 봉입된다. 항암제의 봉입량이 글리콜키토산-담즙산 복합체에 대해 15 중량%을 초과할 경우 나노입자의 직경이 200 nm를 넘게 되어 멸균여과에 의한 멸균이 불가능한 문제점이 있으며, 9 중량%에 미달할 경우에는 항암제의 함량이 너무 낮아 효과적인 항암치료에 부적합하다. The hydrophobic anticancer agent encapsulated in the glycolchitosan-bile acid complex may be any hydrophobic anticancer agent encapsulated therein, for example, adriamycin, doxytaxel, paclitaxel, cisplatin, mitomycin-C and 5-fluoro It may be selected from the group consisting of uracil. Representatively doxytaxel may be used. The hydrophobic anticancer agent is encapsulated in a content of about 9 to 15% by weight inside the glycol chitosan-bile acid complex. If the amount of the anticancer agent exceeds 15% by weight relative to the glycolchitosan-bile acid complex, the diameter of the nanoparticles exceeds 200 nm, so that sterilization by sterile filtration is not possible. This is too low to be suitable for effective chemotherapy.
상기 소수성 항암제는 상기 글리콜키토산-담즙산 복합체 내부에 약 95 중량% 이상의 봉입율로 봉입될 수 있다. 이에 반해 일반적인 나노제형인 리포좀이나 고분자 마이셀의 경우 항암제 봉입율이 약 90% 이하이며, 봉입량도 최대 약 10% 이다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 글리콜키토산-담즙산 복합체는 소수성 항암제를 매우 높은 봉입율과 높은 봉입량으로 봉입할 수 있어 유용한 약물 전달체라고 할 수 있다. The hydrophobic anticancer agent may be encapsulated in the glycol chitosan-bile acid complex at an encapsulation rate of about 95% by weight or more. On the other hand, in the case of liposomes or polymer micelles, which are general nano formulations, the anticancer drug encapsulation rate is about 90% or less, and the encapsulation amount is also about 10% at maximum. Therefore, the glycol chitosan-bile acid complex according to the present invention can be said to be a useful drug carrier because it can encapsulate a hydrophobic anticancer agent in a very high inclusion rate and a high inclusion amount.
상기 글리콜키토산-담즙산 복합체의 자기집합에 의해 형성된 나노입자는 직경이 약 100 내지 200 nm이다. 이러한 작은 직경의 나노입자의 형성으로 인해, 본 발명에 따른 나노입자는 0.2 ~ 0.25 μm 공극의 필터로 멸균여과가 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 멸균여과에 의해 멸균함으로써 주사제로서 제제화될 수 있으며, 오토클레이브와 같은 고온고압 처리에 의한 멸균에 의해 발생될 수 있는 항암제 및/또는 나노입자의 불안정성의 위험을 회피할 수 있다. Nanoparticles formed by the self-assembly of the glycolchitosan-bile acid complex have a diameter of about 100 to 200 nm. Due to the formation of such small diameter nanoparticles, the nanoparticles according to the invention may be sterile filtered with a filter of 0.2 to 0.25 μm pore. Thus, the nanoparticles according to the invention can be formulated as injections by sterilization by sterile filtration, avoiding the risk of instability of the anticancer agent and / or nanoparticles that can be caused by sterilization by high temperature and high pressure treatment such as autoclave. can do.
또한, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 저분자량의 항암제에 비해 nm 단위의 입자크기를 가지므로 EPR 효과에 의한 암조직 선택성이 높아, 암조직에 나노입자가 축적될 수 있으며 나노입자로부터 약물의 방출이 서서히 지속적으로 이루어질 수 있어 효과적으로 항암작용을 발휘할 수 있다. 또한, 종래의 고분자량의 글리콜키토산-담즙산 복합체의 나노입자와는 달리 저분자량의 글리콜키토산을 사용함으로써 수용성이 높아 주사제로 사용하기 적합할 뿐만 아니라. 고분자량 키토산의 독성에 의한 부작용의 회피할 수 있게 된다. 더욱이, 항암제의 봉입량이 높으므로 고분자의 함량을 줄일 수 있어 고분자로 인한 독성의 우려를 더욱 감소시킬 수 있다. In addition, since the nanoparticles according to the present invention have a particle size in nm compared to a low molecular weight anticancer agent, cancer tissue selectivity is high due to the EPR effect, and nanoparticles may accumulate in cancer tissues and release of drugs from the nanoparticles. This can be made slowly and continuously can effectively exhibit anticancer action. In addition, unlike the nanoparticles of the conventional high molecular weight glycol chitosan-bile acid complex, by using a low molecular weight glycol chitosan, it is not only suitable for use as an injection because of its high water solubility. The side effects due to the toxicity of high molecular weight chitosan can be avoided. Moreover, since the amount of the anticancer agent is high, the content of the polymer may be reduced, thereby further reducing the fear of toxicity due to the polymer.
따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다. Therefore, in another aspect, the present invention provides an injection comprising the nanoparticles according to the present invention.
이러한 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 상기 주사제는 직경이 100 내지 200 nm인 나노입자를 포함하므로 0.25 um의 멸균필터에 의해 멸균할 수 있어, 멸균에 의해 고온고압 처리를 할 필요가 없으므로 항암제 및/또는 나노입자의 안정성이 확보될 수 있다. Such injections may be prepared according to conventional methods for preparing injections known in the art. Injectables according to the present invention may be in a form dispersed in a sterile medium so that it can be used as it is when administered to a patient, or may be administered in a form in which distilled water for injection is added and dispersed in an appropriate concentration. Since the injection includes nanoparticles having a diameter of 100 to 200 nm, they can be sterilized by a 0.25 um sterilization filter, so that the high temperature and high pressure treatment is not required by sterilization, thereby ensuring the stability of the anticancer agent and / or the nanoparticles. have.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서,In another aspect of the present invention,
(a) 저분자량의 글리콜키토산을 유기용매에 녹여 글리콜키토산 용액을 제조하는 단계;(a) dissolving a low molecular weight glycol chitosan in an organic solvent to prepare a glycol chitosan solution;
(b) 5-β-콜란산을 유기용매에 용해시켜 담즙산 용액을 제조하는 단계;(b) dissolving 5-β-cholanic acid in an organic solvent to prepare a bile acid solution;
(c) 상기 글리콜키토산 용액에 상기 담즙산 용액을 적하 및 교반하여 글리콜키토산-담즙산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;(c) dropping and stirring the bile acid solution to the glycol chitosan solution to prepare a reaction solution in which a glycol chitosan-bile acid complex is formed;
(d) 상기 반응액을 유기용매 중에서 석출하여 글리콜키토산-담즙산 복합체를 획득하는 단계; 및(d) precipitating the reaction solution in an organic solvent to obtain a glycol chitosan-bile acid complex; And
(e) 유기 용매 중에 용해시킨 소수성 항암제 용액을 상기 획득한 글리콜키토산-담즙산 복합체의 수용액과 혼합하여 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제를 봉입하는 단계를 포함하는 상기 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법을 제공한다. (e) mixing the hydrophobic anticancer agent dissolved in the organic solvent with the aqueous solution of the glycolchitosan-bile acid complex obtained above, and encapsulating the hydrophobic anticancer agent in the glycolchitosan-bile acid complex. It provides a manufacturing method.
