JP2012085632A - ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、並びにヒト化モノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、並びにヒト化モノクローナル抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、並びにその用途を提供する。
【解決手段】腫瘍壊死因子αに結合するヒト化モノクローナル抗体。特定のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域、及び特定のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域を含み、前記アミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、アミノ酸置換は、軽鎖可変領域の第１０アミノ酸のイソロイシンのトレオニンへの置換、第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、また、重鎖可変領域配列の第２アミノ酸のリジンのグルタミンへの置換、第１０アミノ酸のトリプトファンのロイシンへの置換、第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、および第４１アミノ酸のグルタミン酸のグリシンへの置換よりなる群から選択される少なくとも一つである、前記ヒト化モノクローナル抗体。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗腫瘍壊死因子αの抗体に関し、特に、腫瘍壊死因子αを高度に中和することが可能なヒト化モノクローナル抗体およびそのアミノ酸配列に関するものである。
腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−α）は、炎症誘発性サイトカインであり、マクロファージ細胞と単球を含む免疫システム細胞により最初に生成される。腫瘍壊死因子αは、ホモ三量体蛋白質として存在し、各サブユニット中で、最初、一個の２６ｋＤａの膜貫通前駆体蛋白質として翻訳される。腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）により、ＴＮＦ−αの膜貫通領域に近い位置で切割を行なった後、腫瘍壊死因子αの可溶三量体を放出し、エフェクター細胞上の構造区分タイプＩとタイプＩＩの腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲＩとＴＮＦＲＩＩ）を結合することにより、その活性を発揮する。
膜貫通形式の腫瘍壊死因子αも、独特の生物機能が知られており、例えば、細胞間の接触方式における、細胞毒性活性とポリクローナルＢ細胞の活性化（Ｍｉｔｏｍａら、２００８）が挙げられる。腫瘍壊死因子αが自己免疫過程に対し、特定の影響を有することが既に証明されており、多くの自己免疫疾病の主要な治療目標となっている（Ｆｅｌｄｍａｎｎ、２００１）。今までのところ、ある抗腫瘍壊死因子αの試薬、例えば、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、及びインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）は、既に、米国食品医薬局（ＦＤＡ）により承認されており、いずれも、主要な薬理学的メカニズムの作用として、可溶形の腫瘍壊死因子αを効果的に中和する能力を有する。しかし、これらの拮抗薬の膜貫通形式の腫瘍壊死因子αに対する結合作用は異なり、臨床疾病上で、異なる結果をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ、２０１０）。例えば、エタネルセプトは、膜貫通形式の腫瘍壊死因子αが重要な役割を果たす肉芽腫性疾患の発病に対して臨床的に有効ではない（２００８、Ｍｉｔｏｍａ）。よって、抗腫瘍壊死因子αの試薬が、膜貫通形式の腫瘍壊死因子αと結合して、抗体依存性細胞媒介性障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、アポトーシス、及び外から内へのシグナル伝達メカニズムをトリガーすることができるかどうかが必要条件である。
臨床実験におけるマウスモノクローナル抗体の使用による主な障害は、患者にヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）が生じる可能性があるということである（Ｏｗｅｎｓ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、１９９４；Ｓａｎｄｈｕ、１９９２；Ｓｃｈｒｏｆｆら、１９８５）。よって、臨床使用の効果を改善するため、遺伝子工程技術を使用して、マウスに属するアミノ酸残基をヒトに対応するアミノ酸残基に置換して、患者の免疫原生の誘発の可能性を減少させることが行なわれている。
理想的な抗体のヒト型化は、抗原に対する特異性と親和性を維持すると共に、できる限り、免疫原性を低下させることができる。これまでのところ、抗体のヒト型化は、既に、多くの方式により行なわれており、例えば、マウス抗原と可変領域を結合して、ヒト抗体の定常領域に遺伝子的に融合してなるキメラ抗体が最も早期に試され、免疫原性を減少させている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４）。しかし、キメラ抗体には、所望でない抗可変領域反応が生じる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９８９）。もう一つの方式は、相補性決定領域移植法（ＣＤＲ−ｇｔａｆｔｉｎｇ）であり、齧歯目抗体の相補性決定領域を、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）に転移することを含む（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）。残念ながら、相補性決定領域とＦｖフレームワークとの接触面の変化により、抗原との結合が激しく妨害される。最初の相補性決定領域移植抗体は、親の結合親和性を失う傾向にあるので、相補性決定領域のループ構造にとって極めて重要であると見なされるマウスフレームワークアミノ酸の復帰突然変異のための別の作業が必要である（Ｑｕｅｅｎら、１９８９）。可変領域表面再構成（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）によるヒト化は、親抗体の特異性と結合親和性を維持することができる別のアプローチであり、マウスＦｖフレームワーク中の表面に露出する残基を、一般のヒト抗体中に見出される表面露出残基に代替させることにより、抗体の免疫原性を減少させることができる（Ｆｏｎｔａｙｎｅら、２００６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４；Ｓｔａｅｌｅｎｓら、２００６；Ｚｈａｎｇら、２００５）。現在の分子生物技術は、このアミノ酸を変化させる方法を更に容易にしているが、特に、信頼できる抗体のコンピュータモデルが必要であるとき、溶剤中の表面に露出する残基を確認することは依然として困難である（Ｆｏｎｔａｙｎｅら、２００６）。
本発明の目的は、膜貫通型腫瘍壊死因子αと結合する能力を有するヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、並びにヒト化モノクローナル抗体を提供することにある。更に本発明の他の目的は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせ、膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和し得、膜貫通型腫瘍壊死因子αに関する疾病を治療する薬物の調製に用いられるヒト化モノクローナル抗体を提供することにある。
本発明に係るヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号１の配列を含む軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、及び配列番号２の配列を含む重鎖の可変領域のアミノ酸配列を含み、前記配列番号１の配列と前記配列番号２の配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、前記アミノ酸置換は、配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンのトレオニンへの置換、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、配列番号２の第２アミノ酸のリジンのグルタミンへの置換、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンのロイシンへの置換、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、および配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸のグリシンへの置換よりなる群から選択される少なくとも一つであり、且つ、前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
上記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αであることが好ましい。
