JP2012110337A - 抗真菌性および／または抗増殖性分子を同定するためのｔＲＮＡスプライシング経路の酵素の標的化 - Google Patents

抗真菌性および／または抗増殖性分子を同定するためのｔＲＮＡスプライシング経路の酵素の標的化 Download PDF

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Abstract

【課題】ｔＲＮＡスプライシング経路における１以上の構成要素の活性をモジュレートする化合物のスクリーニング及び同定方法を提供する。
【解決手段】ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ及び／又はｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物のスクリーニング及び同定方法。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ及び／又は動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害する化合物を同定するためのアッセイ。真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ及び／又は真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害する化合物を同定するためのアッセイ。癌及び／又は真菌感染症を治療及び／又は予防するために有用な医薬品のリードを同定するために、化合物ライブラリーをハイスループットでスクリーニングするための簡便な高感度アッセイ。
【選択図】図１

Description

１．発明の分野
本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路において１つまたは複数の成分の活性をモジュレートする化合物のスクリーニングおよび同定方法に関する。特に本発明は、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物のスクリーニングおよび同定方法に関する。本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害する化合物を同定するためのアッセイを提供する。本発明はまた、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害する化合物を同定するためのアッセイを提供する。本発明の方法は、癌および／または真菌感染症の治療および／または予防に有用な医薬品の候補を同定するための、化合物ライブラリをハイスループットでスクリーニングするための簡便な高感度アッセイを提供する。
２．発明の背景
２．１ 癌および新生物疾患
癌は米国における死因の第２位である。米国癌学会は、２００１年には、１３０万件の新しい癌の症例が生じ、癌によって５５０，０００人が死亡すると推定した。１９９０年代では、全体の割合が年間１％低下していた。癌に罹患したことのある米国人が９百万人生存している。ＮＩＨは、癌の直接医療費が６００億ドルと推定している。
現在、癌の治療は患者内の新生物細胞を根絶させるための手術、化学療法および／または放射線療法を含む（たとえば、Stockdale、1998、「Principles of Cancer Patient Management」、Scientific American:Medicine、第3巻、RubensteinおよびFederman編、第12章、セクションＩＶ参照）。これらの手法はすべて患者にとって顕著な不利益をもたらす。たとえば手術は、患者の健康状態により禁忌であったり、または患者に承諾されていなかったりする場合がある。さらに、手術によって新生物組織が完全に除去されない可能性もある。放射線療法は、照射された新生物組織が正常な組織よりも放射線に対して高い感度を示す場合にのみ有効であり、また放射線療法はしばしば重篤な副作用を誘発させることがある（同上）。化学療法に関しては、新生物疾患の治療に利用可能な様々な化学療法剤が存在する。しかし、様々な化学療法剤が利用可能であるにもかかわらず、従来の化学療法には多くの不利益が存在する（たとえば、Stockdale、1998、「Principles Of Cancer Patient Management」、Scientific American Medicine、第3巻、RubensteinおよびFederman編、第12章、セクション10参照）。化学療法剤のほぼすべてに毒性があり、化学療法は重篤な嘔気、骨髄抑制、免疫抑制などを含めた、顕著かつ多くの場合危険性の高い副作用を引き起こすことがある。さらに、多くの腫瘍細胞が多剤耐性によって化学療法剤に耐性を有するか、耐性を確立する。
したがって、新規化合物および組成物、ならびに前述の副作用が軽減されたまたは存在しない、癌もしくは新生物疾患の治療に有用な方法が当分野で顕著に必要とされている。さらに、特異性が高く毒性が低い、癌細胞に特異的な治療を提供する癌の治療法が必要とされている。
２．２ 真菌感染症
２．２．１ 病因
真菌は真核微生物であり、酵母、カビ、または両形態の組合せとして生じることができる。一部の真菌は表層性、皮膚性、皮下性、全身性またはアレルギー性の疾患を引き起こすことができる。酵母は、単細胞からなる微視的な真菌であり、出芽により繁殖する。対照的に、カビは菌糸として知られる長い繊維状で存在し、先端が伸張することによって成長する。菌糸は隔壁がまばらであるものから隔壁が規則正しいものまで多岐にわたり、様々な数の核を有する。その形や大きさにかかわらず、真菌はすべて従属栄養性であり、その近接した周囲に加水分解酵素を放出することによってその食物を外部で消化する（吸収栄養性）。
真菌性および他の糸状菌性の病原体（その一部がHuman Mycoses、E.S. Beneke、Upjohn Co.:Kalamazoo, MI、1979；Opportunistic Mycoses of Man and Other Animals、J.M.B. Smith、CAB International:英国Wallingford、1989；およびScrip's Antifungal Report、PJB Publications Ltd、1992に記載されている）は、それだけには限定されないが、アスペルギルス症、黒色砂毛症、カンジダ症、クロモミコーシス、クリプトコッカス症、爪甲真菌症、もしくは外耳炎（耳真菌症）、フェオフィホ真菌症、フィコミコーシス、癜風、白癬、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、黄癬、渦状癬、手白癬、黒癬（手掌）、足白癬、爪白癬、トルロプシス症、黄菌毛、白色砂毛症、およびそれらの別名などの皮膚、毛、または粘膜に関与する真菌症から、それだけには限定されないが、放線菌症、アスペルギルス症、カンジダ症、クロモミコーシス、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、エントモフトラ症、ゲオトリクム症、ヒストプラスマ症、ムコール菌症、菌腫、ノカルジア症、北アメリカ分芽菌症、パラコクシジオイデス症、フェオフィホ真菌症、フィコミコーシス、ニューモシスチス肺炎、パイチオーシス（Pythiosis）、スポロトリクス症、トルロプシス症、およびそれらの別名などの重篤な全身性または日和見感染症までの多岐にわたるヒト、動物、および植物における様々な疾患の原因であり、これらの一部は致命的であり得る。
既知の真菌性および糸状菌性の病原体には、それだけには限定されないが、アブシディア spp.、アクチノマデュラ・マデュレ（Actinomadura madurae）、アクチノミセス spp.、アレッシェリア・ボイジイ（Allescheria boydii）、アルテルナリア spp.、アントプシス・デルトイデア（Anthopsis deltoidea）、アポフィソマイセス・エレガンス（Apophysomyces elegans）、アルニウム・レオプリナム（Arnium leoporinum）、アスペルギルス spp.、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、バシジオボーラス・ラナラム（Basidiobolus ranarum）、バイポラリス spp.、ブラストマイセス・デルマティティス（Blastomyces dermatitis）、カンジダ spp.、セファロスポリウム spp.、ケトコニジウム（Chaetoconidium）spp.、ケトミウム spp.、クラドスポリウム spp.、コクシジオイデスイミティス、コニジオボルス spp.、コリネバクテリウム・テヌイス（Corynebacterum tenuis）、クリプトコッカス spp.、クンニンガメラ・ベルトレティエ（Cunninghamella bertholletiae）、クルブラリア spp.、ダクチラリア spp.、エピデルモフィトン spp.、エピデルモフィトン（Epidermophyton floccosum）、エキセロフィウム（Exserophilum）spp.、エクソフィアラ spp.、フォンセセア spp.、フザリウム spp.、ゲオトリクム spp.、ヘルミントスポリウム spp.、ヒストプラスマ spp.、レシトフォーラ（Lecythophora）spp.、マズレラ spp.、マラッセジア・フルフル（Malassezia furfur）、ミクロスポラム spp.、ムコール spp.、ミコセントロスポラ・アセリーナ（Mycocentrospora acerina）、ノカルジア spp.、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペニシリウム spp.、フェオスクレラ・デマティオイデス（Phaeosclera dematioides）、フェオアンネロマイセス（Phaeoannellomyces）spp.、フィアレモニウム・オボバタム（Phialemonium obovatum）、フィアロフォラ spp.、フォーマ spp.、ピエドライア・ホルタイ（Piedraia hortai）、ニューモシスティスカリニ、ピチウム・インシジオサム（Pythium insidiosum）、リノクラジエラ・アクアスペルサ（Rhinocladiella aquaspersa）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、リゾープス spp.、サクセナエ・バシフォルミス（Saksenaea vasiformis）、サルシノマイセス・フェオムリフォルミス（Sarcinomyces phaeomuriformis）、スポロスリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）、シンセファラストラルン・ラセモサム（Syncephalastruln racemosum）、タエニオレラ・ボッピイ（Taeniolella boppii）、トルロプシス spp.、トリコフィトン spp.、トリコスポロン spp.、ウロクラジウム・カルタルイン（Ulocladium chartaruin）、ワンギエラ・デルマティティディス（Wangiella dermatitidis）、キシロハイファ（Xylohypha）spp.、およびそれらの別名が含まれる。「明らかに病原性の可能性を有する」（Smith、前掲書）他の真菌には、それだけには限定されないが、サーモムコール・インディカセウダティセ（Thermomucor indicaeseudaticae）、ラディオマイセス（Radiomyces）spp.、および既知の病原性のある属の他の種が含まれる。サッカロミセスがヒトの病原体として関係するという報告も存在する（たとえば、Fungemia with Saccharomycetaceas、H. Nielson、J. Stenderup、およびB. Bruun、Scand. J. Infect. Dis.、22:581-584、1990）。ヒトにおける真菌感染症は、従来より許容されかつ容易に利用可能な抗真菌治療法を補助として組み合わせることで、ヒト宿主の免疫応答機構によって、大部分が十分に制御されてきた。しかし、近年では、移植レシピエント、化学療法を受けている患者、およびＨＩＶに感染した個体などの免疫抑制状態および免疫不全状態の個体数が増加した結果、重篤な真菌症の数に顕著な増加がみられる。
真菌感染症は、それだけには限定されないが、カンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、ケカビ症、パイチオーシス、エントモフトラ症、卵菌症、クロモミコーシス、トルロプシス症、ペニシリウム spp.、トリコスポロン spp.、ペシロミセス spp.、ミクロスポラム spp.による感染症、および様々なその他の／より稀な日和見性の真菌症を含めて獣医学においても顕著な問題である（Opportunistic Mycoses of Man and Other Animals、J.M.B. Smith、CAB International、英国Wallingford、1989）。真菌感染症は、イヌおよびネコにおける鼻疾患の一般的な原因である（Fungal Diseases of the Nasal Cavity of the Dog and Cat、Wolf, A.M.、1992、Vet. Clin. of North Amer.:Small Anim. Prac. 22、1119-1132）。それだけには限定されないが、アスペルギルス spp.、カンジダ spp.、ペシロミセス spp.、ペニシリウム spp.、アルテルナリア spp.、ゲオトリクム spp.、およびクラドスポリウム spp.を含めた様々な真菌が動物の眼から単離されており、これらは、それだけには限定されないが、ウマ、イヌ、およびネコを含めたいくつかの種において真菌性角膜炎を引き起こし得る（Microbiology of the Canine and Feline Eye、P.A. GerdingおよびI. Kakoma、1990、Vet. Clin. of North Amer.:Small Anim. Prac.、20、615-625）。それだけには限定されないが、イヌ小胞子菌、毛瘡白癬菌、トリコフィトン・ベルコサム（Trichophyton verucosum）、ミクロスポラム・エキナム（Mycrosporum equinum）、ミクロスポラム・ガリネ（Mycrosporum gallinae）、およびミクロスポラム・ナナム（Mycrosporum nanum）を含めた真菌による皮膚感染症は、多くの異なる動物で野性および家畜のいずれでも生じ、一部の感染症は特定の宿主種に特異的である（Fungal Skin Infections Associated with Animal Contact、W.H. Radentz、1991、AFP43、1253-1256）。
動物に感染する真菌の一部は、動物からヒトへと伝染する。真菌の人畜共通病はペットとして使用される動物に最も関連しており、動物と接触する度合いがより多い獣医学従事者においてより高い頻度で見つかる（同書、M.R. Lappin、Vet. Clin. of North Amer.:Small Anim. Prac.、23、57-78）。ヒトおよび動物の両方を治療するためにも局所性および全身性の抗真菌剤が使用されている。
真菌の感染症または侵襲は、野菜、果物、および木の実の農作物を保護するために殺真菌剤が使用されている農業においても非常に重篤な問題である（F.L. McEwenおよびG.R. Stephenson、1979、The Use and Significance of Pesticides in the Environment、Wiley、ニューヨーク）。病原体と闘うために殺真菌剤を土壌、種子、繁殖材、成長中の植物、および農産物に施用する。種子および土壌に存在する病原体には、それだけには限定されないが、アファノマイセス（Aphanomyces）spp.、アルミラリア（Armillaria）spp.、セファロスポリウム spp.、シリンドロクラジウム（Cylindrocladium）spp.、フザリウム spp.、ヘルミントスポリウム spp.、マクロフォミナ（Macrophomina）spp.、マグナポルテ（Magnaporthe）spp.、オフィオボーラス（Ophiobolus）spp.、フィマトトリカム（Phymatotrichum）spp.、フィトフトラ（Phytophthora）spp.、フィチウム（Pythium）spp.、リゾクトニア（Rhizoctonia）spp.、スセロチウム（Scerotium）spp.、スクレロチニア（Sclerotinia）spp.、チエラビオプシス（Thielaviopsis）spp.、ウスティラゴ（Ustilago）spp.、バーティシリウム spp.、およびウェトキセリニア（Whetxelinia）spp.が含まれる（R. Rodriguez-Kabana、P.A. Backman、およびE.A. Curl、Control of Seed and Soil-Borne Plant Diseases、Antifungal Compounds、M. SiegelおよびH. Sisler編、Marcel Dekker Inc.、ニューヨーク、1977）。生果物および生野菜の収穫後の疾患は、それだけには限定されないが、アルテルナリア spp.、ボトリチス spp.、セントロスポラ（Centrospora）spp.、セラトシスティス（Ceratocystis）spp.、コレトトリカム（Colletotrichum）spp.、クリプトポリオプシス（Cryptoporiopsis）spp.、ディプロディア（Diplodia）spp.、フザリウム spp.、ヘルミントスポリウム spp.、モニリニア（Monilinia）spp.、ネクトリア（Nectria）spp.、オオスポラ（Oospora）spp.、ペニシリウム spp.、フィリクテナ（Phlyctaena）spp.、フォーマ spp.、フォモプシス（Phomopsis）spp.、リゾープス spp.、スクレロティニア（Sclerotinia）spp.、およびバーティシリウム spp.を含めた真菌によって引き起こされる。
殺真菌剤は、農作物の開発中に疾患を制御するため、農作物の貯蔵性を向上させるため、または特定の農作物の生産を増大させるために、世界中の農作物の半分の栽培で使用されていると推定されている（G. OrdishおよびJ.F. Mitchell.、1967、World Fungicide Usage.、Fungicides, an Advanced Treatise、第1巻、39-62ページ、D.C. Torgeson編、Academic Press、ニューヨーク）。米国における非牧草耕作地の約２０％が殺真菌剤で処理されている（E.W. Palm、Estimated Crop Losses Without the Use of Fungicides and Nematicides and Without Nonchemical Controls、CRC Handbook of Pest Management in Agriculture、第1巻、139ページｆ）。経済的な観点では、殺真菌剤の使用を停止すると、畑作物、野菜作物、ならびに果物および木の実作物でもたらされる損失は合計２０億ドルを超えると推定される（同書）。一部の農作物は特に打撃が大きく、たとえば、ピーナッツの損失は全農作物の７０％超となると予想され、ペカンの損失は全農作物の６５％超、トマトの損失は全農作物の６０％超、イモの損失は全農作物の４０％超、ならびにリンゴ、サクランボ、モモ、および西洋ナシなどの果物はそれぞれその全農作物の５０％超となりうる（同書）。
木製品に対する真菌の攻撃も経済的に重大であり、既存の保存剤を大量に使用しても米国において年間１０億ドルの損害が推定されている（生きた木は含まず）（M.P. Levi、Fungicides in Wood Preservation、Antifungal Compounds、M. SiegelおよびH. Sisler編、Marcel Dekker Inc.、ニューヨーク、1977）。何百もの真菌種が木製品から単離されている。表面カビは、それだけには限定されないが、トリコデルマ spp.、グリオクラジウム（Gliocladium）spp.、ペニシリウム spp.、アスペルギルス spp.、およびアルテルナリア spp.を含めた属の侵襲により起こる。辺材変色性の真菌には、それだけには限定されないが、セラトシスティス（Ceratocystis）spp.、ディプロディア（Diplodia）spp.、グラフィウム（Graphium）spp.、アウレオバシディウム（Aureobasidium）spp.、およびサイトスポラ（Cytospora）spp.が含まれる。経済的損失の大部分の原因である腐敗性の真菌には、それだけには限定されないが、コニオフォーラ（Coniophora）spp.、レンティナス（Lentinus）spp.、レンジテス（Lenzites）spp.、ポリポラス（Polyporus）spp.、ポリア（Poria）spp.、およびメルリウス（Merulius）spp.が含まれる。軟腐性の真菌には、それだけには限定されないが、アスコマイセテス（Ascomycetes）spp.、ケトミウム spp.、および不完全菌綱が含まれる。
真菌の侵襲に弱い他の製品には、布地、プラスチック、紙、ゴム、接着剤、乳化重合体、革、化粧品、家庭用消毒剤、脱臭剤、およびペンキが含まれる。（C.C. Yeager、Fungicides in Industry、Antifungal Compounds、M. SiegelおよびH. Sisler編、Marcel Dekker Inc.、ニューヨーク、1977）。他のどの基材よりもペンキに関して最も多くの研究がなされている。ペンキを塗装した表面を攻撃する真菌は、多くの場合、交換が必要なまでにペンキ被膜を損なわせる。真菌は新しい被膜と通して出現し得るので、再塗装は一時的にしかこの問題を解決することができない。ペンキの侵襲には、それだけには限定されないが、プルラリア（Pullularia）spp.、クラドスポリウム spp.、アスペルギルス spp.、およびペニシリウム spp.が含まれる。ペンキ系上の真菌の成長に対し効果がある唯一の成功した方法には、適切な静真菌剤または殺真菌剤の添加を必要とする。
２．２．２ 現在の治療
抗真菌薬物療法の開発は、ヒトまたは動物の宿主および真菌性の病原体はいずれも真核生物であり、多くの共通の薬物標的を有するのが大きな理由で、抗菌薬物療法の開発のように迅速に発展していない。現在までに、抗真菌薬物および候補化合物のほとんどが真菌細胞の表面または膜の成分に対して活性を有するものであった（New Antifungal Agents、J.R. Graybill、Eur. J. Clin. Microbiol. Dis.、8:402-412、1989；Targets for Antifungal Drug Discovery、Y. Koltin、Annual Reports in Medicinal Chemistry、25:141-148、1989；Screening of Natural Products for Antimicrobial Agents、L. SilverおよびK. Bostian、Eur. J. Clin. Microbiol. Dis.、9:455-461、1990；New Approaches for Antifungal Drugs、F.B. Fernandes編、Birkhauser:Boston、1992；Scrip's Antifungal Report、PJB Publications Ltd、1992）。たとえば、ポリエンマクロライドは細胞表面上の真菌に特異的なエルゴステロールに結合し、アゾール薬物はエルゴステロール生合成酵素を阻害する。ある程度の努力がチューブリンおよびヌクレオチド代謝など細胞内の標的に向けられていたが、ベノミルおよびフルオロシトシンなどの得られた化合物は毒性および耐性に関して問題がある。シクロヘキシミド（アクチジオン）は、特に真菌に特異的でないにもかかわらず、一部の農作物に殺真菌剤として使用されている。ブラストサイジンＳも、農作物に抗真菌剤として使用されている。
真菌に特異的な療法は同定が困難なだけでなく、真菌症の治療に現在利用可能な薬物の多くが顕著な副作用を有するか、一部の重要な病原体に対する有効性を欠く。たとえば、抗真菌ポリエンマクロライド系抗生物質であるアムホテリシンＢは、嘔気および嘔吐から腎臓障害にわたる短期および長期の有害作用をどちらも有する。クロトリマゾールおよびミコナゾールなどのアゾール薬は、その使用が一般に局所的または表層的な感染症の治療に限定されるほどの有害な副作用を有する。フルコナゾールなどのより最近開発されたトリアゾール薬は副作用がより少ないが、すべての病原体に対して完全に有効ではない。また、これらの薬物に対して耐性が発生しているというある程度の証拠が存在する。したがって、副作用があったとしても僅かであり、現在の薬物では不十分である病原体に対する有効性を有する新規の抗真菌薬が継続的に必要とされている。
さらに、真菌性および糸状菌性の病原体は多くの場合、薬物流入に対する細胞透過性バリアによって、多くの療法に対して自然に耐性があるか、または耐性を生じている。殺真菌剤耐性の発生は、本来は殺真菌剤に感受性のあった真菌細胞または真菌集団が、殺真菌剤に一定期間曝されたあとに遺伝性の変化によって感受性が低くなった際に起こる。耐性の事例のほとんどは作用部位における変化または殺真菌剤の取り込みの変化に関連しており、解毒は稀な事例である（J. Dekker、Preventing and Managing Fungicide Resistance, Pesticide Resistance: Strategies and Tactics in Man）。特定の用途では（たとえば農業）、殺真菌剤を交互に使用すること、または殺真菌剤の混合物を使用することによって耐性に対処することが可能である。耐性病原体集団の蓄積を予防または遅延させるためには、特定の疾患に対して有効な異なる化学物質が利用可能でなければならない。利用可能な化学物質数を増やすための一方法は、新しい部位特異的な阻害剤を探索することである（同上）。したがって、課題は、病原体に貫入し、ヒト、動物、または植物の宿主に有害作用を与えることなくそれを特異的に死滅させるかその成長を特異的に停止させることができる化合物を同定する方法を開発することである。
抗真菌化合物を同定するための定法は、真菌の成長の阻害を指標としてほぼこれだけに依存してきた。天然産物、半合成、または合成化学物質のライブラリを、標的病原体または関連する非病原体モデル生物を死滅させる、またはその成長を停止させる能力についてスクリーニングする。これらの試験は厄介であり、化合物の作用機構についての情報をまったく与えない。このようなスクリーニングから現れる有望な候補化合物は、その後、ヒト、動物、または植物の宿主に対する毒性の可能性について試験しなければならず、次いで、影響を受けた分子標的、およびこの薬物がこの標的とどのように相互作用するかを正確に同定するために、詳細な作用機構の研究を実施しなければならない。
真菌症の治療はより一層大きな公共の重要性を担っているので、特に免疫無防備状態または免疫抑制状態の個体数の増加ならびに住居および職場における糸状菌感染症に関する公衆の理解が顕著になったことに鑑みて、抗真菌および抗糸状菌の創薬により有効な方法を開発する働きかけが生じている。
抗真菌剤の市場における成功は、標的を表示することに関する既存の治療に対する有効性に大きく依存している。したがって、本発明の方法によって同定かつ開発されたｔＲＮＡスプライシング経路の阻害剤の高い特異性と期待される低い細胞毒性により、現在市場に存在するものと比較して競争上優位にある薬物がもたらされるであろう。
２．３ ｔＲＮＡの生成
真核細胞内のｔＲＮＡの成熟および維持には、５’および３’末端の切断、特定の塩基の修飾、ならびに場合によってはイントロンの除去を含めたいくつかのプロセシング事象が必要である。プロセシングにおけるこれらの様々なステップの酵素は、酵母、古細菌、哺乳動物および細菌系において特性決定されている（Deutscher, M.P.、tRNA Processing Nucleases、tRNA: Structure, Biosynthesis and Function、D. SoilおよびU. RjaBhandary (編)、American Society for Microbiology、ワシントンＤＣ、(1995)、51-65ページ）。５’末端の切断にはＲｎａｓｅＰの活性が必要であり、３’末端の切断には様々なエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼの機能が必要である。修飾は、ｔＲＮＡと様々な修飾酵素との相互作用によって起こる。ほとんどのｔＲＮＡがいくつかの普遍的修飾および種に特異的な修飾を含む（Bjork, G、Biosynthesis and Function of Modified Nucleosides、tRNA: Structure, Biosynthesis and Function、D. SoliおよびU. RajBhandary (編)、American Society for Microbiology、ワシントンＤＣ、(1995)、165-205ページ）。古細菌および真核生物では、いくつかのｔＲＮＡのイソ受容体群が１４〜１０５個のヌクレオチドの大きさにわたる介在配列を含む（Trotta, C.R.およびAbelson, J.N.、tRNA Splicing: An RNA World Add-On or an Ancient Reaction?、RNA World II、Tom Cech、Ray GestelandおよびJohn Atkins (編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)、ならびにAbelson他、1998、Journal of Biological Chemistry、273:12685-12688）。イントロンの除去には３つの酵素の活性が必要である。第１ステップでは、ｔＲＮＡが認識され、５’および３’結合点でｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって切断される。古細菌および真核生物のｔＲＮＡエンドヌクレアーゼは進化的に保存されている酵素であり、５’および３’スプライシング部位で切断を行うために類似の活性部位を含む。しかし、これらはｔＲＮＡ基質を異なる様式で認識するように分岐している。古細菌の酵素はバルジ−ヘリックス−バルジとして知られる保存されているイントロン構造を認識する。この構造は、４−ヌクレオチドヘリックスによって隔てられた２つの３−ヌクレオチドバルジからなる。各バルジ内で切断が生じ、イントロンが放出される。真核生物のエンドヌクレアーゼは成熟ドメインに依存する様式でｔＲＮＡ基質を認識し、成熟ドメインから５’および３’スプライシング部位までの間の一定の距離を測定する（Reyes他、1988、Cell、55:719-730）。しかし、最近になって、真核生物の酵素は各スプライシング部位にバルジを必要とし、この酵素が実際には、古細菌のエンドヌクレアーゼと同一の、イントロンに依存する認識機構によってｔＲＮＡを認識する能力を保持していたことが実証された（Fruscoloni他、2001、EMBO Rep、2:217-221）。
切断されたあと、ｔＲＮＡの半分子は独特のｔＲＮＡスプライシングリガーゼによってライゲーションされる（Trotta, C.R.およびAbelson, J.N.、tRNA Splicing: RNA World Add-On or an Ancient Reaction?、RNA World II、Tom Cech、Ray GestelandおよびJohn Atkins (編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)、ならびにAbelson他、1998、Journal of Biological Chemistry、273:12685-12688）。酵母では、ライゲーション産物はスプライシング結合点にリン酸を有するｔＲＮＡである。リン酸の除去はｔＲＮＡ２’−ホスホトランスフェラーゼによって行われ、成熟ｔＲＮＡ産物が得られる（Trotta, C.R.およびAbelson, J.N.、tRNA Splicing: RNA World Add-On or an Ancient Reaction?、RNA World II、Tom Cech、Ray GestelandおよびJohn Atkins (編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)、ならびにAbelson他、1998、Journal of Biological Chemistry、273:12685-12688）。
ｔＲＮＡは翻訳機構の重要な構成要素であり、様々な他のタンパク質系の構成要素（伸長因子、アミノアシル合成酵素など）と比較した場合に非常に安定している。ｔＲＮＡ分子は非常に長い半減期を有する。さらに、ｒＲＮＡおよびリボソームと同様、ｔＲＮＡは活動的に成長中の細胞の細胞質中に過剰に存在する（Ikemura, T.およびOkeki, H.、1983、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、47:1087-1097）。したがって、ｔＲＮＡ分子の特異的標的化により非制御の細胞増殖の選択的阻害が可能となるが、細胞成長の選択的阻害は可能とならない。
３．発明の概要
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼやｔＲＮＡスプライシングリガーゼなどの酵素）の活性をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。特に、本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物の同定方法を提供する。本発明はまた、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物の同定方法を提供する。本発明は、真菌感染症もしくはその症状を予防、治療、管理または寛解するための、本発明の方法を利用して同定される真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分の活性を阻害または低減する化合物の使用を包含する。より詳細には、本発明は、真菌感染症もしくはその症状を予防、治療、管理または寛解するための、本発明の方法を利用して同定される真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物の使用を包含する。本発明はまた、増殖性疾患もしくはその症状を予防、治療、管理または寛解するための、本発明の方法を利用して同定される動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の活性を阻害または低減する化合物の使用を包含する。より詳細には、本発明はまた、増殖性疾患もしくはその症状を予防、治療、管理または寛解するための、本発明の方法を利用して同定される動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物の使用を包含する。
本発明は、真菌または動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性をモジュレートする化合物を同定するための細胞系アッセイおよび無細胞系アッセイを提供する。これらのアッセイは、レポーター遺伝子に基づいたアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）に基づいたアッセイ、または蛍光偏光アッセイであり得、これらをハイスループットスクリーニング様式で実施し得る。さらに、これらのアッセイは真菌または動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）をモジュレートする化合物の能力を直接的または間接的に測定する。好ましい実施形態では、間接的なアッセイ（たとえばレポーター遺伝子細胞系アッセイまたはＦＲＥＴ細胞系アッセイなどの細胞系アッセイ）を利用して同定される真菌または動物界のｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）をモジュレートする化合物の能力を、より直接的なアッセイ（たとえばＦＩＳＨアッセイ）を利用して確認する。
レポーター遺伝子に基づいたアッセイは、化合物を、レポーター遺伝子を含む核酸を発現するように遺伝子操作した動物界または真菌の細胞と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップとによって実施し得る。あるいは、レポーター遺伝子に基づいたアッセイは、化合物を、動物界または真菌の無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップとによって実施し得る。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における発現に対するレポーター遺伝子の発現の変化は、特定の化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素の活性をモジュレートすることを示す。具体的には、このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における発現に対するレポーター遺伝子の発現の低減は、特定の化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素の活性を低減または阻害することを示す（たとえば、ｔＲＮＡイントロンエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの認識あるいは切断を阻害あるいは低減することによる、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼなど）。対照的に、このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における発現レポーター遺伝子の発現の増大は、特定の化合物は動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を増強することを示す。
一実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の酵素の活性をモジュレートする化合物の同定方法であって（ａ）レポーター遺伝子を含む核酸を動物界または真菌の細胞中で発現させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の存在下の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路において酵素の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の酵素をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する動物界または真菌の細胞と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路において酵素の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の酵素をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、動物界または真菌の無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路において酵素の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
本発明によれば、本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおける、化合物を、細胞、または無細胞抽出物および核酸と接触させるステップは、緩衝液ならびに複数の塩の組合せ（ＫＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＭｇＣｌ２など）を含む水溶液中で実施することが好ましい。水溶液中で使用する各塩の最適な濃度はｔＲＮＡスプライシング経路の酵素および使用する化合物に依存し、慣用の実験を用いて決定することができる。具体的な実施形態では、水溶液は生理的条件に近似するかまたはそれを模倣する。別の具体的な実施形態では、水溶液はさらに界面活性剤またはサーファクタントを含む。
本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて利用するレポーター遺伝子構築体は、レポーター遺伝子のコード領域およびｔＲＮＡイントロンを含み得、これによりレポーター遺伝子をコードしているｍＲＮＡをフレーム外とする。あるいは、本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて利用するレポーター遺伝子構築体は、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、または５’および３’非翻訳領域のどちらにもｔＲＮＡイントロンを含む。別の代替方法では、ｔＲＮＡイントロンはｍＲＮＡスプライシングエレメントを分断する。具体的な実施形態では、本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイで利用するレポーター遺伝子構築体は、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内にレポーター遺伝子のコード領域およびｔＲＮＡイントロンを含む。本明細書中に記載のレポーター遺伝子構築体で利用するイントロンはバルジ−ヘリックス−バルジコンホメーションを含み得る。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイで利用するレポーター遺伝子構築体は、ｔＲＮＡイントロンを含む成熟ドメインを含む。
当業者に周知の任意のレポーター遺伝子を本明細書中に記載のレポーター遺伝子構築体で利用し得る。レポーター遺伝子の例としては、それだけには限定されないが、ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子、コメツキムシルシフェラーゼをコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、シアン蛍光タンパク質をコードする遺伝子、青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−グルコロニダーゼをコードする遺伝子、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子が挙げられる。
本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づいたアッセイは、レポーター遺伝子を発現させるために遺伝子操作した動物界または真菌の細胞中で実施するか、または動物界または真菌の無細胞抽出物を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し得る。当業者に周知の任意の動物または真菌種の任意の細胞または細胞系を本発明の方法に従って利用し得る。さらに、無細胞抽出物は当業者に周知の任意の動物または真菌種の任意の細胞または細胞系由来であり得る。細胞および細胞種の例には、それだけには限定されないが、ヒト細胞、培養マウス細胞、酵母細胞、培養ラット細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞が含まれる。
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性に対する化合物の効果は、ｔＲＮＡエンドヌクレアーゼ抑制アッセイを用いて決定し得る。このようなアッセイは、レポーター遺伝子およびサプレッサーｔＲＮＡを含むように宿主細胞を遺伝子操作するステップであって、オープンリーディングフレームが分断され、サプレッサーｔＲＮＡの発現が誘導性調節エレメントによって調節され、サプレッサーｔＲＮＡがアンチセンスコドン中にｔＲＮＡイントロンを含むように、レポーター遺伝子構築体はそのオープンリーディングフレーム内にナンセンスコドンを有するレポーター遺伝子を含むものである上記ステップ；サプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導するステップ；宿主細胞を化合物と接触させるステップ；当業者に周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用してレポーター遺伝子の発現および／またはレポーター遺伝子にコードされているタンパク質の活性を測定するステップを含む。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減する化合物は機能的サプレッサーｔＲＮＡの産生を阻害または低減し、したがって、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較してレポーター遺伝子の発現を低減する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を増強する化合物は機能的サプレッサーｔＲＮＡの産生を増大し、したがって、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは適切な対照（たとえば陰性対照）の存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較してレポーター遺伝子の産生を増大させる。
蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）アッセイを、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングｔＲＮＡスプライシング経路（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の酵素の活性をモジュレートする化合物を同定するために使用し得る。ＦＲＥＴアッセイは、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の標識した酵素または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の標識したサブユニット、あるいは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の標識した基質を利用して実施し得る。ＦＲＥＴ細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界または真菌の細胞中に微量注入またはトランスフェクトし、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が阻害または低減される。内在性エンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が増大する。あるいは、ＦＲＥＴ細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界または真菌の細胞中に微量注入またはトランスフェクトし、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえば蛍光顕微鏡観察またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、蛍光ドナー部分の波長における、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分による蛍光発光の低減がもたらされる。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が増大される。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。
任意選択で、化合物がリガーゼの活性のみを阻害または低減するという可能性を排除するために、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体などの、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減することが知られている薬剤をＦＲＥＴアッセイの接触ステップに含める。あるいは、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼを欠損する動物界または真菌の細胞をＦＲＥＴアッセイで使用する。一部の実施形態では、反応混合物からＡＴＰを排除することによってｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。特定の作用機構に拘束されることを意図するものではないが、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性はＡＴＰの存在に依存するので、反応からＡＴＰを排除することによりｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性が有効に低減する。
一実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界または真菌の細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質が５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、フルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界または真菌の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、もしくは３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界または真菌の細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質が５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界または真菌の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質が５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、動物界もしくは真菌の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。動物界もしくは真菌の無細胞抽出物中のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が阻害または低減する。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が増大する。あるいは、ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、動物界もしくは真菌の無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。動物界もしくは真菌の無細胞抽出物中のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果、蛍光ドナー部分の波長における、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分による検出可能な蛍光シグナルが生成される。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が増大する。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。
任意選択で、化合物がリガーゼの活性のみを阻害または低減するという可能性を排除するために、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体などの、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減することが知られている薬剤をＦＲＥＴアッセイの接触ステップに含める。あるいは、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼを欠損する動物界または真菌の無細胞抽出物をＦＲＥＴアッセイで使用する。一部の実施形態では、反応混合物からＡＴＰを排除することによってｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。特定の作用機構に拘束されることを意図するものではないが、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性はＡＴＰの存在に依存するので、反応からＡＴＰを排除することによりｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性が有効に低減する。
一実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界もしくは真菌の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質が５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して、その化合物の存在下でより大きな蛍光シグナルが検出可能な場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界もしくは真菌の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質はイントロンを含む。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質はｔＲＮＡイントロンを含む。イントロンはバルジ−ヘリックス−バルジコンホメーションを有しうる。好ましい実施形態では、基質はイントロンを含む成熟ドメインを含む。
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対する化合物の効果は、ＦＲＥＴアッセイを利用して決定し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼのためのＦＲＥＴアッセイは、５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を含むｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、動物界もしくは真菌の無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、ｔＲＮＡ分子の一方の集団の末端がフルオロフォアで標識されており、他方がクエンチャーで標識されているステップと、基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはｔＲＮＡ半分子を結合し、結合されたｔＲＮＡ半分子の蛍光を阻止または低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下におけるシグナルと比較して検出可能な蛍光シグナルを増大させる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下におけるシグナルと比較して検出可能な蛍光シグナルを維持または低減する。
本発明はまた、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するためのＦＲＥＴ無細胞系アッセイであって、５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を含む動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、一方の集団の末端が蛍光ドナー部分で標識されており、かつ他方の集団の末端が蛍光アクセプター部分で標識されているステップと、蛍光ドナー部分の波長における基質の蛍光を測定するステップとを含むアッセイを包含する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはｔＲＮＡ半分子と結合し、その結果、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光がもたらされる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下における蛍光発光と比較して、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下における蛍光発光と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が維持または増大される。
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的にはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性に対する化合物の効果は、蛍光偏光に基づいたアッセイを利用して決定し得る。このようなアッセイでは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光標識した基質を、動物界もしくは真菌の無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、当業者に周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用して蛍光偏光放射を測定するステップであって、対照に対する、または化合物もしくは化合物ライブラリのメンバーの非存在下に対する蛍光偏光放射の変化は、その化合物または化合物ライブラリのメンバーが動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートすることを示すステップとを行う。あるいは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの蛍光標識した基質（たとえば蛍光標識したｔＲＮＡ半分子）を、動物界もしくは真菌の無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、当業者に周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用して蛍光偏光放射を測定するステップであって、対照に対する、または化合物もしくは化合物ライブラリのメンバーの非存在下に対する蛍光偏光放射の変化は、その化合物または化合物ライブラリのメンバーが動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートすることを示すステップとを行う。
さらに、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性に対する化合物の効果は、ＦＩＳＨアッセイを利用して決定し得る。具体的には、ＦＩＳＨアッセイを用いて動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの反応産物の蓄積を測定し得る。動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの反応産物を測定するゲル電気泳動に基づいたアッセイなどの他のアッセイも、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性に対する化合物の効果の評価に使用することができる。