상기 단계 (a)에서 사용되는 10 내지 20 KDa의 저분자량 친수성 글리콜키토산은 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 이러한 저분자량 글리콜키토산은 시판되는 250 KDa의 글리콜키토산(Wako)을 4 M 염산용액으로 분해함으로써 제조될 수 있다. 그런 다음에는, 염산용액으로의 분해물을 아세톤 중에서의 석출함으로써 염산을 제거하는 과정을 수행할 수 있다. 종래에는 글리콜키토산의 분해를 위해 이용된 염산을 제거하기 위해 투석을 하였으나 투석을 하기 위해서는 대량의 물이 소모가 되고 물을 제거하기 위해서는 동결건조를 필요로 하기 때문에 시간이 오래 걸리는 단점이 있었다[Wang et al., "Controls on polymer molecular weight may be used to control the size of palmitoyl glycol chitosan polymeric vesicles" Langmuir, 17: 631~636 (2001)]. 이에 비해, 본원발명에서는 아세톤 중에서 석출법을 이용함으로써 반응시간을 단축하고 저분자량의 글리콜키토산을 고수율로 얻을 수 있다. The low molecular weight hydrophilic glycolchitosan of 10-20 KDa used in step (a) may be prepared by any method known in the art. According to one embodiment, such low molecular weight glycol chitosan can be prepared by decomposing commercially available 250 kDa glycol chitosan (Wako) with 4 M hydrochloric acid solution. Then, hydrochloric acid can be removed by precipitating the decomposed product into the hydrochloric acid solution in acetone. Conventionally, dialysis was performed to remove hydrochloric acid used for the decomposition of glycol chitosan, but a large amount of water was consumed for dialysis, and lyophilization was required to remove water, which took a long time. [Wang et al., "Controls on polymer molecular weight may be used to control the size of palmitoyl glycol chitosan polymeric vesicles" Langmuir, 17: 631-636 (2001). In contrast, in the present invention, by using the precipitation method in acetone, the reaction time can be shortened and low molecular weight glycol chitosan can be obtained in high yield.
상기 단계 (b)의 담즙산 용액은 소수성인 5-β-콜란산의 친수성 글리콜키토산에 대한 공유결합 반응의 촉매를 더 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 촉매는 5-β-콜란산의 카르복실기를 활성화하여 추후 5-β-콜란산이 글리콜키토산의 1차 아민과의 아미드 결합에 의한 공유결합을 용이하게 한다. 상기 촉매로는 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBT)을 함께 사용할 수 있다. 상기 촉매제로서 EDC는 사용된 5-β-콜란산에 대해 구체적으로 약 1 ~ 5 몰배, 예를 들어 약 3 몰배 사용할 수 있으며, HOBT는 구체적으로 약 1 ~ 3 몰배, 예를 들어 약 1.5 몰배 사용할 수 있다. 상기 범위에 미치지 못하면 5-β-콜란산이 충분히 활성화되지 않고 상기 범위보다 커지면 촉매가 과량 사용되어 제거하기 어렵게 될 수 있다. 촉매제로서 EDC만 사용하거나 EDC와 NHS (N-hydroxysuccinimide)를 사용할 경우 글리콜키토산과 담즙산의 결합이 효과적으로 이루어지지 않아 반응효율이 떨어지게 된다. 상기 촉매를 가한 후에는 담즙산을 활성화하기 위하여 적어도 1~3 시간동안 교반할 수 있다.The bile acid solution of step (b) preferably further comprises a catalyst for the covalent reaction of hydrophobic 5-β-cholanic acid to hydrophilic glycol chitosan. This catalyst activates the carboxyl group of 5-β-cholanic acid to facilitate later covalent bonding of 5-β-cholanic acid by an amide bond with the primary amine of glycolchitosan. As the catalyst, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and hydroxybenzotriazole (HOBT) can be used together. As the catalyst, EDC may be used in an amount of about 1 to 5 molar times, for example about 3 molar times, with respect to 5-β-cholanic acid used, and HOBT may be specifically used in about 1 to 3 molar times, for example about 1.5 mole times. Can be. If it is not within the above ranges, if 5-β-cholanic acid is not sufficiently activated and larger than the above range, the catalyst may be excessively used and difficult to remove. If only EDC is used as a catalyst or EDC and NHS (N-hydroxysuccinimide) are used, the coupling efficiency of glycolchitosan and bile acid is not effective. After adding the catalyst, the catalyst may be stirred for at least 1 to 3 hours to activate the bile acid.
상기 단계 (a) 및 (b)에서 글리콜키토산 용액 및 담즙산 용액을 제조하기 위한 유기용매는 글리콜키토산 또는 담즙산을 용해할 수 있으면서, 추후 글리콜키토산-담즙산 복합체 형성을 저해하지 않는 임의의 유기 용매가 사용될 수 있으며, 예를 들어 각각 독립적으로 디메틸아세트아미드, 디메틸설폭사이드, 또는 메탄올이 사용될 수 있다. 상기 용매로서 물을 사용할 경우에는 추후 글리콜키토산-담즙산 복합체를 정제하는 과정에서 제거가 어렵고 투석 및 동결건조의 과정을 필요로 하기 때문에 유기용매를 사용하는 것이 적절하다. In the steps (a) and (b), the organic solvent for preparing the glycol chitosan solution and the bile acid solution may dissolve glycol chitosan or bile acid, and any organic solvent which does not inhibit the formation of the glycolchitosan-bile acid complex in the future may be used. For example, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, or methanol may be used each independently. In the case of using water as the solvent, it is appropriate to use an organic solvent because it is difficult to remove in the process of purifying the glycolchitosan-bile acid complex later and requires a process of dialysis and lyophilization.
상기 글리콜키토산 용액을 제조 시 저분자량의 글리콜키토산을 용매 중에 구체적으로 10-30 w/v%, 예를 들어 10-20 w/v%로 제조할 수 있다. 또한, 저분자량의 글리콜키토산 용액을 제조 시 글리콜키토산에 결합되어 있을 수 있는 염산을 제거하여 반응이 용이하도록 하기 위해 염기를 부가할 수도 있으며, 예를 들어 트리에틸아민(TEA), 트리헥실아민, 트리이소부틸아민, 트리에탄올아민, 트리옥틸아민, 트리이소데실아민 및 트리메틸렌 디피페리딘으로 구성되는 삼차 아민군; 디시클로헥실아민, 디데실아민, 피페리딘, 피페라진, 1,3,5-트리메틸헥사히드로-1,3,5-트리아진, 1,3,5-트리에틸헥사히드로-1,3,5-트리아진 및 1-피페리딘 에탄올로 구성되는 이차아민군; 1-헥사데실아민, 옥타데실아민 및 4-(2-아미노에틸)페놀로 구성된 일차 아민군에서 선택된 화합물 등이 이용될 수 있다.When preparing the glycol chitosan solution, a low molecular weight glycol chitosan may be prepared specifically in a solvent of 10-30 w / v%, for example, 10-20 w / v%. In addition, when preparing a low molecular weight glycol chitosan solution, a base may be added to remove hydrochloric acid that may be bound to glycol chitosan to facilitate the reaction. For example, triethylamine (TEA), trihexylamine, Tertiary amine groups composed of triisobutylamine, triethanolamine, trioctylamine, triisodecylamine and trimethylene dipiperidine; Dicyclohexylamine, didecylamine, piperidine, piperazine, 1,3,5-trimethylhexahydro-1,3,5-triazine, 1,3,5-triethylhexahydro-1,3, Secondary amine group consisting of 5-triazine and 1-piperidine ethanol; Compounds selected from the group of primary amines consisting of 1-hexadecylamine, octadecylamine and 4- (2-aminoethyl) phenol and the like can be used.
상기 담즙산 용액을 제조 시 소수성 담즙산을 용매 중에 구체적으로 0.1-10 w/v%, 예를 들어 0.5-5 w/v%로 제조할 수 있다.In preparing the bile acid solution, hydrophobic bile acid may be specifically prepared in a solvent of 0.1-10 w / v%, for example, 0.5-5 w / v%.
상기 단계 (c)에서 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산을 10 내지 20 치환도(%)로 결합되도록 반응시키며, 반응은 상온에서 구체적으로 약 1-5시간 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 2 시간 수행할 수 있다. 글리콜키토산 단량체에 대해 담즙산의 치환도(%)가 상기 범위에 미치지 못하면 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체가 나노입자를 형성하지 못할 수 있으며, 상기 범위보다 크면 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체가 젤과 같은 형태가 되어 수용해도가 매우 낮아질 수 있고, 글리콜키토산-담즙산 복합체로 형성된 나노입자가 약 200 nm 이상의 직경으로 만들어져 0.25 um 공극의 필터로 멸균-여과가 불가능해질 수 있다. In the step (c) to react the glycol chitosan monomer to the 5-β-cholanic acid in 10 to 20 degree of substitution (%), the reaction can be carried out specifically about 1-5 hours at room temperature, for example For about 2 hours. If the degree of substitution of bile acid (%) for the glycol chitosan monomer does not fall within the above range, the prepared glycol chitosan-bile acid complex may not form nanoparticles, and if it is larger than the above range, the prepared glycol chitosan-bile acid complex may be gel-like. The water solubility may be very low, and the nanoparticles formed of the glycolchitosan-bile acid complex may be made to a diameter of about 200 nm or more, so that sterilization-filtration is impossible with a filter of 0.25 um pore.