また、本発明に係る他のヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号５の配列を含む軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、及び配列番号６の配列を含む重鎖の可変領域のアミノ酸配列を含み、前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
上記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αであることが好ましい。
本発明に係るヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列は、配列番号７の配列を含む軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列、及び配列番号８の配列を含む重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を含み、前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
上記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αであることが好ましい。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１の配列を含む軽鎖、及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号２の配列を含む重鎖を含み、前記配列番号１の配列と前記配列番号２の配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、前記アミノ酸置換は、配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンのトレオニンへの置換、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、配列番号２の第２アミノ酸のリジンのグルタミンへの置換、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンのロイシンへの置換、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、および配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸のグリシンへの置換よりなる群から選択される少なくとも一つであり、且つ、前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
上記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αであることが好ましい。
上記腫瘍壊死因子αは、放出型腫瘍壊死因子α、または膜貫通型腫瘍壊死因子αを含むことが好ましい。
上記ヒト化モノクローナル抗体の膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、約２０−４０ｎＭであることが好ましい。
本発明の他のヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖を含み、前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
上記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αであることが好ましい。
上記腫瘍壊死因子αは、放出型腫瘍壊死因子α、または膜貫通型腫瘍壊死因子αを含むことが好ましい。
上記ヒト化モノクローナル抗体の膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、約２０−４０ｎＭであることが好ましい。
また、本発明に係る膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和する方法は、ヒト化モノクローナル抗体を膜貫通型腫瘍壊死因子αに結合させる工程を含み、前記ヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖を含むところに要旨を有するものである。
また、本発明に係る抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせる方法は、ヒト化モノクローナル抗体を対象の膜貫通型腫瘍壊死因子αに結合させる工程を含み、前記ヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖を含むところに要旨を有するものである。
また、本発明に係る膜貫通型腫瘍壊死因子αに関する疾病を治療する薬物を調製する方法は、ヒト化モノクローナル抗体を提供する工程を含み、前記ヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖を含み、且つ、前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合するところに要旨を有するものである。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、膜貫通型腫瘍壊死因子αと結合する能力を有し、抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせることができる。従って、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせる用途や、膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和する用途や、膜貫通型腫瘍壊死因子αに関する疾病を治療する薬物の用途などに応用することができる。
図１は、精製されたｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。ｍ３５７ＩｇＧ（レーン１と２）とｈ３５７ＩｇＧ（レーン３およびレーン４）は、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞で発現され、蛋白質Ａカラムにより培養基から精製された。サンプルは、非還元状態（レーン１と３）と還元状態（レーン２と４）下で、ＭＯＰＳバッファ溶液により、４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルで電気泳動された。ゲルはクアシンブルーで染色された。Ｍは分子量標準品である。 図２は、ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖ｃＤＮＡとｍ３５７ＩｇＧの重鎖ｃＤＮＡの電気泳動分析の結果をそれぞれ示す図である。 図３Ａは、ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域および軽鎖可変領域について、最終の正確な構造を示す図である。 図３Ｂは、ｍ３５７ＩｇＧの分子表面モデルを示す図である。 図４は、ｍ３５７ＩｇＧとＰＰＳ４の重鎖可変領域ＶH（Ａ）、及び軽鎖可変領域ＶL（Ｂ）のアミノ酸配列を示す図である。ｍ３５７ＩｇＧのヒト化のためのヒト表面殘基のアクセプタとして用いたｍ３５７ＩｇＧ Ｆｖと最も相同性が高かったＰＰＳ４ Ｆｖ配列を、比較のため、ＰＰＳ４ＶLおよびＰＰＳ４ＶHとして示す。ＣＤＲ殘基を括弧（［ ］）中に示し、保存表面殘基を白色フレームで表示し、非保存表面殘基を灰色フレームで表示した。Ｋａｂａｔの慣例（Ｋａｂａｔ、１９９１）に基づいて、アミノ酸配列をナンバリングした。 図５は、ｍ３５７−ＩｇＧ抗体とｈ３５７−ＩｇＧ抗体による、Ｌ９２９細胞中の腫瘍壊死因子α媒介細胞毒性の中和を示す図である。種々の濃度のｍ３５７−ＩｇＧ（●）抗体とｈ３５７−ＩｇＧ（○）抗体をＬ９２９細胞に加え、１００ｎｇ／ｍｌのヒト腫瘍壊死因子αと共に培養した。３７℃で１６時間培養した後、比色ＭＴＴ分析により、細胞の生存を分析した。 図６は、ｍ３５７−ＩｇＧ抗体とｈ３５７−ＩｇＧ抗体の細胞表面上の膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する飽和結合分析を示す図である。膜貫通型腫瘤壞死因子αトランスフェクトＮＳ０細胞を、ｍ３５７−ＩｇＧ（○）またはｈ３５７−ＩｇＧ（●）抗体の連続希釈物（対数希釈）と共に４℃で１時間培養した。これらの細胞を３回洗浄し、それぞれ、ｍ３５７−ＩｇＧに反応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と、ｈ３５７−ＩｇＧに反応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と共に４℃で１時間培養した。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析した。 図７は、膜貫通型腫瘍壊死因子α発現細胞に対するｈ３５７ＩｇＧの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す図である。膜貫通型腫瘍壊死因子α発現細胞を異なる濃度のｈ３５７ＩｇＧ抗体の存在下で１時間培養した。その後、ヒト末梢血単核球ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、膜貫通型腫瘍壊死因子α発現細胞を目標細胞として用いた。細胞質ゾルから上澄み液に遊離するＬＤＨ量を測定することにより、細胞毒性を計算した。この結果を、溶解バッファ処理細胞群に対して１００％溶解した細胞溶解率として示す。