本発明のアッセイは、様々なインキュベーション時間を用いて行うことができる。無細胞系では、化合物または化合物ライブラリのメンバーを加える前に、無細胞抽出物または精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば精製されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ）および酵素の基質（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質）を一緒にインキュベートすることができる。特定の実施形態では、無細胞抽出物または精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば精製されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ）を、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質と共に、化合物または化合物ライブラリのメンバーを加える前に、少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間インキュベートする。他の実施形態では、無細胞抽出物もしくは精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素、またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質を、化合物または化合物ライブラリのメンバーと共に、それぞれ基質、または無細胞抽出物もしくは精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素を加える前にインキュベートする。特定の実施形態では、化合物または化合物ライブラリのメンバーを、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質または無細胞抽出物もしくは精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素と共に、残りの構成要素、すなわちそれぞれ無細胞抽出物もしくは精製された酵素、または基質を加える前に、少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間インキュベートする。反応器に３つの構成要素、すなわち、化合物または化合物ライブラリのメンバー、無細胞抽出物または精製されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素、およびｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質を仕込んだあと、反応を少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間、さらにインキュベートし得る。
反応の進行は連続的に測定することができる。たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットの基質をフルオロフォア（または複数のフルオロフォア）で標識した場合、ＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器を用いて反応の進行を連続的にモニターすることができる。あるいは、反応の異なる時に時点を採り、反応の進行をモニターし得る。
ｔＲＮＡエンドヌクレアーゼ抑制アッセイおよび細胞系アッセイなどの本発明の特定のアッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素に影響を与える化合物の間接的なアッセイであり、ｔＲＮＡスプライシング経路の別の側面に影響を与える化合物を検出し得る。ある化合物が特定の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）のモジュレーターであることを確認するまたは確実にするためには、構成要素の活性（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性）に対する化合物の直接的な効果を測定する任意のアッセイを行うことができる。このようなアッセイには精製された酵素（たとえば精製されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは精製されたｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）を用いたアッセイが含まれ、これらを以下に説明する。
本明細書中に記載のアッセイで利用する化合物は、化合物ライブラリのメンバーであり得る。具体的な実施形態では、化合物は、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される。好ましい実施形態では、有機小分子ライブラリはベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである。
特定の実施形態では、化合物をプールに分けてスクリーニングする。陽性のプールが同定されたあと、そのプールの個々の化合物を個別に試験する。特定の実施形態では、プールの大きさは少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２５種、少なくとも５０種、少なくとも７５種、少なくとも１００種、少なくとも１５０種、少なくとも２００種、少なくとも２５０種、または少なくとも５００種の化合物である。
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物が同定されたあと、周知の技術を利用して、または事前に決定したコードを参照することによって化合物の構造を決定し得る。たとえば、化合物の構造は質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定し得る。
本発明によって同定される化合物は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）に直接結合し得る。あるいは、本発明の方法によって同定される化合物は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質に結合し得る。本発明によって同定される化合物はイントロンに結合し得る。本発明の方法によって同定される化合物はまた、ｔＲＮＡイントロンとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を乱し得る。さらに、本発明によって同定される化合物はｔＲＮＡ成熟ドメインとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を乱し得る。一部の実施形態では、本発明によって同定される化合物は、エンドヌクレアーゼスプライシング酵素のサブユニット間、特に真菌のエンドヌクレアーゼスプライシング酵素間の相互作用を阻害または低減することができる。具体的な実施形態では、本発明によって同定される化合物は、真菌のエンドヌクレアーゼスプライシング酵素の５４ＫＤａサブユニットのループ１０と１５ＫＤａサブユニットとの相互作用を阻害または低減することができる。
好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を優先的に阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を優先的に阻害または低減する。
好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を優先的に阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を優先的に阻害または低減する。
本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定される化合物は小分子である。具体的な実施形態では、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定される化合物は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に影響を与えないと考えられている。別の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定される化合物は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に影響を与えないと考えられている。別の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定される化合物は、抗増殖剤または抗真菌剤として使用されたことがなく、またそのように提案されたこともない。
本発明の方法を利用して同定される化合物はエンドヌクレアーゼおよび／またはリガーゼの１つまたは複数の機能に影響を与え、これは立ち代って酵素の活性をモジュレートし得る。したがって、たとえば、本発明の方法によって同定される化合物はｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによる基質の認識および／または切断に、したがって基質の切断に影響を与え得る。
本明細書中に記載のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物は、当業者に周知のまたは本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイもしくはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（たとえば細胞系アッセイもしくは無細胞系アッセイ）で、ｍＲＮＡの翻訳に対する前記化合物の効果を試験し得る。本発明の方法によって同定される化合物は、ヒトｔＲＮＡ前駆体を含む２８個のイントロンのうち任意のものからの成熟ｔＲＮＡの産生に対するその効果についてスクリーニングすることができる。当業者に周知のまたは本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して過剰増殖細胞対正常細胞に対する特定の化合物の抗増殖効果を決定し得る。さらに、本明細書中に記載のアッセイを利用して同定される特定の化合物は、癌もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解におけるその化合物の有効性を決定するために癌の動物モデルで試験し得る。さらに、本明細書中に記載のアッセイを利用して同定される化合物の特異性は、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対するその特異性、および様々な種由来のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対するその効果（たとえば真菌対動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対するその効果）について試験し得る。
本発明は、増殖性疾患もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、本明細書中に記載の方法によって動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的には、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、治療上または予防上有効な量の化合物もしくは製薬上許容されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。具体的には、本発明は、癌もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、本明細書中に記載の方法によって動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的には、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、有効量の化合物または製薬上許容されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、増殖性疾患（たとえば癌、乾癬、肺線維症）もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、本明細書中に記載の方法によって動物界および真菌のｔＲＮＡスプライシング経路のいずれもの構成要素（具体的には、動物界および真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼならびに／または動物界および真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、有効量の化合物または製薬上許容されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。
理論に拘束されるものではないが、すべてのｔＲＮＡがスプライシングを必要としておらず、ｔＲＮＡスプライシングは増殖中の細胞でより頻繁に起こるので、ｔＲＮＡスプライシング経路を標的とする化合物は、増殖性の高い形質転換した悪性細胞に対してのみ毒性を有し、正常細胞の増殖および代謝は可能であるべきである。イントロン配列の除去を必要とするｔＲＮＡ種は僅かしか存在しない（Trotta, C.R.およびAbelson, J.N.、tRNA Splicing: RNA World Add-On or an Ancient Reaction?、RNA World II、Tom Cech、Ray GestelandおよびJohn Atkins (編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)）。ヒトゲノム配列の最新版では６４８個のｔＲＮＡ種が同定されている。これらのうち、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって除去される必要のあるイントロンを含むのは２８種のみである。ｔＲＮＡを含む２８種のイントロンは、８種の異なるイソ受容体群をコードしている。これらイソ受容体群のうち７種は、冗長の、イントロンを含まない変種を含むか、コドン−アンチコドン相互作用のゆらぎ法則によって解読することができる（Bjork, G.、Biosynthesis and Function of modified Nucleoside in tRNA: Structure, Biosynthesis and Function、D. SollおよびV. RayBhandary (編)、American Society for Microbiology、ワシントンＤＣ (1995）。したがって、ｔＲＮＡスプライシングの阻害における潜在的な制限のある構成要素として１種のｔＲＮＡが残る。ｔＲＮＡイントロンの除去に専ら機能する酵素であるｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを標的化することによって、ｔＲＮＡ産生の阻害は非常に少数の重要なｔＲＮＡ分子（潜在的には１種のみのｔＲＮＡ）に微調整される。したがって、このプロセスを阻害することによって、正常細胞に対して生じる毒性は存在しても非常に穏和であり、翻訳能力の損失の結果として、迅速に増殖中の形質転換細胞が分裂する能力は低減するまたは取り除かれる。
本発明は、真菌感染症もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、本明細書中に記載の方法によって真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的には真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、治療上または予防上有効な量の化合物もしくは製薬上許容されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。具体的には、本発明は、酵母感染症もしくはその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、本明細書中に記載の方法によって真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的には真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、有効量の化合物または製薬上許容されるその塩を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載の方法によって真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（具体的には真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を阻害または低減すると同定された、化合物または製薬上許容されるその塩を用いることによる、物体または部屋の消毒方法を提供する。
本発明はさらに、化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性をモジュレートする能力を検証または確認する方法を提供する。化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性をモジュレートする能力は、このような化合物を同定するための本明細書中に記載のアッセイのうちの１つを利用して検証または確認することができる。
３．１ 用語
本明細書中、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素またはそのサブユニットの文脈で使用する用語「生物学的に活性な断片」とは、酵素またはサブユニットの活性を保持している断片をいう。したがって、たとえばリガーゼの生物学的に活性な断片はリガーゼの活性を保持しており、エンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットの生物学的に活性な断片は、その基質を認識および切断する能力を保持している。
本明細書中で使用する用語「化合物」とは、ｔＲＮＡスプライシング経路内の構成要素（たとえば酵素）の活性をモジュレートするその能力が試験される、またはｔＲＮＡスプライシング経路内の構成要素（たとえば、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）（たとえば酵素）の活性をモジュレートすると同定される任意の薬剤または複合体をいう。
本明細書中で使用する用語「障害」および「疾患」とは、それだけには限定されないが、増殖性疾患（たとえば癌）および真菌感染症を含めた対象の状態をいう。
本明細書中で使用する用語「有効量」とは、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の進行、重篤度、および／または継続期間を軽減または寛解させるため、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）の進行を予防するため、疾患または障害（たとえば増殖性疾患）の退縮を引き起こすため、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患）または真菌感染症に関連する１つもしくは複数の症状の再発、発生または発症を予防するため、あるいは別の治療（たとえば予防剤または治療剤）の予防効果もしくは治療効果（または複数の予防効果もしくは治療効果）を増大または改善するために十分な化合物の量をいう。
本明細書中で使用する用語「蛍光アクセプター部分」とは、蛍光ドナー部分からエネルギーを吸収し、転移されたエネルギーを蛍光として再放出する蛍光化合物をいう。蛍光アクセプター部分の例には、それだけには限定されないが、クマリンおよび関連するフルオロフォア、キサンテン（たとえば、フルオレセイン、ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、およびローダミン）、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアゾインダセン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｄｉａｚｉｎｄａｃｅｎｅ）ならびにフタロシアニンが含まれる。
本明細書中で使用する用語「蛍光ドナー部分」とは、エネルギーを吸収し、そのエネルギーを別の蛍光化合物などのアクセプターへと転移することができる蛍光化合物をいう。蛍光ドナー部分の例には、それだけには限定されないが、クマリンおよび関連する色素、キサンテン色素（たとえば、フルオレセイン、ロドールおよびローダミン）、レゾルフィン、シアニン色素、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタルヒドラジド（たとえばルミノールおよびイソルミノール誘導体）、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、蛍光ユーロピウム、テルビウム錯体ならびに関連する化合物が含まれる。
本明細書中で使用する用語「フルオロフォア」とは、蛍光発光する発色団をいう。
本明細書中、化合物、たとえば本発明の方法によって同定される化合物の文脈で使用する用語「精製された」とは、化学合成した際の化学物質の前駆体または他の化学物質を実質的に含まない化合物をいう。具体的な実施形態では、化合物は他の異なる化合物を６０％、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９９％含まない。好ましい実施形態では、本発明によって同定される化合物は精製されている。
本明細書中、タンパク質性薬剤（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、またはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼやそのサブユニットなどのタンパク質）の文脈で使用する「精製された」という用語は、それが由来する細胞もしくは組織供与源からの細胞性物質もしくは汚染タンパク質を実質的に含まない、または化学合成した際の化学物質の前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤をいう。「細胞性物質を実質的に含まない」という用語には、タンパク質性薬剤が、それを単離したまたは組換えによって生成した、元の細胞の細胞構成要素から分離されているタンパク質性薬剤の調製物が含まれる。したがって、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤には、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満（乾重量）の異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体（「汚染タンパク質」とも呼ばれる）を含むタンパク質性薬剤の調製物が含まれる。タンパク質性薬剤を組換えによって生成する場合は、培地も実質的に含まない、すなわち培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満を表すことが好ましい。タンパク質性薬剤を化学合成によって生成する場合は、化学物質の前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわちタンパク質性薬剤がその合成に関与する化学物質の前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。したがって、このようなタンパク質性薬剤の調製物は目的のタンパク質性薬剤以外に約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾重量）の化学物質の前駆体または化合物を含む。好ましくは、本明細書中に開示するタンパク質性薬剤は単離されている。
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」には、核酸分子をトランスフェクトした特定の対象細胞およびこのような細胞の子孫または潜在的な子孫が含まれる。このような細胞の子孫は、後世代で起こり得る変異もしくは環境の影響または核酸分子が宿主細胞ゲノム中に取り込まれることにより、核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一ではないこともありうる。
本明細書中で使用する用語「管理」、「管理する」、および「管理すること」とは、疾患または障害の治癒をもたらさない、対象が治療（たとえば予防剤または治療剤）から得る有益な効果をいう。特定の実施形態では、対象に疾患または障害を「管理する」ために１種もしくは複数種の治療を投与し、疾患または障害の進行または悪化を予防する。
本明細書中で使用する用語「併用」とは、複数の治療方法（たとえば予防剤および／または治療剤）の使用をいう。用語「併用」の使用は、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）に罹患している対象に治療（たとえば予防剤および／または治療剤）を投与する順序を制限するものではない。第１の治療（たとえば本発明によって同定された化合物などの予防剤または治療剤）を、第２の治療（たとえば、化学療法剤、ＴＮＦ−α拮抗剤または周知の抗真菌剤などの第２の予防剤または治療剤）の投与の前に（たとえば、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前）、同時に、またはその後に（たとえば、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間後）、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）に罹患している対象に投与することができる。
本明細書中で使用する用語「ライブラリ」とは、複数の化合物をいう。ライブラリは、コンビナトリアルライブラリ、たとえば、コンビナトリアル化学技術を用いて合成した化合物の集合、またはそれぞれが独特の三次元空間を占める低分子量（１０００ダルトン未満）の独特の化学物質の集合であることができる。
本明細書中で使用する用語「ＯＲＦ」とは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム、すなわちタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡ中の領域をいう。
本明細書中で使用する用語「非応答性」および「不応性」とは、疾患または障害（たとえば癌や真菌感染症などの増殖性疾患）の現在利用可能な治療（たとえば予防剤または治療剤）で治療したが、それがそのような疾患または障害に関連する１つもしくは複数の症状を軽減させるのに不十分であった患者を説明する用語である。通常、このような患者は重篤な、持続的に活動性の疾患に罹患しており、その疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）に関連する症状を寛解させるためにさらなる治療を必要とする。
本明細書中で使用する表現「製薬上許容される塩（または複数の塩）」には、それだけには限定されないが、本発明の方法を用いて同定される化合物中に存在し得る酸性基または塩基性基の塩が含まれる。塩基性の性質を有する化合物は様々な無機酸および有機酸と様々な塩を形成することができる。このような塩基性化合物の製薬上許容される酸付加塩の調製に使用することができる酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち、それだけには限定されないが、硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ）、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ）、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ）、酢酸（ａｃｅｔｉｃ）、シュウ酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸（ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸水素、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）、乳酸、サリチル酸、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、酸性クエン酸、酒石酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸（ｍａｌｅａｔｅ）、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびパモ酸（すなわち１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））の塩を含めた薬理学的に許容される陰イオンを含む塩を形成する酸である。アミノ部分を含む化合物は、上述の酸に加えて様々なアミノ酸と製薬上許容される塩を形成し得る。酸性の性質を有する化合物は様々な薬理学的に許容される陽イオンと塩基塩を形成することができる。このような塩の例には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウムリチウム、亜鉛、カリウム、および鉄の塩が含まれる。
本明細書中で使用する用語「事前に決定した基準範囲」とは、特定のアッセイにおいて測定された読取値の基準範囲をいう。具体的には、このような用語は、特定の細胞による、または特定の無細胞抽出物中のレポーター遺伝子の発現および／もしくは活性の基準範囲をいう。それぞれの実験室がそれぞれの特定のアッセイ、それぞれの細胞種およびそれぞれの無細胞抽出物について独自の基準範囲を確立するであろう。好ましい実施形態では、分析する化合物バッチのそれぞれに少なくとも１つの陽性対照および少なくとも１つの陰性対照が含まれる。
本明細書中で使用する用語「予防」、「予防する」および「予防すること」とは、本発明の方法によって同定される１つもしくは複数の化合物を投与することによってもたらされた、このような化合物と疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）の既知の治療とを組み合わせて投与することによってもたらされる、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）の１つもしくは複数の症状の再発、発生、進行または発症の予防をいう。
本明細書中で使用する用語「予防剤」および「複数の予防剤」とは、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の予防に使用することができる任意の薬剤（もしくは複数の薬剤）をいう。特定の実施形態では、用語「予防剤」とは、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定された化合物をいう。特定の他の実施形態では、用語「予防剤」とは、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定された化合物ではなく、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の発症、発生、進行および／または重篤度を予防または妨害するために有用であると知られている、あるいはそのために現在使用されている薬剤をいう。予防剤は、それがｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで有する１つもしくは複数の効果に基づいて、様々な種類の薬剤として特徴づけられ得る。たとえば、免疫調節剤は抗血管形成剤としても特徴づけられ得る。
本明細書中で使用する表現「予防上有効な量」とは、その疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）の発生、再発もしくは発症の予防をもたらすのに十分な、または別の治療（たとえば予防剤）の予防効果（もしくは複数の予防効果）を亢進もしくは改善するのに十分な治療（たとえば予防剤）の量をいう。
本明細書中で使用する用語「クエンチャー」とは、蛍光部分からの発光を低減することができる分子または化合物の一部分をいう。このような低減には、光子が蛍光部分から正常に放出された時点よりあとに光を低減させることが含まれる。
本明細書中で使用する用語「プロトコル」には、投薬スケジュールおよび投薬計画が含まれる。
本明細書中で使用する用語「小分子」および類似用語には、それだけには限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち異種有機化合物および有機金属化合物を含む）、１モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約１００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の製薬上許容される形態が含まれる。このような化合物の塩、エステル、および他の製薬上許容される形態も包含される。
本明細書中で使用する用語「対象」および「患者」とは、本明細書中で互換性があるように使用される。用語「対象」および「複数の対象」とは、動物、好ましくは非霊長類（たとえばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）ならびに霊長類（たとえばチンパンジー、カニクイザルなどのサルおよびヒト）を含めた哺乳動物、より好ましくはヒトをいう。一実施形態では、対象は増殖性疾患または真菌感染症の現在の治療に対して不応性または非応答性である。別の実施形態では、対象は家畜（たとえばウマ、ウシ、ブタなど）またはペット（たとえばイヌやネコ）である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
本明細書中で使用する表現「動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質」とは、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除される任意のヌクレオチド配列をいう。たとえば、バルジ−ヘリックス−バルジ構造または前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含むヌクレオチド配列は、本明細書中に記載のアッセイにおいて動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として利用し得る。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除されるヌクレオチド配列は、１０個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、４５個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、５５個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、６５個のヌクレオチド、７５個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１２５個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載のアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質はｔＲＮＡイントロンを含む。この基質は成熟ドメインまたは前駆体ｔＲＮＡまたはバルジ−ヘリックス−バルジコンホメーションを含み得る。好ましい実施形態では、基質は前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含む。
動物界のｔＲＮＡエンドヌクレアーゼの基質は、当業者に周知の任意の方法によって生成し得る。たとえば、ホスホルアダイトまたは他の液相もしくは固相の方法を用いて基質を化学合成し得る。ホスホルアミダイト法によってポリヌクレオチドを形成させるために使用する化学の詳細な説明は周知である（たとえば、Caruthers他、米国特許第4,458,066号および同第4,415,732号；Caruthers他、1982、Genetic Engineering、4:1-17；Users Manual、モデル392および394のポリヌクレオチド合成機、1990、6-1〜6-22ページ、Applied Biosystems、第901237号；Ojwang他、1997、Biochemistry、36:6033-6045参照）。合成後、当業者に公知の標準的な技術を用いて基質を精製することができる（Hwang他、1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96(23):12997-13002およびそれ中で引用された参考文献参照）。基質の長さおよびその合成方法に応じて、このような精製技法には、それだけには限定されないが、逆相高速液体クロマトグラフィー（「逆相ＨＰＬＣ」）、高速液体クロマトグラフィー（「ＦＰＬＣ」）、およびゲル精製が含まれる。
具体的な実施形態では、図１に示す基質を本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する。ハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質を作製するために、ハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質の両方の鎖を別々に転写させ、次いで加熱および冷却によって２本の鎖をハイブリッド形成させる。環状に配置したｔＲＮＡ基質の合成には、ＲＮＡをイントロン中の５’末端から（図１Ｃ）イントロン中の３’末端へと転写する。
本明細書中で使用する用語「相乗的な」とは、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）を予防、治療もしくは管理するために使用されてきた、または現在使用されている治療（たとえば本明細書中に記載の方法のうち１つを用いて同定される化合物）および別の治療（たとえば別の薬剤）の組合せであって、任意の２つ以上の単一の治療の相加効果よりも有効である組合せをいう。治療（たとえば予防剤または治療剤）の組合せの相乗効果により、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）に罹患している患者に１つもしくは複数の治療（たとえば薬剤）をより低い用量で使用すること、および／または前記治療（たとえば薬剤）をより低い頻度で投与することが可能となる。治療（たとえば予防剤または治療剤）をより低い用量で利用できること、および／または前記治療（たとえば薬剤）をより低い頻度で投与できることにより、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）の予防、治療または管理において、前記治療（たとえば薬剤）の有効性を低減させることなく前記治療（薬剤）を対象に投与することに関連する毒性が低減される。さらに、相乗効果により、疾患または障害（たとえば増殖性疾患または真菌感染症）の予防、治療または管理における治療（たとえば薬剤）有効性の改善がもたらされる場合がある。最後に、治療（たとえば予防剤または治療剤）の組合せの相乗効果により、いずれかの治療（たとえば薬剤）を単独で使用することに関連する有害または望ましくない副作用が回避または軽減され得る。
本明細書中で使用する用語「治療剤」および「複数の治療剤」とは、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に使用することができる任意の薬剤（または複数の薬剤）をいう。特定の実施形態では、用語「治療剤」とは、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定される化合物をいう。他の実施形態では、用語「治療剤」とは、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定される化合物ではなく、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に有用であると知られている、あるいはそのために現在使用されている薬剤をいう。治療剤は、それがｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで有する１つもしくは複数の効果に基づいて、様々な種類の薬剤として特徴づけられ得る。たとえば、抗炎症剤は免疫調節剤としても特徴づけられ得る。
本明細書中で使用する用語「治療上有効な量」とは、疾患もしくは障害または１つもしくは複数のその症状の重篤度を軽減させるため、疾患または障害の継続期間を軽減させるため、疾患または障害の１つもしくは複数の症状を寛解させるため、疾患または障害の進行を予防するため、疾患または障害の退縮を引き起こすため、あるいは別の治療の治療効果（もしくは複数の治療効果）を亢進または改善するために十分な治療（たとえば治療剤）の量をいう。具体的な実施形態では、癌の治療に関して、治療上有効な量とは、癌細胞の増殖を阻害または低減する、癌細胞の伝播（転移）を阻害または低減する、癌または１つもしくは複数のその症状の発症、発生、進行もしくは再発を阻害または低減する、あるいは腫瘍の大きさを減少させる治療（たとえば治療剤）の量をいう。好ましい実施形態では、治療（たとえば治療剤）の治療上有効な量により癌細胞の増殖または腫瘍の大きさが対照（たとえばリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」））と比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９０％減少する。他の実施形態では、治療上有効な量により真菌の繁殖が低減するか、対象中の他の器官もしくは組織または他の対象への真菌の伝播が低減する。好ましい実施形態では、治療上有効な量により真菌の繁殖がＰＢＳなどの対照と比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％減少する。
本明細書中で使用する用語「治療」および「複数の治療」とは、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に使用することができる任意の方法、プロトコルおよび／または薬剤をいう。特定の実施形態では、このような用語は、疾患もしくは障害（たとえば増殖性疾患もしくは真菌感染症）または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に有用な、医療従事者に知られている抗真菌療法、生物学的療法、化学療法、放射線療法、支持療法および／または他の療法をいう。
本明細書中で使用する用語「治療」、「治療する」および「治療すること」とは、１つまたは複数の治療（たとえば本発明の方法によって同定される１つまたは複数の化合物）を投与することにより生じる疾患もしくは障害または１つもしくは複数のその症状の重篤度、継続期間および／または進行の軽減または寛解をいう。具体的な実施形態では、このような用語は、癌細胞の増殖の阻害または軽減、癌細胞の伝播（転移）の阻害または軽減、癌または１つもしくは複数のその症状の発症、発生または進行の阻害または軽減、あるいは腫瘍の大きさの減少をいう。他の実施形態では、このような用語は、真菌の繁殖の低減、あるいは対象中の他の器官もしくは組織または他の対象への真菌の伝播の低減をいう。
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡイントロン」とは、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除される任意のヌクレオチド配列をいう。具体的には、用語「ｔＲＮＡイントロン」とは、通常前駆体ｔＲＮＡ中に見つかるイントロンをいう。
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ」とは、前駆体ｔＲＮＡ中に含まれるスプライシング部位の認識および前駆体ｔＲＮＡ中に存在するイントロンの切断を担う酵素をいう。古細菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは古細菌の前駆体ｔＲＮＡ中のバルジ−ヘリックス−バルジモチーフを認識する。真核生物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは、成熟ドメインからスプライシング部位までの距離を測定することによって前駆体ｔＲＮＡ中に含まれるスプライシング部位を認識する。真核生物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはまた、前駆体ｔＲＮＡ中に含まれるバルジ−ヘリックス−バルジモチーフを認識する能力も有する。酵母のｔＲＮＡエンドヌクレアーゼは、分子量５４ｋＤａ（ＳＥＮ５４）、４４ｋＤａ（ＳＥＮ２）、３４ｋＤａ（ＳＥＮ３４）、および１５ｋＤａ（ＳＥＮ１５）のサブユニットを含むヘテロ四量体である。ＳＥＮ２およびＳＥＮ３４サブユニットのヒト相同体は同定されており、そのアミノ酸配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０７９５４１およびＸＰ_０８５８９９に見つかる。具体的な実施形態では、本明細書中に記載のアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは、動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ（好ましくは哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ）由来である、またはこれをコードしている。別の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ（たとえば酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ）由来である、またはこれをコードしている。特定の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼである。
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物」とは、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を含む細胞からの抽出物をいう。特定の実施形態では、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物は、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性ならびに遺伝子の転写および翻訳に必要な構成要素を含む細胞抽出物である。
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡ半分子」および「ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質」とは、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによるｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質の切断後に生じる産物をいう。ｔＲＮＡ半分子は当業者に周知の技術を利用して合成または精製／単離することができる。
本明細書中で使用する用語「ｔＲＮＡスプライシングリガーゼ抽出物」とは、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を含む細胞からの抽出物をいう。特定の実施形態では、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼ抽出物は、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性ならびに遺伝子の転写および翻訳に必要な構成要素を含む細胞抽出物である。
略記
ＨＴＳ ハイスループットスクリーニング
ＦＰ 蛍光偏光
ＦＲＥＴ 蛍光共鳴エネルギー転移
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＦＰＬＣ 高速性能液体クロマトグラフィー
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分取器
４．図面の簡単な説明
図１：ＨＴＳ蛍光スクリーニングにおけるｔＲＮＡスプライシングエンドヌエレアーゼの基質を示す図である。パネルＡに内在性ｔＲＮＡを示し、パネルＢにハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質を示し、パネルＣに環状に配置したｔＲＮＡ基質を示す。５’ｓｓは５’スプライシング部位を意味し、３’ｓｓは３’スプライシング部位を意味する。 図２：ＨｓＳｅｎ２（配列番号１）およびＨｓＳｅｎ２変種（配列番号２）、ならびにヒトおよび酵母（ＳｃＳｅｎ２ｐ（配列番号３）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのＳｅｎｔサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。四角の枠で囲んだアミノ酸残基はＹＲＧＧＹ（配列番号４）活性部位モチーフを示し、周りを囲んだアミノ酸残基は活性部位のヒスチジンを示し、下線を引いたアミノ酸残基は酵母の推定膜貫通ドメインを示す。
５．発明の詳細な説明
本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分の活性に影響を与える化合物の同定方法を提供する。具体的には、本発明は、動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼならびに／または動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼならびに／または動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の同定に使用できるアッセイの例には、それだけには限定されないが、レポーターに基づいたアッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、蛍光偏光アッセイおよびＦＩＳＨアッセイが含まれる。このようなアッセイでは、動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼならびに／または動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対する化合物の効果を直接的または間接的に評価する。エンドヌクレアーゼまたはリガーゼの活性をモジュレートすると同定された化合物は、それぞれエンドヌクレアーゼまたはリガーゼに対するその特異性、および様々な種由来のこのような酵素に対するその効果について試験することが好ましい。動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の構造は、当分野で周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用して決定することができる。
好ましくは、本発明によって同定される化合物はｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減し、かつ種特異性を示す。したがって、一実施形態では、本発明によって同定される化合物は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減することなく真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する。別の実施形態では、本発明によって同定される化合物は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減することなく動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する。別の実施形態では、本発明によって同定される化合物は、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減することなく真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。さらに別の実施形態では、本発明によって同定される化合物は、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減することなく動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する。
本発明の方法によって同定される、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の構成要素（たとえば酵素）の活性を示差的に阻害または低減する化合物は、真菌感染症またはその症状を予防、治療、管理または寛解させるために使用することができる。具体的には、本発明の方法によって同定される、動物界の細胞および動物に有害な影響を与えることなく真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物は、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させるために使用することができる。本発明の方法によって同定される、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害または低減する化合物は、このような化合物が真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対してもある程度の阻害効果を示す場合にも、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させるために使用することができる。さらに、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／もしくは動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対するある程度の軽微なもしくは無視できる阻害効果を有する真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害または低減する化合物の有益な効果（もしくは複数の有益な効果）が動物界の細胞および動物に対する副作用（もしくは複数の副作用）を上回る場合でも、このような化合物を真菌感染症もしくはその症状を予防、治療、管理または寛解させるために使用し得る。
５．１ レポーター遺伝子構築体、トランスフェクト細胞および細胞抽出物
本発明は、１つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結されたｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子を含む特異的なベクター、および前記ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。本発明はまた、１つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結されたｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳を提供する。本発明のこの特定の態様を実行するための技術では、別段に支持しない限り、当業者が日常的に実行している分子生物学、微生物学、ならびに組換えＤＮＡの操作および産生の慣用技術を利用する。たとえば、Sambrook、1989、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版；DNA Cloning、第Ｉ巻およびＩＩ巻(Glover編、1985)；Oligonucleotide Synthesis (Gait編、1984)；Nucleic Acid Hybridization (HamesおよびHiggins編、1984)；Transcription and Translation (HamesおよびHiggins編、1984)；Animal Cell Culture (Freshney編、1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press、1986)；Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (MillerおよびCalos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods in Enzymology、第154巻および155巻(それぞれWuおよびGrossman編、ならびにWu編)、(MayerおよびWalker編、1987)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press、London、Scopes、1987)、Expression of Proteins in Mammalian Cells Using Vaccinia Viral Vectors、Current Protocols in Molecular Biology、第2巻(Ausubel他編、1991)を参照されたい。
５．１．１ レポーター遺伝子
動物界または真菌のｔＲＮＡ経路内の構成要素（たとえば酵素）に対する化合物の効果を確認するために、当業者に周知の任意のレポーター遺伝子をレポーター遺伝子構築体中で使用し得る。レポーター遺伝子とは、その存在または活性によって容易に検出可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。レポーター遺伝子は当業者に周知の任意の方法で得られ、そのエレメントのヌクレオチド配列は当業者に周知の任意の方法によって決定し得る。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、たとえば文献またはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから得ることができる。あるいは、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、適切な供与源由来の核酸から作製し得る。特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含むクローンは利用可能でないが、レポーター遺伝子の配列が知られている場合は、レポーター遺伝子をコードしている核酸を化学合成するか、適切な供与源（たとえば、ｃＤＮＡライブラリ、あるいはレポーター遺伝子を発現している任意の組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリ、またはレポーター遺伝子を発現している任意の組織もしくは細胞から単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、ＰＣＲ増幅によって得てもよい。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定されたあと、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列の操作について当分野で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いて操作し（たとえば、Sambrook他、1990、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州Cold Spring HarborおよびAusubel他編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨークに記載の技術を参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、異なるアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子、たとえばアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製し得る。
レポーター遺伝子の例には、それだけには限定されないが、ルシフェラーゼ（たとえば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、およびコメツキムシルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）（たとえば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および青色蛍光タンパク質）、β−ガラクトシダーゼ（「ｂ−ｇａｌ」）、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、ならびにアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）が含まれる。以下の表１は、様々なレポーター遺伝子およびアッセイすることができるレポーター遺伝子の産物の特性を示す。好ましい実施形態では、リポーター構築体で利用するレポーター遺伝子は容易にアッセイすることができ、目的の細胞または生物中に通常見い出されない活性を有する。