상기 단계 (d)에서는 상기 단계 (c)에서 반응이 완료되어 글리콜키토산-담즙산 복합체가 형성된 반응액을 유기용매 중에서 석출하여 글리콜키토산-담즙산 복합체를 획득한다. 상기 석출에 사용되는 유기용매는 글리콜키토산-담즙산 복합체를 석출해 낼 수 있는 임의의 유기용매일 수 있으며, 예를 들어 아세토니트릴, 아세톤, 또는 이소프로필에테르 등이 이용될 수 있다. 이러한 석출법의 사용으로 인해 투석 및 동결건조 방법을 이용하는 것보다 시간 및 비용을 절약할 수 있다. 석출 후에는 유기용매(예: 아세톤)로 세척한 후 진공건조에 의해 복합체 파우더로 제조할 수 있으며, 추가로 수중에서 증류수에 녹인 후 증류수 중에서 투석 및 동결건조하여 순수한 글리콜키토산-담즙산 복합체를 획득할 수 있다. In step (d), the reaction is completed in step (c) to precipitate the reaction solution in which the glycol chitosan-bile acid complex is formed in an organic solvent to obtain a glycolchitosan-bile acid complex. The organic solvent used for the precipitation may be any organic solvent capable of precipitating the glycol chitosan-bile acid complex, and for example, acetonitrile, acetone, or isopropyl ether may be used. The use of this precipitation method can save time and money than using dialysis and lyophilization methods. After precipitation, it can be prepared as a composite powder by washing with an organic solvent (eg acetone) by vacuum drying, further dissolved in distilled water in water, then dialyzed and lyophilized in distilled water to obtain a pure glycol chitosan-bile acid complex. Can be.
상기 단계 (e)에서 글리콜키토산-담즙산 복합체는 분자 내에 친수성기와 소수성기를 모두 가지므로 수중에서 자기응집체를 형성하여 소수성 핵 및 친수성 껍질의 구조를 가질 수 있으며, 그 수용액을 소수성 항암제 용액과 혼합 시 소수성을 띠는 자기응집체의 내부에 소수성 항암제의 봉입이 이루어질 수 있다. 상기 항암제 용액을 제조하기 위한 용매는 항암제를 용해할 수 있는 임의의 휘발성 용매가 사용될 수 있으며, 예를 들어 메탄올, 에탄올 등이 이용될 수 있다. 항암제의 봉입율은 95% 이상 이루어질 수 있으며, 이는 종래의 통상적인 나노입자의 항암제 봉입율인 90% 보다 현저히 우수하다. 또한, 소수성 항암제의 봉입량이 높기 때문에 나노입자의 제조에 사용되는 고분자의 함량을 줄일 수 있어 고분자의 독성에 의한 부작용의 우려를 감소시킬 수 있어 바람직하다. Since the glycol chitosan-bile acid complex in step (e) has both hydrophilic and hydrophobic groups in the molecule, it may form self-aggregates in water to have the structure of hydrophobic nuclei and hydrophilic shells, and when the aqueous solution is mixed with a hydrophobic anticancer solution, Encapsulation of the hydrophobic anticancer agent may be performed inside the self-aggregate. As the solvent for preparing the anticancer agent solution, any volatile solvent capable of dissolving the anticancer agent may be used. For example, methanol, ethanol, or the like may be used. The encapsulation rate of the anticancer agent may be 95% or more, which is remarkably superior to the anticancer agent encapsulation rate of 90% of conventional nanoparticles. In addition, since the encapsulation amount of the hydrophobic anticancer agent is high, the content of the polymer used in the preparation of the nanoparticles can be reduced, which can reduce the risk of side effects due to the toxicity of the polymer.
상기 단계 (e)에서, 항암제가 글리콜키토산-담즙산 복합체 내부에 봉입되도록 하기 위해, 소수성 물질을 미셀 내부에 봉입시키기 위해 사용되는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 대표적으로는 용매 증발법(solvent evaporation method)를 통해 항암제를 글리콜키토산-담즙산 복합체 내부에 봉입시킬 수 있다. In step (e), any method known in the art used to enclose a hydrophobic material into a micelle may be used so that the anticancer agent is enclosed inside the glycolchitosan-bile acid complex. Typically, the anticancer agent may be encapsulated inside the glycolchitosan-bile acid complex through a solvent evaporation method.
상기 단계 (e)에서 제조되는 항암제가 봉입된 글리콜키토산-담즙산 나노입자는 0.25 um 공극의 필터로 여과할 수 있는 직경 약 200 nm 이하의 나노입자로 제조될 수 있다. The anti-cancer agent-encapsulated glycol chitosan-bile acid nanoparticles prepared in step (e) may be prepared with nanoparticles of about 200 nm or less in diameter that can be filtered with a filter of 0.25 um pores.
나노입자의 멸균을 위해서는, 상기 단계 (e)에서 항암제가 봉입된 소수성 나노입자의 생성이 완료된 다음에 그 나노입자를 0.25 um 공극의 필터로 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다. 멸균 과정은 나노입자를 상업화를 위하여 주사제로서 제조하기 위해 필수적인 과정이며, 오토클레이빙과 같이 고온 및 고압을 사용하게 되면 항암제 및 나노입자의 안정성에 문제가 있을 수 있으며, 대량 공정의 무균시설을 갖추기 위해서는 고가의 시설 투자가 요구된다. 따라서, 상기 제조방법에 따라 0.25 um 공극의 필터를 이용하여 멸균시킬 수 있는 크기로 나노입자를 제조할 수 있게 된 것은 항암제 및 나노입자의 안정성, 및 경제성의 측면에 있어서 큰 의미가 있다고 할 수 있다.For sterilization of the nanoparticles, after the generation of the hydrophobic nanoparticles in which the anticancer agent is enclosed in the step (e) may further comprise the step of filtering the nanoparticles with a filter of 0.25 um pore. The sterilization process is an essential process for preparing nanoparticles as injections for commercialization. Using high temperature and high pressure, such as autoclaving, may cause problems with the stability of anticancer drugs and nanoparticles. Expensive facility investment is required. Therefore, it can be said that the nanoparticles can be manufactured to a size that can be sterilized using a filter having a 0.25 um pore size according to the above-described manufacturing method, in terms of stability and economical efficiency of the anticancer agent and the nanoparticles. .
상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제가 봉입된 나노입자는 물에 대한 용해도가 우수하여 주사제로서 상업화 할 수 있고, 고분자의 함량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 저분자량의 글리콜키토산을 사용하여 독성이 적고, 약 200 nm 이하의 직경을 갖는 나노입자로서 제조할 수 있어 여과에 의해 멸균여과가 가능하므로 주사제로서 제조 시 안정성을 확보할 수 있어 바람직하다. 뿐만 아니라, 고효율, 고용량으로 항암제를 봉입시킬 수 있어 우수한 항암 효과를 발현시킬 수 있고, 암세포에 대한 타겟팅 효과가 매우 우수하여, 효과적으로 항암 치료에 이용될 수 있어 바람직하다.As described above, the nanoparticles encapsulated with a hydrophobic anticancer agent in the glycol chitosan-bile acid complex according to the present invention can be commercialized as an injection because of excellent solubility in water, and can reduce the content of polymer as well as low molecular weight. Glycol chitosan of the less toxic, can be prepared as a nanoparticle having a diameter of about 200 nm or less, since sterile filtration is possible by filtration is preferable because it can ensure the stability when manufacturing as an injection. In addition, it is possible to encapsulate the anticancer agent at high efficiency and high dose, thereby expressing an excellent anticancer effect, and since the targeting effect on cancer cells is very excellent, it can be effectively used for anticancer treatment.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체의 입자크기 및 크기분포를 광산란법(light scattering method)에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 글리콜키토산의 분자량, 담즙산, EDC, 및 HOBT의 사용량을 달리하여 제조한 글리콜키토산-담즙산 복합체 내 담즙산 함량 및 점도를 측정한 결과, 겔을 형성한 글리콜키토산-담즙산 복합체에 대한 담즙산 사용량, 담즙산 치환도 및 겔 형성 사진을 정리한 표이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항암제가 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체 나노입자를 마우스에 투여한 다음 마지막 투여 후 36일째에 종양 억제 효율(%)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항암제가 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체 나노입자를 마우스에 투여한 다음 시간의 경과에 따라 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the results of measuring the particle size and size distribution of the glycol chitosan-bile acid complexes prepared according to an embodiment of the present invention by a light scattering method.