本発明の一態様において、本発明は、ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列を提供する。上記ヒト化モノクローナル抗体は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）と結合し、腫瘍壊死因子αはヒト腫瘍壊死因子αであっても良い。上述のヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明によるヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列、重鎖可変領域のアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンＧ抗体の定常部のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本発明によるヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列は、腫瘍壊死因子αと結合することができる非ヒトモノクローナル抗体に対し、可変領域表面再構成を行なうことにより得られる。
まず、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列を得る。一実施形態において、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体を含んでいても良い。このマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を含み、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を含む。
続いて、前述の腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列に基づいて、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列の分子モデルを構築すると共に、非定常表面残基をラベルする。一実施形態において、分子モデリングプロセスは、コンピュータアシストホモロジーモデリングにより行なうことができる。
その後、非ヒトモノクローナル抗体の可変領域（軽鎖可変領域と重鎖可変領域）と同一性が最も高いヒト配列を探すと共に、両者を比較して、非ヒトモノクローナル抗体の可変領域（軽鎖可変領域と重鎖可変領域）アミノ酸配列の置換可能な残基を決定する。最後に、この置換可能な残基は、非ヒトモノクローナル抗体の可変領域の置換可能な残基の位置に対応する位置に存在する、ヒト配列に対応するアミノ酸残基に置換されて、腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列を獲得する。
一実施形態において、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を含み、且つ、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を含んでいる。非ヒトモノクローナル抗体の可変領域と最も相同性が高い配列を有するヒト配列は、ＰＰＳ４の軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号３）と重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号４）である。この実施形態において、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して行われる置換は、少なくとも以下の一つを含む：配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンはトレオニンに置換され、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第２アミノ酸のリジンはグルタミンに置換され、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンはロイシンに置換され、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸はグリシンに置換される。よって、得られた腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号１の軽鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号２の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１の配列と配列番号２の配列は少なくとも以下の置換の一つを含む：配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンはトレオニンに置換され、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第２アミノ酸のリジンはグルタミンに置換され、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンはロイシンに置換され、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸はグリシンに置換される。
別の実施形態において、前述の腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を含み、非ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を含んでいる。非ヒトモノクローナル抗体の可変領域と最も同一性が高いヒト配列は、ＰＰＳ４の軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号３）と重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号４）である。上述した配列比較実行後に得られた腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５を有し、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含む。
よって、本発明の別の態様によれば、本発明はまた、上述したヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列も提供する。本発明のヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列と重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、本発明によるヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のヌクレオチド配列であり、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、重鎖可変領域のヌクレオチド配列、およびヒト免疫グロブリンＧ抗体の定常領域のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号５の配列をエンコードするヌクレオチド配列を含み、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号６の配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号５の配列をエンコードするヌクレオチド配列は配列番号７の配列であり、配列番号６の配列をエンコードするヌクレオチド配列は配列番号８の配列である。
本発明の別の態様において、本発明は更に、ヒト化モノクローナル抗体を提供する。このヒト化モノクローナル抗体は腫瘍壊死因子αと結合し、腫瘍壊死因子αは、ヒトの腫瘍壊死因子αであっても良い。ヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖と重鎖を含む。一実施形態において、本発明によるヒト化モノクローナル抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体であり、一本鎖は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、およびヒト免疫グロブリンＧ定常領域を含む。
一実施形態において、本発明によるヒト化モノクローナル抗体は、以下のステップにより得られる。
まず、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド断片およびその配列と、重鎖可変領域ヌクレオチド断片およびその配列を得る。一実施形態において、上述の非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド断片（ｃＤＮＡ）は、非ヒトモノクローナル抗体を生成することができるハイブリドーマの総ＲＮＡを抽出した後、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のそれぞれに対応する二個のプライマー対により、総ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことによって得られる。次いで、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド断片の配列をそれぞれ決定した後、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド配列を得る。一実施形態において、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体はマウス抗体を含む。このマウス抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有し、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を有する。