Figure 2012110337
本明細書中以下に、具体的なレポーター遺伝子およびこれらレポーター遺伝子の特徴を詳述する。
５．１．１．１ ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼとは、酸素および基質（ルシフェリン）の存在下で発光する酵素であり、細胞培養物、個々の細胞、生物全体、およびトランスジェニック生物において遺伝子発現のリアルタイムの微光イメージングに使用されている（GreerおよびSzalay、2002、Luminescence、17(1):43-74に総説）。
本明細書中で使用する用語「ルシフェラーゼ」とは、すべてのルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼの活性を有するルシフェラーゼ由来の組換え酵素を包含することを意図する。ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子は、たとえばフォチナス（Photinus）およびルシオラ（Luciola）の種由来のものが特性決定されている（たとえば、フォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）には国際公開公報WO95／25798号、ルシオラ・クルシオータ（Luciola cruciata）およびルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）には欧州特許出願EP0 524 448号、ルシオラ・ナイングレリカ（Luciola naingrelica）にはDevine他、1993、Biochim. Biophys. Acta、1173(2):121-132を参照）。他の真核性ルシフェラーゼ遺伝子には、それだけには限定されないが、コメツキムシ（Photinus plagiophthalamus、たとえばWood他、1989、Science、244:700-702参照）、ウミシイタケ（Renilla reniformis、たとえばLorenz他.、1991、Proc Natl Acad Sci USA、88(10):4438-4442参照）、およびツチボタル（Lampyris noctiluca、たとえばSula-Newby他、1996、Biochem J.、313:761-767参照）が含まれる。コメツキムシは、この種の異なるメンバーが５４６ｎｍ（緑色）、５６０ｎｍ（黄色〜緑色）、５７８ｎｍ（黄色）および５９３ｎｍ（オレンジ色）の異なる色を生物発光するという点で特異である（たとえば、その開示が全体で本明細書中に組み込まれている米国特許第6,475,719号；第6,342,379号；および第6,217,847号参照）。細菌のルシフェリン−ルシフェラーゼ系には、それだけには限定されないが、陸生フォトラブダス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens）の細菌性ｌｕｘ遺伝子（たとえばManukhov他、2000、Genetika、36(3):322-30参照）ならびに海生細菌ビブリオ・フェッシェリ（Vibrio fischeri）およびビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）が含まれる（たとえば、それぞれMiyamoto他、1988、J Biol Chem.、263(26):13393-9およびCohn他、1983、Proc Natl Acad Sci USA.、80(1):120-3参照）。本発明に包含されるルシフェラーゼには、Squirrell他の米国特許第6,265,177号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の突然変異ルシフェラーゼも含まれる。
好ましい実施形態では、ルシフェラーゼは、その開示が全体で本明細書中に組み込まれている上記参考文献のうちいずれかに記載のホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、またはコメツキムシルシフェラーゼである。
５．１．１．２ 緑色蛍光タンパク質
緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）とは、アミノ酸残基６５〜６７が発色団の形成に関与しており、蛍光発光するためにさらなる基質または補因子を必要としない、２３８個のアミノ酸からなるタンパク質である（たとえば、Prasher他、1992、Gene、111:229-233；Yang他、1996、Nature Biotechnol.、14:1252-1256；およびCody他、1993、Biochemistry、32:1212-1218参照）。
本明細書中で使用する用語「緑色蛍光タンパク質」または「ＧＦＰ」とは、すべてのＧＦＰ（緑色以外の色を示すＧＦＰの様々な形態を含む）またはＧＦＰの活性を有するＧＦＰ由来の組換え酵素を包含することを意図する。好ましい実施形態では、ＧＦＰには、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および青色蛍光タンパク質が含まれる。ＧＦＰの天然遺伝子は生物発光性のクラゲ、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）からクローニングした（たとえば、Morin他、1972、J. Cell Physiol.、77:313-318参照）。野生型ＧＦＰは３９５ｎｍに主要な励起ピークを有し、４７０ｎｍに小さな励起ピークを有する。４７０ｎｍでの吸収ピークにより、標準的なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターセットを用いたＧＦＰのレベルのモニターが可能となる。ＧＦＰ遺伝子の突然変異体は、発現を増強するため、ならびに励起および蛍光を改善するために有用であることが見出されている。たとえば、６５位でセリンがアラニン、グリシン、イソロイシン、またはスレオニンで置換されたＧＦＰ突然変異体は、４８８ｎｍで励起させた場合に最大励起がシフトされ、野生型タンパク質より蛍光が大きいＧＦＰ突然変異体がもたらされる（たとえば、Heim他、1995、Nature、373:663-664；米国特許第5,625,048号；Delagrave他、1995、Biotechnology、13:151-154；Cormack他、1996、Gene、173:33-38；およびCramer他、1996、Nature Biotechnol.、14:315-319参照）。ＧＦＰを４８８ｎｍで励起させる能力により、ＧＦＰを標準的な蛍光活性化細胞分取（「ＦＡＣＳ」）装置と共に使用することが可能となる。別の実施形態では、ＧＦＰをそれだけには限定されないが、ウミシイタケ（Renilla reriformis）などのクラゲ以外の生物から単離する。
一般に細胞をＧＦＰで標識する技術は、米国特許第5,491,084号および同第5,804,387号；Chalfie他、1994、Science、263:802-805；Heim他、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:12501-12504；Morise他、1974、Biochemistry、13:2656-2662；Ward他、1980、Photochem. Photobiol.、31:611-615；Rizzuto他、1995、Curr. Biology、5:635-642；ならびにKaetherおよびGerdes、1995、FEBS Lett、369:267-271に記載されている（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。大腸菌（E. coli）および線虫（C. elegans）におけるＧＦＰの発現は、Tan他の米国特許第6,251,384号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。植物細胞におけるＧＦＰの発現はHuおよびCheng、1995、FEBS Lett、369:331-33に記載されており、ショウジョウバエ（Drosophila）におけるＧＦＰの発現はDavis他、1995、Dev. Biology、170:726-729に記載されている。
５．１．１．３ β−ガラクトシダーゼ
β−ガラクトシダーゼ（「ｂ−ｇａｌ」）とは、ラクトースを含めたｂ−ガラクトシド、ならびにガラクトシド類似体であるｏ−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（「ＯＮＰＧ」）およびクロロフェノールレッド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（「ＣＰＲＧ」）の加水分解を触媒する酵素である（たとえば、Nielsen他、1983、Proc Natl Acad Sci USA、80(17):5198-5202；Eustice他、1991、Biotechniques、11:739-742；およびHenderson他、1986、Clin. Chem.、32:1637-1641参照）。ｂ−ｇａｌ遺伝子は、そのタンパク質産物が非常に安定しており、細胞溶解物中でタンパク質溶解性の分解に抵抗性を示し、容易にアッセイできるので、レポーター遺伝子として良好に機能する。ＯＮＰＧを基質として使用した場合、ｂ−ｇａｌの活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーで定量することができる。
本明細書中で使用する用語「β−ガラクトシダーゼ」または「ｂ−ｇａｌ」とは、ｌａｃＺ遺伝子の産物、またはｂ−ｇａｌの活性を有するｂ−ｇａｌ由来の組換え酵素を含めたすべてのｂ−ｇａｌを包含することを意図する。ｂ−ｇａｌ遺伝子は、そのタンパク質産物が非常に安定しており、細胞溶解物中でタンパク質溶解性の分解に耐性があり、容易にアッセイできるので、レポーター遺伝子として良好に機能する。ＯＮＰＧが基質である実施形態では、変換されたＯＮＰＧの量を決定するために、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて４２０ｎｍでｂ−ｇａｌの活性を定量することができる。ＣＰＲＧが基質である実施形態では、変換されたＣＰＲＧの量を決定するために、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて５７０〜５９５ｎｍでｂ−ｇａｌの活性を定量することができる。さらに別の実施形態では、ｂ−ｇａｌ構築体で形質転換させた細菌細胞をＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含むプレート上にプレーティングすることによってｂ−ｇａｌの活性を目視確認することができる。濃青色の細菌コロニーは高いｂ−ｇａｌ活性が存在することを示し、様々な濃さの青色のコロニーはｂ−ｇａｌ活性が様々な程度のレベルであることを示す。
５．１．１．４ β−グルコロニダーゼ
β−グルクロニダーゼ（「ＧＵＳ」）は非常に広範なｂ−グルクロニドの加水分解を触媒し、また、それよりはるかに低い効率で一部のｂ−ガラクツロニドを加水分解する。ＧＵＳは非常に安定しており、多くの界面活性剤および広範なイオン条件を許容し、補因子もイオン性の要件もなく、任意の生理的ｐＨでアッセイすることができ（最適ｐＨは５．０〜７．８である）、熱失活に対して適度に耐性がある（たとえば米国特許第5,268,463号参照。その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
一実施形態では、ＧＵＳは大腸菌（Esherichia coli）のｂ−グルクロニダーゼ遺伝子に由来する。本発明の別の実施形態では、核酸をコードしているｂ−グルクロニダーゼは大腸菌のｂ−グルクロニダーゼ遺伝子に相同である、かつ／または別の生物もしくは種由来であり得る。
ＧＵＳの活性は、蛍光もしくは分光測定によって、または米国特許第5,268,463号（この開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の任意の他の方法によってアッセイすることができる。蛍光アッセイでは、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルクロニドがＧＵＳの非常に感度の高い基質である。蛍光の最大値は５００ｎｍ（青みがかった緑色）に近く、ここでは非常に僅かな植物化合物しか蛍光発光または吸収しない。４−トリフルオロメチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルクロニドはまた、中性ｐＨ付近ではるかに強力に蛍光発光し、ＭＵＧと比較して連続的なアッセイを行うことがより容易に可能となる。４−トリフルオロメチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルクロニドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて蛍光指示薬として使用することができる。分光光度アッセイは非常に簡便であり、中程度の感度がある（Jefferson他、1986、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:8447-8451）。分光光度測定の好ましい基質はｐ−ニトロフェノールｂ−Ｄ−グルクロニドであり、これは、ＧＵＳによって切断されると発色団であるｐ−ニトロフェノールを放出する。そのｐＫａ（約７．１５）よりも高いｐＨでは、イオン化された発色団は４００〜４２０ｎｍの光を吸収して黄色を与える。
５．１．１．５ β−ラクタマーゼ
β−ラクタマーゼはｂ−ラクタムを加水分解するその触媒作用がほぼ拡散律速性であるということに関してほぼ最適な酵素であり、したがってこれらは細胞内レポーター酵素の役割に適している（たとえばChristensen他、1990、Biochem. J.、266:853-861参照）。これらはペニシリンやセファロスポリンなどのｂ−ラクタム抗生物質のｂ−ラクタム環を切断し、その過程で新しい荷電部分を生じる（たとえば、O'Callaghan他、1968、Antimicrob. Agents. Chemother.、8:57-63およびStratton、1988、J. Antimicrob. Chemother.、22、補遺Ａ:23-35参照）。多数のｂ−ラクタマーゼが単離および特性決定されており、これらのすべてが本発明による使用に適している（たとえば、その開示が全体で本明細書中に組み込まれているRichmondおよびSykes、1978、Adv. Microb. Physiol.、9:31-88ならびにAmbler、1980、Phil. Trans. R. Soc. Lond. [Ser.B.]、289:321-331参照）。
使用した例示的なｂ−ラクタマーゼのコード領域が、その開示が全体で本明細書中に組み込まれている米国特許第6,472,205号、Kadonaga他、1984、J. Biol. Chem.、259:2149-2154、およびSutcliffe、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、75:3737-3741に記載されている。当業者には容易に明らかであるように、この配列およびｂ−ラクタマーゼの活性を有するペプチドの他の類似する配列は、本発明による使用に同等に適している。その開示が全体で本明細書中に組み込まれている米国特許第6,472,205号、第5,955,604号、および第5,741,657号に記載の蛍光原基質と適切なｂ−ラクタマーゼとの組合せを、米国特許第4,740,459号（この開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているものなどの様々な広範のアッセイ系で使用することができる。
５．１．１．６ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）は、哺乳動物細胞のＣＡＴ活性が検出可能なレベルではないので哺乳動物細胞系においてレポーター遺伝子として一般的に使用されている。ＣＡＴのアッセイは、細胞性抽出物を放射標識したクロラムフェニコールおよび適切な補因子と共にインキュベートすること、たとえば薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）によって出発物質を産物から分離すること、次いでシンチレーション計数を行うことを含む（たとえば、米国特許第5,726,041号参照。その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
本明細書中で使用する用語「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」または「ＣＡＴ」とは、すべてのＣＡＴまたはＣＡＴの活性を有するＣＡＴ由来の組換え酵素を包含することを意図する。細胞のプロセシング、放射性同位元素、およびクロマトグラフィーによる分離を必要としないレポーター系がハイスループットスクリーニングをより行いやすいことが好ましいが、レポーター遺伝子の安定性が重要である場合にはＣＡＴがレポーター遺伝子として好ましいかもしれない。たとえば、ＣＡＴレポータータンパク質はｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が約５０時間であり、これは所望される結果の種類が累積変化対動的変化である場合に有利である。
５．１．１．７ 分泌性アルカリホスファターゼ
分泌性アルカリホスファターゼ（「ＳＥＡＰ」）酵素とはアルカリホスファターゼの切断された形態であり、タンパク質の膜貫通ドメインが切断されることによりこれが細胞から周辺培地中に分泌されることが可能となる。好ましい実施形態では、アルカリホスファターゼはヒト胎盤から単離する。
本明細書中で使用する用語「分泌性アルカリホスファターゼ」または「ＳＥＡＰ」とは、すべてのＳＥＡＰまたはアルカリホスファターゼの活性を有するＳＥＡＴ由来の組換え酵素を包含することを意図する。ＳＥＡＰの活性は、それだけには限定されないが、蛍光基質の触媒作用の測定、免疫沈降、ＨＰＬＣ、および放射検出を含めた様々な方法によって検出することができる。熱量検出方法よりも感度が高いので発光方法が好ましい。ＳＥＡＰを用いる利点は、ＳＥＡＰタンパク質は細胞から分泌されるので細胞溶解ステップが必要ないことであり、これによりサンプリングおよびアッセイ手順の自動化が容易になる。Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの阻害剤の細胞系評価法で使用するための、ＳＥＡＰを用いた細胞系アッセイは、Potts他の米国特許第6,280,940号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
５．１．２ ｔＲＮＡイントロン
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除される任意のヌクレオチド配列を、周知の分子生物学の技術を利用してレポーター遺伝子をコードしているｍＲＮＡがフレーム外にあるようにレポーター遺伝子のコード領域に挿入し得る。たとえば、バルジ−ヘリックス−バルジ構造または前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含むヌクレオチド配列を、レポーター遺伝子をコードしているｍＲＮＡがフレーム外にあるようにレポーター遺伝子のコード領域に挿入し得る。あるいは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除されるヌクレオチド配列を、レポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、または５’および３’非翻訳領域の両方に挿入し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除されるヌクレオチド配列は１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は少なくとも１０ヌクレオチド長である。
具体的な実施形態では、ｔＲＮＡイントロンをレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内に挿入する。別の実施形態では、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のｔＲＮＡイントロンをレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内に挿入する。別の実施形態では、ｔＲＮＡイントロンをレポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、または５’および３’非翻訳領域の両方に挿入する。別の実施形態では、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のｔＲＮＡイントロンをレポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、または５’および３’非翻訳領域の両方に挿入する。ｔＲＮＡイントロンはバルジ−ヘリックス−バルジコンホメーションを含み得る。
ｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子は当業者に周知の任意の方法によって産生させ得る。たとえば、ｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子は、ホスホルアミダイト法または他の液相もしくは固相の方法を用いて化学合成し得る。ホスホルアミダイト法によってポリヌクレオチドを形成させるために使用する化学の詳細な説明は周知である（たとえば、Caruthers他、米国特許第4,458,066号および第4,415,732号；Caruthers他、1982、Genetic Engineering、4:1-17；Users Manual、モデル392および394のポリヌクレオチド合成機、1990、6-1〜6-22ページ、Applied Biosystems、第901237号；Ojwang、他、1997、Biochemistry、36:6033-6045参照）。合成後、当業者に公知の標準的な技術を使用してｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子を精製することができる（Hwang他、1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96(23):12997-13002およびそれ中で引用された参考文献参照）。ｔＲＮＡイントロンを含むレポーター遺伝子の長さおよびその合成方法に応じて、このような精製技法には、それだけには限定されないが、逆相高速液体クロマトグラフィー（「逆相ＨＰＬＣ」）、高速液体クロマトグラフィー（「ＦＰＬＣ」）、およびゲル精製が含まれる。基質を蛍光アクセプター部分、蛍光ドナー部分および／またはクエンチャーで標識する方法は当分野で周知である（たとえば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号、および同第5,439,797号参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
５．１．３ ベクター
レポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列およびｔＲＮＡイントロンをコードしているヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質をコードしている配列の転写および翻訳に必要なエレメント（配列）を含むベクター内に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、レポーター遺伝子によっても供給することができる。レポーター遺伝子を発現させるために様々な宿主−ベクター系を利用し得る。これらには、それだけには限定されないが、ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌などの微生物；および選択マーカーを用いた形質転換によって作製した安定した細胞系が含まれる。ベクターの発現エレメントはその強度および特異性が様々である。利用する宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写および翻訳エレメントのうち任意のものを使用し得る。
ベクター内にＤＮＡ断片を挿入する既に記載されている方法のうち任意のものを使用して、適切な転写／翻訳調節シグナルおよびタンパク質をコードしている配列からなるキメラ核酸を含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技法ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝的組換え）が含まれ得る。レポーター遺伝子の発現構築体は、レポーター遺伝子が組換えＤＮＡ分子で形質転換させた宿主内で発現されるように第２の核酸配列によって調節され得る。たとえば、レポーター遺伝子構築体の発現は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターなどの当分野で既知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって調節され得る。遺伝子の発現の調節に使用し得るプロモーターの具体例には、それだけには限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon、1981、Nature、290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamoto他、1980、Cell、22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼのプロモーター（Wagner他、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster他、1982、Nature、296:39-42）；β−ラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroff他、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、75:3727-3731）またはｔａｃプロモーター（DeBoer他、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、80:21-25）などの原核生物の発現ベクター；「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American、1980、242:74-94も参照；ノパリン合成酵素のプロモーター領域（Herrera-Estrella他、Nature、303:209-213）またはカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡプロモーター（Gardner他、1981、Nucl. Acids Res.、9:2871）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella他、1984、Nature、310:115-120）を含む植物発現ベクター；Ｇａｌ４のプロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）のプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）のプロモーター、アルカリホスファターゼのプロモーターなどの酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物性転写調節領域：膵腺房細胞中で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子の調節領域（Swift他、1984、Cell、38:639-646；Omitz他、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、50:399-409；MacDonald、1987、Hepatology、7:425-515）、膵臓β細胞中で活性のあるインスリン遺伝子の調節領域（Hanahan、1985、Nature、315:115- 122）、リンパ球細胞中で活性のある免疫グロブリン遺伝子の調節領域（Grosschedl他、1984、Cell、38:647-658；Adames他、1985、Nature、318:533-538；Alexander他、1987、Mol. Cell. Biol.、7:1436-1444）、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞中で活性のあるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Leder他、1986、Cell、45:485-495）、肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子の調節領域（Pinkert他、1987、Genes and Devel.、1:268-276）、肝臓中で活性のあるα−胎児性タンパク質遺伝子の調節領域（Krumlauf他、1985、Mol. Cell. Biol.、5:1639-1648；Hammer他、1987、Science、235:53-58）、肝臓中で活性のあるα１−抗トリプシン遺伝子の調節領域（Kelsey他、1987、Genes and Devel.、1:161-171）、骨髄性細胞中で活性のあるβ−グロビン遺伝子の調節領域（Mogram他、1985、Nature、315:338-340；Kollias他、1986、Cell、46:89-94）、脳内の乏突起膠細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の調節領域（Readhead他、1987、Cell、48:703-712）、骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子の調節領域（Sani、1985、Nature、314:283-286）、ならびに視床下部中で活性のある性腺刺激放出性ホルモン遺伝子の調節領域（Mason他、1986、Science、234:1372-1378）が含まれる。
具体的な実施形態では、レポーター遺伝子に機能的に連結されているプロモーター、１つまたは複数の複製起点、および任意選択で１つまたは複数の選択マーカー（たとえば抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを使用する。好ましい実施形態では、ベクターはＣＭＶベクター、Ｔ７ベクター、ｌａｃベクター、ｐＣＥＰ４ベクター、５．０／Ｆベクター、またはテトラサイクリンに制御されるプロモーターを有するベクター（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ（商標）5／ＦＲＴ／ＴＯ）である。
本発明のレポーター遺伝子構築体を含む発現ベクターは、３つの一般的な手法、すなわち（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」核酸の機能が存在することまたは存在しないこと、（ｃ）挿入された配列の発現、および（ｄ）配列決定によって同定することができる。第１の手法では、発現ベクター中に挿入したレポーター遺伝子の存在は、挿入されたレポーター遺伝子に相同的な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第２の手法では、目的の核酸、すなわちレポーター遺伝子構築体をベクター中に挿入することによって生じる特定の「マーカー」核酸の機能（たとえば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成など）が存在することまたは存在しないことに基づいて、組換えベクター／宿主系を同定および選択することができる。たとえば、目的の核酸をベクターのマーカー核酸配列中に挿入した場合は、マーカー核酸の機能が存在しないことによって挿入物を含む組換え体を同定することができる。第３の手法では、組換え体によって発現されたレポーター遺伝子の産物のアッセイを行うことによって組換え発現ベクターを同定することができる。このようなアッセイは、たとえば特定のレポーター遺伝子の物理的または機能的特性に基づくことができる。
好ましい実施形態では、レポーター遺伝子構築体を安定した細胞系発現ベクター内にクローニングする。好ましい実施形態では、安定した細胞系発現ベクターは部位特異的なゲノム組込み部位を含む。別の好ましい実施形態では、レポーター遺伝子構築体をエピソーム性の哺乳動物発現ベクター内にクローニングする。
５．１．４ トランスフェクション
適切な遺伝子をコードしているベクターを合成したあと、宿主細胞を目的のベクターで形質転換またはトランスフェクトする。安定した形質転換体を使用することが好ましい。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。より好ましい実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は目的の組織または他の目的生体試料から単離した一次細胞である。本発明の方法で使用することができる宿主細胞には、それだけには限定されないが、ハイブリドーマ、前Ｂ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、および３Ｔ３細胞が含まれる。別の好ましい実施形態では、宿主細胞は組織などの供与源の不死化細胞系である。本発明で使用することができる他の宿主細胞には、それだけには限定されないが、ウイルス感染した細胞が含まれる。
形質転換は、たとえばポリヌクレオチドをウイルス内にパッケージングすることおよび宿主細胞にウイルスを形質導入することを含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する任意の知られている方法、ならびにポリヌクレオチドを直接取り込ませることによって行い得る。使用する形質転換手順は形質転換させる宿主に依存する。直接取り込ませることによる哺乳動物の形質転換（すなわちトランスフェクション）は、GrahamおよびVan der Eb、1978、Virol.、52:546のリン酸カルシウム沈降方法、またはその様々な知られている改変方法によって実施し得る。組換えポリヌクレオチドを細胞内、特に哺乳動物細胞内へ導入する他の方法には、デキストラン媒介のトランスフェクション、リン酸カルシウム媒介のトランスフェクション、ポリブレン媒介のトランスフェクション、プロトプラストの融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（または複数のポリヌクレオチド）をリポソーム内に封入すること、およびポリヌクレオチドを核内へ直接微量注入することが含まれる。このような方法は当業者に周知である。
好ましい実施形態では、目的の構築体を含む安定した細胞系をハイスループットスクリーニング用に作製する。このような安定した細胞系は、選択マーカーを含むレポーター遺伝子構築体を導入させ、細胞を富化培地中で１〜２日間成長させ、細胞を選択培地中で成長させることによって作製し得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択された細胞に耐性を与え、細胞がプラスミドをその染色体内に安定に組み込み、成長して増殖巣を形成することを可能にし、次にこれをクローニングして細胞系へと拡大させることができる。
それだけには限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler他、1977、Cell、11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy他、1980、Cell、22:817）遺伝子を含めたいくつかの選択系を使用し得、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子（Wigler他、1980、Natl. Acad. Sci. USA、77:3567；O'Hare他、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78:1527）、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78:2072）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子（Colberre-Garapin他、1981、J. Mol. Biol.、150:1）、およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ遺伝子（Santerre他、1984、Gene、30:147）を選択するための基礎として代謝拮抗剤耐性を使用することができる。
５．１．５ 無細胞抽出物
本発明は、無細胞系中のレポーター遺伝子構築体の翻訳を提供する。本発明のこの特定の態様を実行するための技術では、別段に支持しない限り、当業者が日常的に実行している分子生物学、微生物学、ならびに組換えＤＮＡの操作および産生の慣用技術を利用する。たとえば、Sambrook、1989、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版；DNA Cloning、第Ｉ巻および第ＩＩ巻(Glover編、1985)；およびTranscription and Translation (HamesおよびHiggins編、1984)を参照されたい。
当業者に周知の任意の技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳させるための無細胞抽出物を作製し得る。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳反応のための無細胞抽出物は、細胞を遠心分離し、上清を清澄にすることによって作製することができる。具体的には、本発明によって利用する細胞抽出物はＳ１抽出物（すなわち１，０００×ｇの回転の上清）からＳ５００抽出物（すなわち５００，０００×ｇの回転の上清）、好ましくはＳ１０抽出物（すなわち１０，０００×ｇの回転の上清）からＳ２５０抽出物（すなわち２５０，０００×ｇの回転の上清）であり得る。具体的な実施形態では、本発明によって利用する細胞抽出物はＳ５０抽出物（すなわち５０，０００×ｇの回転の上清）からＳ１００抽出物（すなわち１００，０００×ｇの回転の上清）である。
無細胞翻訳抽出物は、任意の種由来の細胞から単離し得る。たとえば、無細胞翻訳抽出物はヒト細胞、培養マウス細胞、培養ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、アフリカツメガエル（Xenopus）の卵母細胞、ウサギの網状赤血球、コムギ胚芽、またはライムギ胚から単離し得る（たとえば、KriegおよびMelton、1984、Nature、308:203ならびにDignam他、1990、Methods Enzymol.、182:194-203参照）。あるいは、無細胞翻訳抽出物、たとえばウサギの網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽抽出物を、たとえばＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入することができる。好ましい実施形態では、無細胞抽出物はヒト細胞から単離した抽出物である。具体的な実施形態では、ヒト細胞はＨｅＬａ細胞である。
５．２ ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の精製
ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素、特にｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片は、当業者に公知の任意の方法を用いて発現および精製することができる。本発明は、当業者に公知の任意の方法を用いて動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的なその断片を発現および精製することを包含する。本発明はまた、当業者に公知の任意の方法を利用して動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットを発現および精製することを包含する。具体的な実施形態では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼを発現および精製することを包含する。動物界および真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼならびに動物界および真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼは、たとえば組換えＤＮＡ技術によって発現させることができる。具体的な実施形態では、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの精製を容易にするために、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼのサブユニットをペプチドタグに融合させる。他の実施形態では、内在性の動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、または内在性の動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを精製する。
特定の実施形態では、組換えヒトｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを精製して本発明の方法で用いる。他の実施形態では、任意のヒト細胞源由来の部分的に精製されたヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを本発明の方法で用いる。
他の実施形態では、組換えヒトｔＲＮＡスプライシングリガーゼを精製して本発明の方法で用いる。他の実施形態では、任意のヒト細胞源由来の部分的に精製されたヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼを本発明の方法で用いる。
５．２．１ 組換えＤＮＡ
様々な実施形態において、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素、たとえば動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼは、転写および翻訳される特定のヌクレオチド配列によってコードされている。ヌクレオチド配列は組換え細胞中で増幅および発現させるために発現ベクター内に挿入する。
特定の実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットは、転写および翻訳される特定のヌクレオチド配列によってコードされている。ヌクレオチド配列は組換え細胞中で増幅および発現させるために発現ベクター内に挿入する。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはヘテロ四量体であり、４つのサブユニットのそれぞれを同一細胞内で同時に発現させるか、異なる細胞内で別々に発現させ得る。サブユニットを単離し、その後合わせてｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを生成する。好ましくは、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットを同一細胞内で発現させ、機能するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを細胞から単離する。
他の実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットは、転写および翻訳される特定のヌクレオチド配列によってコードされている。ヌクレオチド配列は組換え体中で増幅および発現させるために発現ベクター内に挿入する。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと同様に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはヘテロ四量体である。ヘテロ四量体のサブユニットは同一細胞内で同時に発現させるか、異なる細胞内で別々に発現させ得る。別々の細胞内で産生させた場合は、サブユニットを単離し、その後合わせてｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを産生させ得る。
他の実施形態では、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの生物学的に活性な断片は、転写および翻訳される特定のヌクレオチド配列によってコードされている。ヌクレオチド配列は組換え細胞中で増幅および発現させるために発現ベクター内に挿入する。
一部の実施形態では、それだけには限定されないが、リガーゼの活性、キナーゼの活性、環状ホスホジエステラーゼの活性、アデニル酸合成酵素の活性、およびホスホジエステラーゼの活性を含めた特定の酵素活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片を本発明の方法で使用する。一実施形態では、ライゲーション／ＲＮＡ結合酵素の活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片を本発明の方法およびアッセイで使用する。特定の実施形態では、ライゲーション／ＲＮＡ結合酵素の活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片はアミノ酸５９５〜８２７に対応する。別の実施形態では、アデニル酸合成酵素の活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片を本発明の方法およびアッセイで使用する。特定の実施形態では、アデニル酸合成酵素の活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片はアミノ酸１５〜３９７に対応する。別の実施形態では、キナーゼの活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片を本発明の方法およびアッセイで使用する。特定の実施形態では、キナーゼの活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片はアミノ酸３９７〜８２７に対応する。特定の実施形態では、アデニル酸合成酵素の活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片はアミノ酸１５〜３９７に対応する。別の実施形態では、ホスホジエステラーゼの活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片を本発明の方法およびアッセイで使用する。特定の実施形態では、ホスホジエステラーゼの活性を有するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの断片はアミノ酸５９６〜８２７に対応する。
本明細書中で使用する発現構築体とは、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）または生物学的に活性なその断片をコードしているヌクレオチド配列であって、１つまたは複数の調節領域もしくはエンハンサー／プロモーター配列に機能的に連結されており、適切な宿主細胞中での酵素の発現を可能にする配列をいう。「機能的に連結されている」とは、調節領域および発現させるｔＲＮＡスプライシング酵素をコードしているヌクレオチド配列が転写、および最終的には翻訳が可能となるように結合および配置されている結合をいう。一部の実施形態では、発現構築体とは、１つまたは複数の調節領域もしくはエンハンサー／プロモーター配列に機能的に連結されており、適切な宿主細胞中での動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットの発現を可能にする、それぞれ動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットをコードしているヌクレオチド配列をいう。他の実施形態では、発現構築体とは、１つまたは複数の調節領域もしくはエンハンサー／プロモーター配列に機能的に連結されており、適切な宿主細胞中での動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットの発現を可能にする、１個、２個、３個もしくは４個の動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニット（好ましくはヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニット）または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットをコードしているヌクレオチド配列をいう。さらに他の実施形態では、発現構築体とは、１つまたは複数の制御領域もしくはエンハンサー／プロモーター配列に機能的に連結されており、適切な宿主細胞中でのｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片の発現を可能にする、それぞれ動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片をコードしているヌクレオチド配列をいう。
ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ、またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片）の転写に必要な調節領域は、発現ベクターによって提供することができる。適合性のある宿主−構築体系では、ＲＮＡポリメラーゼなどの細胞性転写因子が発現構築体上の調節領域に結合して宿主生物中でのｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の転写をもたらす。遺伝子の発現に必要な調節領域の性質の詳細は宿主細胞間で異なり得る。一般に、ＲＮＡポリメラーゼを結合して、機能的に結合している核酸配列の転写を促進する能力を有するプロモーターが必要である。このような調節領域には、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などの転写および翻訳の開始に関連する５’非コード配列が含まれ得る。コード配列の３’にある非コード領域は、ターミネーターおよびポリアデニル化部位などの転写停止調節配列を含み得る。
構成的、組織特異的かつ／または誘導性の調節領域をｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の発現に使用し得る。宿主細胞の増殖に最適な条件とｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を高レベルに発現させる条件とが異なる場合には誘導性プロモーターを使用することが望ましいかもしれない。有用な調節領域の例を以下に示す。
ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列にプロモーターなど調節的機能を有するＤＮＡ配列を付加させるため、あるいはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列をベクターのクローニング部位内に挿入するために、当分野で周知の技術を用いて、適合性のある適切な制限部位を提供するリンカーまたはアダプターをｃＤＮＡの末端にライゲーションさせ得る（Wu他、1987、Methods in Enzymol、152:343-349）。制限酵素を用いた切断に次いで、ライゲーションの前に一本鎖ＤＮＡの末端を消化または充填することによって平滑末端を作製するための修飾を行うことができる。あるいは、所望の制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲを使用することによるＤＮＡの増幅によって、所望の制限酵素部位をＤＮＡの断片内に導入することができる。
調節領域（エンハンサー／プロモーター配列）に機能的に連結されているｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列を含む発現構築体は、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を発現および産生させるために、それ以上クローニングすることなく適切な宿主細胞内に直接導入することができる。発現構築体はまた、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＭＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列の、たとえば相同組換えによる宿主細胞ゲノム内への組み込みを促進するＤＮＡ配列も含むことができる。この場合、宿主細胞中でｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくはスプライシングｔＲＮＡリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を増幅および発現させるために適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを使用する必要はない。
それだけには限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または改変ウイルスを含めた様々な発現ベクターを本発明で使用し得る。典型的には、このような発現ベクターは、適切な宿主細胞中でベクターを増殖させるための機能的な複製起点、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列を挿入するための１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含む。発現ベクターは、それだけには限定されないが細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、およびヒトを含めた原核生物または真核生物由来であり得る適合性のある宿主細胞と共に使用する必要がある。
大腸菌系のベクターは、外来タンパク質を高レベルで発現させるための最も一般的かつ多用途の系である（Makrides、1996、Microbiol Rev、60:512-538）。大腸菌中での発現に使用できる調節領域の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７およびλＰＬが含まれ得る（Makrides、1996、Microbiol Rev、60:512-538）。原核生物の発現ベクターの非限定的な例には、λｇｔ１１などのλｇｔベクター系（Huynh他、1984、「DNA Cloning Techniques」、第1巻:A Practical Approach (D. Glover編)、49-78ページ、IRL Press、Oxford）およびｐＥＴベクター系（Studier他、1990、Methods Enzymol.、185:60-89）が含まれ得る。しかし、原核生物の宿主−ベクター系の潜在的な不利点は、哺乳動物細胞の翻訳後プロセシングの多くを行えないことである。したがって、真核生物の宿主−ベクター系が好ましい。具体的な実施形態では、宿主−ベクター系は哺乳動物の宿主−ベクター系である。別の実施形態では、宿主−ベクター系はヒトの宿主−ベクター系であり、これが最も好ましい。
哺乳動物の宿主細胞中でｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＭＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を発現させるために、様々な調節領域、たとえばＳＶ４０初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞で有用であり得る誘導性プロモーターには、それだけには限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳腺腫瘍ウイルスグルココルチコイド応答性末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、およびｈｓｐ７０遺伝子に関連するものが含まれる（Williams他、1989、Cancer Res.、49:2735-42；Taylor他、1990、Mol. Cell Biol.、10:165-75）。組換え宿主細胞中でのｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の発現を駆動するために、熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターを使用することが有利であるかもしれない。
さらに、発現ベクターは、選択されたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしているＤＮＡを含む宿主細胞を最初に単離、同定または追跡するために、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含み得る。ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素を長期的に高収率で産生させるためには、哺乳動物細胞中での安定した発現が好ましい。それだけには限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler他、1977、Cell、11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskiおよびSzybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy他、1980、Cell、22:817）を含めたいくつかの選択系を哺乳動物細胞で使用し得、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）（Wigler他、1980、Natl. Acad. Sci. USA、77:3567；O'Hare他、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78:1527）、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78:2072）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（Colberre-Garapin他、1981、J. Mol. Biol.、150:1）、およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（Santerre他、1984、Gene、30:147）を選択するための基礎として代謝拮抗剤耐性を使用することができる。それだけには限定されないが、ヒスチジノールおよびゼオシン（商標）などの他の選択マーカーも使用することができる。
５．２．２ 組換えタンパク質の産生
５．２．２．１ ペプチドのタグ付加
ペプチドタグおよびｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質を作製するにより、酵素の精製を補助することができる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用するｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素は酵母のｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは酵母のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片である。具体的な実施形態では、本発明の方法で使用するｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素は哺乳動物のｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片である。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼはヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼである。別の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼである。さらに別の好ましい実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはヒトの動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットである。ペプチドおよびｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素を含む融合タンパク質は、酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしているヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードしている配列に、適切なリーディングフレーム中でライゲーションさせることによって作製するとこができる。改変した遺伝子が、翻訳停止シグナルおよび／または偽性（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）メッセンジャーＲＮＡスプライシングシグナルによって分断されずに同一翻訳リーディングフレーム内に確実に保たれるように注意すべきである。
ペプチドタグは、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）のアミノ末端またはカルボキシル末端に融合させ得る。融合を行う正確な部位は重要ではない。最適な部位は慣用の実験によって決定することができる。
当分野で知られている様々なペプチドタグを、それだけには限定されないが、免疫グロブリンの定常領域、ポリヒスチジン配列（Petty、1996、Metal-chelate affinity chromatography、Current Protocols in Molecular Biology、第2巻、Ausubel他編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Smith、1993、Methods Mol. Cell Bio.、4:220-229）、大腸菌のマルトース結合タンパク質（Guan他、1987、Gene、67:21-30）、様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第5,496,934号；第5,202,247号；第5,137,819号；Tomme他、1994、Protein Eng.、7:117-123）、およびＦＬＡＧエピトープ（Short Protocols in Molecular Biology、1999、Ausubel他編、John Wiley & Sons、Inc.、ユニット10.11）を含めたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片にコンジュゲートさせ得る。特異的結合パートナーによって認識され、したがって（好ましくは固定されているかつ／または固体担体上にある）結合パートナーとの親和性結合による単離を容易にする当業者に周知の他のペプチドタグを、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片にコンジュゲートさせ得る。当業者は理解されるように、上述のペプチドタグのコード領域を得るために、それだけには限定されないが、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、および合成方法を含めた多くの方法を使用することができる。それらを検出および単離するためのペプチドタグおよび試薬の一部は市販されている。
具体的な実施形態では、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片にコンジュゲートさせたポリヒスチジンタグは、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または少なくとも１０個のヒスチジンを有する。好ましい実施形態では、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片にコンジュゲートさせたポリヒスチジンタグは８個のヒスチジンを有する。
具体的な実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットにコンジュゲートさせたポリヒスチジンタグは、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個または少なくとも１０個のヒスチジンを有する。好ましい実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットにコンジュゲートさせたポリヒスチジンタグは８個のヒスチジンを有する。
別の実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットを複数のペプチドで標識することができる。具体的な実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットを８個のヒスチジンおよび１個のＦｌａｇエピトープタグからなるペプチドタグで標識する。
本発明の特定の実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングの異なるサブユニットである。
５．２．２．２ 発現系および宿主細胞
好ましい哺乳動物の宿主細胞には、それだけには限定されないが、ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓細胞系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓細胞系（懸濁培養での増殖用にサブクローニングした２９３、２９３−ＥＢＮＡ、または２９３細胞、Graham他、J. Gen. Virol.、36:59、1977、ハムスター新生児腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci.、77；4216、1980）、マウスセルトリ細胞（Mather、Biol. Reprod.、23:243-251、1980）、マウス線維芽細胞細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２）、イヌ科動物腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、およびマウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ５１）などのヒト、サルおよびげっ歯類由来のもの（たとえばKriegler M.、「Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual」、ニューヨーク、Freeman & Co.、1990参照）が含まれる。
いくつかのウイルス系の発現系も哺乳動物細胞で利用してｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を産生させ得る。ＤＮＡウイルスの骨格を用いたベクターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Hamer他、1979、Cell、17:725）、アデノウイルス（Van Doren他、1984、Mol Cell Biol、4:1653）、アデノ随伴ウイルス（McLaughlin他、1988、J Virol、62:1963）、およびウシパピローマウイルス（Zinn他、1982、Proc Natl Acad Sci、79:4897）由来であった。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、ドナーＤＮＡ配列をアデノウイルスの転写／翻訳調節複合体、たとえば後期プロモーターおよびトリパータイト（tripartite）リーダー配列にライゲーションさせ得る。その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノム内に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえばＥ１またはＥ３領域）内に挿入することにより、生存可能であり、感染させた宿主中で異種産物を発現させることができる組換えウイルスがもたらされる。（たとえばLoganおよびShenk、1984、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、81:3655-3659参照）。
他の有用な真核生物の宿主−ベクター系には酵母系および昆虫系が含まれる。酵母では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターをサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母）、ピヒア・パアストリス（Pichia pastoris）、およびハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（メチロトローフ酵母）で使用し得る。総説には、Current Protocols in Molecular Biology、第2巻、1988、Ausubel他編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience、第13章；Grant他、1987、Expression and Secretion Vectors for Yeast、Methods in Enzymology、WuおよびGrossman編、1987、Acad. Press、ニューヨーク、第153巻、516-544ページ；Glover、1986、DNA Cloning、第ＩＩ巻、IRL Press、ワシントンＤＣ、第3章；ならびにBitter、1987、Heterologous Gene Expression in Yeast、Methods in Enzymology、BergerおよびKimmel編、Acad. Press、ニューヨーク、第152巻、673-684ページ；ならびにThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、1982、Strathern他編、Cold Spring Harbor Press、第Ｉ巻およびＩＩ巻を参照されたい。
昆虫系では、バキュロウイルスであるオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中でｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を発現させるベクターとして使用することができる。ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしている配列をウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリンの遺伝子）内にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンのプロモーター）の調節下に置き得る。その後、これらの組換えウイルスを用いて宿主細胞を感染させ、その宿主細胞中で挿入されたＤＮＡが発現される。（たとえば、Smith他、1983、J Virol、46:584；Smith、米国特許第4,215,051号参照）。
本明細書中に記載のクローニングベクターおよび発現ベクターのうち任意のものを、当分野で周知の技術によって既知のＤＮＡ配列から合成およびアセンブルし得る。調節領域およびエンハンサーエレメントは、天然および合成の様々な起源のものであることができる。一部のベクターおよび宿主細胞は購入し得る。有用なベクターの非限定的な例は、Current Protocols in Molecular Biologyの付録5、1988、Ausubel他編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience、ならびにClontech Laboratories、Stratagene Inc.、およびInvitrogen, Incなどの供給業者のカタログに記載されている（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
クローニングしたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片をコードしているヌクレオチド配列を含む発現構築体は、それだけには限定されないが、原核細胞には細菌の形質転換（Hanahan、1985、DNA Cloning, A Practical Approach、1:109-136）、ならびに真核細胞にはリン酸カルシウム媒介のトランスフェクション（Wigler他、1977、Cell、11:223-232）、リポソーム媒介のトランスフェクション（Schaefer-Ridder他、1982、Science、215:166-168）、エレクトロポレーション（Wolff他、1987、Proc Natl Acad Sci、84:3344）、および微量注入（Cappechi、1980、Cell、22:479-488）を含めた当分野で知られている様々な技法によって宿主細胞内に導入することができる。
正しくプロセシングされたｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）、またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を長期的に高収率で産生させるためには、哺乳動物細胞中での安定した発現が好ましい。ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を安定して発現させる細胞系は、選択マーカーを含むベクターを用いることによって遺伝子操作し得る。例として示し限定するものではないが、発現構築体を導入したあと、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、その後選択的培地に交換し得る。発現構築体中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、それにより最適に発現構築体がその染色体内に安定に組み込まれ、培地中で増殖して細胞系へと拡大可能となる。このような細胞を長期間培養する一方で、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を連続的に発現させることができる。
好ましい実施形態では、ヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくはそのサブユニットまたはヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは生物学的に活性なその断片を２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１１２６８）中に安定にトランスフェクトする。
５．２．２．３ タンパク質の精製
一般に、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片は、硫安塩析、酸性抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めた既知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。具体的な実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットは酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットである。別の実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片は酵母のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片である。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットまたは動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは、それぞれ哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットまたは哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼである。より好ましい実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットまたは動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは、それぞれヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットまたはヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼである。別の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片は哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片である。より好ましい実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片はヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは生物学的に活性なその断片である。本発明の方法で使用するｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素が精製可能となる前に、細胞培養物から全タンパク質を調製しなければならない。この手順は前記細胞の収集、洗浄および溶解を含み、当業者に周知である。
具体的には、ペプチドタグと融合したｔＲＮＡスプライシング経路の組換え酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を、ペプチドタグの特性に基づいて精製し得る。手法の１つは、タグとその結合パートナーとの特異的な分子相互作用に基づく。他の手法は、抗体の、精製するタグ上またはタンパク質上に存在するエピトープに対する免疫特異的結合に依存する。当分野で周知のアフィニティークロマトグラフィーの原理は、一般にこれらの手法のいずれにも適用可能である。ｔＲＮＡスプライシング酵素−ペプチドタグの融合タンパク質を溶出させたあと、画分を回収してｔＲＮＡスプライシング酵素の存在および／またはペプチドタグの存在について試験することができる。具体的な実施形態では、画分をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性および／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性について試験する。次いで、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性および／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性のレベルが特定の閾値レベルを超える画分をプールすることができる。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングリガーゼの酵素活性を測定するために当分野で使用される任意の方法が本発明において意図される。
以下に、タグとその結合パートナーとの特異的な分子相互作用に基づいたいくつかの方法を記載する。
免疫グロブリンの定常領域に融合したｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の精製に一般的に適用可能な方法は、当分野で周知の技術であるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。ブドウ球菌（staphylococcus）のプロテインＡは、鎖免疫グロブリンの第２および第３の定常領域の間に位置する領域に特異的に結合する４２ｋＤのポリペプチドである。免疫グロブリンの様々なクラス、サブクラスおよび種のＦｃドメインにより、ヒトＦｃ領域に対するプロテインＡの親和性は強力であるが種間で異なり得る。より好ましくないサブクラスにはヒトＩｇＧ−３およびほとんどのラットのサブクラスが含まれる。特定のサブクラスでは、精製において（ブドウ球菌の）プロテインＧをプロテインＡの代わりに使用し得る。抗体の親和性精製で一般的に使用される固相はプロテインＡ−セファロース（ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＢｉｏｒａｄ）であり、これは、本質的に同じ様式で免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合したｔＲＮＡスプライシング酵素またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の精製で使用することができる。結合したｔＲＮＡスプライシング酵素−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＨが徐々に低下する連続的なクエン酸、酢酸およびグリシン−ＨＣｌ緩衝液を含めた当分野で知られている様々な緩衝液系によって溶出させることができる。この方法は、組換え細胞がｔＲＮＡスプライシング酵素と同時精製する抗体も産生する場合はあまり好ましくない。たとえば、Langone、1982、J. Immunol. meth.、51:3；Wilchek他、1982、Biochem. Intl.、4:629；Sjobring他、1991、J. Biol. Chem.、26:399；Antibodies A Laboratory Manual、617-618ページ、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor laboratory、1988を参照されたい。
あるいは、ポリヒスチジンタグを使用してもよく、この場合、金属キレートクロマトグラフィーによってｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を精製することができる。ポリヒスチジンタグは通常６個のヒスチジンの配列であり、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）などの二価の金属イオンに対して高い親和性を有し、ニトリロ三酢酸マトリックスなどの固相上に固定することができる。ポリヒスチジンはＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースに対する十分に特徴的な親和性を有しており、２つの緩和な処理のどちらかによって溶出させることができる。イミダゾール（０．１〜０．２Ｍ）は結合部位に関して樹脂と有効に競合し、ｐＨを６．０より僅かに低くまで低下させることによりヒスチジン側鎖がプロトン化されて結合が破壊される。精製方法は、細胞培養溶解物をＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライすること、汚染物質を洗い流すこと、およびｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）、そのサブユニットまたは生物学的に活性な断片をイミダゾールまたは弱酸で溶出させることを含む。Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）およびＱｉａｇｅｎなどの供給業者から得ることができる。ｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドクヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片の検出および定量に使用することができるポリヒスチジンタグを認識する抗体も利用可能である。
使用できる別の例示的なペプチドタグは、蠕虫である日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）から最初にクローニングされたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列である。一般に、大腸菌などの原核宿主細胞中で発現されるｔＲＮＡスプライシング酵素−ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズを用いて吸着させ、次いで遊離還元グルタチオンの存在下、中性ｐＨで溶出することによって、細胞培養溶解物から精製することができる。ＧＳＴは特定の条件下で二量体を形成することが知られているので、二量体のｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）が得られうる。Smith、1993、Methods Mol. Cell Bio.、4:220-229を参照されたい。
使用できる別の有用なペプチドタグは、ｍａｌＥ遺伝子にコードされている大腸菌のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。ＭＢＰに融合した動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片はアミロース樹脂に結合し、汚染物質は洗い流される。マルトースによって結合したｔＲＮＡスプライシング酵素−ＭＢＰ融合体をアミロース樹脂から溶出させる。たとえば、Guan他、1987、Gene、67:21-30を参照されたい。
ｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえば、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼもしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片を精製する第２の手法は、そのポリクローナルまたはモノクローナル抗体が利用可能なエピトープを含むペプチドタグに適用される。また、ｔＲＮＡスプライシング酵素またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体が利用可能な場合にも適用される。イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降などの、免疫特異的結合によってタンパク質を精製するための当分野で知られている様々な方法を使用することができる。たとえば、Antibodies A Laboratory Manual、第13章、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor laboratory、1988；ならびにCurrent Protocols in Immunology、第8章、セクションＩおよびＩＩ、Coligan他編、John Wiley、1991を参照されたい（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
特に、本発明はＨｓＳｅｎ２ｐおよびＨｓＳｅｎ３４ｐの発現および精製に関する（表２を参照）。
Figure 2012110337
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットのオープンリーディングフレームの５’および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼをコードしているオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅に使用することができる。
本発明はまた、ＨｓＳｅｎ２ｐ変種（「ＨｓＳｅｎ２変種」）の発現および精製に関する。ＨｓＳｅｎ２変種とは、ヒトＳｅｎ２のゲノムＤＮＡ配列のエクソン８を欠いたＨｓＳｅｎ２のスプライシング変種である。図２は、２つのヒトＳｅｎ２のサブユニット（すなわちＨｓＳｅｎ２およびＨｓＳｅｎ２変種）のアミノ酸配列ならびに酵母のサブユニットＳｃＳｅｎ２ｐのアミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。配列アラインメントにより、ＹＲＧＧＹモチーフ（配列番号４）、酵母（ＳｃＳｅｎ２ｐ）の５’スプライシング部位の活性部位および古細菌の（示さず）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ間で高い類似度が示されている。配列アラインメントに基づいて、ＨｓＳｅｎ２変種はＨｓＳｅｎ２のエンドヌクレアーゼに存在する推定膜貫通ドメインを欠き、これにより動物界の細胞中におけるＨｓＳｅｎｔ変種の局在化に影響が与えられ得る。
具体的な実施形態では、ＨｓＳｅｎ２変種はｔＲＮＡイントロンを含むもの以外の基質のエンドヌクレアーゼ溶解性の切断を触媒する。他の実施形態では、ＨｓＳｅｎｔ変種はｔＲＮＡイントロンを含む基質のエンドヌクレアーゼ溶解性の切断を触媒する。さらに他の実施形態では、ＨｓＳｅｎ２変種はｔＲＮＡイントロンを含む基質および基質ｔＲＮＡイントロンを含まない基質のエンドヌクレアーゼ溶解性の切断を触媒する。
それだけには限定されないが、ＨｓＳｅｎ２、ＨｓＳｅｎ２変種およびＨｓＳｅｎ３４を含めたヒトサブユニットを本発明の方法によって利用することができる。具体的な実施形態では、ＨｓＳｅｎ２サブユニットを本発明の方法によって利用する。別の実施形態では、ＨｓＳｅｎ２変種サブユニットを本発明の方法によって利用する。別の実施形態では、ＨｓＳｅｎ３４サブユニットを本発明の方法によって利用する。さらに別の実施形態では、ＨｓＳｅｎ２、ＨｓＳｅｎ２変種、ＨｓＳｅｎ３４またはその任意の組合せを本発明の方法によって利用する。
本発明はまた、それだけには限定されないがＳＥＮ２、ＳＥＮ３４、ＳＥＮ５４、およびＳＥＮ１５（アクセッション番号はそれぞれＳＥＮ２：Ｍ３２３３６、ＳＥＮ３４：ＹＡＲ００８ｗ、ＳＥＮ５４：ＹＰＬ０８３ｃ、ＳＥＮ１５：ＹＭＲ０５９ｗ）を含めた酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットの発現および精製方法を提供する。
具体的な実施形態では、Trotta他、1997、Cell、89:849-858に記載の手順に従って酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを精製する。別の具体的な実施形態では、Xu他、1990、Methods in Enzymology、181:463-471（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の手順に従って酵母のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを精製する。簡単に説明すると、精製はポリミンＰ沈降、次いでヘパリン−アガロースクロマトグラフィー、次いでブルートリスアクリルＭクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびセファデックス（Ｓｅｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０ゲル濾過クロマトグラフィーを含み得る。あるいは、本発明の方法で使用する酵母のｔＲＮＡスプライシングリガーゼは、Phizicky他、1986、Journal of Biol. Chem.、261(6):2978-2986（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の方法を用いて精製し得る。
５．３ 化合物
本発明の方法を用いてスクリーニングしたライブラリは様々な化合物種を含むことができる。本発明の方法によってスクリーニングすることができるライブラリの例には、それだけには限定されないが、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに小分子ライブラリ（好ましくは有機小分子ライブラリ）が含まれる。一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリ中の化合物は核酸またはペプチド分子である。非限定的な例では、ファージディスプレイライブラリ中にペプチド分子が存在することができる。他の実施形態では、化合物の種類には、それだけには限定されないが、天然に存在しないアミノ酸、たとえば、Ｄ−アミノ酸、α−アミノリン酸やα−アミノリン酸などのアミノ酸のリン類似体、または非ペプチド結合を有するアミノ酸を含むペプチドを含むペプチド類似体、ホスホロチオエートやＰＮＡなどの核酸類似体、ホルモン、抗原、合成もしくは天然に存在する薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトースおよびガラクトースが含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリも本発明のアッセイで使用することができる。
好ましい実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、それだけには限定されないが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、およびベンゾジアゼピンを含めた有機小分子ライブラリである。別の実施形態では、コンビナトリアルライブラリはペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；または炭水化物ライブラリを含む。コンビナトリアルライブラリはそれ自体が市販されている（たとえば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ；Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ペンシルベニア州Ｅｘｔｏｎ；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州Ｃｏｌｕｍｂｉａなどを参照）。
好ましい実施形態では、ライブラリの化合物がより細胞に取り込まれやすくなるようにライブラリを事前に選択する。たとえば、化合物が細胞内に入る可能性を増大する、それだけには限定されないが大きさ、親油性、親水性、および水素結合などの特定のパラメータに基づいて化合物を選択する。別の実施形態では、化合物を三次元または四次元のコンピュータ計算プログラムによって解析する。
本発明の方法によって使用するためのコンビナトリアル化合物のライブラリは合成してもよい。薬理学的活性、生物学的活性または他の活性についてスクリーニングすることができる有機小化合物の大きなコレクション、すなわちライブラリの作製に向けられた合成方法に大きな関心がもたれている。巨大なコンビナトリアルライブラリを作製するために適用する合成方法は、溶液中または固相中、すなわち固体担体上で行う。固相合成では、過剰の試薬を加えて各反応ステップ後に洗い流すことが容易に行えるので、複数ステップの反応を実施し、反応を高収率で完了させることが容易になる。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製およびスクリーニングを改善させる傾向にある。しかし、より慣例の液相化学が固相化学よりも広範な有機反応を支持する。
本発明のコンビナトリアル化合物のライブラリは、Kilcoin他の米国特許第6,190,619号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の装置を用いて合成し得る。米国特許第6,190,619号は、複数の別々の化合物の並行合成用またはコンビナトリアル化合物ライブラリ用の複数の反応器を保持できる合成装置を開示している。
一実施形態では、コンビナトリアル化合物のライブラリを溶液中で合成することができる。Boger他の米国特許第6,194,612号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の方法は、コンビナトリアルライブラリの液相合成の鋳型として有用な化合物を特徴とする。鋳型は、液体／液体抽出または固体／液体抽出を用いて未反応物質から反応産物を容易に精製することが可能になるよう設計されている。鋳型を用いてコンビナトリアル合成によって産生される化合物は、好ましくは有機小分子である。ライブラリ中の一部の化合物は非ペプチドまたはペプチドの効果を模倣し得る。コンビナトリアル化合物のライブラリの固相合成とは対照的に、液相合成では複数ステップの固相合成の個々のステップをモニターするための特殊なプロトコルを使用する必要がない（Egner他、1995、J. Org. Chem.、60:2652；Anderson他、1995、J. Org. Chem.、60:2650；Fitch他、1994、J. Org. Chem.、59:7955；Look他、1994、J. Org. Chem.、49:7588；Metzger他、1993、Angew. Chem., Int. Ed. Engl.、32:894；Youngquist他、1994、Rapid Commun. Mass Spect.、8:77；Chu他、1995、J. Am. Chem. Soc.、117:5419；Brummel他、1994、Science、264:399；およびStevanovic他、1993、Bioorg. Med. Chem. Lett.、3:431）。
本発明の方法に有用なコンビナトリアル化合物のライブラリは固体担体上で合成することができる。一実施形態では、分割合成（ｓｐｌｉｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法、すなわち合成中に固体担体を分離および混合するプロトコルを使用して化合物ライブラリを固体担体上で合成する（たとえば、Lam他、1997、Chem. Rev.、97:41-448；Ohlmeyer他、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10922-10926、およびそれ中で引用された参考文献参照）。最終ライブラリ中の各固体担体は、実質上１種の化合物がその表面に結合している。各担体に１種の産物が結合している、コンビナトリアルライブラリを固体担体上で合成する他の方法は当業者には知られているであろう（たとえば、Nefzi他、1997、Chem. Rev.、97:449-472参照）。
本明細書中で使用する用語「固体担体」とは、特定の種類の固体担体に限定されない。多数の担体が利用可能であり、当業者に公知である。固体担体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、および多糖類が含まれる。適切な固体担体は、所望の最終用途および様々な合成プロトコルへの適切性に基づいて選択し得る。たとえば、ペプチドの合成では、固体担体は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ケンタッキー州Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ）；クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンを含めたポリスチレン（たとえばＢａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから得られるＰＡＭ樹脂）；ポリ（ジメチルアクリルアミド）グラフトスチレンコ−ジビニル−ベンゼン（たとえばＡｍｉｎｏｔｅｃｈ、カナダから得られるＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールグラフトポリスチレン樹脂（たとえばＴＥＮＴＡＧＥＬもしくはＡＲＧＯＧＥＬ、Ｂａｙｅｒ、ドイツＴｕｂｉｎｇｅｎ）ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州から得られる）、またはセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）などの樹脂でありうる。
本発明の一部の実施形態では、リンカーによって化合物を固体担体に結合させることができる。リンカーは固体担体の必須構成要素および一部分であることができ、または固体担体上で合成されるもしくは合成後に固体担体上に結合される必須構成要素でないものであってもよい。リンカーは、固体担体に化合物の結合点を提供することだけでなく、リンカーの性質に応じて様々な条件下で分子の様々な基が固体担体から切断されることを可能にすることでも有用である。たとえば、リンカーは、とりわけ求電子的に切断される、求核的に切断される、光切断可能である、酵素的に切断される、金属によって切断される、還元的条件下で切断されるまたは酸化的条件下で切断されることができる。好ましい実施形態では、化合物は、化合物のハイスループットスクリーニングの前に固体担体から切断される。
本発明の特定の実施形態では、試験化合物は小分子である。
５．４ ｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の構成要素（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物の能力を同定および検証するために様々なアッセイを使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性またはそのサブユニットをモジュレートする、たとえば阻害する化合物の能力を同定および検証するためのアッセイを包含する。他の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性またはそのサブユニットをモジュレートする、たとえば阻害する化合物の能力を同定および検証するためのアッセイを包含する。他の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性または生物学的なその断片をモジュレートする、たとえば阻害する化合物の能力を同定および検証するためのアッセイを包含する。本発明のさらに他の実施形態では、本発明は、生物学的に活性なその断片中の真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする、たとえば阻害する化合物の能力を同定および検証するためのアッセイを包含する。
本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の酵素の活性をモジュレートする化合物の能力を同定および検証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系アッセイならびにｉｎ ｖｉｖｏ系アッセイを包含する。一部の実施形態では、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性に対する化合物の効果を評価するために複数のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを同時にまたは順次に行うことができる。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイをハイスループット様式で行う。
５．４．１ レポーター遺伝子に基づいたアッセイ
５．４．１．１ 細胞系アッセイ
レポーター遺伝子構築体を含むベクターを宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトし、化合物ライブラリの合成もしくは購入または両方を行ったあと、間接細胞系アッセイでｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物を同定するために、細胞を用いてライブラリをスクリーニングする。本発明はさらに、本明細書中に記載のより直接的なアッセイ（たとえば無細胞系アッセイ）によって、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の酵素をモジュレートする化合物の特異的な標的を特性決定することを包含する。一部の実施形態では、化合物は動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする。さらに他の実施形態では、化合物は動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする。
レポーター遺伝子に基づいたアッセイは、化合物または化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内、またはレポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、もしくは５’および３’非翻訳領域の両方の内、またはレポーター遺伝子のｍＲＮＡスプライシング部位内にレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築体とｔＲＮＡイントロンとを含むように遺伝子操作した細胞と接触させるステップと、前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップとによって実施し得る。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の変化は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートすることを示す。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の低減は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の酵素の活性を低減または阻害する（たとえば、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌレアーゼの活性、たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによるｔＲＮＡイントロンの認識もしくは切断を低減もしくは阻害する）ことを示す。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の増大は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性を増強することを示す。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」））またはレポーター遺伝子の発現に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえばレポーター遺伝子の発現に影響を与えることが知られている薬剤、好ましくはｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の成分（たとえば酵素）の活性に影響を与える薬剤）を本明細書中に記載の細胞系アッセイに含める。
化合物または化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内、レポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、もしくは５’および３’非翻訳領域の両方の内、またはｍＲＮＡスプライシング部位内にレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築体とｔＲＮＡイントロンとを含むように遺伝子操作した細胞と接触させるステップは、生理的条件下で実施することが好ましい。具体的な実施形態では、水溶液の存在下で化合物または化合物ライブラリのメンバーを細胞に加える。この実施形態によれば、水溶液は緩衝液および複数の塩の組合せを含み得、生理的条件に近いまたはそれを模倣することが好ましい。あるいは、水溶液は緩衝液、複数の塩の組合せ、および界面活性剤またはサーファクタントを含み得る。水溶液中で使用し得る塩の例には、それだけには限定されないが、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、および／またはＭｇＣｌ２が含まれる。水溶液中で使用する各塩の最適な濃度は使用する細胞および化合物に応じて異なり、慣用の実験を用いて決定することができる。化合物または化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子構築体を含むように遺伝子操作した細胞と接触させるステップは、少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間行い得る。
一実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）レポーター遺伝子を含む核酸を細胞中で発現させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは対照の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路において１つまたは複数の成分の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップと、（ｄ）本明細書中に記載のアッセイなどを用いて化合物によってモジュレートされるｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば酵素）を同定するするステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、本明細書中に記載のまたは当業者に公知の直接アッセイによって決定されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性および／またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする。
別の実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路において１つまたは複数の成分の活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）構成要素（たとえば酵素）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、前記試験化合物の非存在下もしくは対照の存在下における前記レポーター遺伝子の発現の事前に決定した基準範囲と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路において１つまたは複数の成分の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップと、（ｃ）セクションＸＸＸに記載のアッセイなどを用いて化合物にモジュレートされるｔＲＮＡスプライシング経路内のｃ構成要素（たとえば酵素）を同定するステップとを含む方法を提供する。
細胞系レポーター遺伝子アッセイ中におけるレポーター遺伝子の発現は、当業者に周知の任意の技術によって検出し得る。レポーター遺伝子発現の発現の検出方法は使用するレポーター遺伝子に応じて異なる。様々なレポーター遺伝子のアッセイは当業者に周知である。報告された遺伝子の発現は、レポーター遺伝子のＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現、または発現されたレポーター遺伝子に関連する活性についてアッセイを行うことによって検出し得る。たとえば、セクション５．１に記載したように、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（「ｂ−ｇａｌ」）、β−グルコロニダーゼ（「ＧＵＳ」）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、およびアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）が基質の存在下で分析でき、ハイスループットスクリーニングが行える酵素である。ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（「ｂ−ｇａｌ」）、およびアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）の反応産物を、たとえば光イメージング（たとえばルシフェラーゼ）、分光光度吸光（たとえばｂ−ｇａｌ）、または蛍光（たとえばＡＰ）における変化によってアッセイする。光出力、吸光、および／または蛍光における変化のアッセイはハイスループットスクリーニングに容易に適応できる。たとえば、ｂ−ｇａｌの活性はマイクロプレートリーダーで測定することができる。緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の活性は蛍光の変化によって測定することができる。４８８ｎｍで蛍光発光するＧＦＰ突然変異体の場合は、ＧＦＰ活性に基づいて細胞を分離するために標準的な蛍光活性化細胞分取（「ＦＡＣＳ」）装置を使用することができる。
レポーター遺伝子の発現の改変は、レポーター遺伝子の発現レベルを陰性対照（たとえばＰＢＳまたはレポーター遺伝子の発現に影響を与えないことが知られている別の薬剤）、および任意選択で陽性対照（たとえばレポーター遺伝子の発現に影響を与えることが知られている薬剤）と比較することによって決定し得る。あるいは、レポーター遺伝子の発現の改変は、レポーター遺伝子の発現レベルを事前に決定した基準範囲と比較することによって決定し得る。
レポーター遺伝子の発現は、たとえば前記遺伝子にコードされているタンパク質および／またはＲＮＡを定量することによって容易に検出することができる。したがって、それだけには限定されないが、遺伝子の発現を検出および／もしくは可視化する免疫アッセイ（たとえば、ウエスタンブロット、免疫沈降、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫細胞化学など）、ならびに／またはそれぞれ遺伝子をコードしているｍＲＮＡを検出および／もしくは可視化することによって遺伝子の発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（たとえば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）などを含めた当分野で標準的な多くの方法を使用することができる。このようなアッセイは日常的であり、当分野で周知である（たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons、Inc.、ニューヨーク参照。その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。例示的な免疫アッセイを以下に簡単に記載する（これらは限定することを意図しない）。
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（たとえばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を加えたＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％トラジロール）などの溶解緩衝液中で細胞集団を溶解すること、抗体を細胞溶解液に加えること、一定時間（たとえば１〜４時間）４０℃でインキュベートすること、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に加えること、約１時間以上４０℃でインキュベートすること、ビーズを溶解緩衝液で洗浄すること、およびビーズをＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁させることを含む。抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、たとえばウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体と抗原との結合を増大させ、バックグラウンドを減少させるために改変できるパラメータに関する知識を有するであろう（たとえば細胞溶解液をセファロースビーズで事前に清澄にすること）。免疫沈降プロトコルに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨークの10.16.1を参照されたい。
ウエスタンブロット分析は一般に、タンパク質試料を調製すること、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルで電気泳動すること（たとえば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜へと写すこと、膜をブロッキング溶液（たとえば３％のＢＳＡを含むＰＢＳや無脂肪乳）でブロッキングすること、膜を緩衝液（たとえばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液で希釈した（特定の抗原を認識する）一次抗体でブロッキングすること、膜を緩衝液で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液で希釈した、酵素基質（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）または放射性分子（たとえば３２Ｐや１２５Ｉ）にコンジュゲートさせた二次抗体（一次抗体を認識する、たとえば抗ヒト抗体など）でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液で洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドのノイズを減少させるために改変できるパラメータに関する知識を有するであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨークの10.8.1を参照されたい。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに抗原をコーティングすること、酵素基質（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートさせた（特定の抗原を認識する）一次抗体をウェルに加えて一定時間インキュベートすること、および抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的の抗体は検出可能な化合物にコンジュゲートされていなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートさせた（一次抗体を認識する）二次抗体をウェルに加え得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングしたウェルに目的の抗原を加える前に検出可能な化合物にコンジュゲートさせた二次抗体を加えてもよい。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために改変できるパラメータ、ならびに当分野で知られているＥＬＩＳＡの他の変形に関する知識を有するであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第19巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨークの11.2.1を参照されたい。
５．４．１．２ 無細胞系アッセイ
レポーター遺伝子構築体を含むベクターを作製し、無細胞翻訳抽出物を作製または購入し、化合物ライブラリの合成もしくは購入または両方を行ったあと、間接無細胞系アッセイでｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物を同定するために、無細胞翻訳抽出物および核酸を用いてライブラリをスクリーニングする。本発明はさらに、本明細書中に記載のより直接的なアッセイによってｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）をモジュレートする化合物の特定の標的を特性決定することを包含する。