Figure 2 shows the amount of bile acid used for the glycol chitosan-bile acid complex as a result of measuring the bile acid content and viscosity in the glycol chitosan-bile acid complex prepared by varying the amount of glycol chitosan molecular weight, bile acid, EDC, and HOBT, Table shows the bile acid substitution degree and gel formation photograph.
Figure 3 is a graph showing the hydrogen nuclear magnetic resonance (1H NMR) analysis spectrum of the glycol chitosan-bile acid complex prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a graph showing the tumor inhibition efficiency (%) 36 days after the last administration to the mice administered the glycol chitosan-bile acid composite nanoparticles encapsulated with an anticancer agent prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 is a graph showing the results of measuring the weight of the mouse over time after the administration of the mice administration of the anti-cancer agent-encapsulated glycol chitosan-bile acid composite nanoparticles prepared according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by them in any sense.
비교예Comparative Example 1~4 1-4
A. A. 저분자량의Low molecular weight 글리콜키토산의Of glycolchitosan 제조( Produce( 제조예Manufacturing example 1-4) 1-4)
20g의 글리콜키토산(Mw:250K Da, Wako)을 4M 염산 1.5L에 녹인 후, 45℃ 오일 배쓰에서 4, 8, 48, 또는 96시간 동안 교반하였다. 이후 상기 용액을 8L 아세톤 중에서 석출하여 여과한 후 아세톤으로 세척하고 진공건조하였다. 20 g of glycol chitosan (Mw: 250K Da, Wako) was dissolved in 1.5 L of 4M hydrochloric acid and then stirred for 4, 8, 48, or 96 hours in a 45 ° C oil bath. The solution was then precipitated in 8 L acetone, filtered, washed with acetone and dried in vacuo.
저분자량의 글리콜키토산의 분자량은 겔투과 크로마토그래피(GPC) 분석을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 하기 표 1에 정리하였다. The molecular weight of the low molecular weight glycolchitosan was confirmed using gel permeation chromatography (GPC) analysis. The results are summarized in Table 1 below.
B. B. 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체의 제조 (1) Preparation of complexes (1)
제조예 1~4에서 제조된 상이한 분자량 100 KDa(비교예 1), 50 KDa (비교예 2), 20 KDa(비교예 3), 또는 10 KDa(비교예 4)의 글리콜키토산 2.0g을 13mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 테트라에틸아민(TEA) 0.1g을 넣어 1 시간동안 교반하여 완전히 녹였다. 담즙산으로서 0.156g의 5-β-콜란산은 6ml 디메틸아세트아미드(DMAC)에 녹이고 0.246 g의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 0.088g의 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)를 가한 후 2 시간동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 글리콜키토산 용액을 상기 제조된 5-β-콜란산 용액에 빠르게 첨가한 후 2 시간동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴(ACN) 중에서 석출하고 아세톤으로 세척한 후 진공건조 하였다. 진공건조 후 글리콜키토산-담즙산 복합체 파우더를 증류수에 녹인 후 수산화나트륨 용액을 적가하면서 pH를 6.5로 조정하였다. 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에서 투석하고 동결건조하여 순수한 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하였다. 13 mL of glycol chitosan 2.0 g having different molecular weights of 100 KDa (Comparative Example 1), 50 KDa (Comparative Example 2), 20 KDa (Comparative Example 3), or 10 KDa (Comparative Example 4) prepared in Preparation Examples 1 to 4 It was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and 0.1 g of tetraethylamine (TEA) was added thereto, stirred for 1 hour, and completely dissolved. As bile acid, 0.156 g of 5-β-cholanic acid was dissolved in 6 ml dimethylacetamide (DMAC) and 0.246 g of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.088 g of hydroxybenzone. Triazole (HOBt) was added and stirred for 2 hours to activate the carboxyl group. Then, the prepared glycol chitosan solution was quickly added to the prepared 5-β-cholanic acid solution, followed by stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, precipitated in acetonitrile (ACN), washed with acetone and dried in vacuo. After vacuum drying, the glycol chitosan-bile acid composite powder was dissolved in distilled water, and the pH was adjusted to 6.5 while dropwise adding sodium hydroxide solution. Dialysis and lyophilization in distilled water to remove sodium chloride produced a pure glycol chitosan-bile acid complex.
비교예Comparative Example 5~6 및 5 to 6 and 실시예Example 1~2: 1 to 2: 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체의 제조(2) Preparation of the composite (2)
제조예 1~4에서 제조된 상이한 분자량 100 KDa(비교예 5), 50 KDa (비교예 6), 20 KDa(실시예 1), 또는 10 KDa(실시예 2)의 글리콜키토산 2.0g을 13mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 테트라에틸아민(TEA) 0.1g을 넣어 1 시간동안 교반하여 완전히 녹인다. 담즙산으로서 0.31g의 5-β-콜란산은 12 ml 디메틸아세트아미드용액에 녹이고 0.49 g의 1-에틸-3- (3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 0.17g의 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)를 가한후 2 시간동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 글리콜키토산 용액을 상기 제조된 5-β-콜란산 용액에 빠르게 첨가한 후 2 시간동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴(ACN) 중에서 석출하고 아세톤으로 세척한 후 진공건조 하였다. 진공건조 후 글리콜키토산-담즙산 복합체 파우더를 증류수에 녹인 후 수산화나트륨 용액을 적가하면서 pH를 6.5로 조정하였다. 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에서 투석하고 동결건조하여 순수한 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하였다. 13 mL of glycol chitosan 2.0 g having different molecular weights of 100 KDa (Comparative Example 5), 50 KDa (Comparative Example 6), 20 KDa (Example 1), or 10 KDa (Example 2) prepared in Preparation Examples 1 to 4 Dissolve in dimethyl sulfoxide (DMSO), add 0.1 g of tetraethylamine (TEA) and stir for 1 hour to dissolve completely. 0.31 g of 5-β-cholanic acid as a bile acid is dissolved in 12 ml dimethylacetamide solution and 0.49 g of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.17 g of hydroxybenzotria After adding sol (HOBt) and stirring for 2 hours to activate the carboxyl group. Then, the prepared glycol chitosan solution was quickly added to the prepared 5-β-cholanic acid solution, followed by stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, precipitated in acetonitrile (ACN), washed with acetone and dried in vacuo. After vacuum drying, the glycol chitosan-bile acid composite powder was dissolved in distilled water, and the pH was adjusted to 6.5 while dropwise adding sodium hydroxide solution. Dialysis and lyophilization in distilled water to remove sodium chloride produced a pure glycol chitosan-bile acid complex.