続いて、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド配列に基づいて、それぞれ、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列を獲得する。一実施形態において、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を有し、非ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を有する。
その後、前述の腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列により、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域の分子モデルを構築すると共に、非定常表面残基をラベルする。一実施形態において、分子モデリングプロセスは、コンピュータアシストホモロジーモデリングにより行なう。
続いて、本発明による腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列と最も同一性が高いヒト配列を探すと共に、両者の比較を実行して、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の可変領域（軽鎖可変領域と重鎖可変領域）アミノ酸配列の置換可能な残基を決定する。最後に、前述の腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列のヌクレオチド配列を、置換可能な残基の対応位置でエンコードして、点変異により、この残基位置に対応するヒト配列の残基をエンコードするヌクレオチドに置換して、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド断片と重鎖可変領域のヌクレオチド断片を獲得する。
その後、本技術領域で熟知される方法により、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド断片と重鎖可変領域のヌクレオチド断片と、既知のヒト抗体定常領域ヌクレオチド断片を、それぞれ、適切な発現ベクターにクローン化し、この発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすると、宿主細胞は、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体を発現する。
一実施形態において、非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を有し、且つ、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を有する。前述の非ヒトモノクローナル抗体の可変領域（軽鎖可変領域アミノ酸配列および重鎖可変領域）アミノ酸配列と相同性が最も高いヒト配列は、ＰＰＳ４の軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号３）と重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号４）である。この実施形態において、腫瘍壊死因子αと結合する非ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して行なわれる置換は、少なくとも以下の一つを含む：配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンはトレオニンに置換され、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第２アミノ酸のリジンはグルタミンに置換され、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンはロイシンに置換され、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンがアルギニンに置換され、配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸はグリシンに置換される。よって、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号１の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号２の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１の配列と配列番号２の配列は、少なくとも一つの以下のアミノ酸置換を含む：配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンはトレオニンに置換され、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第２アミノ酸のリジンはグルタミンに置換され、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンはロイシンに置換され、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンはアルギニンに置換され、配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸がグリシンに置換される。
別の実施形態において、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１の配列を含み、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２の配列を含む。本発明による腫瘍壊死因子αと結合するモノクローナル抗体の可変領域（軽鎖可変領域および重鎖可変領域）アミノ酸配列と相同性が最も高いヒト配列は、ＰＰＳ４の軽鎖可変領域配列（配列番号３）と重鎖可変領域配列（配列番号４）である。上記のようにして配列を比較した後、得られた腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号５の軽鎖可変領域を含み、配列番号６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。よって、本発明による腫瘍壊死因子αと結合するヒト化モノクローナル抗体は、配列番号５の軽鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号６の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
本発明のヒト化モノクローナル抗体と結合する腫瘍壊死因子αは、放出型腫瘍壊死因子α、または膜貫通型腫瘍壊死因子αを含む。本発明のヒト化モノクローナル抗体の放出型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、約２０−４０ｎＭであり、好ましくは、約１０−２０ｎＭである。
更に本発明のヒト化モノクローナル抗体の膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は約２０−４０ｎＭであり、好ましくは、約１０−２０ｎＭである。一実施形態において、本発明のヒト化モノクローナル抗体の膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は約１６．８ｎＭである。
更に一実施形態において、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、細胞上で発現される膜貫通型腫瘍壊死因子αと結合することにより、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を生じる。
現在分かっていることは、膜貫通型腫瘍壊死因子αと多くの疾病が関係しているということである。例えば、細胞表面が発現する膜貫通型腫瘍壊死因子αのマクロファージ細胞と単球細胞は、例えば、クローン病やウェゲナー肉芽腫症などの肉芽腫性疾患で重要な役割を果たしており、抗体依存性細胞媒介性細胞障害により、細胞を直接滅亡させる（Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒｔｓら、２００４）。
このように本発明のヒト化モノクローナル抗体は、膜貫通型腫瘍壊死因子αと結合する能力を有し、且つ、抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせる能力があるので、本発明の更なる態様において、本発明は、膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和するヒト化モノクローナル抗体の用途、および抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせるヒト化モノクローナル抗体の用途も提供する。
更に本発明のヒト化モノクローナル抗体は、膜貫通型腫瘍壊死因子αに相関する疾病を治療する薬物の用途にも応用できる。
材料と方法
Ａ．ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）と結合するマウスモノクローナル抗体
１．ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体の獲得と精製
ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞株３５７−１０４−４（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９２０３０６０３）（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーから購入）をマウス腹腔内に注射し、マウスに腫瘍と腹水を生じさせた。生成したマウス腹水は、大量のヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）を含む。上述のステップは、ＧｌｙｃｏＮＥＸ Ｉｎｃ．（http://www.glyconex.com.tw/）に委託して行なった。
続いて、この腹水をマウスから取り出し、腹水をプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア）に通して精製し、ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）を獲得した。
２．ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）のｃＤＮＡ配列の獲得
（１）ハイブリドーマ細胞株３５７−１０４−４（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９２０３０６０３）の総ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔにより抽出した。
（２）アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製のＬｉｇｈｔ Ｐｒｉｍｅｒ ＭｉｘとＨｅａｖｙ Ｐｒｉｍｅｒｓの二個のプライマー対により、総ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖と重鎖のｃＤＮＡをそれぞれ、獲得した。
（３）この軽鎖と重鎖のｃＤＮＡを、それぞれ、ＴＯＰＯベクター上にクローン化して、二個のクローンを得た。
（４）ＤＮＡ配列決定後、制限酵素部位を有する二個のプライマー対を設計した。
（５）制限酵素部位を有する二個のプライマー対を合成した。
ここで、ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖のｃＤＮＡに用いるプライマー対は以下のとおりである：
３５７ＶＬ’Ａｓｃプライマー:
5’-CAGGCGCGCCGAAATTGTGCTGACCCAGTC-3’（配列番号１１）
３５７ＶＬ３’Ｇｌｉｎｋプライマー：
5’-CCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCAATTTCCAGCTTGC-3’（配列番号１２）。
ｍ３５７ＩｇＧの重鎖のｃＤＮＡに用いるプライマー対は以下のとおりである：
３５７ＶH５’Ｇｌｉｎｋプライマー：
5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGTGAAACTGCAGGA-3’（配列番号１３）
３５７ＶH３’Ｎｏｔ：
5’-CAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’（配列番号１４）。
その後、ステップ（３）で形成された２つのクローン中でポリメラーゼ連鎖反応を行なって、ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖と重鎖のｃＤＮＡを増幅させた。
Ｂ．再構成のための、ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）のコンピューターモデリング
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏモデリング２．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、カナダ）を使用して、ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）のホモロジーモデリングプロセスを行なった。ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖可変領域（ＶL）と重鎖可変領域（ＶH）に対し、二個の別々のＢＬＡＳＴＰ検索を行なった。蛋白質データバンク（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中で検索することによって配列を分析し、ｍ３５７蛋白質配列のホモロジーを同定した。マウス抗乳癌抗体Ｆａｂ断片の重鎖可変領域ＳＭ−３［ＰＤＢ ｅｎｔｒｙ：１ＳＭ３］（Ｄｏｋｕｒｎｏら、１９９８）と抗サーマス・アクタチクス(ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ)ＤＮＡ ポリメラーゼＩモノクローナル抗体Ｆａｂ断片の軽鎖可変領域構造［ＰＤＢ ｅｎｔｒｙ：１ＡＹ１］（Ｍｕｒａｌｉら、１９９８）のホモロジーモデリングに基づいて、ｍ３５７ＩｇＧ Ｆｖ断片の三次元（３Ｄ）構造を構築した。最終的な三次元モデルは、ＭＯＤＥＬＬＥＲモジュール（Ｓａｌｉら、１９９５）により生成され、空間的拘束を満足させる（ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）ことにより、比較蛋白質構造モデリングの自動方法を行なった。ｍ３５７ＩｇＧに対し、蛋白質ホモロジーモデリングおよびループモデリングを自動的に行なった。モデル抗体ループ（Ｍｏｄｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｏｏｐｓ）モジュールを使用することにより、最高の配列鑑別度で、ＰＤＢデータベースからテンプレート構造を選択してＣＤＲループのモデル構築を行い、、且つ、ループ精製モジュールを使用して、ＣＤＲループのモデル構築を完全にし、立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ）を最小化すると共に、正確な結合距離と角度を確認した。その後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏモデリング２．１中のＣＨＡＲＭｍ（Ｂ．Ｒ．Ｂｒｏｏｋｓ、１９８３）プログラムと、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＣＨＡＲＭｍ ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄにより、構造のエネルギーを最小化して、このモデル全体を更に純化した。構造のエネルギー最小化は、二つのステップで行なった。まず、抑制最急降下最小化（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ｄｅｓｃｅｎｔ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を５０００ステップいった後、続いて、フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）のαカーボンが、適切な位置で維持固定されるまで、共役勾配最小化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を５０００ステップ行なった。ＡＲＥＡＩＭＯＬプログラム（ＣＣＰ４、１９９４）により、三次元モデル上で、ｍ３５７ＩｇＧ残基の溶媒接近表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ）を計算した。相対接近が３０％以上の残基は、接近可能であると定義した。
Ｃ．ＩｇＧの構築、発現および精製
オーバーラッピングＰＣＲにより、ｍ３５７ＩｇＧのヒト化可変領域（軽鎖可変領域および重鎖可変領域）をエンコードするｃＤＮＡ断片を獲得した。続いて、ヒトＩｇＧからの定常領域配列とオーバーラッピングＰＣＲにより合成される可変領域配列を、哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（重鎖）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡ（軽鎖）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、サブクローニングした。その後、ＥｃｏＲＶ制限酵素認識部位を利用して、二個の構築体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を融合させ、ｐＳｅｃ−ｐｃＤＮＡ−ｈ３５７−ＩｇＧを生成した。メーカーの使用説明書により、エフェクテン(Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、重鎖と軽鎖遺伝子を含むプラスミドを、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞（ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、英国）中でトランスフェクトさせた。ハイグロマイシン(Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ)（４００μｇ／ｍｌ）で４週間抽出した後、安定したクローンを、無血清の既知組成培地ＨｙＱＮＳ０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの初期播種密度にてシェーカー中で培養した。３７℃で５日間後の培養基を取り出し、蛋白質Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ−ｃａｒｅ）クロマトグラフィにより、抗体を上澄みから精製した。