レポーター遺伝子に基づいたアッセイは、化合物を、無細胞抽出物、およびレポーター遺伝子とレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内、レポーター遺伝子構築体の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域もしくは５’および３’非翻訳領域の両方の内、またはレポーター遺伝子のｍＲＮＡスプライシング部位内のｔＲＮＡイントロンとを含むレポーター遺伝子構築体と接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を測定することによる無細胞様式で実施し得る。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の変化は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートすることを示す。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の低減は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性を低減または阻害する（たとえば、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによるｔＲＮＡイントロンの認識または切断を阻害または低減することなどによって、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を低減または阻害する）ことを示す。このようなレポーター遺伝子に基づいたアッセイにおいて、事前に決定した基準範囲に対する、化合物または対照の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現の増大は、特定の化合物がｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性を増強することを示す。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばＰＢＳまたはレポーター遺伝子の発現に影響に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえばレポーター遺伝子の発現に影響に影響を与えることが知られている薬剤、好ましくはｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分の活性に影響を与える薬剤）を本明細書中に記載の無細胞系アッセイに含める。
具体的な実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは対照の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、前記レポーター遺伝子はｔＲＮＡイントロンを含むステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、ある化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現が、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは対照の存在下における前記レポーター遺伝子の発現と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物が同定されるステップと、（ｃ）セクション５．４．６に記載のアッセイなどを使用して、化合物によりモジュレートされるｔＲＮＡスプライシング経路内の構成要素（たとえば酵素）を同定するステップとを含む方法を提供する。
無細胞抽出物中の化合物の活性は、レポーター遺伝子にコードされているレポータータンパク質の活性をアッセイすることによって、あるいは、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたタンパク質の標識（たとえば３５Ｓで標識したメチオニンを用いる）、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはウエスタンブロット分析や免疫沈降などの免疫学的方法によってレポーター遺伝子の発現を定量することによって測定することができる。このような方法は当業者に周知である。
５．４．２ ＦＲＥＴアッセイ
蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）アッセイは、ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性の改変を検出するために使用することができる。ＦＲＥＴに基づいたアッセイは蛍光共鳴エネルギー転移によるシグナル生成に依存し、これによれば、蛍光の変化は、第１のフルオロフォアと別のフルオロフォア（ドナー）またはクエンチャーのいずれかの相互作用している共鳴エネルギーアクセプターとの距離の変化によって生じる。フルオロフォアとクエンチャー分子または部分を含めた相互作用分子または部分との組合せは「ＦＲＥＴ対」として知られ、当業者に公知である。
ＦＲＥＴ対相互作用の機構には、対の一方のメンバーの吸収スペクトルが他方のメンバーである第１のフルオロフォアの発光スペクトルと重なることが必要である。相互作用分子または部分がクエンチャーである場合は、その吸収スペクトルがフルオロフォアの発光スペクトルと重なる必要がある（Stryer、L.、Ann. Rev. Biochem.、1978、47:819-846；BIOPHYSICAL CHEMISTRY第ＩＩ部、Techniques for the Study of Biological Structure and Function、C. R. CantorおよびP. R. Schimmel、448-455ページ(W. H. Freeman and Co.、米国San Francisco、1980)；Selvin, P. R.、1995、Methods in Enzymology、246:300-335参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。効率的な、または相当な度合いのＦＲＥＴ相互作用には、対の吸収および発光スペクトルが高い度合いの重なりを有することが必要である。ＦＲＥＴ相互作用の効率はその重なりに正比例する（Haugland他、P.N.A.S. U.S.A.、63:24-30 (1969）。大きなシグナルを得るためには、高い度合いの重なりが必要である。このことに基づいてフルオロフォア−クエンチャーの対を含めたＦＲＥＴ対が選択されている。
いくつかのフルオロフォアの組合せのうち任意のものを本発明で使用するために選択することができる（たとえば、Pesce他編、Fluorescence Spectroscopy、Marcel Dekker、ニューヨーク、1971；White他、Fluorescence Analysis: A practical Approach、Marcel Dekker、ニューヨーク、1970；Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、第6版、Molecular Probes, Inc.、オレゴン州Eugene、1996を参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。一般に、アクセプターフルオロフォアのスペクトルの相当な部分を有する好ましいドナーフルオロフォアが選択される。さらに、特定の用途では、ドナーがヘリウム−カドミウムの４４２ｎＭまたはアルゴンの４８８ｎＭなどのレーザー周波数に近い最大励起を有することが望ましいかもしれない。このような用途では、強いレーザー光を使用することがドナーフルオロフォアを励起させる有効手段として役割を果たす場合がある。アクセプターフルオロフォアは、その励起スペクトルがドナーフルオロフォアの発光スペクトルと相当な重なりを有する。さらに、アクセプター部分の発光スペクトルの最大波長は、ドナー部分の励起スペクトルの最大波長よりも少なくとも１０ｎｍ大きいことが好ましい。アクセプターフルオロフォアの発光スペクトルは、典型的には可視スペクトルの赤色部分にあるが、スペクトルの赤外線領域内のより長い波長で発光するアクセプターフルオロフォアを使用することができると考えられる。
蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分またはクエンチャーとのＦＲＥＴを得るためには、２つの部分は互いに空間的に近接していなければならない。したがって、特定の実施形態では、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質は、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分またはクエンチャーが互いに最大で０．５ｎｍ、最大で１ｎｍ、最大で５ｎｍ、最大で１０ｎｍ、最大で２０ｎｍ、最大で３０ｎｍ、最大で４０ｎｍ、最大で５０ｎｍもしくは最大で１００ｎｍしか離れていないように標識する。
５．４．２．１ 標識した基質を用いた細胞系アッセイ
ＦＲＥＴ−細胞に基づいたアッセイは、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞内に微量注入またはトランスフェクション（たとえばリポソームまたはエレクトロポレーションを用いる）して、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、または前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。内在性ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはエンドヌクレアーゼによる基質の切断から生じたｔＲＮＡ半分子をライゲーションし、検出可能な蛍光シグナルの産生を消光させる。したがって、化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応がエンドヌクレアーゼによるｔＲＮＡ基質の切断より先に進行しないように反応をｔＲＮＡスプライシングリガーゼの既知の阻害剤（たとえばｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体）またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を欠損する細胞の存在下で実施することができる。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成が阻害または低減する。内在性エンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能なシグナルの生成が増大される。化合物がｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応を完了するまで進行させる。内在性ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはｔＲＮＡ半分子を成熟ｔＲＮＡへと結合する（すなわちライゲーションする）。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成を維持または増強する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルを低減させる。
任意の機構に拘束されることを意図するものではないが、このアッセイは、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質の５’および３’末端が、５’末端と３’末端とが近接している結果蛍光シグナルが消光されるように空間的に近接しているという理論に基づいている。当業者には、基質の特定の構造的配置に応じてアッセイを改変し得ることが理解されよう。
あるいは、ＦＲＥＴ−細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞内に微量注入またはトランスフェクトして、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、または前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、蛍光ドナー部分の波長における蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる検出可能な蛍光シグナルの低減がもたらされる。内在性ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはエンドヌクレアーゼによる基質の切断から生じたｔＲＮＡ半分子をライゲーションし、蛍光ドナー部分の波長における蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる検出可能な蛍光シグナルの生成を誘導する。したがって、化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応がエンドヌクレアーゼによるｔＲＮＡ基質の切断より先に進行しないように反応をｔＲＮＡスプライシングリガーゼの既知の阻害剤（たとえばｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体）の存在下、またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を欠損する細胞中で実施することができる。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が維持または増強される。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。化合物がｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応を完了するまで進行させる。内在性ｔＲＮＡスプライシングリガーゼは生じたｔＲＮＡ半分子を成熟ｔＲＮＡへと結合する（すなわちライゲートする）。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害し、したがって陰性対照と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって陰性対照と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が増大される。
このアッセイは、ｔＲＮＡスプライシング経路の活性に貢献する条件を提供する任意の緩衝液系中で実施することができる。このような緩衝液系は当業者に周知である。具体的な実施形態では、緩衝液は細胞を維持する培地である。培地中にマグネシウムイオンを含めるよう注意すべきである。
特定の実施形態では、アッセイを少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間実施する。
動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除される任意のヌクレオチド配列を本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイの基質として利用し得る。たとえば、バルジ−ヘリックス−バルジ構造または前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含むヌクレオチド配列を本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイにおいて動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として利用し得る。バルジ−ヘリックス−バルジ構造を含むヌクレオチド配列は真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として利用し得る。動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識および切除されるヌクレオチド配列は、１０個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、４５個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、５５個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、６５個のヌクレオチド、７５個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１２５個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質はｔＲＮＡイントロンを含む。基質はバルジ−ヘリックス−バルジコンホメーションを含み得る。具体的な実施形態では、基質はｔＲＮＡイントロンを含む成熟ドメインを含む。
好ましい実施形態では、図１Ｂまたは図１Ｃに示したｔＲＮＡ基質を本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイで利用する。ハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質のイントロンの５’および３’遊離末端（図１Ｂ）またはｔＲＮＡ基質のイントロンの５’および３’遊離末端（図１Ｃ）を、５’末端のフルオロフォアと３’末端のフルオロフォアとが空間的に近接することにより蛍光共鳴エネルギー転移がもたらされるようにフルオロフォアで標識する。その後、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによる基質の切断によって標識した５’末端と標識した３’末端とが空間的に離れ、したがって蛍光共鳴エネルギー転移の低減がもたらされる。ｔＲＮＡ半分子のライゲーションにより５’末端のフルオロフォアと３’末端のフルオロフォアとが近接し、したがって蛍光共鳴エネルギー転移の増大がもたらされる。あるいは、ハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質のイントロンの５’末端または３’末端のどちらか（図１Ｂ）、または環状に配置したｔＲＮＡ基質のイントロン（図１Ｃ）を、クエンチャーとフルオロフォアとが近接することにより検出可能な蛍光シグナルの阻害がもたらされるようにクエンチャーで標識し、他方の末端をフルオロフォアで標識する。その後、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼによる基質の切断によって標識した５’末端と標識した３’末端とが空間的に離れ、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が増大する。ｔＲＮＡ半分子のライゲーションにより５’末端と３’末端とが近接し、したがって検出可能な蛍光シグナルの生成が低減する。
本発明によれば、１対の蛍光ドナーおよびアクセプター部分を用いて基質を標識することができる。あるいは、基質は蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分の異なる対を用いて標識することができる。たとえば、２対、３対、４対、５対以上の蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分を使用することができる。この場合、少なくとも１対は他の対のうち少なくとも１対の蛍光アクセプター部分の発光スペクトルとは異なる発光スペクトルを有する蛍光アクセプター部分を含むことが好ましい。あるいは、少なくとも３対用いる場合は、第１対、第２対および第３対の蛍光アクセプター部分は他の２対の蛍光アクセプター部分とは異なる発光スペクトルを有する。基質を蛍光アクセプター部分、蛍光ドナー部分および／またはクエンチャーで標識する方法は当分野で周知である（たとえば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201、同第6,280,981号、同第5,843,658号、および同第5,439,797号参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。標識した基質は、当業者に周知の技法を利用して真菌または動物界の細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞）内に微量注入またはトランスフェクトすることができる（たとえば、Adams他、1991、Nature、349:694-697参照）。
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質は当業者に公知の任意の方法によって標識することができる。特定の実施形態では、フルオロフォアを用いたＲＮＡの部位特異的な標識を使用してｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を標識することができる。より具体的な実施形態では、QinおよびPyle、1999 (Methods、18(1):60-70、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)に記載の方法を用いてｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を標識する。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を標識するための最適な経路は慣用の実験を用いて当業者が決定することができる。具体的な実施形態では、異なる方法、異なる標識および／またはｔＲＮＡ基質中の異なる標識位置を用いてｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を標識する。その後、異なる標識を行った基質を個別に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤または活性化剤をそれぞれ存在させておよび存在させずにスプライシングアッセイに供する。スクリーニングアッセイの最適な標識は、最も容易に検出可能であり、阻害剤または活性化剤の効果の最も再現性のある検出を可能にする標識である。さらに、慣用の実験によって、使用する標識に応じて当業者に公知の一般的な方法を用いて標識の検出感度を増強させ得る。しかし、他の標識化手順も、特にそれらが他の望ましい利点を提供する場合は本発明の方法で使用し得る。
５．４．２．２ 標識した基質を用いた無細胞系アッセイ
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物および化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は３’末端がフルオロフォアで標識され、５’末端がクエンチャーで標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。無細胞抽出物中のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。無細胞抽出物中のｔＲＮＡスプライシングリガーゼはエンドヌクレアーゼによる基質の切断から生じたｔＲＮＡ半分子をライゲーションし、検出可能な蛍光シグナルの生成を消光させる。したがって、化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応がｔＲＮＡ基質の切断より先に進行しないように反応をｔＲＮＡスプライシングリガーゼの既知の阻害剤（たとえばｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体）の存在下、またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を欠損する無細胞抽出物中で実施することができる。一部の実施形態では、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性は反応混合物からＡＴＰを排除することによって阻害または低減される。特定の作用機構に拘束されることを意図するものではないが、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性はＡＴＰの存在に依存するので、反応からＡＴＰを排除することによりｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性が有効に低減される。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成が阻害または低減される。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能なシグナルの生成が増大される。化合物がｔＲＮＡリガーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応を完了するまで進行させる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼは生じたｔＲＮＡ半分子を成熟ｔＲＮＡへと結合する（すなわちライゲートする）。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成を維持または増強する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルを低減させる。
あるいは、ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物および化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、蛍光ドナー部分の波長における蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる検出可能な蛍光シグナルが低減する。無細胞抽出物中のｔＲＮＡスプライシングリガーゼはエンドヌクレアーゼによる基質の切断から生じたｔＲＮＡ半分子をライゲーションし、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が増大する。したがって、化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応がｔＲＮＡ基質の切断より先に進行しないように、反応をｔＲＮＡスプライシングリガーゼの既知の阻害剤（たとえばｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的に結合する抗体）の存在下、またはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を欠損する無細胞抽出物中で実施することができる。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光を維持または増強する。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。化合物がｔＲＮＡリガーゼの活性をモジュレートするかどうかを決定するためには、反応を完了するまで進行させる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼは生じたｔＲＮＡ半分子を成熟ｔＲＮＡと結合させる（すなわちライゲートする）。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が増大する。
このアッセイは、ｔＲＮＡスプライシング経路に貢献する条件を提供する任意の緩衝液系中で実施することができる。このような緩衝液系は当業者に周知である。具体的な実施形態では、緩衝液はｐＨ７．０の２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む。緩衝液系のｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度などがＦＲＥＴを妨げないよう注意すべきである。
特定の実施形態では、アッセイを少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間実施する。
本発明によれば、１対の蛍光ドナー化合物およびアクセプターを用いて基質を標識することができる。あるいは、基質は蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分の異なる対を用いて標識することができる。たとえば、２対、３対、４対、５対以上の蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分を使用することができる。この場合、少なくとも１対は他の対のうち少なくとも１対の蛍光アクセプター部分の発光スペクトルとは異なる発光スペクトルを有する蛍光アクセプター部分を含むことが好ましい。あるいは、少なくとも３対用いる場合は、第１対、第２対および第３対の蛍光アクセプター部分は他の２対の蛍光アクセプター部分とは異なる発光スペクトルを有する。基質を蛍光アクセプター部分、蛍光ドナー部分および／またはクエンチャーで標識する方法は当分野で周知である（たとえば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号、および同第5,439,797号参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
５．４．３ ｔＲＮＡ抑制アッセイ
ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の成分（たとえば酵素）の活性に対する化合物または化合物ライブラリのメンバーの効果は、ｔＲＮＡエンドヌクレアーゼ抑制アッセイを用いて決定してもよい。このようなアッセイでは、第１のレポーター遺伝子構築体およびサプレッサーｔＲＮＡを含むように宿主細胞を遺伝子操作するステップと、サプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導するステップと、宿主細胞を化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、レポーター遺伝子の発現および／またはレポーター遺伝子にコードされているタンパク質の活性を測定するステップを行う。第１のレポーター遺伝子構築体は、そのオープンリーディングフレーム内に、オープンリーディングフレームが分断されるようにナンセンスコドンを有するレポーター遺伝子を含む。たとえばSambrook (Sambrook、1989、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版；DNA Cloning、第Ｉ巻および第ＩＩ巻(Glover編、1985))に記載の標準的な突然変異誘発技術を使用して、当業者に周知の任意のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内にナンセンスコドンを導入してもよい。第１のレポーター遺伝子構築体を、サプレッサーｔＲＮＡを含むよう遺伝子操作した宿主細胞内にトランスフェクトする。あるいは、第１のレポーター遺伝子を、サプレッサーｔＲＮＡと共に宿主細胞内に同時トランスフェクトする。サプレッサーｔＲＮＡの発現は、テトラサイクリンにより調節される調節エレメントなどの制御可能な調節エレメントによって調節されており（たとえば、Buvoli他、2000、Molecular and Cellular Biology、20:3116-3124；ParkおよびBhandary、1998、Molecular and Cellular Biology、18:4418-4425参照）、サプレッサーｔＲＮＡは正しくスプライシングされたサプレッサーｔＲＮＡのみが機能的であるように、アンチコドンステムにｔＲＮＡイントロンを含む。機能的サプレッサーｔＲＮＡの発現は（ｉ）サプレッサーｔＲＮＡの転写、および（ｉｉ）ｔＲＮＡスプライシングに依存する。機能的サプレッサーｔＲＮＡの発現によりレポーター遺伝子中のナンセンスコドンが抑制され、完全長の機能的なレポーター遺伝子の発現がもたらされる。したがって、完全長の機能的なレポーター遺伝子の発現は機能的サプレッサーｔＲＮＡの発現と相関し、言い換えると、サプレッサーｔＲＮＡの転写レベルおよびｔＲＮＡスプライシングレベルと相関する。完全長のレポーター遺伝子の発現およびレポーター遺伝子にコードされているタンパク質の活性は、当業者に周知の、または本明細書中に記載の任意の方法によってアッセイすることができる。
ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性を阻害または低減する化合物は、機能的サプレッサーｔＲＮＡの産生を阻害または低減し、したがって事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物が存在せず、対照が存在する場合のレポーター遺伝子の発現と比較して、レポーター遺伝子の発現が低減する。ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性を増強する化合物は機能的サプレッサーｔＲＮＡの産生を増大し、したがって、事前に決定した基準範囲と比較して、または前記化合物の非存在下もしくは対照の存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較してレポーター遺伝子の産生が増大する。
サプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導するステップは、宿主細胞を化合物と接触させるステップと同時に、または化合物を宿主細胞と接触させるステップの少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも０．５時間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間もしくは少なくとも１２時間前に実施してもよい。特定の実施形態では、宿主細胞をたとえばテトラサイクリンなどの薬剤と共に、約５分間、約１５分間、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、または約１２時間インキュベートすることによってサプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導する。他の実施形態では、サプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導するためにテトラサイクリンなどの薬剤を加える前に、約５分間、約１５分間、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間または約１２時間、宿主細胞を化合物と接触させる。
場合によっては、第１のレポーター遺伝子とは異なるレポーター遺伝子を含む第２のレポーター遺伝子構築体を含むように宿主細胞を遺伝子操作し、ここで第２のレポーター遺伝子はナンセンスコドンを含まない。具体的な実施形態では、ｔＲＮＡエンドヌクレアーゼ抑制アッセイで使用するレポーター遺伝子は赤色および緑色のコメツキムシルシフェラーゼであり、赤色のルシフェラーゼがナンセンスコドンを含む。宿主細胞は、２つのルシフェラーゼ遺伝子およびその発現が制御される調節エレメントによって調節されるサプレッサーｔＲＮＡ（テトラサイクリンに制御される調節エレメントなど）を安定して発現するよう遺伝子操作してもよい。テトラサイクリンなどの薬剤が存在しない場合はサプレッサーｔＲＮＡが発現せず、したがって赤色対緑色の比が低い。テトラサイクリンなどの薬剤が存在する場合はサプレッサーｔＲＮＡが発現し、したがって赤色対緑色の比が増大する。ハイスループットスクリーニングには、化合物の存在下で細胞を蒔く。一定時間後、テトラサイクリンなどの薬剤を含む培地を加えてサプレッサーｔＲＮＡの発現を誘導する。
ｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）を阻害する化合物は、該化合物を含まない対照と比較して赤色対緑色の比を減少させる。このアッセイでｔＲＮＡスプライシング経路内の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする化合物を同定したあと、その化合物が標的としているｔＲＮＡスプライシング経路内の特定の構成要素（たとえば酵素）を同定するため、および／または化合物の活性を確認するために、本明細書中に記載のアッセイのうち１つまたは複数を用いてそれらを試験し得る。
５．５ ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。具体的には、本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する化合物の同定方法を提供する。
本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物の能力を同定および／または検証するための様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを包含する。動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に対する化合物の効果を評価するために、複数のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを同時にまたは順次、行うことができる。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のアッセイをハイスループット様式で行う。
本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイは、任意の動物界の細胞もしくは真菌細胞、または任意の精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを利用して行うことができる。具体的な実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物界の細胞は、哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ（たとえば非ヒト哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ）または哺乳動物細胞である。好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは動物細胞は、ヒトのｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはヒト細胞である。別の実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは真菌細胞は、酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは酵母細胞である。
５．５．１ ＦＲＥＴに基づくアッセイ
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性の変化を検出するために、蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）に基づくアッセイを包含する。本明細書中に記載のＦＲＥＴアッセイでは、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットまたは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質をフルオロフォアで標識してもよい。動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニット（もしくは複数のサブユニット）が決定または単離されていない場合には、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質をフルオロフォアで標識する。
５．５．１．１ 標識基質を用いた無細胞系アッセイ
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、精製された動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成が阻害または低減する。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能なシグナルの生成が増大する。
あるいは、ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、精製された動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が維持されるかまたは増大する。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光を低減する。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばＰＢＳまたは基質の切断に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえば基質の切断に影響を与えることが知られている薬剤）を本明細書中に記載のＦＲＥＴ無細胞系アッセイに含める。
このアッセイは、ｔＲＮＡエンドヌクレアーゼの反応を促す条件を提供する任意の緩衝液系中で実施することができる。このような緩衝液系は当業者に周知である。具体的な実施形態では、緩衝液はｐＨ７．０の２０ｍＭ トリス、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．４％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む。緩衝液系のｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度などがＦＲＥＴを妨げないよう注意すべきである。
特定の実施形態では、アッセイを少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間実施する。
一実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。これらの実施形態に従って、同定した抗真菌化合物を、動物界の細胞に対する負の効果がほとんどないかまたは存在しないことを決定または確認するためにさらに試験してもよい。
本発明によれば、１対の蛍光ドナー化合物およびアクセプター化合物を用いてｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を標識してもよい。基質は蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分の異なる対を用いて標識することができる。たとえば、２対、３対、４対、５対またはそれ以上の蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分を使用することができる。この場合、少なくとも１対は他の対のうち少なくとも１対の蛍光アクセプター部分とは異なる発光スペクトルを有する蛍光アクセプター部分を含むことが好ましい。あるいは、少なくとも３対用いる場合は、第１対、第２対および第３対の蛍光アクセプター部分は、他の２対の蛍光アクセプター部分とは異なる発光スペクトルを有する。基質を蛍光アクセプター部分、蛍光ドナー部分および／またはクエンチャーで標識する方法は当分野で周知である（たとえば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号、および同第5,439,797号参照、これらの開示は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイにおける動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の活性は、当業者に周知の技術を利用して基質の蛍光発光スペクトルを測定することによって決定することができる。測定される蛍光発光スペクトルは、使用するフルオロフォアに部分的に依存する。
５．５．１．２ 標識ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを用いた無細胞系アッセイ
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、フルオロフォアで標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニット（たとえばＳＥＮ２）およびクエンチャーで標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２のサブユニット（たとえばＳＥＮ３４）を、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で化合物とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップとによって実施し得る。標識サブユニットからの動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成は、検出可能な蛍光シグナルの低減をもたらす。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または低減する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成を増大させる。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増大させる化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光を低減または阻害する。
あるいは、ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、蛍光ドナー部分で標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニット（たとえばＳＥＮ２）および蛍光アクセプター部分で標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニット（たとえばＳＥＮ３４）を、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で化合物とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップとによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成は、蛍光ドナー部分の波長での蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらす。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または低減する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光を低減する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増大させる化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナーの波長での蛍光アクセプターの蛍光発光を増大させる。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばＰＢＳまたは基質の切断に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえば基質の切断に影響を与えることが知られている薬剤）を本明細書中に記載のＦＲＥＴ無細胞系アッセイに含める。
一実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）フルオロフォアで標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよびクエンチャーで標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを、化合物ライブラリのメンバーと、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）蛍光ドナー部分で標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよび蛍光アクセプター部分で標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを、化合物ライブラリのメンバーと、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）フルオロフォアで標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよびクエンチャーで標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを、化合物ライブラリのメンバーと、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光シグナルが検出可能でない場合、または化合物の非存在下もしくは陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）蛍光ドナー部分で標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよび蛍光アクセプター部分で標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを、化合物ライブラリのメンバーと、エンドヌクレアーゼの形成を促す条件下で接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。これらの実施形態に従って、同定した抗真菌化合物を、動物界の細胞に対する負の効果がほとんどないかまたは存在しないことを決定または確認するためにさらに試験してもよい。
５．５．１．３ 標識ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを用いた細胞系アッセイ
ＦＲＥＴ細胞系アッセイは、フルオロフォアで標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニット（たとえばＳＥＮ２）およびクエンチャーで標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニット（たとえばＳＥＮ３４）を細胞内に微量注入またはトランスフェクトしてからその細胞を化合物と接触させるステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップとによって実施し得る。好ましくは、微量注入またはトランスフェクトした細胞は動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの１つまたは複数のサブユニットを欠失している。標識サブユニットからの動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成は、検出可能な蛍光の低減をもたらす。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または低減する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成を増大する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増大する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルを低減または阻害する。
あるいは、ＦＲＥＴ細胞系アッセイは、蛍光ドナー部分で標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニット（たとえばＳＥＮ２）および蛍光アクセプター部分で標識した動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニット（たとえばＳＥＮ３４）を細胞内に微量注入してからその細胞を化合物と接触させるステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップとによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成は、蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる蛍光ドナー部分の波長での検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらす。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または低減する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプターの蛍光発光を低減させる。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増大する化合物は、陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光を増大させる。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばＰＢＳまたは基質の切断に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえば基質の切断に影響を与えることが知られている薬剤）を本明細書中に記載のＦＲＥＴ細胞系アッセイに含める。
一実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）フルオロフォアで標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよびクエンチャーで標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを微量注入またはトランスフェクトした細胞を、化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップであって、化合物の存在下において、検出可能な蛍光シグナルが、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）蛍光ドナー部分で標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよび蛍光アクセプター部分で標識した動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを微量注入またはトランスフェクトした細胞を、化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）フルオロフォアで標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよびクエンチャーで標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを微量注入またはトランスフェクトした細胞を、化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定するステップであって、化合物の存在下において、検出可能な蛍光シグナルが、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法であって、（ａ）蛍光ドナー部分で標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第１のサブユニットおよび蛍光アクセプター部分で標識した真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの第２の異なるサブユニットを化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。これらの実施形態に従って、同定した抗真菌化合物を、動物界の細胞に対する負の効果がほとんどないかまたは存在しないことを決定または確認するためにさらに試験してもよい。
特定の実施形態では、化合物および細胞を少なくとも０．２時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または少なくとも１日間インキュベートする。
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットを蛍光アクセプター部分、蛍光ドナー部分および／またはクエンチャーで標識する方法は当分野で周知である（たとえば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号、および同第5,439,797号参照、これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
５．５．２ 結合アッセイ
具体的な実施形態では、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物を直接結合アッセイによって同定することができる。具体的には、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質と動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を直接または間接的に低減または阻害することによって、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する化合物を、直接結合アッセイを用いて同定することができる。このようなアッセイは、国際公開公報WO02／083837号および同WO02／083953号（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。簡単に説明すると、直接結合アッセイは、化合物ライブラリを、それぞれの固体担体の表面に実質上１種の化合物が結合するように、固体担体（たとえばポリマービーズ）に結合させることによって実施し得る。ライブラリの複数の固体担体を、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質に水溶液中で曝し、色素標識した基質：担体に結合した化合物の複合体を形成させる。基質を特定の化合物に結合させることにより、化合物を含む固体担体（たとえばビーズ）が標識され、これは他の未標識の固体担体から物理的に分離することができる。標識した固体担体を同定したあと、担体上の化合物の化学構造は、たとえば結合した化合物の構造に対応する固体担体上のコードを読み取ることによって決定することができる。
あるいは、結合アッセイは、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、ラベルをつけた試験管もしくはマイクロタイターウェル、またはマイクロアレイ中の溶液中の遊離の化合物ライブラリのメンバーと接触させることによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの標識した基質に結合するライブラリ中の化合物は検出可能に標識された複合体を形成し、該複合体は様々な方法（それだけには限定されないが、複合体形成した基質の電気泳動、クロマトグラフィー、もしくは熱安定性特性の変化を区別する方法を含む）によって同定され、かつライブラリ中の複合体形成していない未標識の化合物、および複合体形成していない動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの標識基質から除去することができる。
