JP2012080819A - 特定の細胞内に選択的に取り込まれる蛍光色素を利用して多種類の細胞から特定の細胞を純化濃縮する方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Abstract
【解決手段】長波長レーザー装置を搭載した細胞検出・分離装置及び古くより肝臓検査に用いられてきた安全性の高い長波長蛍光色素を肝細胞の指標として用いるという二つの方法を組み合わせることで、これまで極めて困難であった肝細胞を高い選択性で安全にかつ廉価,易操作性に検出、分離し、純化濃縮する。
【選択図】図5
Description
上記の使い捨て以外の方式は以下の方法が知られている。米国特許第3710933号(特許文献5)または米国特許第3826364号(特許文献6)に記述されている方法が現在一般的な製品に使用されている分離方法であって、液滴形成用ノズルから空気中に試料液を液滴として吐出し、分離対象の細胞を含む液滴は液滴単位で電場によって分離するという方法である。特開昭64−3541(特許文献7)は、フローセルを流れる試料液の周囲にシース流を流し、試料液に電場を加えることで帯電した粒子を試料流からシース流の法へシフトさせて分離計測する方法である。特開平1−170853(特許文献8)は、フローセルを流れる粒子に圧力パルスを与えて、フローセル内の定常的に流れている流路ではない流路に粒子を分離する方法が記載されている。国際公開番号WO98/10267(特許文献9)は、フローセル内に周囲をシース流でしぼって流した微粒子に場を与えて微粒子の流れをシフトさせて分離するという技術が公開されている。国際公開番号WO2004/101731(特許文献10)において、フローセル内の流路の両側に設置したゲル電極によって液体中で帯電している細胞を電場で分離する方法が公開されている。米国特許US6808075(特許文献11)において、粒子の流れに対して垂直にメニスカスを形成するバブルバルブにより圧力パルスを加えて流れをシフトさせて分離する方式が公開されている。PCT/US2006/000237 (特許文献12)は、特許文献8と同様に圧力パルスを与えるが目的とする粒子を含む水滴単位で射出してコンテナに回収方法である。米国特許第4756427号(特許文献13)には、シース流で絞られた試料液の流れの中の粒子を計測しターゲットとなる粒子であると判断した場合に、パルス流で別流路に導入して分離する方法が記載されている。使い捨てチップを利用するフローサイトメーターは特許4358888(特許文献14)に記載されている。
スーパーオキシドディスムターゼ(Superoxide dismutase;(以下、「SOD」という)は、生体内で酸素毒性を示す活性酸素を分解する酵素である。SODはその活性中心に銅(Cu)イオンと亜鉛(Zn)イオン、またはマンガン(Mn)イオンや、鉄(Fe)イオンなど、金属イオンをもった酵素で、細胞質やミトコンドリアに多く局在している。中でもマンガンイオンを持つ酵素は、マンガネーゼスーパーオキシドディスムターゼ(Manganese superoxide dismutase;以下「MnSOD」という)と呼ばれ、ミトコンドリア特有の酵素である。これらのSODは、活性酸素による細胞の損傷を防御する作用を有すると考えられている。
7)親水処理を施したチップを用いて細胞分離を行った後に、その分離した細胞をそのままチップ内で培養して、細胞品質を検証するためのスクリーニングを行うことを特徴とする細胞分離方法。
本発明は流路閉鎖系長波長セルソーターと安全性の高い廉価なICGを含む長波長の蛍光色素を組み合わせ、肝細胞を含む長波長蛍光色素を摂取した細胞を生きたまま汚染されずに純化濃縮する装置である。この装置は極めて強い細胞選択性を発揮できる簡便で易操作性の省力タイプのセルソーターである。
いずれも3−5%CO2インキュベータ内で、37℃で培養した。
図4は、細胞の大きさと蛍光強度を摂取したものとそうでないものとを比較した。
図5は、それらをヒストグラムで示した。
2…シース液流路
3…照射光