실시예Example 3: 3: 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체의 제조(3) Preparation of the composite (3)
제조예 4에서 제조된 분자량 10 KDa의 글리콜키토산 2.0g을 13mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 테트라에틸아민(TEA) 0.1g을 넣어 1 시간동안 교반하여 완전히 녹인다. 담즙산으로서 0.46g의 5-β-콜란산은 12 ml 디메틸아세트아미드용액에 녹이고 0.74 g의 1-에틸-3- (3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 0.26g의 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)를 가한 후 2 시간동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 글리콜키토산 용액을 상기 제조된 5-β-콜란산 용액에 빠르게 첨가한 후 2 시간동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴(ACN) 중에서 석출하고 아세톤으로 세척한 후 진공건조 하였다. 진공건조 후 글리콜키토산-담즙산 복합체 파우더를 증류수에 녹인 후 수산화나트륨 용액을 적가하면서 pH를 6.5로 조정하였다. 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에서 투석하고 동결건조하여 순수한 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하였다. 2.0 g of glycol chitosan having a molecular weight of 10 KDa prepared in Preparation Example 4 was dissolved in 13 mL of dimethylsulfoxide (DMSO), and 0.1 g of tetraethylamine (TEA) was stirred for 1 hour to completely dissolve. 0.46 g of 5-β-cholanic acid as bile acid is dissolved in 12 ml dimethylacetamide solution and 0.74 g of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.26 g of hydroxybenzotria After adding sol (HOBt), the mixture was stirred for 2 hours to activate the carboxyl group. Then, the prepared glycol chitosan solution was quickly added to the prepared 5-β-cholanic acid solution, followed by stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, precipitated in acetonitrile (ACN), washed with acetone and dried in vacuo. After vacuum drying, the glycol chitosan-bile acid composite powder was dissolved in distilled water, and the pH was adjusted to 6.5 while dropwise adding sodium hydroxide solution. Dialysis and lyophilization in distilled water to remove sodium chloride produced a pure glycol chitosan-bile acid complex.
비교예Comparative Example 7~9 및 7-9 and 실시예Example 4: 4: 저분자량의Low molecular weight 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체의 제조(4) Preparation of the composite (4)
제조예 1~4에서 제조된 상이한 분자량 100 KDa(비교예 7), 50 KDa (비교예 8), 20 KDa(비교예 9), 또는 10 KDa(실시예 4)의 글리콜키토산 2.0g을 12mL 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 테트라에틸아민(TEA) 0.1g을 넣어 1시간동안 교반하여 완전히 녹였다. 담즙산으로서 0.62g의 5-β-콜란산은 디메틸아세트아미드(DMAC)에 녹이고 0.99g의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 0.35g의 하이드록시벤조트리아졸 (HOBt)를 가한후 2 시간동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 글리콜키토산 용액을 상기 제조된 5-β-콜란산 용액에 빠르게 첨가한 후 2 시간동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴(ACN) 중에서 석출하고 아세톤으로 세척한 후 진공건조 하였다. 진공건조 후 글리콜키토산-담즙산 복합체 파우더를 증류수에 녹인 후 수산화나트륨 용액을 적가하면서 pH를 6.5로 조정하였다. 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에서 투석하고 동결건조하여 순수한 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하였다. 12 g of glycol chitosan 2.0 g having different molecular weights of 100 KDa (Comparative Example 7), 50 KDa (Comparative Example 8), 20 KDa (Comparative Example 9), or 10 KDa (Example 4) prepared in Preparation Examples 1-4 It was dissolved in sulfoxide (DMSO), and 0.1 g of tetraethylamine (TEA) was added thereto, and stirred for 1 hour to completely dissolve it. As bile acid, 0.62 g of 5-β-cholanic acid was dissolved in dimethylacetamide (DMAC) and 0.99 g of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.35 g of hydroxybenzotria. After adding sol (HOBt), the mixture was stirred for 2 hours to activate the carboxyl group. Then, the prepared glycol chitosan solution was quickly added to the prepared 5-β-cholanic acid solution, followed by stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, precipitated in acetonitrile (ACN), washed with acetone and dried in vacuo. After vacuum drying, the glycol chitosan-bile acid composite powder was dissolved in distilled water, and the pH was adjusted to 6.5 while dropwise adding sodium hydroxide solution. Dialysis and lyophilization in distilled water to remove sodium chloride produced a pure glycol chitosan-bile acid complex.
상기의 비교예 1~9 및 실시예 1~4에서 담즙산의 반응량을 달리하여 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체에서의 담즙산의 함량을 핵자기 공명법(NMR, nuclear magnetic resonance)으로 확인하였으며,(표 2) 점도를 측정하였다.(도 2, 표 2)In Comparative Examples 1 to 9 and Examples 1 to 4, the content of bile acid in the glycol chitosan-bile acid complex prepared by varying the reaction amount of bile acid was confirmed by nuclear magnetic resonance (NMR). Table 2) The viscosity was measured. (Fig. 2, Table 2)
실시예Example 5~10 및 5-10 and 비교예Comparative Example 10~21: 10-21: 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체에 In the complex 도세탁셀Doclex 봉입 Enclosed
고농도의 도세탁셀을 내부에 포함하는 저분자량의 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하기 위하여, 실시예 1에 따라 제조된 글리콜키토산(20KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 10 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입시키기 위해 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산에 대해 5 중량%(비교예 10), 10 중량%(실시예 5), 및 15 중량%(비교예 11)의 반응량이 되도록 도세탁셀을 소량의 메탄올에 용해하여 농도가 다른 3 개의 도세탁셀 용액을 제조하였다. In order to prepare a low molecular weight glycol chitosan-bile acid complex containing a high concentration of docetaxel therein, glycol chitosan (20KDa) -5-β-cholanic acid (the degree of substitution of cholanic acid for chitosan monomers) : 10%) 5% by weight (Comparative Example 10), 10% by weight (Example 5), and 15% by weight (Comparative Example) for glycol chitosan (10KDa) -5-β-cholanic acid to encapsulate docetaxel in the complex Docetaxel was dissolved in a small amount of methanol so as to react with 11) to prepare three docetaxel solutions having different concentrations.
실시예 2에 따라 제조된 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 10 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입시키기 위해 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산에 대해 5 중량%(비교예 12), 10 중량%(실시예 6), 15 중량%(실시예 7), 및 20 중량%(비교예 13)의 반응량이 되도록 도세탁셀을 소량의 메탄올에 용해하여 농도가 다른 3 개의 도세탁셀 용액을 제조하였다.Glycochitosan (10KDa) -5-β- to encapsulate docetaxel in a glycol chitosan (10KDa) -5-β-cholanic acid (substitution degree of cholanic acid for chitosan monomer: 10%) complex prepared according to Example 2 Docetaxel was added to a small amount of methanol so as to react 5% by weight (Comparative Example 12), 10% by weight (Example 6), 15% by weight (Example 7), and 20% by weight (Comparative Example 13) relative to cholanic acid. Three docetaxel solutions with different concentrations were prepared by dissolution.
실시예 3에 따라 제조된 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 15 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입시키기 위해 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산에 대해 5 중량%(비교예 14), 10 중량%(실시예 8), 15 중량%(실시예 9), 및 20 중량%(비교예 15)의 반응량이 되도록 도세탁셀을 소량의 메탄올에 용해하여 농도가 다른 3 개의 도세탁셀 용액을 제조하였다.Glycochitosan (10KDa) -5-β- to encapsulate docetaxel in a glycol chitosan (10KDa) -5-β-cholanic acid (substitution degree of cholanic acid to chitosan monomer: 15%) complex prepared according to Example 3 Docetaxel was added to a small amount of methanol so as to react 5% by weight (Comparative Example 14), 10% by weight (Example 8), 15% by weight (Example 9), and 20% by weight (Comparative Example 15) relative to cholanic acid. Three docetaxel solutions with different concentrations were prepared by dissolution.
실시예 4에 따라 제조된 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 20 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입시키기 위해 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산에 대해 5 중량%(비교예 16), 10 중량%(실시예 10), 및 20 중량%(비교예 17)의 반응량이 되도록 도세탁셀을 소량의 메탄올에 용해하여 농도가 다른 3 개의 도세탁셀 용액을 제조하였다.Glycochitosan (10KDa) -5-β- to encapsulate docetaxel in a glycol chitosan (10KDa) -5-β-cholanic acid (substitution degree of cholanic acid to chitosan monomer: 20%) complex prepared according to Example 4 Three docetaxel solutions with different concentrations were dissolved in small amounts of docetaxel in a reaction amount of 5% by weight (Comparative Example 16), 10% by weight (Example 10), and 20% by weight (Comparative Example 17) relative to cholanic acid. Was prepared.