具体的な実施形態では、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに結合する化合物を同定する。この実施形態によれば、化合物とタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの相互作用を検出する当業者に周知のいずれのアッセイも、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに結合する化合物を同定するために用いることができる。たとえば、化合物ライブラリを、それぞれの固体担体の表面に実質上１種の化合物が結合するように、固体担体（たとえばポリマービーズ）に結合させることによってアッセイを実施することができる。ライブラリの複数の固体担体を、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに水溶液中で曝し、色素標識したエンドヌクレアーゼ：担体に結合した化合物の複合体を形成させる。エンドヌクレアーゼを特定の化合物に結合させることにより、化合物を含む固体担体（たとえばビーズ）が標識され、これは他の未標識の固体担体から物理的に分離することができる。標識した固体担体を同定したあと、担体上の化合物の化学構造は、たとえば結合した化合物の構造に対応する固体担体上のコードを読み取ることによって決定することができる。
あるいは、アッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ラベルをつけた試験管もしくはマイクロタイターウェル、またはマイクロアレイ中の溶液中の遊離の標識化合物のライブラリのメンバーと接触させることによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに結合するライブラリ中の化合物は検出可能に標識された複合体を形成し、該複合体は様々な方法によって同定され、かつライブラリ中の複合体形成していない標識された化合物、および複合体形成していない未標識の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼから除去することができる。
５．５．３ 蛍光偏光アッセイ
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に対する化合物の効果は、蛍光偏光に基づくアッセイを利用して決定してもよい。このようなアッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光標識した基質を、動物界の無細胞抽出物（好ましくは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、蛍光偏光放射を測定することによって実施する。このアッセイの重要な側面は、アッセイで使用する基質の大きさが、基質の切断に引き続く発光した蛍光偏光の変化を識別するのに十分に大きいことである。無細胞抽出物中の真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたは精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果放射偏光の強度の変化がもたらされる。蛍光標識した基質は、平面偏光で励起した際には、励起と発光との間の時間に回転しない場合にのみ固定平面内で光を発する。放射光の偏光解消の度合いは、基質の大きさに依存する基質の回転量に依存する。小さな基質は、励起された時点と蛍光を発した時点との間に、大きな基質よりも多く回転する。小さな蛍光標識基質は高速に回転し、放射光の偏光解消が起こる。大きな蛍光標識基質はよりゆっくりと回転し、偏光を保った放射光がもたらされる。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する化合物は基質の切断を阻害または低減し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して、または化合物の非存在下と比較して基質の回転が低減し、その結果偏光を保った放射光が生じる。ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は基質の切断を亢進し、したがって陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して、または化合物の非存在下と比較して基質の回転が増大し、その結果より多くの放射光が偏光解消する。
光の強度は９０°離れた平面内で測定され、多くの場合水平強度および垂直強度と呼ばれる。一部の機器では、励起フィルターは可動であり、発光フィルターは固定されている。特定の他の機器では、水平強度および垂直強度は光ファイバーによって同時に測定する。研究グレードの蛍光偏光機器がたとえばＰａｎＶｅｒａ、ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。Ａｂｏｔｔは臨床検査機器を提供している。蛍光偏光値は以下の式によって決定される：
偏光＝強度 垂直 −強度 水平
強度垂直＋強度水平
蛍光偏光値はほとんどの場合１０００で割算し、ミリ偏光単位（ｍＰ）として表される。
具体的な実施形態では、それぞれ図１Ｂおよび１Ｃに示したハイブリッド形成したｔＲＮＡ基質または環状に配置された（circularly permitted）ｔＲＮＡ基質を蛍光偏光アッセイにおいて基質として使用し、環状に配置されたｔＲＮＡ基質の５’末端、３’末端または５’および３’末端の両方をフルオロフォアで標識する。
５．５．４ ＦＩＳＨアッセイ
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性は、動物界の細胞または真菌細胞中でｔＲＮＡイントロンの持続性（persistence）および量を検出するアッセイで決定してもよい。ｔＲＮＡイントロンの量は、細胞を化合物とインキュベートした後またはその間の様々な時点で定量する。ｔＲＮＡイントロンは、ｔＲＮＡイントロンに特異的なプローブを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）によって検出することができる。特定の実施形態では、動物界の細胞または真菌細胞を化合物と接触させない対照実験を平行して実施する。
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤の非存在下では、スプライシング反応は速く、細胞中のイントロンの濃度は低い。理論に縛られないが、スプライシングされたイントロンは通常分解されるので、動物界の細胞または真菌細胞中のｔＲＮＡイントロンの濃度は検出閾値より低い。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤が存在する場合には、スプライシング反応が減速し、ｔＲＮＡイントロンの量が増加する。したがって、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを阻害する化合物を、動物界の細胞または真菌細胞中のｔＲＮＡイントロンのレベルを増加させるその能力によって同定することができる。
ＦＩＳＨを実施する方法は当業者に周知であり、本発明で使用することができる。ＦＩＳＨの例示的な方法は、SarkarおよびHopper、1998 (Mol. Biol. Cell、9:3041-3055)（その全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
特定の実施形態では、ハイスループットスクリーニングで動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に対する化合物の効果を決定するためにＦＩＳＨアッセイを用いる。特に、９６レンズの顕微鏡をＦＩＳＨに基づくハイスループットスクリーニングに使用することができる。具体的な実施形態では、９６個の細胞培養物を、それぞれ別個の化合物と共に９６ウェルプレートでインキュベートする。次いで、細胞をｔＲＮＡイントロンに特異的なプローブを用いたＦＩＳＨ解析に供し、９６レンズの顕微鏡を用いて解析する。シグナルの存在、または有意により強いシグナルの存在は、細胞中にｔＲＮＡイントロンが高いレベルで存在し、したがって化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤候補であることを示す。
理論に縛られないが、ＦＩＳＨアッセイは化合物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤として直接同定する。したがって、特定の実施形態では、ｔＲＮＡスプライシングの阻害剤としてＦＩＳＨアッセイで同定された化合物はｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤の明白な候補である。
５．５．５ 他のスクリーニングアッセイ
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性は、対照（好ましくは陰性対照、より好ましくは陰性対照および陽性対照）と比較した、化合物の存在下でエンドヌクレアーゼによって切断されるｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質の量を検出するアッセイによって決定してもよい。このようなアッセイは、化合物を、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの標識基質および無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を促す条件で接触させるかまたはインキュベートするステップと、切断された基質の量を測定するステップとによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質は、当業者に公知の技術を利用して、任意の検出可能な薬剤（それだけには限定されないが、蛍光色素（たとえば、フルオレセインおよび誘導体（たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびオレゴングリーン（商標））、ローダミンおよび誘導体（たとえばテキサスレッド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標））および誘導体など）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅ（商標）などが含まれる）などの分光学的標識、放射性標識（たとえば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなど）、酵素（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、金コロイドや有色ガラスもしくはプラスチック（たとえばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの分光学的有色標識、またはナノ粒子（０．１〜１０００ｎｍの規定寸法を有する無機イオンのナノクラスター）が含まれる）で標識することができる。特定の実施形態では、化合物を、動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの標識基質および無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、もしくはそれ以上接触させるかまたはインキュベートする。切断された基質の量はｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に比例する。切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの量は、当業者に公知のいかなる技術によっても測定することができる。
特定の実施形態では、切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、切断されていないｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質からゲル電気泳動によって分離する。切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質の量は、切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質のシグナルの強度を測定することによって定量することができる。切断されていないｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質に対して、切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質によって生成されるシグナルが強ければ強いほど、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼはより活性である。シグナル強度はオートラジオグラフィーまたはホスホイメージャーを使用して定量することができる。ある化合物の存在下でｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性が低減しているとき、すなわち、その化合物の非存在下または陰性対照の存在下での反応と比較して、切断されたｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質のシグナルが切断されていないｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質に対して低減している場合は、その化合物はｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤として同定される。
他の実施形態では、切断されたｔＲＮＡの量は質量分析を用いて決定する。
５．６ ｔＲＮＡスプライシングリガーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、化合物が動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする能力を同定および／または検証するための様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを包含する。動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対する化合物の効果を評価するために、複数のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを同時にまたは順次、行うことができる。本明細書中に記載の、もしくは当業者に周知の技術を利用して、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに関連する１つもしくは複数の活性を測定し、動物界のおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対する化合物の効果を決定することができる。動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに関連する活性の例には、それだけには限定されないが、キナーゼ活性、環状ホスホジエステラーゼ活性、アデニル酸合成酵素活性、および２’ホスホトランスフェラーゼ活性が含まれる。たとえば、Abelson他、1998、Journal of Biol. Chem.、273(21):2685-88；Belfort他、1997、Cell、89:1003-6；Xu他、1990、Methods in Enzymology、181:463-471；Phizicky他、1986、Journal of Biol. Chem.、261(6):2978-2986；Belford他、1993、Journal of Biological Chem.、268(4):2444-2450；Gomes他、1997、Biochemical and Biophysical Res. Comm.、237:588-94；Greer他、1982、Cell、32:537-46を参照されたい。真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的な活性を測定して、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に明確にまたは特異的に影響を与える化合物を同定することができる。あるいは、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに特異的な活性を測定して、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に明確にまたは特異的に影響を与える化合物を同定することができる。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイをハイスループットの様式で行う。
本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイは、任意の動物界の細胞もしくは真菌細胞または任意の精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを利用して実施することができる。具体的な実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼは哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングリガーゼである（たとえば非ヒト哺乳動物のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよびヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）。好ましい実施形態ではｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼはヒトのｔＲＮＡスプライシングリガーゼである。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用する真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼは酵母のｔＲＮＡスプライシングリガーゼである。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用するｔＲＮＡスプライシングリガーゼの種類は、アッセイを実施する目的に応じて変わる。
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする（たとえば低減または増強する）化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質、たとえばｔＲＮＡ半分子を、化合物または化合物ライブラリのメンバーおよび、成熟ｔＲＮＡ分子の集団を生じるのに十分な量の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと接触させるステップと、（ｂ）成熟ｔＲＮＡ分子の形成を測定するステップであって、化合物の存在下で生じる成熟ｔＲＮＡ分子の量が、事前に決定した基準範囲と比較して、または対照（たとえばリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」））の存在下もしくは化合物の非存在下と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を包含する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物は、生じる成熟ｔＲＮＡ分子の量を増大させる。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物は、生じる成熟ｔＲＮＡ分子の量を低減させる。成熟ｔＲＮＡ分子の形成または発生は、それだけには限定されないが、電気泳動を含めた当業者に周知の技術を利用して測定することができる。一部の実施形態では、ｔＲＮＡリガーゼは粗抽出物由来である。他の実施形態では、ｔＲＮＡリガーゼは、当業者に公知の、または本明細書中に記載の標準的な方法によって均一にまで精製された組換えｔＲＮＡリガーゼである（たとえば、Xu他、1990、Methods in Enzymology、181:463-71；Phyizicky他、1986、Journal of Biol. Chem.、261(6):2978-86参照）。
本発明はまた、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする（たとえば低減または増強する）化合物の同定方法であって、（ａ）動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を、基質を切断してｔＲＮＡ半分子を生じるのに十分な量の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、（ｂ）ｔＲＮＡ半分子を、化合物または化合物ライブラリのメンバーおよび、成熟ｔＲＮＡ分子の集団を生じるのに十分な量の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと接触させるステップと、（ｃ）成熟ｔＲＮＡ分子の形成を測定するステップであって、前記化合物の存在下で生じる成熟ｔＲＮＡ分子の量が、事前に決定した基準範囲と比較して、または対照（たとえばリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」））の存在下もしくは化合物の非存在下で変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物が同定されるステップとを含む方法を包含する。
本発明は、当業者に周知のポリヌクレオチドキナーゼアッセイを利用した、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法を包含する。いかなる作用機構に縛られることも意図しないが、このアッセイは動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼがＡＴＰのｇ−リン酸を様々なポリヌクレオチドへと転移させる能力に基づいている。ポリヌクレオチドキナーゼ活性を測定する１つの例示的なアッセイは、たとえば６００ヌクレオチド長のポリ（Ａ）ヌクレオチドを提供するステップと、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを提供するステップと、化合物ライブラリと共に事前にインキュベートしたかまたはしていない、十分な量の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを、たとえばＤＴＴおよびＭｇＣｌ２を含む緩衝液を含めた適切な緩衝液中で提供するステップと、反応物質を１５分間３７℃でインキュベートするステップと、反応物をフェノールクロロホルム抽出するステップと、水相にウシ血清アルブミンおよび冷トリクロロ酢酸を加えるステップと、遠心分離によって不溶性物質を回収するステップと、冷トリクロロ酢酸およびピロリン酸ナトリウムを加えるステップと、ガラス繊維フィルターで酸不溶性物質を回収するステップと、ガラスフィルター上の放射活性を測定するステップであって、測定される放射活性の量がｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性に比例するステップとを含み得る。化合物がｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性を阻害または低減するときは、測定される放射活性の量は、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下において測定される放射活性の量と比較して低減する。他方で、化合物がｔＲＮＡスプライシングリガーゼのキナーゼ活性を増大させるときには、測定される放射活性の量は、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下において測定される放射活性と比較して低減する。ポリヌクレオチドキナーゼアッセイは当分野で周知である。たとえば、Xu他、1990、Methods in Enzymology、181:463-471；Phizicky他、1986、Journal of Biol. Chem.、261(6):2978-2986；Pick他、1986、J. Biol. Chem.、261:6684を参照されたい。
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの環状ホスホジエステラーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法を包含する。環状ホスホジエステラーゼ活性を測定するための当業者に公知のいかなるアッセイも本発明の範囲内に含まれる。たとえば、Phizicky他、1986、Journal of Biol. Chem.、261(6):2978-2986；Greer他、1983、Cell、537（これらの両方は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。環状ホスホジエステラーゼ活性を測定するための１つの例示的なアッセイは、Xu他(1990、Methods in Enzymology、181:463-471)に記載の初期のプロトコルに基づいており、該アッセイは、アッセイの基質、たとえば３’末端環状リン酸を３２Ｐで標識したＵｎＧ＞Ｐを、動物界または真菌のｔＲＮＡリガーゼと３０℃で２０分間インキュベートするステップと、沸騰およびリボヌクレアーゼＡの添加によって反応を停止させるステップと、反応混合物をセルロースプレート上で分析するステップとを含む。ｃＧＭＰおよび２’−ＧＭＰの量は、薄層プレートからスポットを切り出してシンチレーションカウンターでカウントすることによって定量する。このアッセイは、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの環状ホスホジエステラーゼ活性に対する化合物の効果を評価するために、化合物が存在する場合および存在しない場合においてに実施し得る。さらに、ＡＭＰのｔＲＮＡスプライシングリガーゼへの共有結合による付加は、タンパク質を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＤＴＴ、およびｔＲＮＡリガーゼを含む反応混合物中で［３２Ｐ−ＡＴＰ］とインキュベートすることによって実証することができる。３０℃で１０分間インキュベートしたあと、等体積の１２５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、１．５％ ＳＤＳ、１３５ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール、２０％ グリセロールおよび０．１％ ブロモフェノールブルーを加え、混合物を沸騰させ、アデニル化されたタンパク質の存在を同定するためにＳＤＳゲル上の移動度に基づいて解析する。
５．６．１ ＦＲＥＴに基づくアッセイ
本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性の変化を検出するための「ＦＲＥＴ」に基づくアッセイを包含する。本発明は、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質がフルオロフォアで標識されているＦＲＥＴに基づくアッセイを包含する。
５．６．１．１ ＦＲＥＴ標識した基質
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するためのＦＲＥＴ無細胞系アッセイであって、５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を含む動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、無細胞抽出物（好ましくは動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、一方の集団がフルオロフォアで標識され、他方の集団がクエンチャーで標識されるようにｔＲＮＡ半分子の各集団の末端を標識するステップと、基質の蛍光を測定するステップとを含むアッセイを包含する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはｔＲＮＡ半分子を結合し、その結果蛍光シグナルの損失がもたらされる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下と比較して検出可能な蛍光シグナルを維持または増大する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下におけるシグナルと比較して検出可能な蛍光シグナルを低減する。
動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質は、当業者に公知のいかなる方法によっても標識することができる。特定の実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質は、フルオロフォアを用いたＲＮＡの部位特異的な標識化を使用して標識することができる。より具体的な実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質は、QinおよびPyle、1999 (Methods、18(1):60-70)（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の方法を使用して標識する。動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を標識するための最適なプロトコルは、日常的な実験を用いて当業者が決定することができる。具体的な実施形態では、当業者に公知のＲＮＡ標識スキームを用いて５’ｔＲＮＡ半分子の５’末端を標識する。別の具体的な実施形態では、当業者に公知のＲＮＡ標識スキームを用いて３’ｔＲＮＡ半分子の３’末端を標識する。ライゲーション部位が標識されないように標識部位を選択することは、当業者には理解されよう。さらに、日常的な実験によって、使用する標識に応じて当業者に公知の一般的な方法を用いて標識の検出感度を増強してもよい。
具体的な実施形態では、異なる方法、異なる標識および／またはｔＲＮＡ基質中の異なる標識位置を用いて動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を標識する。その後、異なる標識を行った基質を個別に、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの阻害剤または活性化剤をそれぞれ存在させた場合および存在させない場合においてスプライシングアッセイに供する。スクリーニングアッセイのための最適な標識は、最も容易に検出可能であり、阻害剤または活性化剤の効果の最も再現性のある検出を可能にする標識である。しかし、他の標識方法も、特にそれらが他の望ましい利点を提供する場合は本発明の方法で使用し得る。
本発明はまた、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するためのＦＲＥＴ無細胞系アッセイであって、５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を含む動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ抽出物）または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、一方の集団の末端が蛍光ドナー部分で標識され、かつ他方の集団の末端が蛍光アクセプター部分で標識されるステップと、蛍光ドナー部分の波長での基質の蛍光を測定するステップとを含むアッセイを包含する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはｔＲＮＡ半分子と結合し、その結果、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光がもたらされる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下における蛍光発光と比較して、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって、前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下における蛍光発光と比較して、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が維持されるかまたは増大する。
５．６．１．２ ＦＲＥＴ標識酵素
ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、フルオロフォアで標識したｔＲＮＡスプライシングリガーゼ（たとえば動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）およびクエンチャーで標識したｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼと基質との複合体の形成を促す条件下で化合物とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと（リガーゼは基質に対して高い親和性を有すると考えられるので、安定した複合体が形成されるであろう）、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によってｔＲＮＡスプライシングリガーゼの蛍光を測定するステップによって実施し得る。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼと基質との複合体の形成は、検出可能な蛍光の低減をもたらす。複合体の形成を阻害または低減する化合物は、化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下と比較して検出可能な蛍光シグナルの生成を増大する。複合体の形成を増大する化合物は、化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して検出可能な蛍光シグナルを低減または阻害する。
あるいは、ＦＲＥＴ無細胞系アッセイは、蛍光ドナー部分で標識したｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび蛍光アクセプター部分で標識したｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼと基質との複合体の形成を促す条件下で化合物とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、たとえばＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によってｔＲＮＡスプライシングリガーゼの蛍光を測定するステップとによって実施し得る。複合体の形成は、蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる蛍光ドナー部分の波長での結果検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらす。複合体の形成を阻害または低減する化合物は、化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下と比較して、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光を低減する。複合体の形成を増大する化合物は、化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下と比較して、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光を増大させる。好ましい実施形態では、陰性対照（たとえばＰＢＳまたは基質の切断に影響を与えないことが知られている別の薬剤）および陽性対照（たとえば基質の切断に影響を与えることが知られている薬剤）を本明細書中に記載のＦＲＥＴ無細胞系アッセイに含める。
５．６．２ 蛍光偏光に基づくアッセイ
動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対する化合物の効果は、蛍光偏光に基づくアッセイを用いて決定してもよい。このようなアッセイでは、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの蛍光標識した基質、たとえば蛍光標識したｔＲＮＡ半分子を、精製された動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼならびに化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させ、発蛍光偏光放射を測定する。このアッセイの重要な側面は、このアッセイで使用する基質の大きさが、基質のライゲーションに引き続く放射蛍光偏光の変化を識別するのに十分に大きいことである。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼは基質をライゲーションし、その結果放射偏光の強度の変化がもたらされる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって化合物の非存在下の陰性対照（たとえばＰＢＳ）と比較して基質の回転が増大し、その結果、より大きく偏光解消された光が生じる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって陰性対照または化合物が存在しない場合と比較して基質の回転が低減し、その結果偏光を保った放射光が生じる。
５．６．３ ＦＩＳＨアッセイ
動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性は、２つのｔＲＮＡ半分子から生じた成熟ｔＲＮＡ分子の量を動物界の細胞または真菌細胞中で検出するアッセイで決定してもよい。成熟ｔＲＮＡ分子の量は、細胞を化合物とインキュベートした後またはその間の様々な時点で定量し得る。成熟ｔＲＮＡ分子は、成熟ｔＲＮＡ分子に特異的なプローブを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）によって検出することができる。特定の実施形態では、動物界の細胞もしくは真菌細胞を化合物と接触させないか、または陰性対照（たとえばＰＢＳ）と接触させる対照実験を並行して実施する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの阻害剤が存在しない場合には、リガーゼはｔＲＮＡ半分子を結合して成熟ｔＲＮＡ分子を形成する。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの阻害剤が存在する場合には、リガーゼが減速し、成熟ｔＲＮＡ分子の量が低減する。したがって、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを阻害する化合物は、動物界の細胞または真菌細胞中の成熟ｔＲＮＡ分子のレベルを低減させるその能力によって同定することができる。ＦＩＳＨを実施する方法は当業者に周知であり、本発明に使用することができる。ＦＩＳＨの例示的な方法が、SarkarおよびHopper、1998 (Mol. Biol. Cell、9:3041-3055)（その全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
特定の実施形態では、ハイスループットスクリーニングで動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対する化合物の効果を決定するためにＦＩＳＨアッセイを用いる。特に、９６レンズの顕微鏡をＦＩＳＨに基づくハイスループットスクリーニングに使用することができる。具体的な実施形態では、９６個の細胞培養物を、それぞれ別個の化合物と共に９６ウェルプレートでインキュベートする。次いで、細胞を成熟ｔＲＮＡ分子に特異的なプローブを用いたＦＩＳＨ解析に供し、９６レンズの顕微鏡を用いて解析する。検出されたシグナルの低減は、成熟ｔＲＮＡ分子がより低いレベルで細胞中に存在し、したがって該化合物がｔＲＮＡスプライシングリガーゼの阻害剤候補であることを示す。
５．６．４ ゲル電気泳動に基づくアッセイ
本発明は、ゲル電気泳動に基づくアッセイを用いて、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対するその効果について化合物を特性決定することを包含する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を測定するためのゲル電気泳動に基づくアッセイは当分野で周知であり、標準的な方法のうち任意のものを本発明の方法を組み合わせて使用することができる（たとえば、Gomes他、1997、Biochemical and Biophysical Res. Comm.、237(3):588-594参照、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
本発明は、Belford他(1993、Journal of Biological Chem.、268(4):2444-2450)に記載のアッセイに基づいた、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、放射標識したｔＲＮＡ前駆体の基質（たとえば、当業者に公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を使用して調製した放射標識したｔＲＮＡ Ｐｈｅ前駆体（Reyes他、1987、Anal. Biochem、166:90-106、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる））を、十分な量の精製された動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと、ｔＲＮＡ前駆体が切断されるような条件下で接触させるステップと、切断された基質を、化合物または化合物ライブラリのメンバーと共にプレインキュベートした精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと共にインキュベートするステップと、たとえば８Ｍ尿素ゲルまたは１２％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動によってリガーゼ反応の産物を分析し、オートラジオグラフィーによってゲルを可視化するステップとを含む方法を提供する。あるいは、本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、放射標識したｔＲＮＡ前駆体の基質を、十分な量の精製された動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと、ｔＲＮＡ前駆体が切断される条件下で接触させるステップと、切断された基質を、精製された動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーとライゲーションに適切な条件下でインキュベートするステップと、電気泳動、たとえば８Ｍ尿素ゲルまたは１２％ポリアクリルアミドゲルによってリガーゼ反応の産物を分析し、オートラジオグラフィーによってゲルを可視化するステップとを含む方法を提供する。反応産物は、ゲルスライスのたとえば１分当たりのチェレンコフ計数によって定量することができる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物は切断された基質のライゲーションを阻害または低減し、したがって前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下において検出される産物の量と比較して、検出されるリガーゼ反応の産物（すなわち成熟ｔＲＮＡ分子）の量が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物は切断された基質のライゲーションを亢進し、したがって前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下において検出される産物の量と比較して、検出されるリガーゼ反応の産物の量が維持されるかまたは増大する。
本発明は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、無細胞抽出物または精製された動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを、ｔＲＮＡ半分子と、化合物または化合物ライブラリのメンバーの存在下において、半分子のライゲーションを促進するのに十分な条件下で接触させるステップと、たとえば半分子が放射標識されている場合は電気泳動およびオートラジオグラフィーによって、またはたとえば半分子が標識されていない場合はライゲーション産物に特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によってリガーゼ反応の産物を分析するステップとを含む方法を提供する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを阻害または低減し、したがって前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下において検出される産物の量と比較して、検出されるリガーゼ反応の産物の量が低減する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を増強する化合物はｔＲＮＡ半分子のライゲーションを亢進し、したがって前記化合物の非存在下または陰性対照（たとえばＰＢＳ）の存在下において検出されるリガーゼ反応の産物の量を維持または増大させる。
ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対する化合物の効果を評価する目的で、化合物もしくは化合物ライブラリのメンバーが存在する場合または存在しない場合にｔＲＮＡスプライシングリガーゼ反応から形成された産物の量を定性的および定量的に決定するために、ゲル電気泳動に基づくアッセイを用いる。ｔＲＮＡ前駆体分子、成熟ｔＲＮＡ、５’および３’ｔＲＮＡ半分子は異なる電気泳動移動度を有し、電気泳動によって分離し、当業者に公知の標準的な方法を用いて可視化および／または定量し得る。
ｔＲＮＡスプライシングリガーゼ反応の産物を反応物質から分離する方法は、電気泳動分離の任意の方法を含み、該方法としては、それだけには限定されないが、変性および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、尿素ゲル電気泳動、ゲル濾過、パルスフィールドゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、連続フロー電気泳動、ゾーン電気泳動、アガロースゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動が挙げられる。電気泳動分離の他の実施形態には、それだけには限定されないが、尿素ゲル電気泳動、ゲル濾過、パルスフィールドゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、連続フロー電気泳動、ゾーン電気泳動、およびアガロースゲル電気泳動が含まれる。
好ましい実施形態では、複数のキャピラリー管を有するキャピラリーカートリッジを含む自動電気泳動システムを、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に対するその効果について化合物をハイスループットでスクリーニングするために使用する。自動キャピラリーゲル電気泳動を行うための装置は、米国特許第5,885,430号；同第5,916,428号；同第6,027,627号；および同第6,063,251号（これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
米国特許第5,885,430号（その全体が参照により組み込まれる）に開示されている装置により、標準サイズのマイクロタイタートレイから試料を複数のキャピラリー管中へと同時に直接導入することが可能となる。米国特許第5,885,430号は、複数のキャピラリー管を有する、電気泳動を行う毎に洗浄することができる使い捨てのキャピラリーカートリッジを開示している。各キャピラリー管の第１の末端はマウンティングプレート中に保持され、複数の第１の末端が集合してマウンティングプレート中でアレイを形成する。第１の末端間の間隔は、標準サイズのマイクロタイタートレイのウェルの中心間の間隔に対応する。したがって、キャピラリー管の第１の末端をトレイのウェル中に存在する試料に同時に浸すことができる。カートリッジは、キャピラリー管の第２の末端が保持される第２のマウンティングプレートを備える。キャピラリー管の第２の末端はマイクロタイタートレイ中のウェルに対応する配列で配置されており、各末端を個々のウェルに浸す際に、各キャピラリー管をその隣接する管から隔て、したがって相互汚染が起こらないことを可能にする。
各マウンティングプレートにプレート孔を備え、キャピラリー管をこれらのプレート孔を通して挿入してもよい。このような場合、マウンティングプレートの露出したキャピラリー管末端を有する側を加圧できるように、プレート孔をすき間なくシールする。このマウンティングプレートのキャピラリー管開口部周辺に陽圧をかけることによって、電気泳動操作中に空気および流体を導入することが可能となり、また再コンディショニングする際にゲルおよび他の物質をキャピラリー管から押出すためにも使用することができる。キャピラリー管をこれらプレート孔内に配置する際、カニューレおよび／またはプラスチックチューブなどを含む針を用いてこれらを損傷から保護することができる。金属製のカニューレなどを使用する場合は、これらは電気泳動中の電流の電気接点としての役割を果たすことができる。第２のマウンティングプレートの存在下では、第２のマウンティングプレートはキャピラリー管の第２の末端が突出するプレート孔を備える。この場合、第２のマウンティングプレートは圧力セルの圧力保持部材としての役割を果たし、キャピラリー管の第２の末端は圧力セルの内部空間につながっている。圧力セルはまた、注入口および排出口も備える。注入口よりゲル、緩衝溶液、洗浄剤などを内部空間内に導入することができ、これらのそれぞれがキャピラリー管の第２の末端に同時に入ることができる。
別の好ましい実施形態では、自動電気泳動システムは、チャネル設計の一部を小さな連続的に作動する電気泳動要素として用いて酵素反応を実行および分析する、相互接続したチャネルの複雑な設計からなるチップシステムであって、１つの試料の反応がチップの一領域で進み、別の試料の産物の電気泳動分離がチップの別の部分で進むシステムを含むことができる。このようなシステムは、米国特許第5,699,157号；同第5,842,787号；同第5,869,004号；同第5,876,675号；同第5,942,443号；同第5,948,227号；同第6,042,709号；同第6,042,710号；同第6,046,056号；同第6,048,498号；同第6,086,740号；同第6,132,685号；同第6,150,119号；同第6,150,180号；同第6,153,073号；同第6,167,910号；同第6,171,850号；および同第6,186,660号（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されている。
米国特許第5,699,157号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているシステムは、化学、生化学、生物工学、分子生物学および数々の他の分野で応用する対象物質の高速電気泳動分析用の微量流体システムを提供する。このシステムは基材中のチャネル、光源および光受容器を有する。チャネルは、物質がチャネルを通って移動し、分子種に応じてバンドに分離するように溶液中の対象物質を電場中に保持する。光源は各分子種のバンドの蛍光を励起し、光受容器はバンドから蛍光を受け取るように配置されている。このシステムはさらに、光受容器がチャネルに沿って一定間隔にある領域でのみ蛍光を受け取ることができるように、チャネルをマスキングする手段も有する。システムはまた、チャネルに沿ったバンドの速度が決定され、物質の分析が可能となるように、光受容器によって受け取られた光の強度の変調周波数を解析する装置も有する。
米国特許第5,699,157号に開示されているシステムはまた、対象物質の高速電気泳動分析を行う方法であって、溶液中の対象物質を微量流体システムのチャネル中に保持するステップと、対象物質がチャネルを通って移動して各分子種のバンドに分離するように物質を電場に供するステップと、光をチャネルに向けるステップと、チャネルに沿った一定間隔にある領域から光を同時に受け取るステップと、チャネルに沿ったバンドの速度を前記物質の解析のために決定できるように、受け取った光の光強度の周波数を解析するステップとを含む方法も提供する。各分子種のバンドの速度を決定することにより、その分子種の電気泳動移動度およびそれが何であるかが決定される。
米国特許第5,842,787号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）は、一般に、既に記載されているもの（米国特許第5,699,157号に記載の装置など）とは少なくとも部分的に異なる深さを有するチャネルであって、チャネルの深さが、それだけには限定されないが、試料の攪乱の軽減、拡散による非特異的な試料の混合の軽減、および分解能の増大など数々の有益かつ予想外の結果をもたらすチャネルを用いた装置およびシステムに向けられている。
別の実施形態では、電気泳動分離方法はポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む。好ましい実施形態では、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、異なるＲＮＡ分子の移動度を区別するために非変性である。
５．６．５ 直接結合アッセイ
本発明は、動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するための直接結合アッセイを包含する。特に化合物は、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質と動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼとの相互作用を直接もしくは間接的に低減または阻害することによって、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害するものである。このようなアッセイは、国際公開公報WO02／083837および同WO02／083953号（これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。簡単に説明すると、直接結合アッセイは、化合物ライブラリを、それぞれの固体担体の表面に実質上１種の化合物が結合するように固体担体（たとえばポリマービーズ）に結合させることによって実施し得る。ライブラリの複数の固体担体を、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質に水溶液中で曝し、色素標識基質：担体に結合した化合物の複合体を形成させる。基質を特定の化合物に結合させることにより化合物を含む固体担体（たとえばビーズ）が標識され、これは他の未標識の固体担体から物理的に分離することができる。標識した固体担体を同定したあと、担体上の化合物の化学構造は、たとえば結合した化合物の構造に対応する固体担体上のコードを読み取ることによって決定することができる。
あるいは、直接結合アッセイは、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質を、ラベルをつけた試験管もしくはマイクロタイターウェル、またはマイクロアレイ中の溶液中の遊離の化合物ライブラリのメンバーと接触させることによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの標識基質に結合するライブラリ中の化合物は検出可能に標識された複合体を形成し、該複合体は様々な方法（それだけには限定されないが、複合体形成した基質の電気泳動、クロマトグラフィー、もしくは熱安定性特性の変化を区別する方法を含む）によって同定され、かつライブラリ中の複合体形成していない標識化合物、および複合体形成していない未標識の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質から除去することができる。
具体的な実施形態では、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに結合する化合物を同定する。この実施形態によれば、化合物とタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの相互作用を検出するための当業者に周知の任意のアッセイを用いて、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに結合する化合物を同定することができる。たとえば、このアッセイは、化合物ライブラリを、それぞれの固体担体の表面に実質上１種の化合物が結合するように、固体担体（たとえばポリマービーズ）に結合させることによって実施することができる。ライブラリの複数の固体担体を、検出可能な標識を有する動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに水溶液中で曝し、色素標識エンドヌクレアーゼ：担体に結合した化合物の複合体を形成させる。リガーゼを特定の化合物に結合させることにより化合物を含む固体担体（たとえばビーズ）が標識され、これは他の未標識の固体担体から物理的に分離することができる。標識した固体担体を同定したあと、担体上の化合物の化学構造は、たとえば結合した化合物の構造に対応する固体担体上のコードを読み取ることによって決定することができる。
あるいは、このアッセイは、動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを、ラベルをつけた試験管もしくはマイクロタイターウェル、またはマイクロアレイ中の溶液中の遊離の標識化合物のライブラリのメンバーと接触させることによって実施し得る。動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに結合するライブラリ中の化合物は検出可能に標識された複合体を形成し、様々な方法によって同定され、かつライブラリ中の複合体形成していない標識化合物、および複合体形成していない未標識の動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼから除去することができる。
５．６．６ 他のスクリーニングアッセイ
動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性は、対照（好ましくは陰性対照、より好ましくは陰性対照および陽性対照）と比較して、ある化合物の存在下においてライゲーションして成熟ｔＲＮＡになるｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質の量が検出されるアッセイで決定してもよい。このようなアッセイは、化合物を、動物界および／もしくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼの標識基質ならびに無細胞抽出物または精製された動物界および／もしくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼと、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を助ける条件下で接触させるかあるいはインキュベートするステップと、産生される成熟ｔＲＮＡの量を測定するステップとによって実施し得る。
動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質は、当業者に公知のいかなる検出可能な薬剤でも標識することができる。本発明において有用な標識は上記のとおりである。
特定の実施形態では、化合物を、動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの標識基質ならびに無細胞抽出物または精製された動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、またはそれ以上接触させるあるいはインキュベートする。産生される成熟ｔＲＮＡの量（たとえばｔＲＮＡ半分子の減少）はｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性に比例する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼによって産生される成熟ｔＲＮＡの量は当業者に公知のいずれの技術によっても測定することができる。