4−1…ソーティング流路(PULL側)
4−2…ソーティング流路(PUSH側)
5…ソーティングリザーバー
6…フィルター7−1、7−2…電磁バルブ
8−1…負圧定圧ポンプ
8−2…陽圧定圧ポンプ
9−1…分離対象である細胞
9−2…分離非対象の細胞
10…試料液リザーバー
11…回収試料液リザーバー
20…シース液リザーバー
22…シース液用ポート
23…シース液回収ポート
24…シース液回収ポート
25…チップ用基板
27…流路
31…試料液リザーバー
32 …シース液用ポート
34…廃液リザーバー
35 …回収試料液リザーバー
36 …試料液
37…シース液リザーバー
50−1…波長785nmのレーザー光源
50−2…波長473nmのレーザー光源
51 …対物レンズ
52…波長785nmと波長473nmのレーザー光
53…ソーティング流路4−1と4−2で挟まれた領域
54,55,56…ダイクロイックミラー
57,58,59…バンドパスフィルター
60…透過レーザー光遮断用空間フィルター
61…フォトダイオード
62,63…光電子増倍管
64…AD変換器
69…AD変換器
70…キーボード
71…ディスプレイ
Claims (8)
- 夾雑細胞群を含むサンプル液中のある特定細胞を分離・濃縮する方法であって、
蛍光抗体を用いずに、前記サンプル液中の前記特定細胞が生きた状態で特異的に内部に取り込む蛍光染色物質を利用して前記特定細胞を生きた状態で蛍光染色する工程、および
光照射によって発生する蛍光を検出することで、前記特定細胞を識別し分離する工程を含む、細胞分離濃縮方法。 - 前記夾雑細胞群がES細胞またはiPS細胞から分化した細胞群であり、前記特定細胞が肝細胞であり、前記染色に用いる化学物質はインドシアニングリーンであり、光照射に用いる波長は750nmから800nmの範囲であり、蛍光の検出波長は800nmから900nmの範囲である、請求項1に記載の細胞分離濃縮方法。
- 前記細胞を識別し分離する工程の前に前記サンプル液にスーパーオキシドディスムターゼあるいはマンガネーゼスーパーオキシドディスムターゼを事前に混入することで、細胞分離処理時の光照射によってインドシアニングリーンから発生する活性酸素を消滅させることを含む、請求項2に記載の細胞分離濃縮方法。
- 前記各工程を前記夾雑細胞群を含む前記サンプル液をマイクロ流路が形成されたチップ上で行うことを含み、
前記細胞が前記マイクロ流路を流れている状態で光照射を行い、特定細胞由来の蛍光を検出した時に発生する蛍光を検出した信号をもとに、そのマイクロ流路の側面に接続したソーティング流路を介して定圧空気ポンプを電磁バルブ経由で空気圧を、前記サンプルが流れる前記マイクロ流路の両側から短時間だけ作用させることで、前記特定細胞の流れを変化させてチップ内の分岐流路に分離することを含む、請求項1に記載の細胞分離濃縮方法。 - 前記マイクロ流路が形成された前記チップには、前記マイクロ流路の上流側と下流側に接続するリザーバーとソーティング流路が形成されており、
前記流路の上流側のリザーバーの上部空間に対して空気加圧あるいは下流側のリザーバーの上部空間に対して大気より陰圧とすることで、チップ内のサンプルの送液を非接触で行うことで、細胞サンプルがチップ内に閉じ込められた状態で前記各工程を行うことを含む、請求項4に記載の細胞分離方法。 - 親水処理を施したチップを用いて細胞分離を行った後に、その分離した細胞をそのまま前記チップ内で培養して、細胞品質を検証するためのスクリーニングを行うことを含む、請求項4に記載の細胞分離方法。
- インドシアニングリーンが選択的に肝細胞に取り込まれ、一時細胞内にとどまり、速やかに胆汁に排出することを利用することを含む、請求項2に記載の細胞分離法。
- マイクロ流路およびリザーバーを形成した樹脂製のチップであって、前記マイクロ流路および前記リザーバーの表面を親水処理を施すことで細胞培養プレートとして使用できる、マイクロ流路チップ。
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