비교예 9에서 제조된 글리콜키토산(20KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 20 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입시키기 위해 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산에 대해 5 중량%(비교예 18), 10 중량%(비교예 19), 15 중량%(비교예 20), 및 20 중량%(비교예 21)의 반응량이 되도록 도세탁셀을 소량의 메탄올에 용해하여 농도가 다른 3 개의 도세탁셀 용액을 제조하였다. Glycol chitosan (20KDa) -5-β-cholan to encapsulate docetaxel in the glycol chitosan (20KDa) -5-β-cholanic acid (substitution degree of cholanic acid to chitosan monomer: 20%) complex prepared in Comparative Example 9 Dissolve docetaxel in a small amount of methanol to bring about 5% by weight (Comparative Example 18), 10% by weight (Comparative Example 19), 15% by weight (Comparative Example 20), and 20% by weight (Comparative Example 21) relative to the acid. To prepare three docetaxel solutions having different concentrations.
실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 9에 따라 제조된 글리콜키토산(10KDa)-5-β-콜란산 복합체 50 mg을 각각 증류수와 PBS 완충용액이 3:1의 부피비로 혼합된 용액 6.66 ml에 초음파 분쇄기에서 분산시키고, 이 용액에 상기 도세탁셀 용액을 초음파 분쇄기에서 천천히 적하한 후 3 분동안 초음파 분쇄기로 분산시켰다. 이후 회전증발기를 이용하여 3 분동안 메탄올을 제거하고 0.2 마이크로 필터로 필터하여 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 제조하였다. 얻어진 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 동적 광산란법(light scattering method)을 이용하여 입자크기를 측정하였다(표 3).50 mg of the glycol chitosan (10KDa) -5-β-cholanic acid complexes prepared according to Examples 1, 2, 3, 4, and 9 were distilled water and PBS buffer solution of 3: 1, respectively. 6.66 ml of the mixed solution by volume ratio was dispersed in an ultrasonic grinder, and the docetaxel solution was slowly added dropwise in the ultrasonic grinder and then dispersed in the ultrasonic grinder for 3 minutes. Thereafter, methanol was removed for 3 minutes using a rotary evaporator, and a 0.2 micro filter was used to prepare a glycol chitosan-bile acid complex encapsulated with docetaxel. The particle size of the obtained docetaxel-encapsulated glycol chitosan-bile acid complex was measured using a dynamic light scattering method (Table 3).
실험예Experimental Example 1: 제조 조건에 따른 1: Depending on the manufacturing conditions 저분자량의Low molecular weight 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체 내의 담즙산 Bile Acids in the Complex 컨쥬게이션Conjugation 효율 측정 Measure efficiency
상기 비교예 1~9 및 실시예 1~4에서 글리콜키토산의 분자량, 담즙산, EDC, 및 HOBT의 사용량을 달리하여 제조한 글리콜키토산-담즙산 복합체 내 담즙산 함량을 수소 핵자기 공명법(1H NMR)을 이용하여 분석하였고 각각의 점도를 측정하였다. The bile acid content in the glycol chitosan-bile acid complex prepared by varying the amount of glycol chitosan, bile acid, EDC, and HOBT used in Comparative Examples 1 to 9 and Examples 1 to 4 was subjected to hydrogen nuclear magnetic resonance method ( 1 H NMR). And analyzed for each viscosity.
1H-NMR 스펙트로미터(spectrometer; Bruker, 400 MHz)를 이용하여 상기 실시예 1~4 및 비교예 1~9에서 제조한 글리콜키토산-담즙산 복합체에서 글리콜키토산의 단량체에 대한 담즙산의 치환도(DS, degree of substitution)를 측정하였다. 이때 사용된 NMR 용매로는 D2O/메탄올의 혼합용매(1:2, v/v)를 사용하였다. 또한 점도의 측정은 Brookfield LVDV Ⅱ 기기를 이용하여 검체 120mg를 4ml에 녹여 100rpm에서 측정하였다. Degree of substitution of bile acids for glycol chitosan monomers in the glycol chitosan-bile acid complexes prepared in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 9 using a 1 H-NMR spectrometer (Bruker, 400 MHz) , degree of substitution) were measured. In this case, a mixed solvent of D 2 O / methanol (1: 2, v / v) was used as the NMR solvent. In addition, the viscosity was measured at 100 rpm by dissolving 120 mg of the sample in 4 ml using a Brookfield LVDV II instrument.
그 결과를 하기 표 2, 도 2 및 도 3에 나타내었다.The results are shown in Table 2, FIG. 2 and FIG. 3.
도 3은 실시예 2에 따라 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the hydrogen nuclear magnetic resonance (1H NMR) analysis spectrum of the glycol chitosan-bile acid complex prepared according to Example 2.
도 3의 1H NMR 분석 스펙트럼에 따르면 글리콜키토산-담즙산 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있었다. According to the 1 H NMR analysis spectrum of Figure 3 it was confirmed that the glycol chitosan-bile acid complex was prepared.
표 2에 나타낸 바와 같이, 담즙산의 치환도는 글리콜키토산의 분자량에 따라 다르게 나타났다. 분자량 100KDa과 50KDa인 글리콜키토산을 담즙산과 반응시킨 경우, 글리콜키토산 단량체에 대한 담즙산의 치환율이 낮아 반응효율이 떨어지는 결과를 얻었으며 또한 도 2에 나타낸 바와 같이 분자량 100KDa와 50KDa인 글리콜키토산은 담즙산과 결합하게 되면 점성이 큰 젤 형태가 되어 주사제로의 사용이 적합하지 않게 되었다. 분자량 20 KDa과 10 KDa인 글리콜키토산을 담즙산과 반응시킨 경우에는 반응에 사용한 모든 담즙산이 치환되었다. 그러나, 분자량이 20 KDa의 글리콜키토산에 20 중량% 이상의 담즙산이 치환되는 경우에는 점성이 큰 글리콜키토산-담즙산 복합체가 제조가 되었다. 또한 분자량이 10KDa 내지 20KDa의 글리콜키토산에 5 중량%의 담즙산이 결합된 글리콜키토산-담즙산 복합체는 점성은 낮으나 소수성 부분인 담즙산의 양이 소수성 핵을 형성하기에 충분하지 못해서 나노입자가 형성되지 않았다. 따라서, 분자량이 10 KDa 내지 20 KDa인 글리콜키토산에 10 내지 20 중량%의 담즙산이 결합된 경우 현저히 용해도가 높아진 글리콜키토산-담즙산 복합체 나노제형을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다. As shown in Table 2, the degree of substitution of bile acids was different depending on the molecular weight of glycolchitosan. When the glycol chitosan having a molecular weight of 100 KDa and 50 KDa was reacted with bile acid, the substitution efficiency of the bile acid to the glycol chitosan monomer was low, resulting in low reaction efficiency. Also, as shown in FIG. 2, the glycol chitosan having a molecular weight of 100 KDa and 50 KDa was combined with bile acid. This results in a viscous gel that is not suitable for use as an injection. When glycol chitosan having a molecular weight of 20 KDa and 10 KDa was reacted with bile acid, all bile acids used in the reaction were replaced. However, when 20 weight% or more of bile acids are substituted for the glycol chitosan of the
실험예Experimental Example 2: 2: 도세탁셀이Docetaxel 봉입된Enclosed 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체의 입자크기 분포 측정 Measurement of Particle Size Distribution of Composites
상기 실시예 5~10 및 비교예 10~21에서 얻어진 나노입자를 1 mg/ml의 농도로 증류수에 잘 분산시킨 후 NICOMP 380ZLS를 이용하여 동적 광산란법(light scattering method)으로 입자크기를 측정하였다. 실시예 5~10에서 얻어진 나노입자의 측정결과를 도 1에 나타내었고, 실시예 5~10 및 비교예 10~18에서 얻어진 나노입자의 측정결과를 표 3에 나타내었다. The nanoparticles obtained in Examples 5 to 10 and Comparative Examples 10 to 21 were well dispersed in distilled water at a concentration of 1 mg / ml, and particle sizes were measured by a dynamic light scattering method using NICOMP 380ZLS. The measurement result of the nanoparticles obtained in Examples 5-10 is shown in FIG. 1, and the measurement result of the nanoparticles obtained in Examples 5-10 and Comparative Examples 10-18 is shown in Table 3.