特定の実施形態では、ライゲーション産物（たとえば成熟ｔＲＮＡ）を、ライゲーションされていないｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質（たとえば５’および３’ｔＲＮＡ半分子）から、ゲル電気泳動によって分離する。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼによって形成された成熟ｔＲＮＡの量は、ｔＲＮＡ半分子のシグナル強度と比較した、産生された成熟ｔＲＮＡのシグナルの強度を測定することによって定量することができる。成熟ｔＲＮＡによって生成されたシグナルが強ければ強いほど、かつｔＲＮＡ半分子のシグナルが弱ければ弱いほど、ｔＲＮＡスプライシングリガーゼはより活性である。シグナル強度はオートラジオグラフィーまたはホスホイメージャーを用いて定量することができる。ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性がある化合物の存在下において低減している、すなわち、その化合物の非存在下または陰性対照の存在下での反応と比較して、成熟ｔＲＮＡのシグナルがｔＲＮＡ半分子に対して低減している場合は、その化合物はｔＲＮＡスプライシングリガーゼの阻害剤として同定される。他の実施形態では、成熟ｔＲＮＡの量は質量分析を用いて決定する。
５．７ 化合物の構造の特性決定
本発明の方法を利用して同定される化合物の構造は、当業者に公知の任意の方法または本明細書中に記載の方法を用いて決定し得る。同定された化合物の種類に応じて、化合物の構造を決定する最適な方法を使用すること、たとえば、本発明の方法を用いて同定した化合物が６０ＫＤａより大きい分子量を有するポリペプチドである場合、ＮＭＲよりもＸ線結晶構造解析を用いて構造を決定することが好ましいことは、当業者には理解されるであろう。
ライブラリが化合物のアレイまたはマイクロアレイを含み、各化合物がアドレスまたは識別子を有する場合は、たとえば陽性試料を、個々の試験アッセイに適用した当初の化合物リストと相互参照することによって化合物をデコンボリューションすることができる。
ライブラリがペプチドまたは核酸ライブラリである場合は、ペプチドまたは核酸の直接配列決定を行うことによって化合物の配列を決定することができる。このような方法は当業者に周知である。
標的ＲＮＡに結合した化合物の新たな特性決定を行うためにいくつかの物理化学的技法を使用することができる。このような技法の例としては、それだけには限定されないが、質量分析、ＮＭＲ分光分析、Ｘ線結晶構造解析および振動分光分析が挙げられる。
５．７．１ 質量分析
化合物の構造を解明するために、質量分析（たとえばエレクトロスプレーイオン化法（「ＥＳＩ」）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（「ＭＡＬＤＩ」）、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴法（「ＦＴ−ＩＣＲ」））を使用することができる。
ＭＡＬＤＩではイオンの脱離用のパルスレーザーおよび飛行時間解析器を用い、これは非共有的なｔＲＮＡ：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の複合体を検出するために使用されている（Gruic-Sovulj他、1997、J. Biol. Chem.、272:32084-32091）。しかし、非共有結合した複合体はＭＡＬＤＩプロセス中に分解し得るので、検出には標的核酸と化合物との共有的な架橋結合が必要である。
ＥＳＩ質量分析（「ＥＳＩ−ＭＳ」）は、ＭＡＬＤＩプロセスとは異なり、断片化がほとんどないか、まったくない分子イオンを生じるので、ＥＳＩ−ＭＳは非共有的な分子相互作用を研究するためにより高い有用性を有している（Xavier他、2000、Trends Biotechnol.、18(8):349-356）。ＥＳＩ−ＭＳは、ＨＩＶ Ｔａｔペプチドおよびタンパク質とＴＡＲ ＲＮＡによって形成される複合体を研究するために使用されている（Sannes-Lowery他、1997、Anal. Chem.、69:5130-5135）。
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（「ＦＴ−ＩＣＲ」）質量分析は、高分解能のスペクトル、同位元素に分解した（isotope-resolved）前駆体イオンの選択、および正確な質量の割り当てをもたらす（Xavier他、2000、Trends Biotechnol.、18(8):349-356）。ＦＴ−ＩＣＲは、アミノグリコシド抗生物質と同族および非同族ＲＮＡとの相互作用の研究に用いられている（Hofstadler他、1999、Anal. Chem.、71:3436-3440；およびGriffey他、1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:10129-10133）。本明細書中に記載したすべての質量分析方法にも当てはまるように、ＦＴ−ＩＣＲでは化合物の標識化を必要としない。
質量分析の利点は、化合物の構造を解明することだけでなく、ＲＮＡに結合した化合物の構造を決定することにもある。このような情報は、ＲＮＡに特異的に結合する化合物のコンセンサス構造の発見を可能にすることができる。
５．７．２ ＮＭＲ分光測定
ＮＭＲ分光分析は、化学シフトの変化を定性的に決定することにより、具体的には緩和効果を用いて測定した距離から決定することによって、複合体形成した標的核酸を同定する有益な技術であり、ＮＭＲに基づく手法は、タンパク質薬物標的の小分子結合体の同定に用いられている（Xavier他、2000、Trends Biotechnol.、18(8):349-356）。ＮＭＲによる構造−活性関係（「ＳＡＲ」）の決定は、隣接するサブサイトに結合する小分子が標的タンパク質の二次元１Ｈ−１５Ｎスペクトルによって同定される、ＮＭＲについて記載された最初の方法である（Shuker他、1996、Science、274:1531-1534）。線幅拡大、転移核ＮＯＥおよびパルスフィールド勾配拡散測定により結合分子からのシグナルをモニターする（Moore、1999、Curr. Opin. Biotechnol.、10:54-58）。小分子のライブラリを用いたＮＭＲによるリード（lead）作製の戦略が最近記載されている（Fejzo他、1999、Chem. Biol.、6:755-769）。
化合物の構造を解明するためにＮＭＲによるＳＡＲを用いることができる。
上述のように、ＮＭＲ分光分析は、化学シフトの変化を定性的に決定することにより、具体的には緩和効果を用いて測定した距離から決定することによって標的核酸中の結合部位を同定する技術である。本発明で用いることができるＮＭＲの例としては、それだけには限定されないが、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ、相関分光法（「ＣＯＳＹ」）、および核オーバーハウザー効果（「ＮＯＥ」）分光分析が挙げられる。化合物の構造決定を行うためのこのような方法は当業者に周知である。
質量分析と同様に、ＮＭＲの利点は化合物の構造を解明することだけでなく、ＲＮＡに結合した化合物の構造を決定することにもある。このような情報は、ＲＮＡに特異的に結合する化合物のコンセンサス構造の発見を可能にすることができる。
５．７．３ Ｘ線結晶構造解析
化合物の構造を解明するためにＸ線結晶構造解析を用いることができる。Ｘ線結晶構造解析の総説としては、たとえばBlundell他、2002、Nat Rev Drug Discov、1(1):45-54を参照されたい。Ｘ線結晶構造解析の第１のステップは結晶の形成である。結晶の形成は、高度に精製された可溶性のある試料の調製から始まる。その後、核形成を誘導することが知られているいくつかの溶液の可変因子（ｐＨ、イオン強度、温度、ならびに有機添加物、塩および界面活性剤の比濃度など）を最適化することによって、結晶化の条件を決定する。高品質のタンパク質結晶の生成を自動化するために、結晶化プロセスを自動化する技術が開発されている。結晶が形成されたあと、データ収集のために結晶が回収され、準備される。その後、回析によって結晶を解析する（多軸回析計（multi-circle diffractometer）、高速ＣＣＤ検出器、および検出器オフセットなど）。一般に、構造を決定するには複数の結晶をスクリーニングする必要がある。
５．７．４ 振動分光分析
化合物の構造を解明するために振動分光分析（たとえば赤外線（ＩＲ）分光分析やラマン分光分析）を用いることができる。
赤外線分光分析では、量子力学的な選択規則（光の吸収により分子の電気双極子モーメントの変化が引き起こされることを必要とする）に従った振動モードの励起の結果、化合物により吸収される赤外光（１００〜１０，０００ｎｍの波長）の周波数を測定する。いかなる分子の赤外線スペクトルも、任意の化合物を同定するための分子指紋（molecular fingerprint）とみなすことができる、様々な強度の吸収波長の独特なパターンである。
赤外線スペクトルは、標準的な強度（ダブルビーム機器）または事前に測定した（「ブランク」）強度（シングルビーム機器）と比較して、化合物による、光の個々の周波数（混合周波数の赤外線光源から周波数を分離する回折格子により生成した）の吸収を測定することによって、走査モードで測定することができる。好ましい実施形態では、赤外線スペクトルを、すべての赤外光周波数の混合光線（干渉計によって生成する）を化合物に通すかまたは化合物に反射させるパルスモード（「ＦＴ−ＩＲ」）で測定する。その結果生じる干渉写真は、シグナル強度を増大させ、電気シグナル中のランダムノイズを平均化するために後続のパルスから生じる干渉写真と合わせても合わせなくてもよいが、フーリエ変換または高速フーリエ変換アルゴリズムを用いてスペクトルへと数学的に変換される。
ラマン分光分析では、入射光線に対する、散乱可視光または紫外光の赤外線周波数の吸収による周波数の差を測定する。通常は単一レーザー周波数である入射単色光線は、正確には化合物に吸収されるわけではなく、過渡的に電場と相互作用する。試料から散乱される光の大部分は無変化であるが（レイリー散乱）、散乱光の一部は入射周波数および分子振動周波数の和または差である周波数を有する。ラマン（非弾性）散乱の選択規則には分子の分極率の変化が必要である。一部の振動遷移は赤外線およびラマン分光測定のどちらでも観察可能であるが、多くの場合はどちらか一方の技法でのみ観察可能である。いかなる分子のラマンスペクトルも、任意の化合物を同定するための分子指紋とみなすことができる、様々な強度の吸収波長の独特なパターンである。
ラマンスペクトルは、単色光を試料に対して、それに通すか好ましくは反射させ、レイリー散乱光をフィルタリングし、かつラマン散乱光の周波数を検出することによって測定する。改良されたラマン分光計が、Fink他の米国特許第5,786,893号（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
振動顕微鏡観察は、可視顕微鏡および分光計を組み込むことによって、単一ビーズを扱うために空間的に分解された様式で測定することができる。顕微鏡赤外線分光計は、Reffiner他の米国特許第5,581,085号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。試料の顕微鏡赤外線解析および顕微鏡ラマン解析を同時に行う機器が、Sostek他の米国特許第5,841,139号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
本方法の一実施形態では、それだけには限定されないが、Fenniri他、2000、J. Am. Chem. Soc.、123:8151-8152に記載のものを含めた方法によって、生じる各ビーズが振動（ＩＲまたはラマン）スペクトル中の吸収線の特徴的なパターンを有するように化学修飾したスチレンモノマーを塗布したポリスチレンビーズ上で化合物を合成する。当業者に公知の分割−プール合成方法を用いて、ビーズの分光学的パターンがビーズ上の化合物の構成要素のうち１つを同定するように化合物ライブラリを調製する。標的ＲＮＡを結合するその能力に応じて分離されたビーズは、その振動スペクトルによって同定することができる。本方法の一実施形態では、合成中のビーズの適切なソーティングおよびビンニングが、任意の１個のビーズ上の化合物の１つまたは複数のさらなる構成要素の同定を可能にする。本方法の別の実施形態では、合成中のさらなるソーティングの補助を用いてまたは用いずにビーズの分光学的パターンを使用し、次いで塗布したビーズおよび合成中の適切なソーティングに助けられた、可能性のある化合物の部分的な再合成を行うことによって、ビーズ上の化合物の部分的な同定が可能である。
別の実施形態では、好ましくは化合物がビーズ上にあるうちに、またはそれだけには限定されないが光化学、酸、もしくは熱処理を含めた方法を用いてビーズから切断したあとに、化合物のＩＲまたはラマンスペクトルを検査する。化合物は、ＩＲまたはラマンスペクトルのパターンを、コンビナトリアルライブラリ中の各化合物について事前に得られたスペクトルと比較することによって同定することができる。
５．８ 二次アッセイ
動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする、上述のアッセイで同定される化合物（利便上、本明細書中で「リード」（lead）化合物と呼ぶ）は、ＲＮＡへの直接結合および生物活性のどちらについてもさらに試験することができる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび／または動物モデルで生物活性について化合物を試験する。別の実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼならびに動物界の細胞増殖に対するその効果についてリード化合物を評価する。別の実施形態では、リード化合物を、同属種または類似体を設計するために用いる。別の実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼならびに真菌の繁殖に対するその効果についてリード化合物を評価する。さらに別の実施形態では、リード化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の１つまたは複数の成分（たとえば酵素）の活性をモジュレートする機構を評価するために、突然変異誘発の研究を実施することができる。
５．８．１ リード化合物の特異性
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼなどの動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば酵素）に対する化合物の特異性は、真菌細胞、真菌無細胞抽出物、または真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の精製された真菌の酵素（たとえば精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）を利用した、セクション５．４、５．５および５．６に記載の１つもしくは複数のアッセイを実施することによって決定することができる。真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼなどの真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば酵素）に対する化合物の特異性は、動物界の細胞、動物界の無細胞抽出物、または動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の精製された動物界の酵素（たとえば精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは精製されたｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）を利用した、セクション５．４、５．５および５．６に記載の１つもしくは複数のアッセイを実施することによって決定することができる。動物界のｔＲＮＡスプライシング経路および真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の両者の構成要素（たとえば酵素）に影響を与える化合物は、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状、および／または増殖性疾患に罹患している患者における真菌感染症の予防、治療、管理または寛解に使用し得る。真菌のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば酵素）のみに影響を与える化合物は、真菌感染症またはそれに関連する症状もしくは病状の予防、治療、管理または寛解に使用し得る。動物界のｔＲＮＡスプライシング経路の構成要素（たとえば酵素）のみに影響を与える化合物は、増殖性疾患またはそれに関連する症状もしくは病状の予防、治療、管理または寛解に使用し得る。
５．８．２ 抗増殖性アッセイ
上述のアッセイで同定した化合物（利便上、本明細書中で「リード」化合物と呼ぶ）は、それだけには限定されないが、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび機能的リードアウトシステム（functional readout system）に連結したｔＲＮＡスプライシングリガーゼをはじめとする動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素を含むか、または含むよう遺伝子操作した宿主細胞を用いて、生物活性について試験することができる。たとえば、リード化合物が存在する場合および存在しない場合における動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の活性を評価するために、表現型的または生理学的なリードアウト（readout）を使用することができる。
一実施形態では、リード化合物が存在する場合および存在しない場合における動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素の活性を評価するために、表現型的または生理学的なリードアウトを使用することができる。動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素が、動物界のｔＲＮＡスプライシング酵素が内在的に発現される細胞で過剰発現されてもよい。リード化合物の効果は、標的細胞の細胞成長または生存度を測定することによってアッセイすることができる。このようなアッセイは、特定の増殖性疾患に関与している細胞種の代表的な細胞を用いて実施することができる。接触させた細胞の増殖または生存のレベルがより低いことは、リード化合物が無制御の細胞増殖を特徴とする患者の状態の治療に有効であることを示す。あるいは、患者由来の細胞を培養する代わりに、腫瘍もしくは悪性細胞株または内皮細胞株の細胞を用いてリード化合物のスクリーニングを行ってもよい。細胞培養物モデルの具体例としては、それだけには限定されないが、肺癌に対する原発性ラット肺腫瘍細胞（Swafford他、1997、Mol. Cell. Biol.、17:1366-1374）および大細胞未分化癌細胞株（Mabry他、1991、Cancer Cells、3:53-58）；結腸癌に対する結腸直腸細胞株（ParkおよびGazdar、1996、J. Cell Biochem.、Suppl. 24:131-141）；乳癌に対する複数の確立された細胞株（Hambly他、1997、Breast Cancer Res. Treat.、43:247-258；Gierthy他、1997、Chemosphere、34:1495-1505；PrasadおよびChurch、1997、Biochem. Biophys. Res. Commun.、232:14-19）；前立腺癌に対するいくつかの十分に確立された細胞モデル（Webber他、1996、Prostate、第1部、29:386-394；第2部、30:58-64；および第3部、30:136-142；Boulikas、1997、Anticancer Res.、17:1471-1505）；泌尿生殖器癌に対する一連のヒト膀胱癌細胞株（Ribeiro他、1997、Int. J. Radiat. Biol.、72:11-20）；移行細胞癌の器官培養物（Booth他、1997、Lab Invest.、76:843-857）およびラット進行モデル（Vet他、1997、Biochim. Biophys Acta、1360:39-44）；ならびに白血病およびリンパ腫に対する確立された細胞株（Drexler、1994、Leuk. Res.、18:919-927、Tohyama、1997、Int. J. Hematol.、65:309-317）が挙げられる。
リード化合物に曝したあとに患者細胞もしくは細胞株の生存および／または成長を評価するために、当分野で周知の多くのアッセイを使用することができる。たとえば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒＤＵ）の取り込み（たとえば、Hoshino他、1986、Int. J. Cancer、38、369；Campana他、1988、J. Immunol. Meth.、107:79参照）または（３Ｈ）−チミジンの取り込み（たとえば、Chen, J.、1996、Oncogene、13:1395-403；Jeoung, J.、1995、J. Biol. Chem.、270:18367-73参照）を測定することによって、細胞を直接計数することによって、およびプロトオンコジーン（たとえばｆｏｓ、ｍｙｃ）や細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、サイクリンＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）のような既知の遺伝子の転写、翻訳もしくは活性の変化を検出することによってアッセイすることができる。このようなタンパク質およびｍＲＮＡのレベルならびに活性は、当分野で周知のいずれの方法によっても決定することができる。たとえば、タンパク質は、市販されている抗体を用いたウエスタンブロットまたは免疫沈降などの既知の免疫診断的方法によって定量することができる。ｍＲＮＡは、たとえばノーザン分析、ＲＮａｓｅプロテクション、および逆転写と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応を用いた当分野で周知かつ日常的な方法を用いて定量することができる。細胞の生存度は、トリパンブルー染色または当分野で公知の他の細胞死もしくは生存度マーカーを用いて評価することができる。具体的な実施形態では、細胞の生存度を決定するために細胞のＡＴＰのレベルを測定する。分化は、たとえば形態の変化に基づいて視覚的に評価することができる。
リード化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の形質転換（または悪性表現型への進行）を阻害するその能力についても評価することができる。この実施形態では、形質転換細胞表現型を有する細胞をリード化合物と接触させ、形質転換表現型に関連する特徴（ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍化能力に関連するｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴のセット）の変化について検査し、そのような変化としてはたとえば、それだけには限定されないが、軟寒天中でのコロニー形成、より円形の細胞形態、基層へのより緩やかな付着、接触阻止の損失、足場依存性の損失、プラスミノーゲンアクチベーターなどのプロテアーゼの放出、糖輸送の増大、血清要求の低減、または胎児性抗原の発現などが挙げられる（Luria他、1978、General Virology、第3版、John Wiley & Sons、New York、436-446ページ参照）。
侵襲性の損失または接着力の低下も、リード化合物の抗癌効果を実証するために評価することができる。たとえば、転移癌形成の一態様は、前癌細胞または癌細胞が疾患の原発部位から剥離し、続発部位で新規増殖コロニーを確立する能力である。細胞が末梢部位に浸潤する能力は、その細胞の癌状態の潜在性を反映している。侵襲性の損失は、たとえばＥ−カドヘリン媒介性の細胞−細胞接着の誘導を含めた当分野で公知の様々な技法によって測定することができる。このようなＥ−カドヘリン媒介性の接着は、表現型の逆転および侵襲性の損失をもたらすことが可能である（Hordijk他、1997、Science、278:1464-66）。
侵襲性の損失は、細胞遊走の阻害によってさらに検査することができる。様々な２次元および３次元の細胞マトリックスが市販されている（Calbiochem-Novabiochem Corp.、San Diego、CA）。マトリックスを通過するかまたはその中に向かう細胞遊走は、顕微鏡観察、経時的写真撮影もしくは動画撮影を用いて、または細胞遊走の測定を可能にする当分野の任意の方法によって検査することができる。関連する実施形態では、侵襲性の損失は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する応答によって検査する。ＨＧＦ誘導細胞散乱は、マディンダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞などの細胞の侵襲性と相関する。このアッセイでは、ＨＧＦに応答した細胞の散乱活性を失った細胞集団を同定する（Hordijk他、1997、Science、278:1464-66）。
あるいは、侵襲性の損失は、化学走性チャンバ（Neuroprobe/Precision Biochemicals Inc.、Vancouver、BC）を通る細胞遊走によって測定することができる。このようなアッセイでは、化学誘引性物質をチャンバの片側（たとえば下のチャンバ）でインキュベートし、反対側（たとえば上のチャンバ）を分離しているフィルター上に細胞を蒔く。細胞が上のチャンバから下のチャンバへと渡るためには、細胞はフィルター中の小さな孔を通って能動的に遊走しなければならない。その後、遊走した細胞数のチェッカーボード解析を侵襲性と相関させることができる（たとえばOhnishi, T.、1993、Biochem. Biophys. Res. Commun.、193:518-25参照）。
具体的な実施形態では、正常な動物界の細胞（すなわち異常増殖していない細胞；癌細胞や癌細胞株ではない）に対するリード化合物の効果と、異常増殖している異常細胞（たとえば癌細胞や癌細胞株）の増殖に対するリード化合物の効果を比べる。異常増殖している細胞（たとえば形質転換した悪性細胞または細胞株）を選択的に阻害し、かつ正常な細胞成長および代謝に影響しない化合物は、好ましくは増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の治療、予防、管理または寛解において抗増殖性化合物として利用する。
５．８．３ 動物モデルおよび毒性研究
本明細書中に記載のアッセイで同定されるリード化合物は、増殖性疾患の動物モデルを用いて生物活性について試験することができる。これらには、トランスジェニックマウスなどの、機能的リードアウトシステムと組み合わせた動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび／または動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼを含むよう遺伝子操作した動物が含まれる。このような動物モデル系としては、それだけには限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。本発明の具体的な実施形態では、本発明の方法によって同定される化合物をマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は、ＳＣＩＤマウスモデルやトランスジェニックマウスなどのように、当業者に慣用され、かつ周知である。
本発明によって同定される化合物の抗血管形成活性は、血管新生化した腫瘍の様々な実験動物モデルを用いて決定することができる。本発明によって同定される化合物の抗腫瘍活性は、化合物を動物モデルに投与し、その化合物が前記動物モデル内での癌細胞の増殖または伝播を低減するのに有効であることを立証することによって決定することができる。一般に、ヒト癌の動物モデルの例には、それだけには限定されないがコンパニオン・アニマルの自発性腫瘍が含まれる（たとえばVailおよびMacEwen、2000、Cancer Invest、18(8):781-92参照）。
肺癌の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、ZhangおよびRoth (1994、In Vivo、8(5):755-69)に記載の肺癌動物モデルおよびｐ５３機能が破壊されたトランスジェニックマウスモデル（たとえばMorris他、1998、J La State Med Soc、150(4):179-85参照）が挙げられる。乳癌の動物モデルとしては、それだけには限定されないが、サイクリンＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスが挙げられる（たとえばHosokawa他、2001、Transgenic Res、10(5):471-8参照）。結腸癌の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、ＴＣＲβおよびｐ５３のダブルノックアウトマウスが挙げられる（たとえばKado他、2001、Cancer Res、61(6):2395-8参照）。膵臓癌の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、Ｐａｎｃ０２ネズミ膵臓腺癌の転移性モデル（たとえばWang他、2001、Int J Pancreatol、29(1):37-46参照）および皮下膵臓腫瘍中を発生させたｎｕ−ｎｕマウス（たとえばGhaneh他、2001、Gene Ther、8(3):199-208参照）が挙げられる。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、重症複合型免疫不全（「ＳＣＩＤ」）マウス（たとえばBryant他、2000、Lab Invest、80(4):553-73参照）およびＩｇＨｍｕ−ＨＯＸ１１トランスジェニックマウス（たとえばHough他、1998、Proc Natl Acad Sci USA、95(23):13853-8参照）が挙げられる。食道癌の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、ヒトパピローマウイルス１６Ｅ７型オンコジーンを遺伝子組み換えしたマウスが挙げられる（たとえばHerber他、1996、J. Virol、70(3):1873-81参照）。結腸直腸癌の動物モデルの例としては、それだけには限定されないが、Ａｐｃマウスモデルが挙げられる（たとえば、FoddeおよびSmits、2001、Trends Mol Med、7(8):369-73ならびにKuraguchi他、2000、Oncogene、19(50):5755-63参照）。
本明細書中に記載のアッセイで同定されるリード化合物は、真菌感染症の動物モデルを用いて生物活性について試験することができる。カンジダ感染症、接合菌症、カンジダ乳腺炎、潜在性トリコスポロン血症を伴った進行性播種性トリコスポロン症、播種性カンジダ症、肺パラコクシジオイデス症、肺アスペルギルス症、ニューモシスティスカリニ肺炎、クリプトコッカス髄膜炎、コクシジオイデス症髄膜脳炎および脳脊髄血管炎、アスペルギルスニガー（クロコウジカビ）感染症、フザリウム角膜炎、副鼻腔真菌症、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）心内膜炎、脛骨軟骨形成不全症、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）膣炎、口腔咽頭カンジダ症、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、足白癬、皮膚カンジダ症、真菌性胎盤炎、播種性トリコスポロン症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、真菌性角膜炎、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）感染症、真菌性腹膜炎、クルブラリア・ゲニクラータ（Curvularia geniculata）感染症、ブドウ球菌眼内炎、スポロトリクム症、ならびに皮膚糸状菌症などの真菌感染症の動物モデルが開発されている（たとえば、Arendrup他、2002、Infection、30(5):286-291；Kamie、2001、Mycopathologia、152(1):5-13；Guhad他、200、FEMS Microbiol Lett.、192(1):27-31；Yamagata他、200、J Clin Microbiol.、38(9):32606；Andrutis他、2000、J Clin Microbiol.、38(6):2317-2323；Cock他、2000、Rev Inst Med Trop Sao Paulo、42(2):59-66；Shibuya他、1999、Microb Pathog.、27(3):123-131；Beers他、1999、J Lab Clin Med.、133(5):423-33；Najvar他、1999、Antimicrob Agents Chemother.、43(2):413-414；Williams他、1988、J Infect Dis.、178(4):1217-1221；Yoshida、1988、Kansenshogaku Zasshi、72(6):621-630；Alexandrakis他、1998、Br J Ophthalmol.、82(3):306-11；Chakrabarti他、1997、J Med Vet Mycol.、35(4):295-97；Martin他、1997、Antimicrob Agents Chemother.、41(1):13-16；Chu他、1996、Avian Dis.、40(3):715-19；Fidel他、1996、J Infect Dis.、173(2):425-31；Cole他、1995、FEMS Microbiol Lett.、15；126(2):177-80；Pollock他、1995、Nat Genet.、9(2):202-09；Uchida他、1994、Jpn J Antibiot.、47(10):1407-12；Maebashi他、1994、J Med Vet Mycol.、32(5):349-59；JensenおよびSchonheyder、1993、J Exp Amin Sci.、35(4):155-60；GoksalanおよびAnaissie、1992、Infect Immun.、60(8):3339-44；Kurup他、1992、J Immunol.、148(12):3783-88；Singh他、1990、Mycopatholgia、112(3):127-37；SalkowskiおよびBalish、1990、Infect Immun.、58(10):3300-06；Ahmad他、1985、Am J Kidney Dis.、7(2):153-56；Alture-Werber E、Edberg SC、1985、Mycopathologia、89(2):69-73；Kane他、1981、Antimicrob Agents Chemother.、20(5):595-99；Barbee他、1977、Am J Pathol.、86(1):281-84；ならびにMaestrone他、1973、Am J Vet Res.、34(6):833-36参照）。
本発明によって同定される化合物の毒性および／または有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。本発明によって同定される化合物で、高い治療指数を示すものが好ましい。本発明によって同定される化合物で毒性の副作用を示すものを使用してもよいが、未感染細胞の潜在的な損傷を最小限にし、したがって副作用を低減するために、罹患組織の部位をこのような薬剤の標的とさせる送達系を設計するよう注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するために本発明によって同定される化合物の用量範囲を設定するのに使用することができる。このような薬剤の用量は、毒性をほとんど伴わないか全く伴わないでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用いる剤形および利用する投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いるいかなる薬剤についても、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。動物モデルにおいて、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の最大半値阻害が得られる試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を設定し得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
５．８．４ 抗真菌アッセイ
上述のアッセイで同定される化合物（利便上、本明細書中で「リード」化合物と呼ぶ）は、抗真菌活性について試験することができる。当分野で周知の標準的な抗真菌アッセイのうち任意のものを使用して候補化合物の抗真菌活性を評価することができる。真菌の様々な種に対する抗真菌効果を試験することができる。米国臨床検査標準化委員会（ＮＣＣＬＳ）が推奨する試験（National Committee for Clinical Laboratories Standards、1995、Proposed Standard M27T、Villanova、Pa.（これらのすべてはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい）および当業者に公知の他の方法（Pfaller他、1993、Infectious Dis. Clin. N. Am.、7:435-444）を使用してリード化合物の抗真菌効果を評価することができる。リード化合物の抗真菌活性は、当業者に周知のプロトコルを用いた大量希釈（macrodilution）法および／または微量希釈（microdilution）法を使用して試験することができる（たとえば、Clancy他、1997、Journal of Clinical Microbiology、35(11):2878-82；Ryder他、1998、Antimicrobial Agents and Chemotherapy、42(5):1057-61；米国特許第5,521,153号；同第5,883,120号、同第5,521,169号参照、これらのすべてはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。簡単に説明すると、真菌株を適切な液体培地中で培養し、使用した特定の真菌株に応じた適切な温度で、やはり使用した特定の真菌株に応じた所定の時間、生育させる。その後、光度測定により接種菌を調製し、懸濁液の濁度を標準（たとえばマクファーランド標準）の濁度に合わせる。接種菌の濁度に対するリード化合物の効果を目視または分光光度測定によって決定する。培養物の濁度を決定することによって測定した接種菌の可視的な成長を阻止するリード化合物の最低濃度として定義される、リード化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定する。
リード化合物の抗真菌活性は、当業者に周知の比色アッセイを利用しても決定することができる。リード化合物の抗真菌活性の評価に使用することができる１つの例示的な比色アッセイは、Pfaller他(1994、Journal of Clinical Microbiology、32(8):1993-6、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる；Tiballi他、1995、Journal of Clinical Microbiology、33(4):915-7も参照されたい）に記載されている。このアッセイでは、酸化−還元指示薬（Alamar Biosciences,Inc.、Sacramento CA）を用いた比色終点を使用する。
リード化合物の抗真菌活性は、当業者に周知の光度アッセイを利用しても決定することができる（たとえば、Clancy他、1997、Journal of Clinical Microbiology、35(11):2878-82；Jahn他、1995、Journal of Clinical Microbiology、33(3):661-667参照、これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。光度アッセイは、臭化３−（４，５−ジメチル−２チアゾリル）−２，５，−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＴ）のホルマザンへの還元によって、生存真菌によるミトコンドリア呼吸を定量することに基づいている。このアッセイによって決定されるＭＩＣは、光学密度の最初の急落を伴う試験化合物の最も高い濃度と定義される。一部の実施形態では、大量希釈、微量希釈およびＭＴＴアッセイを平行して用いてリード化合物を抗真菌活性についてアッセイする。
リード化合物の抗真菌特性はまた、真菌溶解アッセイから、ならびに、とりわけ成長阻害アッセイ、蛍光に基づく真菌生存度アッセイ、フローサイトメトリー分析、および当業者に公知の他の標準的なアッセイを含めた他の方法によって決定してもよい。
一部の実施形態では、リード化合物による真菌株の成長阻害のアッセイを用いて、化合物の「Ｅｄ．５０」値（真菌細胞の５０％を死滅させる化合物の濃度として定義される）を導く。あるいは、リード化合物による成長阻害を、最小阻害濃度（ＭＩＣ）（真菌細胞の成長阻害を行うために必要な化合物の濃度である）に関して特徴づけてもよい。このような値は、特定の生物または生物集団に対する特定の抗真菌剤の有効性の表示として当業者に周知である。たとえば、上述のように、生存真菌集団を９９．９％まで減少させるために必要な濃度である最小阻害濃度によって、抗真菌化合物による真菌集団の細胞溶解も特徴づけることができる。生存真菌集団を５０％減少させるために必要な化合物の濃度と定義されるＭＩＣ．５０の値も使用することができる。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、とりわけ、所望の真菌標的（たとえばカンジダアルビカンス）に対して２５ｕｇ／ｍＬ未満、より好ましくは７ｕｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは１ｕｇ／ｍＬ未満のＭＩＣ値を有することに基づいて使用のために選択される。
リード化合物の抗真菌有効性を特定および測定するのに有用な別のパラメータは、リード化合物の抗真菌活性の動態の測定である。このような測定は、抗真菌活性を時間の関数として決定することによって行うことができる。好ましい実施形態では、リード化合物は真菌細胞の効率的な溶解に至る動態を示す。別の好ましい実施形態では、リード化合物は殺真菌性である。
最も好ましい実施形態では、リード化合物は標的微生物（特に真菌）に対して選択的な毒性を示し、動物界（好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞）に対して最小限の毒性を示す。毒性用量（すなわち「ＬＤ．５０」）の決定は、薬理学の分野で周知のプロトコルを用いて実施することができる。動物界（好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞）に対するリード化合物の効果の確認は、当業者に周知の組織培養アッセイを用いて行うことが好ましい（たとえば、Gootz, T. D. (1990)、Clin. Microbiol. Rev.、3:13-31参照、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。哺乳動物細胞に対しては、このようなアッセイ方法としては、とりわけ、トリパンブルー排除およびＭＴＴアッセイが挙げられる（Moore他(1994)、Compound Research、7:265-269、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。膜透過性が変化した際に特定の細胞種が特定の代謝物を放出し得る場合は、その特定の代謝物をアッセイしてもよく、たとえば赤血球が溶解した際のヘモグロビンの放出をアッセイしてもよい（Srinivas他(1992)、J. Biol. Cheri.、267:7121-7127、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。リード化合物は、たとえばヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）もしくはウマ胎仔腎臓（ＦＥＫ）細胞培養物、または当業者によって日常的に使用されている他の一次細胞培養物を用いて、一次細胞に対して試験することが好ましい。ジャーカット細胞などの永久細胞株も使用し得る。一部の実施形態では、それだけには限定されないがＣａｃｏ−２（ヒト結腸癌細胞株）およびＨｕｈ７（ヒト肝癌細胞株）をはじめとする癌腫株でリード化合物を試験する。さらに他の実施形態では、本発明のリード化合物を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中で試験してもよい。好ましい実施形態では、状況に応じてＭＩＣまたはＥＤ．ｓｕｂ．５０よりも少なくとも１桁大きい、より好ましくは少なくとも２、３およびさらに４桁大きいＬＤ．５０を有することに少なくとも部分的に基づいて、動物または動物細胞／組織培養で使用するためにリード化合物を選択する。すなわち、好ましい実施形態では、リード化合物を動物に投与する場合、適切な治療指数は好ましくは１０より大きく、より好ましくは１００、１０００またはさらに１０，０００よりも大きい。
５．８．５ 同属種または類似体の設計
所望の生物活性を示す化合物は、有用な薬理学的活性を有する同属種または類似体を開発または設計するためのリード化合物として使用することができる。たとえば、リード化合物を同定したあと、分子モデリング技術を用いて、より有効であり得る該化合物の変種を設計することができる。分子モデリングシステムの例はＣＨＡＲＭおよびＱＵＡＮＴＡプログラムである（Polygen Corporation、Waltham、MA）。ＣＨＡＲＭは、エネルギー最小化および分子力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を行う。ＱＵＡＮＴＡにより、分子の互いに対する挙動のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および分析が可能となる。
いくつかの論文が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説しており、そのようなものとしては、Rotivinen他、1988、Acta Pharmaceutical Fennica、97:159-166；Ripka、1998、New Scientist、54-57；McKinalyおよびRossmann、1989、Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol.、29:111-122；PerryおよびDavies、OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design、189-193ページ(Alan R. Liss, Inc.、1989)；LewisおよびDean、1989、Proc. R. Soc. Lond.、236:125-140および141-162；Askew他、1989、J. Am. Chem. Soc.、111:1082-1090などがある。化学物質のスクリーニングを行い、グラフィックに示す他のコンピュータプログラムが、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Pasadena、California）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Mississauga、Ontario、Canada）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Cambridge、Ontario）などの会社から市販されている。これらは主に特定のタンパク質に対して特異的な薬物への適用のために設計されているが、任意の同定された領域に対して特異的な薬物を設計するために適合させることができる。類似体および同属種は、上述した生物活性のスクリーニングを用いて、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼへの結合について試験することができる。あるいは、スクリーニングによって生物活性がほとんどないか全くないと確認されたリード化合物を使用しても、生物活性を有する化合物の類似体および同属種を設計することが可能である。
５．８．６ 突然変異誘発研究
本発明によって同定される化合物が動物界および／または真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートするために必要な動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼのアミノ酸残基および／または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの基質のヌクレオチド配列は、当業者に周知の標準的な突然変異誘発技術を利用して決定することができる。さらに、本発明の方法によって同定される化合物が動物界または真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートするために必要な動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニット（もしくは複数のサブユニット）および／または動物界もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質のヌクレオチド配列は、当業者に周知の標準的な突然変異誘発技術を利用して決定することができる。１つまたは複数の変異（たとえば、欠失、付加および／または置換）をｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼもしくはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）またはそのサブユニットもしくは生物学的に活性な断片中に導入してもよく、そして化合物が存在する場合または存在しない場合における酵素の活性に対する変異の効果を、本明細書中に記載のアッセイを用いて決定することができる。さらにまた、１つまたは複数の変異（たとえば、欠失、付加、および／または置換）をｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素（たとえばｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼまたはｔＲＮＡスプライシングリガーゼ）の基質中にも導入してもよく、そして化合物が存在する場合または存在しない場合における酵素の活性に対する変異の効果を、本明細書中に記載のアッセイを用いて決定することができる。具体的には、１つまたは複数の変異（たとえば、欠失、付加および／または置換）を、レポーター遺伝子のオープンフレームリーディング内のｔＲＮＡイントロンのヌクレオチド配列中に導入してもよく、本明細書中に記載のレポーター遺伝子に基づくアッセイにおけるレポーター遺伝子の発現に対する効果を決定することができる。ｔＲＮＡイントロン中の変異が、レポーター遺伝子の発現をモジュレートする化合物の能力に影響を与える場合は、変異した配列がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性において役割を果たしている。
当業者に公知の標準的な技術を使用して、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のヌクレオチド配列および／またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質のヌクレオチド配列中に変異を導入することができき、そのような技術としてたとえば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発が挙げられる。具体的な実施形態では、７５個未満の核酸残基の置換、５０個未満の核酸残基の置換、４５個未満の核酸残基の置換、４０個未満の核酸残基の置換、３５個未満の核酸残基の置換、３０個未満の核酸残基の置換、２５個未満の核酸残基の置換、２０個未満の核酸残基の置換、１５個未満の核酸残基の置換、１０個未満の核酸残基の置換、または５個未満の核酸残基の置換を、ｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素のヌクレオチド配列および／またはｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の基質のヌクレオチド配列中に導入する。
５．９ 増殖性疾患を予防、治療または管理するための同定化合物の使用
本発明は、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される１つもしくは複数の化合物を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の予防、治療または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される１つもしくは複数の化合物を、予防上または治療上有効な量の用量でそれを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明によって同定した化合物は、このような化合物が以前に前記増殖性疾患を予防、治療、管理または寛解させるために使用されたことがある場合は、前記増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させるために投与しない。
本発明はまた、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の酵素の活性を阻害または低減する、本明細書中に記載のスクリーニング方法を利用して同定される１つもしくは複数の化合物と、前記増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られている（それだけには限定されないが、以下のセクション５．９．１に記載の予防剤または治療剤、および乾癬もしくは線維症の予防、治療、管理または寛解に有用な薬剤を含む）、１つもしくは複数の他の治療（たとえば予防剤または治療剤）とを、それを必要としている対象に施すことを含む方法を提供する。本発明の併用療法の治療（たとえば予防剤または治療剤）は、順次または同時に施すことができる。具体的な実施形態では、本発明の併用療法は、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の酵素の活性を阻害または低減する本発明の化合物と、前記化合物と同じ作用機構を有する少なくとも１つの他の治療（たとえば予防剤または治療剤）とを含む。別の実施形態では、本発明の併用療法は、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の１つもしくは複数の酵素の活性を阻害または低減する本発明の化合物と、前記化合物とは異なる作用機構を有する少なくとも１つの他の治療（たとえば予防剤または治療剤）とを含む。本発明の併用療法は、相加または相乗効果を有して化合物と一緒に機能することによって本発明の化合物の予防効果または治療効果を改善する。本発明の併用療法は、それぞれの治療（たとえばそれぞれの予防剤または治療剤）に関連する副作用を軽減させる。
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中に含めて対象に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で対象に同時に投与することができる。予防剤または治療剤は、同一または異なる投与経路によって対象に投与し得る。
具体的な実施形態では、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定される１つまたは複数の化合物を含む医薬組成物を、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解するために対象、好ましくはヒトに投与する。この実施形態によれば、医薬組成物は、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られている１つまたは複数の他の治療（たとえば予防剤または治療剤）も含み得る。
動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物は、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させる一連の治療の第１、第２、第３、第４または第５治療として使用し得る。本発明は、このような増殖性疾患の従来の治療に対して不応性の対象において、増殖性疾患（たとえば癌）または１つもしくは複数のその症状を治療、管理または寛解させる方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物を、予防上または治療上有効な量の用量で前記対象に投与することを含む方法を提供する。癌が、ある治療に対して不応性であると決定され得ることは、癌細胞の少なくともある程度の有意な部分がその治療に応答して死滅しないかまたはその細胞分裂が停止しないことを意味する。このような決定は、このような文脈中で当分野で認められる「不応性」の意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイする当業者に周知の任意の方法によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。具体的な実施形態では、癌細胞の数が有意に低下していないか、または増加している場合に癌は不応性である。
本発明は、ある増殖性疾患の既存の単一薬剤治療に不応性の対象における該増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の治療、管理または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物の予防上または治療上有効な量の用量と、予防上または治療上有効な量の用量の１つまたは複数の他の治療（たとえば１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤）とを前記対象に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、増殖性疾患または１つもしくは複数のその症状の治療、管理または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物を、任意の他の治療（たとえば、放射線療法、化学療法または手術）と組み合わせて、他の治療に不応性であると証明されたが既にその治療を受けていない患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、増殖性疾患（たとえば癌）に罹患しており、以前に他の治療を受けたことが原因で免疫抑制状態にある患者の治療または管理方法を提供する。本発明はまた、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／もしくは生物学的療法／免疫療法では毒性がありすぎると証明されたか、または証明され得る、すなわち、それらが治療または管理される対象にとって容認できないか、または耐えられない副作用をもたらす場合に、癌などの増殖性疾患を治療または管理する別の方法を提供する。さらに、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物を投与することによって、以前に治療されており、かつ疾患活動性がない患者において癌などの増殖性疾患の再発を予防する方法を提供する。