Ｄ．抗腫瘍壊死因子αの中和効力分析
既知の方法（Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｎ、１９８７）に従って、アクチノマイシンＤで処理されたマウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＬ−１）により、ヒト腫瘍壊死因子αに対するｍ３５７ＩｇＧおよびｈ３５７ＩｇＧの中和活性を測定した。要約すると、Ｌ９２９細胞を、９６ウェルプレート中に３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで三回播種すると共に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で１６時間培養した。その後、幾つかの抗体希釈液を調製し、アクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中に入れ、３７℃で１６時間培養した。上清を除去した後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、３７℃で４時間培養した。その後、ＳＤＳ溶液（１０％）をウェル中に加えた。室温で２４時間培養した後、色度計により、各ウェル中の色が紫色に変化するのを記録した。５７０ｎｍで測定される溶出の光学密度（ＯＤ）を測定した結果、生存細胞の数量と正の相関が見られた。ブランクの対照群（培養物のみ）、腫瘍壊死因子αの対照群（腫瘍壊死因子αのみ）、および抗体の対照群（抗体のみ）もまた、上記実験中で行なわれた。シグマプロットソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カナダ）を用いて複雜なＳ状非線形回帰（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｇｍｏｉｄ ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）分析によりＥＤ50値を計算した。
Ｅ．ＮＳ０細胞上の膜貫通型腫瘍壊死因子αの安定した発現
既知の技術（Ｐｅｒｅｚら、１９９０）で示されるように、抵抗腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＮＦ−α ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ＴＡＣＥ）媒介開裂に対して耐性がある欠失変異体膜貫通腫瘍壊死因子αを、部位特異的変異導入法によって生成した。非開裂形式の膜貫通腫瘍壊死因子αでは、天然の膜貫通腫瘍壊死因子αのアミノ酸＋１〜＋１２が削除された。非開裂形式の膜貫通腫瘍壊死因子α遺伝子は、ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化されると共に、エフェクテンにより、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞にトランスフェクトされ、細胞表面上で膜貫通腫瘍壊死因子αを発現させた。
Ｆ．ｍ３５７−ＩｇＧとｈ３５７−ＩｇＧの膜貫通腫瘍壊死因子αに対する飽和結合分析
膜貫通腫瘍壊死因子αトランスフェクトＮＳ０細胞を、ｍ３５７−ＩｇＧとｈ３５７−ＩｇＧの連続希釈物（対数希釈）と共に、２％のウシ胎仔血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（蛍光活性化細胞分類［ＦＡＣＳ］バッファ）中にて４℃で１時間培養した。この細胞を、蛍光活性化細胞分類バッファで３回洗浄した後、それぞれ、ｍ３５７−ＩｇＧのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とｈ３５７−ＩｇＧのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により、４℃で１時間染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロー血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カナダ）により蛍光強度を測定した。
Ｇ．抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）の分析
目標物質であるｈ３５７−ＩｇＧの抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性を、ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により測定し、製造メーカーの取扱説明書に基づいて、損傷した細胞のサイトゾルから遊離するＬＤＨ活性を測定した。要約すると、高度に表現された膜貫通腫瘍壊死因子αの細胞を、異なる濃度のｈ３５７抗体の存在下で、５％ＣＯ2インキュベーターのアッセイ培地（１％ＦＢＳ含有ＤＥＭＥ）中で１時間培養した後、エフェクター細胞として梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加えた（エフェクター細胞：目標細胞＝２０：１）。更に３７℃で１６時間培養した後、ウェル毎に１００μｌの上澄みを採取し、新しい９６−ウェルの平底プレート中に移した。ＬＤＨ基質（１００μｌ）を各ウェルに加え、避光下にて室温で３０分間培養した。サンプルの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーにより４９０ｎｍで測定した。溶解バッファにより最大放出（ｒｅｌｅａｓｅ）を決定した。以下の式により、特定の溶解百分率を計算した：％細胞毒性＝［実験例の放出−自然放出］／［最大放出−自然放出］×１００。
結果
Ａ．ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体（ｍ３５７ＩｇＧ）
１．ヒト腫瘍壊死因子αと結合するマウスモノクローナル抗体の分析
精製したｍ３５７ＩｇＧに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行なった。この結果を図１のレーン１とレーン２に示す。レーン１は非還元状態における精製したｍ３５７ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果であり、レーン２は還元状態における精製したｍ３５７ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
２．ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖と重鎖のｃＤＮＡ
ポリメラーゼ連鎖反応により得られたｍ３５７ＩｇＧの軽鎖と重鎖のｃＤＮＡについて電気泳動分析を行なった。この結果を図２に示す。レーン１はｍ３５７ＩｇＧの軽鎖のｃＤＮＡ（配列番号９）であり、レーン２はｍ３５７ＩｇＧの重鎖のｃＤＮＡ（配列番号１０）である。
Ｂ．ｍ３５７可変断片の分子モデリング
ＲＴ−ＰＣＲにより、ハイブリドーマ細胞株３５７−１０１−４（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ９２０３０６０３）からの抗腫瘍壊死因子αモノクローナル抗体ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域（ＶH）および軽鎖可変領域（ＶL）をエンコードしたｃＤＮＡ（データは示さず）を得た。「材料と方法」中に記載したホモロジーモデリング（ｐｒｏｇｒａｍ ＭＯＤＥＬＬＥＲ）により、それぞれ、ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域ＶH、および軽鎖可変領域ＶLの推定アミノ酸配列の三次元構造を構築した。その後、ＰＤＢからの１ＳＭ３（配列同一性および相似性が、それぞれ、８７％と９３％）テンプレート構造が１．９５Å、ＰＤＢからの１ＡＹ１（配列同一性および相似性が、それぞれ、８５％と９１％）テンプレート構造が２．２０Åの解析度で、ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ、モデリングした。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏモデリング２．１プログラムにより、ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域ＶHおよび軽鎖可変領域ＶLの最終の正確な構造を獲得した。この結果を図３Ａに示す。
図３Ａは、ｍ３５７ＩｇＧの可変領域を示す図である。ｍ３５７ＩｇＧの三次元構造は、それぞれ、重鎖可変領域に対応する１ＳＭ３と軽鎖可変領域に対応する１ＡＹ１の結晶構造を比較するホモロジーモデリングにより生成した。ＣＤＲループを太線で示す。図３Ｂは、ｍ３５７ＩｇＧの分子表面モデルを示す図であり、非ヒト様（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｌｉｋｅ）表面残基とＣＤＲループの関係を示す。相対溶媒接近が３０％以上の１７個の残基は、非ヒト様の表面残基であり、太い矢印で示す。ＣＤＲループを太線で示す。５Å内のＣＤＲループに近い残基（点線の円）を点線矢印で示す。好ましくは「ヒト」アミノ酸に突然変異する６個の残基を実線矢印で示す。重鎖可変領域フレームワーク中の４個の残基をヒト化のために決定し、軽鎖可変領域フレームワーク中の２個の残基のみヒト化のために決定した。
Ｃ．ｍ３５７ＩｇＧ可変領域断片のヒト化