도 1는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체의 입자크기 및 크기분포를 광산란법(light scattering method)에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. FIG. 1 is a graph showing the results of particle size and size distribution of a glycol chitosan-bile acid-composite prepared docetaxel prepared according to an embodiment of the present invention by a light scattering method.
도 1의 입자크기 분포에 따르면, 실시예 5~10을 통해 직경 약 100 ~ 200 nm의 도세탁셀이 봉입된 저분자량의 글리콜키토산-담즙산 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있다. According to the particle size distribution of Figure 1, it can be confirmed that the low molecular weight glycol chitosan-bile acid complex prepared by docetaxel with a diameter of about 100 ~ 200 nm through Examples 5-10.
하기 표 3에서 나타난 바와 같이, 도세탁셀이 10-15 중량%로 봉입되었을 때 입자 크기가 약 200 nm 이하로서 0.2~0.25 마이크로미터 여과기를 통해 멸균 여과가 가능한 것으로 나타났다. As shown in Table 3 below, when docetaxel was encapsulated at 10-15% by weight, the particle size was about 200 nm or less, and it was shown that sterile filtration was possible through a 0.2 to 0.25 micrometer filter.
실험예Experimental Example 3: 3: 저분자량의Low molecular weight 글리콜키토산Glycol Chitosan -- 담즙산Bile acid 복합체 내의 Within the complex 도세탁셀Doclex 봉입률 측정 Fill rate measurement
상기 실시예 5~10 및 비교예 10~18에서, 글리콜키토산(20KDa 또는 10KDa)-5-β-콜란산(10% , 15%, 또는 20%) 복합체에 도세탁셀을 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 또는 20 중량%가 되도록 봉입한 나노입자에 대해서 실제 사용한 도세탁셀의 양에 대한 글리콜키토산-담즙산 복합체 내에 봉입된 도세탁셀의 양을 HPLC(Waters)를 이용하여 측정함으로써 봉입된 도세탁셀 함량과 봉입률을 계산하였다.In Examples 5 to 10 and Comparative Examples 10 to 18, 5% by weight, 10% by weight of docetaxel in the glycol chitosan (20KDa or 10KDa) -5-β-cholanic acid (10%, 15%, or 20%) complex The amount of docetaxel encapsulated by measuring by HPLC (Waters) the amount of docetaxel encapsulated in the glycol chitosan-bile acid complex relative to the amount of docetaxel actually used for the nanoparticles encapsulated to 15 wt%, or 20 wt% Inclusion rate was calculated.
분석을 위하여 시료 내 용매는 50% 아세트니트릴을 사용하였다. 분석은 1 ml/분의 유속으로 25℃에서 진행하였고 약물의 검출은 UV 검출기를 이용하여 232 nm 파장에서 측정하였다. 이때 사용된 컬럼은 C18 컬럼(150mm L.ⅹ 4.6 mm I.D.)으로 입자크기가 5μm인 것을 사용하였다. 이동상은 50% 아세트니트릴 용액을 사용하였다. 정량화는 도세탁셀의 농도와 그에 따른 특성 피크의 면적 변화를 이용하여 검량선을 작성한 후 이를 이용하여 시료 내 도세탁셀의 농도를 계산하였다. 또한, 약물 봉입률 및 약물 담지량은 아래 식을 이용하여 계산하였다. 50% acetonitrile was used as the solvent in the sample for analysis. The analysis was carried out at 25 ° C. at a flow rate of 1 ml / min and the detection of the drug was measured at 232 nm wavelength using a UV detector. The column used was a C18 column (150 mm L.ⅹ 4.6 mm I.D.) was used as the particle size of 5μm. Mobile phase used 50% acetonitrile solution. For quantification, a calibration curve was prepared using the concentration of docetaxel and the area change of the characteristic peak, and then the concentration of docetaxel in the sample was calculated using the calibration curve. In addition, the drug loading rate and the drug loading amount were calculated using the following formula.
봉입률(%)=(나노입자내 약물량)/(초기 약물 사용량)ⅹ100Inclusion Rate (%) = (Drug Amount in Nanoparticles) / (Initial Drug Consumption) ⅹ100
약물함량(%)=(나노입자내 약물량)/(전체 나노입자 중량)ⅹ100Drug Content (%) = (Drug Content in Nanoparticles) / (Total Nanoparticle Weight) ⅹ100
분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다.The analysis results are shown in Table 3 below.
비교예 9에서 제조된 글리콜키토산(20KDa)-5-β-콜란산(키토산 단량체에 대한 콜란산의 치환도: 20 %) 복합체에 도세탁셀을 봉입하였을 때에는 도세탁셀의 봉입량과 관계없이 입자 크기가 200 nm를 초과하여 멸균 여과 필터가 어렵기 때문에 글리콜키토산 분자량은 20KDa을 초과하지 않아야하며 복합체 제조시 글리콜키토산 단량체에 대한 5-β-콜란산의 중량%도 20%를 초과하지 않아야 한다.When docetaxel was encapsulated in a glycol chitosan (20KDa) -5-β-cholanic acid (substituted degree of cholanic acid for chitosan monomer: 20%) complex prepared in Comparative Example 9, the particle size was 200 regardless of the amount of docetaxel encapsulated. Since sterile filtration filters are difficult to exceed nm, the glycolchitosan molecular weight should not exceed 20KDa and the weight percent of 5-β-cholanic acid to the glycolchitosan monomer in the preparation of the complex should not exceed 20%.
상기 표 3에 나타난 바와 같이 글리콜키토산(20KDa 또는 10KDa)-5-β-콜란산(10%, 15% 또는 20%) 복합체에 도세탁셀을 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%로 반응시켰을 때 봉입률은 모두 95% 이상으로서 실제 사용된 도세탁셀이 거의 봉입됨을 알 수 있다. 또한, 도세탁셀의 봉입율이 19%를 초과할 경우에는 생성된 나노입자의 직경이 200 nm를 초과하여 여과에 의해 멸균하기 어려운 나노입자가 생성된다는 것을 알 수 있다. As shown in Table 3, when docetaxel was reacted at 10% by weight, 15% by weight, or 20% by weight of the glycol chitosan (20KDa or 10KDa) -5-β-cholanic acid (10%, 15% or 20%) complex The encapsulation rate is all 95% or more, which shows that almost all of the docetaxel actually used is encapsulated. In addition, when the encapsulation rate of docetaxel exceeds 19%, it can be seen that the diameter of the produced nanoparticles exceeds 200 nm to produce nanoparticles which are difficult to sterilize by filtration.