本発明に包含される方法によって予防、治療、管理または寛解させることができる増殖性疾患には、それだけには限定されないが、新生物、腫瘍、転移、または無制御の細胞増殖を特徴とするいかなる疾患もしくは障害（たとえば乾癬）も含まれる。具体的な実施形態では、本発明の方法によって予防、治療、管理または寛解される増殖性疾患は、細胞の過増殖を特徴とするかまたはそれを伴う非癌性の障害である。このような障害の例としては、それだけには限定されないが、乾癬および肺線維症が挙げられる。別の実施形態では、本発明の方法によって予防、治療、管理または寛解される増殖性疾患は良性または悪性の癌である。癌は原発性または転移癌であってよい。
本発明に包含される方法によって予防、治療、管理または寛解させることができる癌の具体例としては、それだけには限定されないが、頭部、頚部、眼、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が挙げられる。さらなる癌としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：白血病（たとえばそれだけには限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（たとえば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病および脊髄形成異常症候群）、慢性白血病（たとえば、それだけには限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病）；真性赤血球増加症；リンパ腫（たとえば、それだけには限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病）；多発性骨髄腫（たとえば、それだけには限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫）；ワルデンストレームマクログロブリン血症；意義未確定の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織の肉腫（たとえば、それだけには限定されないが、骨肉腫（bone sarcoma）、骨肉腫（osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（angiosarcoma）（血管肉腫（hemangiosarcoma））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管血管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫）；脳腫瘍（たとえば、それだけには限定されないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫）；乳癌（たとえば、それだけには限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌）；副腎癌（たとえば、それだけには限定されないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌）；甲状腺癌（たとえば、それだけには限定されないが、乳頭状または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌）；膵臓癌（たとえば、それだけには限定されないが、膵島細胞腫、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌性腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫）；下垂体癌（たとえば、それだけには限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌性腫瘍、末端肥大症、および尿崩症）；眼癌（たとえば、それだけには限定されないが、眼球黒色腫（虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫など）、ならびに網膜芽細胞腫）；膣癌（たとえば扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫）；外陰部癌（たとえば扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病）；子宮頸癌（たとえば、それだけには限定されないが、扁平上皮癌および腺癌）；子宮癌（たとえば、それだけには限定されないが、子宮内膜癌および子宮肉腫）；卵巣癌（たとえば、それだけには限定されないが、上皮性卵巣癌、境界腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍）；食道癌（たとえば、それだけには限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌）；胃癌（たとえば、それだけには限定されないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表層伝播性、拡散伝播性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫）；結腸癌；直腸癌；肝臓癌（たとえば、それだけには限定されないが、肝細胞癌および肝芽腫）；胆嚢癌（たとえば腺癌）；胆管癌（たとえば、それだけには限定されないが、乳頭性、結節性、および拡散性）；肺癌（たとえば非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌）；精巣癌（たとえば、それだけには限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、標準型（典型型）、精母細胞性、非精上皮腫、胚性癌腫、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍））；前立腺癌（たとえば、それだけには限定されないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫）；陰茎癌；口腔癌（たとえば、それだけには限定されないが、扁平上皮癌）；基底癌；唾液腺癌（たとえば、それだけには限定されないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌）；咽頭癌（たとえば、それだけには限定されないが、扁平上皮癌および疣状癌）；皮膚癌（たとえば、それだけには限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫（表層伝播性黒色腫、結節状黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端性黒子性黒色腫））；腎臓癌（たとえば、それだけには限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂および／または尿管））；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（たとえば、それだけには限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫）。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる（このような障害の総説には、Fishman他、1985、Medicine、第2版、J.B. Lippincott Co.、PhiladelphiaおよびMurphy他、1997、Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery、Viking Penguin、Penguin Books U.S.A., Inc.、米国を参照）。また、アポトーシスの異常によって引き起こされる癌も本発明の方法および組成物によって予防、治療、管理または寛解させることができることが企図される。このような癌には、それだけには限定されないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに前癌性の病変（たとえば家族性大腸ポリープ症および骨髄異形成症候群）が含まれ得る。
５．９．１ 抗癌治療
本発明は、癌または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される１つもしくは複数の化合物および１つまたは複数の他の治療（たとえば予防剤または治療剤）を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。治療剤または予防剤には、それだけには限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬、無機分子、および有機分子が含まれる。癌または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に有用であることが知られている、あるいはそのために使用されてきた、または現在使用されている、いかなる薬剤または治療（たとえば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法）も、動物界のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物と組み合わせて使用することができる。このような薬剤（すなわち抗癌剤）の例としては、それだけには限定されないが、血管形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤および免疫調節剤（化学療法剤および免疫調節効果を有する化学療法剤以外の薬剤など）が挙げられる。
血管形成阻害剤（すなわち抗血管形成剤）としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）；抗血管形成性抗トロンビンＩＩＩ；アンジオザイム（angiozyme）；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ１２−９５６６；ベネフィン；ベバシズマブ；ＢＭＳ−２７５２９１；軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９補体断片；ＣＥＰ−７０５５；Ｃｏｌ３；コンブレタスタチンＡ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）；フィブロネクチン断片；Ｇｒｏ−β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ；ヘパリン六糖断片；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）；インターロイキン−１２；クリングル５（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）；ＭｏＡｂ ＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット；ＮＭ−３；パンゼム；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；血小板因子−４（ＰＦ４）；プリノマスタット；プロラクチン１６ｋＤ断片；プロリフェリン（Proliferin）関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４；レチノイド；ソリマスタット（solimastat）；スクワラミン；ＳＳ３３０４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１２４８；テトラヒドロコルチゾール−Ｓ；テトラチオモリブデ―ト；サリドマイド；トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；トランスフォーミング増殖因子−β；バスキュロスタチン（vasculostatin）；バソスタチン（vasostatin）（カルレティキュリン断片）；ＺＤ６１２６；ＺＤ６４７４；およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）。化学療法剤としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（たとえばＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニソロン（ＭＰ）、副腎皮質ステロイド、ステロイド類、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、およびマロノニトリルアミド（たとえばレフルノアミド）。化学療法以外の免疫調節剤としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：抗Ｔ細胞受容体抗体（たとえば、抗ＣＤ４抗体（たとえば、ｃＭ−Ｔ４１２（Boeringer）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１（登録商標）（ＩＤＥＣおよびＳＫＢ）、ｍＡＢ４１６２Ｗ９４、オルソクローンおよびＯＫＴｃｄｒ４ａ（Janssen-Cilag））、抗ＣＤ３抗体（たとえば、Ｎｕｖｉｏｎ（Product Design Labs）、ＯＫＴ３（Johnson&Johnson）、またはリツキサン（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５抗体（たとえば抗ＣＤ５リシン結合免疫コンジュゲート）、抗ＣＤ７抗体（たとえばＣＨＨ−３８０（Novartis））、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体（たとえばＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（たとえばＣＡＭＰＡＴＨ １Ｈ（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ２抗体（たとえばＭＥＤＩ−５０７（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開公報WO02／098370号および同WO02／069904号）、抗ＣＤ１１ａ抗体（たとえばザネリム（Xanelim）（Genentech））、および抗Ｂ７抗体（たとえばＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ）））；ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン；ＬＦＡ−３ＴＩＰ（Biogen、国際公開公報WO93／08656号および米国特許第6,162,432号）；可溶性サイトカイン受容体（たとえば、ＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインまたはその断片、ＩＬ−１β受容体の細胞外ドメインまたはその断片、およびＩＬ−６受容体の細胞外ドメインまたはその断片）、サイトカインまたはその断片（たとえば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ）、抗サイトカイン受容体抗体（たとえば、抗ＩＦＮ受容体抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（たとえばゼナパックス（Zenapax）（Protein Design Labs））、抗ＩＬ−４受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＩＬ−１０受容体抗体、および抗ＩＬ−１２受容体抗体）、ならびに抗サイトカイン抗体（たとえば、抗ＩＦＮ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体（たとえばＡＢＸ−ＩＬ−８（Abgenix））、および抗ＩＬ−１２抗体）。
本発明の方法によって使用することができる抗癌剤の具体例としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロンアセテート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；アクチノマイシンＣ（cactinomycin）；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン（dactinomycin）；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロモスタノロンプロピオネート；ヅアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロキシウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキン−２（組換えインターロイキン−２、すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチドアセテート；レトロゾール；ロイプロリドアセテート；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソルナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコル；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロールアセテート；メレンゲストロールアセテート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスパー（mitosper）；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；プロマイシン；プロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロンアセテート；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキセート；トリメトレキセートグルクロン酸塩；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗癌薬としては、それだけには限定されないが、以下のものが挙げられる：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタリレリックス；抗背方化形態発生タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス制御物質；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；βクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビサナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルフォキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔＭ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン類；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン類；シクロプラタム；シペミシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；ジヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシフォスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロミチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エピリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；ホルフェニメックス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；ガリウム硝酸塩；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン類；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポミアノール、４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎ３酢酸；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリンアミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコル；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多腫瘍サプレッサー１−ベースの治療法；マスタード抗癌剤；ミカパーオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポリフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニソン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａ−ベースの免疫調節物質；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤、ミクロアルガル；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウ
ムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；セネセンス由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；ナトリウムフェニルアセテート；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；スーパー活性血管活性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；５−フルオロウラシル；ロイコボリン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；サイマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；サイモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキセート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；トリホスチン類；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメックス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；サリドマイド；ベラレソール；ベラミン；ベルディンス；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマー。
本発明はまた、本発明の方法によって同定される１つまたは複数の化合物を、癌細胞を破壊するための、Ｘ線、γ線および他の放射線源を使用することを含む放射線療法と組み合わせて投与することを包含する。好ましい実施形態では、放射線療法を外部放射線照射または遠隔地にある源から放射線を向ける遠隔療法として施す。他の好ましい実施形態では、放射線療法を内部療法または放射活性源を体内の癌細胞もしくは腫瘍塊の近くに置く近接照射療法として施す。
癌の治療法ならびにその用量、投与経路および推奨される用法は当分野で公知であり、Physician's Desk Reference (第56版、2002)などの文献に記載されている。
５．１０ 真菌感染症を予防、管理または治療するための同定される化合物の使用
本発明は、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明によって同定される１つもしくは複数の化合物を、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する１つもしくは複数の化合物を予防上または治療上有効な量の用量で、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させるために当分野で使用されている標準的または実験的な治療に不応性の真菌感染症の予防、治療、管理または寛解方法であって、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する１つもしくは複数の化合物を予防上または治療上有効な量で、それを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明はまた、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解方法であって、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本明細書中に記載のスクリーニング方法を利用して同定される１つもしくは複数の化合物と、前記真菌感染症または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られている（それだけには限定されないが、以下のセクション５．１０．１に記載の予防剤または治療剤を含む）、１つまたは複数の他の治療（たとえば予防剤または治療剤）とを、それを必要としている対象に施すことを含む方法を提供する。本発明の併用療法の治療（たとえば予防剤または治療剤）は、順次または同時に施すことができる。具体的な実施形態では、本発明の併用療法は、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する本発明の化合物、および前記化合物と同じ機構を有する少なくとも１つの他の治療（たとえば予防剤または治療剤）を含む。別の実施形態では、本発明の併用療法は、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する本発明の化合物、および前記化合物とは異なる作用機構を有する少なくとも１つの他の治療（たとえば予防剤または治療剤）を含む。本発明の併用療法は、相加または相乗効果を有して化合物と一緒になって機能することによって本発明の化合物の予防効果または治療効果を改善する。本発明の併用療法は、それぞれの治療（たとえばそれぞれの予防剤または治療剤）に伴う副作用を軽減させる。
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中に含めて対象に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で対象に同時に投与することができる。予防剤または治療剤は、同一または異なる投与経路によって対象に投与してもよい。
具体的な実施形態では、真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定される１つもしくは複数の化合物を含む医薬組成物を、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解させるために対象、好ましくはヒトに投与する。この実施形態によれば、医薬組成物はまた、真菌感染症または１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理または寛解に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られている１つまたは複数の他の治療（たとえば予防剤または治療剤）を含んでもよい。
真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される化合物は、表層感染症（たとえば皮膚を冒す感染症）から、非常に侵襲性が高く致死的な感染症に至る感染症を引き起こす、当分野で公知のいかなる真菌生物による真菌感染症を予防、治療、管理または寛解させるためにも使用することができる。真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される化合物は、広範な真菌生物に対する抗真菌活性を有し、そのような真菌生物としては、それだけには限定されないが皮膚糸状菌、白癬菌、小胞子菌、トリコデルマ、クリプトコッカス、フザリウム、表皮菌、カンジダ種（主にカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、次いでカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis））、アスペルギルス種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ニューモシスティス・カリニおよび一部の接合菌が挙げられる。
本発明の真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される化合物は、真菌感染症に感染しやすい免疫無防備状態の対象で特に有用である。免疫無防備状態の患者としては、たとえば、ＨＩＶに感染した患者、化学療法を受けている患者、移植レシピエント、または免疫抑制薬治療を受けている癌患者が挙げられる。免疫無防備状態の患者を攻撃する真菌生物はしばしば日和見真菌と呼ばれ、それだけには限定されないが、カンジダ、トリコスポロン、クリプトコッカスが含まれる。真菌のｔＲＮＡスプライシング経路内の酵素の活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される化合物は、広範なスペクトルの抗細菌剤を用いた治療により免疫系が無防備状態となっている対象、または侵襲性の方法（たとえばカテーテル、人工器官）を施された患者でも有用である。
一部の実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物は、当業者に公知の標準的な抗真菌アッセイによって決定した、対象、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト対象において真菌感染症を治療、管理および／または予防するための当業者に公知の他の抗真菌剤に匹敵する治療上の有効性を有する。具体的な実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物は、カンジダのほとんどの種を含めた広範なスペクトルの抗真菌性を有するポリエン化合物のアムホテリシンＢと同じ抗真菌効力を有する。具体的な好ましい実施形態では、本発明によって同定される抗真菌化合物は毒性が軽減しており（たとえば腎毒性、肝臓毒性が軽減している）、一方で哺乳動物、好ましくはヒトにおいて真菌感染症を治療、管理および／または予防するために当分野で一般的に使用されている抗真菌剤と同様の臨床上の有効性を維持している。別の好ましい実施形態では、本発明によって同定される抗真菌化合物は、真菌感染症を治療および／または予防するために一般的に使用されている他の抗真菌剤と比較して、それだけには限定されないが嘔気および嘔吐を含めた副作用が軽減しており、一方で哺乳動物、好ましくはヒトにおいて真菌感染症を治療および／または予防するために当分野で一般的に使用されている抗真菌剤と同様の臨床上の有効性を維持している。
他の実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物はそれ自体が抗真菌活性を有するだけでなく、宿主、好ましくは哺乳動物において真菌感染症を治療、管理および／または予防するために一般的に使用されている他の抗真菌剤の抗真菌活性を増強する。他の実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物はそれ自体が抗真菌活性を有するだけでなく、前記抗真菌剤と組み合わせて使用した場合に、宿主、好ましくは哺乳動物において真菌感染症を治療および／または管理するために一般的に使用されている他の抗真菌剤の、治療上の有効性を増強する。
好ましい実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物は、真菌感染症の治療、管理および／または予防に一般的に使用されている抗真菌剤（それだけには限定されないが、ポリエン抗真菌薬（たとえばアムホテリシンＢ）、アゾール抗真菌薬、アリルアミンおよびモルホリン抗真菌薬物、代謝拮抗抗真菌薬を含む）に対して一次および／または二次薬物耐性を生じた対象（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト対象）において真菌感染症または１つもしくは複数のその症状を治療、予防、管理または寛解するのに有用である。具体的な実施形態では、本発明の方法によって同定される抗真菌化合物は、真菌種（それだけには限定されないが、シュードアレシェリア・ボイディ（Psuedallescherica boydii）、フザリウムspp.、トリコスポロンspp.、およびカンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）を含む）がアムホテリシンＢに耐性がある場合に、対象（好ましくは哺乳動物対象および最も好ましくはヒト対象）において真菌感染症または１つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理または寛解するのに有用である。
５．１０．１ 抗真菌剤
真菌感染症を予防、治療、管理または寛解するための当業者に周知の抗真菌剤および治療を本発明の組成物および方法に使用することができる。抗真菌剤の非限定的な例としては、真菌感染症を阻害もしくは低減する、真菌の繁殖を阻害もしくは低減する、または他の対象への真菌の伝播を阻害もしくは低減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子が挙げられる。抗真菌剤の例としては、それだけには限定されないが、アゾール薬（たとえば、ミコナゾール、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標））、イミダゾール、トリアゾール（たとえばフルコナゾール（ＤＩＦＬＵＣＡＮ（登録商標））、およびイトラコナゾール（ＳＰＯＲＡＮＯＸ（登録商標））、ポリエン（たとえば、ナイスタチン、アムホテリシンＢ（ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（登録商標））、アムホテリシンＢ脂質複合体（「ＡＢＬＣ」）（ＡＢＥＬＣＥＴ（登録商標））、アムホテリシンＢコロイド状分散液（「ＡＢＣＤ」）（ＡＭＰＨＯＴＥＣ（登録商標））、リポソーム性アムホテリシンＢ（ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）））、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、およびピリミジン（たとえばフルシトシン（ＡＮＣＯＢＯＮ（登録商標））が挙げられる。
抗真菌治療ならびにその用量、投与経路、および推奨される用法は当分野で公知であり、Physician's Desk Reference (第56版、2002)などの文献に記載されている。
５．１１ 化合物を投与するための組成物および方法
本発明は、本発明の方法によって同定される化合物または製薬上許容されるその塩を含む組成物を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する、本発明によって同定される化合物または製薬上許容されるその塩を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界および／もしくは真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する、本発明の方法によって同定される化合物を含む組成物を提供する。これらの実施形態に従って、組成物は、１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤であって、真菌感染症もしくは増殖性疾患または１つもしくは複数のそれらの症状の予防、治療、管理または寛解に有用であることが知られている、そのために使用されていた、あるいは現在使用されている予防剤または治療剤も含み得る。
本発明の組成物は無菌的でないか、または無菌的であってもよく、対象への投与に好適であり得る。予防剤または治療剤に加えて、本発明の組成物は、対象へ適切に投与するための形態を提供する好適な量の製薬上許容されるビヒクルを含み得る。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象への投与に好適な医薬組成物であり、有効量の本発明によって同定される化合物もしくは製薬上許容されるその塩および／または有効量の１つもしくは複数の他の予防剤もしくは治療剤と、製薬上許容されるビヒクルとを含む。
本発明の方法を用いて同定される、生物学的に活性な化合物または製薬上許容されるその塩を、増殖性疾患または真菌感染症に罹患している患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与することができる。具体的な実施形態では、増殖性疾患または真菌感染症に対する予防措置として、化合物または製薬上許容されるその塩を患者（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。患者に投与する場合、化合物または製薬上許容されるその塩は、場合によっては製薬上許容されるビヒクルを含む組成物の構成要素として投与することが好ましい。
本発明の組成物は、経口的に、または任意の他の都合のよい経路（たとえば点滴もしくはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚の内面（たとえば、口腔粘膜、直腸、および腸管粘膜など）を介した吸収）によって投与することができ、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与し得る。投与は全身性または局所的であることができる。様々な送達系（たとえばリポソーム、微粒子、ミクロカプセル、カプセルへのカプセル封入など）が公知であり、化合物および製薬上許容されるその塩を投与するために使用することができる。
投与方法としては、それだけには限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸から、吸入によって、または特に耳、鼻、眼、もしくは皮膚へ局所的な投与が挙げられる。投与方法は専門家の裁量に任される。ほとんどの場合、投与の結果、化合物または製薬上許容されるその塩が血流中に放出される。
具体的な実施形態では、化合物または製薬上許容されるその塩を局所的に投与することが望まれ得る。限定しないが、これは、たとえば手術中の局所注入によって、局所適用（たとえば手術後に創傷包帯と組み合わせて）、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、あるいはシラスティック膜などの膜を含めた多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状材料または線維からなる移植物によって行ってもよい。
特定の実施形態では、化合物または製薬上許容されるその塩を、脳室内、くも膜下腔内および硬膜外注射を含めた任意の適切な経路によって中枢神経系内に導入することが望まれ得る。脳室内注射は、たとえばオンマヤリザーバー（Ommaya reserver）などのリザーバーに接続した脳室内カテーテルによって容易になるかもしれない。
たとえば吸入器または噴霧器を用い、かつエアロゾル化剤と共に製剤化することによるか、または炭化フッ素もしくは合成肺サーファクタント中での灌流を介した肺投与を用いることもできる。特定の実施形態では、化合物および製薬上許容されるその塩は、慣用の結合剤およびトリグリセリドなどのビヒクルを用いて、坐薬として製剤化することができる。
別の実施形態では、化合物および製薬上許容されるその塩を、小胞、特にリポソーム中で送達することができる（Langer、1990、Science、249:1527-1533；Treat他、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler (編)、Liss、New York、353-365ページ(1989)；Lopez-Berestein、同書、317-327ページを参照；一般に同書を参照）。
さらに別の実施形態では、化合物および製薬上許容されるその塩を徐放系で送達することができる（たとえばGoodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115-138ページ(1984)参照）。Langer、1990、Science、249:1527-1533による総説に記載の他の徐放系を使用してもよい。一実施形態では、ポンプを使用し得る（Langer、上記；Sefton、1987、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.、14:201；Buchwald他、1980、Surgery、88:507；Saudek他、1989、N. Engl. J. Med.、321:574参照）。別の実施形態では、高分子物質を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise (編)、CRC Pres.、Boca Raton、Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall (編)、Wiley、New York (1984)；RangerおよびPeppas、1983、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.、23:61参照；Levy他、1985、Science、228:190；During他、1989、Ann. Neurol.、25:351；Howard他、1989、J. Neurosurg.、71:105も参照）。さらに別の実施形態では、徐放系を化合物または製薬上許容されるその塩の標的ＲＮＡの近傍に配置することができ、これにより全身用量の一部しか必要でなくなる。
上述のように、本発明の組成物は、対象へ投与する形態を提供する製薬上許容されるビヒクルを含み得る。具体的な実施形態では、用語「製薬上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可されたか、または米国薬局方もしくは動物、哺乳動物、より詳細にはヒトでの使用についての他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「ビヒクル」とは、本発明の化合物かそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体をいう。このような製薬用ビヒクルは、水や油（たとえばピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、野菜もしくは合成起源のもの）などの液体であることができる。製薬用ビヒクルは、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであることができる。さらに、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤および着色剤を使用してもよい。患者に投与する際、製薬上許容されるビヒクルは無菌的であることが好ましい。本発明の化合物を静脈内投与する場合、水が好ましいビヒクルである。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体ビヒクルとして、特に注射用溶液に使用することができる。適切な製薬用ビヒクルはとしてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤が挙げられる。化合物の組成は、所望する場合は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
組成物は、液剤、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、散剤、徐放性製剤、坐薬、乳剤、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、または使用に適したいかなる他の形態をとることもできる。一実施形態では、製薬上許容されるビヒクルはカプセルである（たとえば米国特許第5,698,155号参照）。好適な製薬用ビヒクルの他の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第19版、1995、1447〜1676ページ（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
好ましい実施形態では、化合物または製薬上許容されるその塩を、人間への経口投与に適応した医薬組成物として日常的な方法によって製剤化する。経口送達用の組成物は、たとえば錠剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、顆粒、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、またはエリキシルの形態であり得る。製薬上、口当たりのよい調製物を提供するために、経口投与する組成物は１つまたは複数の薬剤、たとえばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリーなどの香味剤；着色料；および保存料を含み得る。さらに、錠剤または丸薬形態の場合は、胃腸管内での分散および吸収を遅延させ、それにより長時間持続した作用をもたらすために、組成物をコーティングすることができる。浸透活性により制御される化合物を覆う選択的透過膜もまた、経口投与する組成物に適している。これらの後者の方針（platform）では、カプセルの周囲の環境からの流体が制御化合物に吸収され、化合物が膨張して薬剤または薬剤組成物がすき間から排出される。これらの送達方針では、即放配合物のスパイク状特性とは対照的に、本質的にゼロ次の送達特性を提供することができる。モノステアリン酸グリセロールやステアリン酸グリセロールなどの時間遅延剤を用いてもよい。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なビヒクルを含むことができる。このようなビヒクルは、製薬グレードであることが好ましい。通常、静脈内投与用の組成物は無菌的な等張水性緩衝液を含む。必要な場合は、組成物は可溶化剤も含み得る。
別の実施形態では、化合物または製薬上許容されるその塩を静脈内投与用に製剤化することができる。静脈内投与用の組成物は、注射部位での痛みを軽減させるために、場合によりリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、たとえば、活性物質の量を示したアンプルやサシェなどの気密に密閉された容器中で、乾燥した凍結乾燥散剤または水を含まない濃縮物として、成分を個別にまたは一緒に混合して剤形単位で供給する。化合物または製薬上許容されるその塩を点滴によって投与する場合は、たとえば無菌的な製薬グレードの水または生理食塩水を含む点滴瓶を用いて投薬することができる。化合物または製薬上許容されるその塩を注射によって投与する場合は、投与前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
特定の疾患の治療に有効となる化合物または製薬上許容されるその塩の量は疾患の性質に依存し、標準的な臨床的技法によって決定することができる。さらに、最適な用量範囲の特定を補助するために、場合によってはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してもよい。使用する正確な用量もまた、投与経路および疾患の重篤度に依存し、専門家の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。しかし、経口投与の好適な用量範囲は一般に、体重１キログラムあたり１日約０．００１ミリグラム〜約５００ミリグラムの化合物または製薬上許容されるその塩である。本発明の具体的な好ましい実施形態では、経口用量は、体重１キログラムあたり１日約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラム、より好ましくは体重１キログラムあたり１日約０．１ミリグラム〜約７５ミリグラム、より好ましくは体重１キログラムあたり１日約０．５ミリグラム〜５ミリグラムである。本明細書中に記載の用量とは、投与される全量をいう。すなわち、複数の化合物を投与する場合、または化合物を治療薬と共に投与する場合は、好ましい用量は投与する全量に相当することをいう。経口用組成物は、好ましくは約１０重量％〜約９５重量％の活性成分を含む。
静脈内（ｉ．ｖ．）投与に対する好適な用量範囲は、体重１キログラムあたり１日約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラム、体重１キログラムあたり１日約０．１ミリグラム〜約３５ミリグラム、および体重１キログラムあたり１日約１ミリグラム〜約１０ミリグラムである。鼻腔内投与に対する好適な用量範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日である。坐薬は一般に体重１キログラムあたり１日約０．０１ミリグラム〜約５０ミリグラムの本発明の化合物を含み、約０．５重量％〜約１０重量％の範囲の活性成分を含む。
皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下、脳内、膣内、経皮投与または吸入による投与に対して推奨される用量は、体重１キログラムあたり１日約０．００１ミリグラム〜約２００ミリグラムである。局所投与に対する好適な用量は、投与部位に応じて約０．００１ミリグラム〜約１ミリグラムの範囲である。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から導いた用量応答曲線から推定し得る。このような動物モデルおよび系は当分野で周知である。
化合物および製薬上許容されるその塩は、ヒトで使用する前に、所望の治療活性または予防活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでアッセイすることが好ましい。たとえば、化合物、製薬上許容されるその塩、および／または別の治療薬を投与することが好ましいかどうかを決定するためにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用することができる。安全性および有効性を実証するために動物モデル系を使用することができる。
等価な内容（Equivalents）：
本発明は、本明細書中に記載の具体的な実施形態による範囲に限定されるものではない。実際、当業者には、前述の説明および添付の図から、記載したものに加えて本発明の様々な変形が明らかとなるであろう。このような変形は添付の特許請求項の範囲内にあることを意図する。
様々な出版物、特許および特許出願が本明細書中で引用されており、それらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

Claims (25)

  1. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、真菌無細胞抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
    （ｂ）半分子のライゲーションを測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下のシグナルと比較して、ライゲーションした半分子の増大が検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップ
    を含む、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法。
  2. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、真菌無細胞抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、ｔＲＮＡ分子の一方の集団の末端がフルオロフォアで標識されており、他方がクエンチャーで標識されているステップ；
    （ｂ）半分子の蛍光を測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下のシグナルと比較して、蛍光シグナルの増大が検出可能な場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップ
    を含む、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法。
  3. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、真菌無細胞抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、ｔＲＮＡ分子の一方の集団の末端が蛍光アクセプター部分で標識されており、他方が蛍光ドナー部分で標識されている、上記ステップ；
    （ｂ）半分子の蛍光を測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下の蛍光発光と比較して、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光の低減が検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物が同定されるステップ
    を含む、真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗真菌化合物の同定方法。
  4. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、動物界の無細胞抽出物または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
    （ｂ）半分子のライゲーションを測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下のシグナルと比較して、ライゲーションした半分子の増大が検出される場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップ
    を含む、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法。
  5. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、動物界の無細胞抽出物または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、ｔＲＮＡ分子の一方の集団の末端がフルオロフォアで標識されており、他方がクエンチャーで標識されている、上記ステップ；
    （ｂ）半分子の蛍光を測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下のシグナルと比較して、蛍光シグナルの増大が検出可能な場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップ
    を含む、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法。
  6. （ａ）５’ｔＲＮＡ半分子の集団および３’ｔＲＮＡ半分子の集団を、動物界の無細胞抽出物または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼおよび化合物または化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、ｔＲＮＡ分子の一方の集団の末端が蛍光アクセプター部分で標識されており、他方が蛍光ドナー部分で標識されている、上記ステップ；
    （ｂ）半分子の蛍光を測定するステップであって、前記化合物の非存在下または陰性対照の存在下の蛍光発光と比較して、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光の低減が検出される場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップ
    を含む、動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法。
  7. ｔＲＮＡスプライシングリガーゼの活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記無細胞抽出物が酵母の無細胞抽出物である、請求項１、２または３に記載の方法。
  9. 前記無細胞抽出物が哺乳動物の無細胞抽出物である、請求項４、５または６に記載の方法。
  10. 前記無細胞抽出物がヒトの無細胞抽出物である、請求項４、５または６に記載の方法。
  11. 前記化合物がペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（Diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記有機小分子ライブラリがベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである、請求項１１に記載の方法。
  13. ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記化合物の構造を質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記化合物が前記真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと直接結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
  16. 前記化合物が前記真菌のｔＲＮＡスプライシングリガーゼと直接結合する、請求項４、５または６に記載の方法。
  17. 前記化合物が基質に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 請求項１、２または３に記載の方法によって同定される化合物もしくは製薬上許容されるその塩を有効量で投与することを含む、真菌感染症もしくはその症状の治療、予防または寛解方法。
  19. 前記真菌感染症が酵母感染症である、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項４、５または６に記載の方法によって同定される化合物もしくは製薬上許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む、増殖性疾患もしくはその症状の治療、管理または寛解方法。
  21. 前記増殖性疾患が癌、乾癬または肺線維症である、請求項２０に記載の方法。
  22. 動物界のｔＲＮＡスプライシングリガーゼに対する化合物の効果を評価するステップをさらに含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  23. 前記化合物の細胞毒性を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記化合物の細胞増殖抑制活性を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記対象がヒトである、請求項１８または２０に記載の方法。
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