可変領域再構成によるヒト化は、最初にＰａｄｌａｎが１９９１年に提案した。この方法では、抗体のフレームワーク領域中の潜在抗原部位は排除され、抗体の抗原親和性に影響しない（Ｐａｄｌａｎ、１９９１）。この方法は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が、表面残基から派生する可変領域だけに反応することを前提としており、他の研究者（Ｆｏｎｔａｙｎｅら、２００６；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８；Ｓｔａｅｌｅｎｓら、２００６）により採用され改変されてきた。本実施例では、以下の三つのステップにより、ｍ３５７ＩｇＧの可変領域再構成を行なった。まず、ｍ３５７ＩｇＧの重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれ構築した。次に、ＡＲＥＡＩＭＯＬプログラムを使用して溶媒接近可能残基を計算し、非ヒト様のフレームワーク表面残基を同定した。最後に、ヒトフレームワークの配列アライメント結果に基づいて、これらの表面残基を、ヒトの対応表面残基に突然変異させた。可変領域上で、マウスｍ３５７ＩｇＧの非ヒト様フレームワーク表面残基を置換するため、ヒト目標配列から、一組の高度に相同性を有する表面残基を選択した。ＩＭＧＴデータベース（http://imgt.cines.fr/）中で検索を行い、検索結果から、ファージ提示法、またはヒト化抗体の配列を排除して、ｍ３５７ＩｇＧと対応する可変領域に対し、相同性が最も高いヒト重鎖可変領域と軽鎖可変領域の配列ペアを同定した。ヒト配列で見出される最も同一性の高い表面残基は、ＰＰＳ４の可変領域である（フレームワーク領域中の配列同一性は、それぞれ、重鎖可変領域；７６％、軽鎖可変領域：７３％）（図４）。ＡＲＥＡＩＭＯＬプログラムの計算結果に基づいて、重鎖可変領域中の２０個の表面残基のうち８個は、ヒトとマウスの配列間で非保存的であり、軽鎖可変領域中の１６個の表面残基のうち９個は非保存的であった。これら１７個（８個＋９個）の表面残基は、置換の候補者であった。しかし、ＣＤＲ領域中の重鎖Ｈ５２ＢＱ、重鎖Ｈ５２ＣＳ、重鎖Ｈ５４Ｎ、重鎖Ｈ６１Ｅ、軽鎖Ｌ３１Ｆ、軽鎖Ｌ５５Ｓ、軽鎖Ｌ９０Ｗ、軽鎖Ｌ９２Ｄ、軽鎖Ｌ９３Ｙ、および軽鎖Ｌ９６Ｒの置換は、ＣＤＲのコンフォメーションを潜在的に変化させ、軽鎖中のＣＤＲ２近くの５Å内の余分な非定常表面残基であるＬ５９Ｖも、結合親和性に潜在的に影響する（図３Ｂ）。その結果、これらの１１個のマウス残基は維持され、抗原親和性を保持する。最後に、残りの６個の残基を選択して、ヒト保存残基に置換した。ＰＰＳ４と比較すると、軽鎖可変領域の第１０の比較位置におけるイソロイシンはトレオニンに置換され（ｍ３５７ＩｇＧの軽鎖可変領域の第１０アミノ酸のイソロイシンがトレオニンに置換される）、第１８の比較位置のリジンはアルギニンに置換される（ｍ３５７軽鎖可変領域の第１８のアミノ酸のリジンがアルギニンに置換される）。ＰＰＳ４と比較すると、重鎖可変領域の第３の比較位置のリジンはグルタミンに置換され（ｍ３５７重鎖可変領域の第２アミノ酸のリジンがグルタミンに置換される）、第１１の比較位置のトリプトファンがロイシンに置換され（ｍ３５７重鎖可変領域の第１０アミノ酸のトリプトファンがロイシンに置換される）、第１９の比較位置のリジンがアルギニンに置換され（重鎖可変領域の第１８アミノ酸のリジンがアルギニンに置換される）、第４２の比較位置のグルタミン酸がグリシンに置換される（重鎖可変領域の第４１アミノ酸のグルタミン酸がグリシンに置換される）（図４）。
Ｄ．ヒト化３５７（ｈ３５７）ＩｇＧ1の構築と発現。
ｍ３５７ＩｇＧのヒト化重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、インフレームで、ヒトＩｇＧ1の重鎖とカッパ軽鎖定常領域に融合させた。完全なヒト化３５７（ｈ３５７）ＩｇＧ1分子を発現するため、二種の哺乳動物発現ベクターであるｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏとｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡを使用し、ｈ３５７ＩｇＧのヒト化重鎖と軽鎖をそれぞれ、導入した。その後、軽鎖発現カセットを重鎖発現ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏベクターに連接させ、単一の発現ベクターを得た。組み換えｈ３５７ＩｇＧの発現レベルは約１４ｍｇ／Ｌであった。蛋白質Ａクロマトグラフィにより、ｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧを含む培養基をそれぞれ、精製すると共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質精製物を決定した（図１）。図１に示すように、非還元状態下で、二つの抗体は、１５５ｋＤａの分子量を有する単一バンド（レーン１と３）を示した。還元状態下では、二つの抗体は、それぞれ５５ｋＤａ（重鎖）と２６ｋＤａ（軽鎖）の分子量を有する二つの蛋白質バンド（レーン２と４）を生成した。
Ｅ．ｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧによる腫瘍壊死因子α媒介細胞毒性の中和
抗腫瘍壊死因子α抗体の機能活性を調べるために、可溶性腫瘍壊死因子α活性を抑制する抗体の能力をテストした。腫瘍壊死因子αは、マウスＬ９２９細胞に対して細胞毒性を生じさせる。組み換えヒト腫瘍壊死因子α抗体および上記細胞の共培養により、Ｌ９２９アッセイでｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧを両方評価した。図５に示すように、１００ｎｇ／ｍｌのヒト腫瘍壊死因子αで処理されたＬ９２９細胞中の腫瘍壊死因子α媒介細胞毒性は、ｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧの両方により、用量依存的に効果的に中和され、ＥＤ５０値はそれぞれ、３．０７ｎＭと２．３０ｎＭであった。この結果は、ヒト化３５７ＩｇＧは、マウス３５７ＩｇＧと同程度の濃度で、腫瘍壊死因子αの中和活性を維持することを示している。
Ｆ．ｈ３５７ＩｇＧ抗体と膜貫通腫瘍壊死因子αとの結合活性
腫瘍壊死因子αは、膜関連の前駆体（膜貫通腫瘍壊死因子α）として存在し、腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＮＦ変換酵素、ＴＡＣＥ）により媒介される蛋白分解切断により成熟した可溶体が放出される。多くの研究により、腫瘍壊死因子α拮抗薬は、アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）、外側から内側へのシグナリングメカニズムにより、細胞溶解を生じることが調査されてきた（Ａｒｏｒａら、２００９；Ｃａｒｏｎら、１９９９；Ｍｉｔｏｍａら、２００８；Ｓｃａｌｌｏｎら、１９９５）。ｈ３５７ＩｇＧと膜貫通腫瘍壊死因子αとの結合能力を分析するため、膜貫通腫瘍壊死因子αの非開裂形式のｃＤＮＡを、ＮＳ０細胞にトランスフェクトして細胞膜上で発現させ、フロー血球計算器を用いてｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧの両方の結合活性を評価した。図６のデータは、ｍ３５７ＩｇＧとｈ３５７ＩｇＧは共に、濃度依存的に膜貫通腫瘍壊死因子αと結合することを示しており、ＫＤ値はそれぞれ、１２．０ｎＭと１６．８ｎＭである。同程度のＫＤ値は、ヒト化過程において、膜貫通ＴＮＦ−αの結合親和性を変化させないことを示す。ｈ３５７ＩｇＧがナノモル範囲の結合親和性を有することは、ｈ３５７ＩｇＧが、膜貫通腫瘍壊死因子αを介して、更に多くのエフェクター機能、またはアポトーシスメカニズムを潜在的にトリガーすることを示唆している。
Ｇ．ｈ３５７ＩｇＧの抗体依存性細胞媒介性細胞障害に対する能力
既知の文献で示されるように、インフリキシマブおよびアダリムマブの膜貫通腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、エタネルセプトよりも高く、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）、またはアポトーシスにより、細胞表面発現膜貫通腫瘍壊死因子αの細胞死滅作用に影響するが、これは、臨床疾病で異なる効果が生じる原因のひとつである（Ｔａｙｌｏｒ、２０１０）。細胞表面発現腫瘍壊死因子α様マクロファージと単球は、例えばクローン病やウェゲナー肉芽腫症などの肉芽腫性疾患において非常に重要な役割を果たしており、抗体依存性細胞媒介性細胞障害により、細胞を直接、死滅させる（Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒら、２００４）。腫瘍壊死因子α拮抗薬が膜貫通型腫瘍壊死因子α発現細胞に結合すると、これらの細胞は、ナチュラルキラー細胞のターゲットとされる。ヒトＩｇＧ1由来のＦｃ領域からなるｈ３５７ＩｇＧは、腫瘍壊死因子α産生細胞中で、潜在的に細胞溶解を生じる。よって、ｈ３５７ＩｇＧの、膜貫通腫瘍壊死因子α発現目標細胞に対するＡＤＣＣ仲介能力を評価するため、分離した末梢血単核球ＰＭＢＣを抗体依存性細胞媒介性細胞障害の分析に用いた。エフェクター細胞：目標細胞（Ｅ：Ｔ）は２０：１である。ｈ３５７ＩｇＧの濃度が６．２５ｕｇ／ｍｌのときに、腫瘍壊死因子α目標細胞の２０％以上が溶解した（図７）。これらのデータは、ｈ３５７ＩｇＧが、細胞表面で発現された膜貫通腫瘍壊死因子αとの結合によって抗体依存性細胞媒介性細胞障害を仲介することを示唆している。従って、ｈ３５７ＩｇＧは、ＡＤＣＣ能を有する治療抗体と同様、更に効果的な腫瘍壊死因子α中和抗体に発展する可能性を有している。