표 2와 표 3에 따르면 글리콜키토산의 분자량이 10 내지 20 KDa, 담즙산의 치환도가 10 내지 20 중량%를 벗어난 조합일 경우 입자 크기가 100~200nm 범위를 벗어나며, 글리콜키토산 분자량이 10K 내지 20KDa인 경우에도 담즙산 치환도가 5%이면 나노입자가 형성되지 않아서 사이즈가 측정되지 않았다. 따라서 나노입자가 형성되기 위한 소수성 핵이 형성되기 위해서는 소수성 담즙산이 10% 이상 결합되어야 함을 알 수 있다. 글리콜 키토산 분자량이 20 KDa이고 담즙산 치환도가 10% 인 경우, 글리콜키토산 분자량이 10 KDa이고 담즙산 치환도가 20%인 경우에는 입자크기가 200nm를 초과하게 되기 때문에 0.2μm 멸균여과가 불가능하게 된다. 따라서, 글리콜키토산의 분자량이 20 KDa 미만이고, 담즙산의 치환도가 20 중량% 미만인 경우에 멸균여과가 가능한 입자크기의 나노입자가 생성될 수 있음을 확인할 수 있다. 실험예 4: 도세탁셀이 봉입된 저분자량의 글리콜키토산 - 담즙산 복합체의 항암 효과 측정 According to Table 2 and Table 3, when the combination of the molecular weight of glycol chitosan is 10 to 20 KDa, the substitution degree of bile acid is 10 to 20% by weight, the particle size is outside the range of 100 ~ 200nm, the glycol chitosan molecular weight is 10K to 20KDa Even when the bile acid substitution degree of 5% nanoparticles were not formed because the size was not measured. Therefore, in order to form a hydrophobic nucleus for the formation of nanoparticles it can be seen that more than 10% of the hydrophobic bile acid. When the glycol chitosan molecular weight is 20 KDa and the bile acid substitution degree is 10%, when the glycol chitosan molecular weight is 10 KDa and the bile acid substitution degree is 20%, since the particle size exceeds 200 nm, 0.2 μm sterilization filtration is impossible. Therefore, when the molecular weight of glycol chitosan is less than 20 KDa, and the degree of substitution of bile acid is less than 20% by weight, it can be seen that nanoparticles having a particle size capable of sterilizing filtration can be produced. Experimental Example 4: Docetaxel Enclosed Low molecular weight Anticancer Effect of Glycol Chitosan - Bile Acid Complex
상기 실시예 7에서 제조된 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체의 항암효과를 측정하기 위하여 실험동물로서 누드 마우스 (BALB/c)를 이용하여 하기와 같이 실험하였다. In order to measure the anticancer effect of the docetaxel-containing glycol chitosan-bile acid complex prepared in Example 7, the experiment was performed using nude mice (BALB / c) as experimental animals.
사람주 유방암 세포(MDA-MB231)를 이식한 실험동물에 상기 실시예 2에서 제조된 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 5 mg/kg 또는 10 mg/kg를 4 일에 한 번씩 3 회 투여한 후 36 일동안 실험동물의 체중 및 종양 크기를 측정하였다. 이때 양의 대조군으로서 상업적으로 판매되고 있는 탁소텔(taxotereTM, 사노피-아벤티스, 성분: 도세탁셀)을 사용하였으며, 음의 대조군으로서 주사용 증류수를 사용하였다. 또한, 비교군으로서 항암제가 봉입되지 않은 실시예 1에서 제조된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 도세탁셀 함량 기준으로 5mg/kg 및 10 mg/kg로 투여하였다. Dosetaxel-containing glycol chitosan-bile acid complex prepared in Example 2 was administered to the experimental animal transplanted with human breast cancer cells (MDA-MB231) 5 mg / kg or 10 mg / kg three times every four days. The body weight and tumor size of the experimental animals were measured for 36 days. At this time, commercially available taxotere (taxotere ™ , Sanofi-Aventis, component: docetaxel) was used as a positive control, and distilled water for injection was used as a negative control. In addition, the glycol chitosan-bile acid complex prepared in Example 1 without an anticancer agent was administered as a comparative group at 5 mg / kg and 10 mg / kg based on the docetaxel content.
그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다. The results are shown in FIGS. 4 and 5.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항암제가 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체 나노입자를 마우스에 투여한 다음 마지막 투여후 36일째에 종양 크기를 측정하여 tumor inhibition 정도를 계산한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 4 shows the results of calculating the degree of tumor inhibition by measuring the tumor size 36 days after the last administration to the mice administered the glycol chitosan-bile acid composite nanoparticles encapsulated with an anticancer agent prepared according to an embodiment of the present invention It is a graph.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항암제가 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체 나노입자를 마우스에 투여한 다음 시간의 경과에 따라 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the results of measuring the weight of the mouse over time after the administration of the mice administration of the anti-cancer agent-encapsulated glycol chitosan-bile acid composite nanoparticles prepared according to an embodiment of the present invention.
도 4에 따르면, 글리콜키토산-담즙산 복합체만을 투여한 군의 실험동물의 종양 억제 효율(%)은 86%로서 종양을 유의적으로 억제시키지 못하였으며, 5 mg/kg의 탁소텔과 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 투여한 실험동물의 종양 크기는 유사한 패턴으로 종양의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 10 mg/kg의 도세탁셀이 봉입된 글리콜키토산-담즙산 복합체를 투여한 실험동물의 종양 억제 효율은 7.248 %로서 같은 용량의 탁소텔을 투여한 실험동물군의 종양억제 효율인 3.959%보다 훨씬 큰 종양억제 효과를 보임을 확인하였다. According to Figure 4, the tumor suppression efficiency (%) of the experimental animals of the group administered only the glycolchitosan-bile acid complex was 86%, did not significantly inhibit the tumor, 5 mg / kg glycol containing docetaxel and docetaxel Tumor size of the experimental animals administered the chitosan-bile acid complex was confirmed to inhibit tumor growth in a similar pattern. However, the tumor suppression efficiency of the experimental animals administered with the glycol chitosan-bile acid complex containing 10 mg / kg of docetaxel was 7.248%, which was much greater than the tumor suppression efficiency of 3.959% of the experimental animals treated with the same dose of taxotel. It was confirmed to show an inhibitory effect.
도 5에 따르면, 모든 투여군에서 체중이 크게 감소하지 않음을 확인할 수 있으며 도세탁셀 봉입 글리콜키토산-담즙산 복합체 10 mg/kg 투여군에서 약간의 체중 감소가 있었으나 21 일 이후 회복된 후 유지되었다.According to Figure 5, it can be seen that the body weight does not significantly decrease in all the administration group, there was a slight weight loss in the docetaxel-embedded glycolchitosan-bile acid complex 10 mg / kg administration group, but was maintained after recovery after 21 days.
Claims (8)
상기 글리콜키토산 단량체는 10 내지 20 KDa이고, 글리콜키토산 단량체에 대해 5-β-콜란산이 10 내지 20 치환도(%)로 결합되고, 상기 복합체 내부에 9 내지 15 중량%의 함량으로 항암제가 봉입되며, 직경이 100 내지 200 nm인 나노입자.A nanoparticle having a hydrophobic anticancer agent encapsulated inside a glycol chitosan-bile acid complex in which 5-β-cholanic acid is covalently bonded to glycol chitosan to form self-aggregates in water,
The glycol chitosan monomer is 10 to 20 KDa, 5-β-cholanic acid is bound by 10 to 20 substitution degree (%) to the glycol chitosan monomer, and the anticancer agent is encapsulated in the content of 9 to 15% by weight in the complex. , Nanoparticles having a diameter of 100 to 200 nm.
(b) 5-β-콜란산을 유기용매에 용해시켜 담즙산 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 글리콜키토산 용액에 상기 담즙산 용액을 적하 및 교반하여 글리콜키토산-담즙산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;
(d) 상기 반응액을 유기용매 중에서 석출하여 글리콜키토산-담즙산 복합체를 획득하는 단계; 및
(e) 유기 용매 중에 용해시킨 소수성 항암제 용액을 상기 획득한 글리콜키토산-담즙산 복합체의 수용액과 혼합하여 글리콜키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 항암제를 봉입하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 나노입자의 제조방법.(a) dissolving a low molecular weight glycol chitosan in an organic solvent to prepare a chitosan solution;
(b) dissolving 5-β-cholanic acid in an organic solvent to prepare a bile acid solution;
(c) dropping and stirring the bile acid solution to the glycol chitosan solution to prepare a reaction solution in which a glycol chitosan-bile acid complex is formed;
(d) precipitating the reaction solution in an organic solvent to obtain a glycol chitosan-bile acid complex; And
(e) mixing a hydrophobic anticancer agent dissolved in an organic solvent with an aqueous solution of the glycolchitosan-bile acid complex thus obtained, thereby encapsulating a hydrophobic anticancer agent in the glycolchitosan-bile acid complex. Method for producing a nanoparticle of any one claim.
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