本発明では好ましい実施例を上記の通り開示したが、本発明は上記実施例に限定されず、当業者であれば、本発明の精神と領域を逸脱しない範囲内で各種の改変や調整を行なうことができ、このようなものも本発明の範囲内に包含される。
本願明細書中に記載した文献の詳細は、以下のとおりである。

Claims (17)

  1. ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列であって、
    配列番号１の配列を含む軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、及び
    配列番号２の配列を含む重鎖の可変領域のアミノ酸配列
    を含み、
    前記配列番号１の配列と前記配列番号２の配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、
    前記アミノ酸置換は、配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンのトレオニンへの置換、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、配列番号２の第２アミノ酸のリジンのグルタミンへの置換、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンのロイシンへの置換、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、および配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸のグリシンへの置換よりなる群から選択される少なくとも一つであり、且つ、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とするヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
  2. 前記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αである請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
  3. ヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列であって、
    配列番号５の配列を含む軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、及び
    配列番号６の配列を含む重鎖の可変領域のアミノ酸配列
    を含み、
    前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とするヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
  4. 前記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αである請求項３に記載のヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
  5. ヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列であって、
    配列番号７の配列を含む軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列、及び
    配列番号８の配列を含む重鎖の可変領域のヌクレオチド配列
    を含み、
    前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とするヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列。
  6. 前記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αである請求項５に記載のヒト化モノクローナル抗体のヌクレオチド配列。
  7. ヒト化モノクローナル抗体であって、
    軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１の配列を含む軽鎖、及び
    重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号２の配列を含む重鎖
    を含み、
    前記配列番号１の配列と前記配列番号２の配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、
    前記アミノ酸置換は、配列番号１の第１０アミノ酸のイソロイシンのトレオニンへの置換、配列番号１の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、配列番号２の第２アミノ酸のリジンのグルタミンへの置換、配列番号２の第１０アミノ酸のトリプトファンのロイシンへの置換、配列番号２の第１８アミノ酸のリジンのアルギニンへの置換、および配列番号２の第４１アミノ酸のグルタミン酸のグリシンへの置換よりなる群から選択される少なくとも一つであり、且つ、
    前記モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とするヒト化モノクローナル抗体。
  8. 前記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αである請求項７に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  9. 前記腫瘍壊死因子αは、放出型腫瘍壊死因子α、または膜貫通型腫瘍壊死因子αを含む請求項７に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  10. 前記ヒト化モノクローナル抗体の前記膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、約２０−４０ｎＭである請求項９に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  11. ヒト化モノクローナル抗体であって、
    軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び
    重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖
    を含み、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とするヒト化モノクローナル抗体。
  12. 前記腫瘍壊死因子αは、ヒト腫瘍壊死因子αである請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  13. 前記腫瘍壊死因子αは、放出型腫瘍壊死因子α、または膜貫通型腫瘍壊死因子αを含む請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  14. 前記ヒト化モノクローナル抗体の前記膜貫通型腫瘍壊死因子αに対する結合親和性は、約２０−４０ｎＭである請求項１３に記載のヒト化モノクローナル抗体。
  15. 膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和する方法であって、
    ヒト化モノクローナル抗体を膜貫通型腫瘍壊死因子αに結合させる工程を含み、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、
    軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び
    重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖
    を含むことを特徴とする膜貫通型腫瘍壊死因子αを中和する方法。
  16. 抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせる方法であって、
    ヒト化モノクローナル抗体を対象の膜貫通型腫瘍壊死因子αに結合させる工程を含み、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、
    軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び
    重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖
    を含むことを特徴とする抗体依存性細胞媒介性細胞障害を生じさせる方法。
  17. 膜貫通型腫瘍壊死因子αに関する疾病を治療する薬物を調製する方法であって、
    ヒト化モノクローナル抗体を提供する工程を含み、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、
    軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号５の配列を含む軽鎖、及び
    重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号６の配列を含む重鎖
    を含み、且つ、
    前記ヒト化モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子αに結合することを特徴とする膜貫通型腫瘍壊死因子αに関する疾病を治療する薬物を調製する方法。
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