JP2012050374A - グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】バレイショ等のナス科植物のグリコアルカロイド生合成酵素酵素活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を用いて新規の生物を作成・検定する方法。
【選択図】なし
Description
[1] 以下の(a)または(b)のタンパク質:
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(b) 配列番号1に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。
[2] 以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子;
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA;
(d) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(e) 配列番号2に示す塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(f) 配列番号2に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
(g) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(h) 配列番号3に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。
[4] 以下の(i)〜(l)のいずれかのDNAからなる遺伝子:
(i) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA;
(j) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(k) 配列番号4に示す塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、
グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(l) 配列番号4に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
[5] [2]または[4]の遺伝子を含有する組換えベクター。
[6] [5]の組換えベクターを導入した形質転換体。
[7] 植物体である[6]の形質転換体。
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号2、配列番号4または配列番号5に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異および/または多型の存在を決定する工程、
とを含む、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および/または多型の存在を検出する方法。
[9] 植物がバレイショ等のナス科植物である[8]の方法。
[10] [8]または[9]の方法によってグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および/または多型を検出し、突然変異および/または多型を有する植物体を選抜する方法。
[11] [10]の方法により選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異および/または多型を有する植物体。
[12] バレイショ等のナス科植物である[11]の植物体。
[13] グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするグリコアルカロイド生合成酵素の活性が、既存品種に対して変化している植物を選抜する、[8]または[9]の植物体を選抜する方法。
[14] [13]の方法によって選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能が既存品種に対して変化しているか、またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して変化している植物体。
[15] バレイショ等のナス科植物である[14]の植物体。
1.新規のグリコアルカロイド生合成酵素
本発明のタンパク質・酵素は、バレイショ等ナス科植物(Solanaceae)に含まれるグリコアルカロイド生合成酵素である。バレイショ等ナス科には、バレイショ(Solanum tuberosum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ナス(Solanum melongena)、トウガラシ(Capsium annum)等が含まれる。また、本発明の酵素は、膜結合型のチトクロームP450モノオキシダーゼである。本発明の酵素により得られるグリコアルカロイドは、バレイショ等のナス科植物に合成されるグリコアルカロイドが含まれ、例えばバレイショのチャコニン及びソラニン等のグリコアルカロイド、トマトのトマチン等のグリコアルカロイドが挙げられる。
本発明の遺伝子は、ステロイド化合物に水酸基を結合する活性を持つグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子であり、上記のグリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明のベクターは、上記配列番号2または配列番号4のDNAが挿入された組換えベクターである。ベクターとしては公知の酵母用、植物細胞用、昆虫細胞用等のものを広く使用できる。公知の酵母用ベクターとしてはpDR196、pYES-DEST 52、Yip5、Yrp17、Yep24などが挙げられ、公知の植物細胞用ベクターとしては、pGWB vector、pBiEl2-GUS、pIG121-Hm、pBI121、pBiHyg-HSE、pB119、pBI101、pGV3850、pABH-Hm1などが挙げられ、公知の昆虫細胞用ベクターとしては、pBM030、pBM034、pBK283などが挙げられる。本発明において使用されるベクターには、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の遺伝子の発現や抑制に関する構成要素が組込まれ、必要に応じて、選択マーカー(例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子)を含有する。遺伝子の発現や抑制に関する構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。形質転換体は、酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、酵母、植物細胞、昆虫細胞(Sf9など)、植物ウイルスなどが挙げられる。好ましくは、酵母、植物細胞または植物ウイルスなどが挙げられる。組換えベクターの導入方法は、微生物にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110(1972)]、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング(tri-parental mating)法等が挙げられる。また、形質転換植物体を作製する方法として、ウイルス、アグロバクテリウムのTiプラスミド、Riプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられる。宿主植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ等の双子葉植物が挙げられる。形質転換植物体は、本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞を再生させることにより得ることができる。植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行うことができる。
本発明のグリコアルカロイド生合成酵素は膜結合型のチトクロームP450モノオキシダーゼであり、通常の植物体から回収することができる[Collu ら, 2001, FEBS Lett. 508:215-220など]。さらには、例えば、本発明の遺伝子で形質転換した酵母等の微生物や昆虫細胞発現系を用いた大量生産により製造することができ、昆虫細胞の例としては、Morikawaら[2006, Plant Cell 18:1008-1022]のものが挙げられる。
本発明は、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子突然変異、一塩基多型(SNP)等の多型、遺伝子発現変異の存在を検出するための方法を提供する。変異個体は放射線によるもの、化学処理によるもの、UV照射によるもの、自然突然変異によるものであっても構わない。
グリコアルカロイド含量の分析方法および精製方法については、Matsudaら(Phytochem. Anal. 15:121-124, 2004)やKozukueら(J. Agric. Food Chem. 52: 2079-2083, 2004)等液体クロマトグラフィーを用いた方法が知られている。しかし、サンプルの前処理が煩雑であったり、検出限界が十分に高いものではない、強酸を用いるためカラムや装置への負荷が大きいといった課題がある。よって本発明では、GA類を効率的に精製し、且つ高い精度で分析できるアルカリ耐性の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーを用いた方法(該方法は、日本国特許出願 特願2009-170317として出願済み)を用いることが出来る。実施例5に本方法のジャガイモでの適用例を示す。
(実施例1)グリコアルカロイド生合成候補遺伝子Eの全長配列の取得
バレイショ(Solanum tuberosum)の品種「サッシー」の萌芽からmRNAの抽出をRNeasy(キアゲン社)で行った。全cDNAの合成はスーパースクリプト ファーストストランド システム(インビトロジェン社)を用いて行った。グリコアルカロイドのアグリコンはコレステロールからできるといわれているが確証はない(非特許文献1)。しかし、近縁の化合物から作られると仮定しても幾つかの水酸化の過程が必要になる。水酸化の過程には少なくともチトクロームP450型モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、NADPH-flavin リダクターゼの3種の可能性が考えられる。この中からP450型を標的に考え、バレイショの発現する遺伝子は公開されている情報のDFCI Potato Gene Index (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html) Release 11.0から萌芽で多くのESTクローンが単離されている遺伝子TC155233に注目した。
ゲノムDNAをRNeasy(キアゲン社)で「サッシー」から抽出した。実施例1と同じプライマー並びに(U904: TGATAAGGAAATCCTGGGAGA(配列番号8)、U901: AGAGAAGCCATGAAGGATGG(配列番号9))を用いて、さらに第2イントロンは酵素をPrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社)とプライマー(U898: GAAATACGCTACTACGGAAGAACC(配列番号10)とU899: CGTCATTTGCCTAATCTCATC(配列番号11))を用いてPCRを行い、全長ゲノムDNAの塩基配列を決定した(配列番号5)。イントロンは7箇所あることが明らかになった。
遺伝子を形質転換によって抑制する方法としては、強力なプロモーターで駆動する構成を持つ逆方向の相補鎖遺伝子断片の発現(植物で一般的にRNAi法と呼ばれる)で行った[Chuangと Meyerowitz Proc Natl Acad Sci U S A., 97, 4985-90 (2000)、WesleyらPlant J., 27, 581-90 (2001)]。実施例1で取得した全長cDNAに対し、プライマー[U675: GAGCTCTAGAGGTTTGGGACAGGAGGAAT (配列番号12)、U676: GGATCCATATGCAAGCCTGTGCATCTTAT (配列番号13)]を用いてPCR(条件:95℃5分、(95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒)を30回、72℃10分)を行い、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpKT11(特開2001-161373号公報)を基本として、カルフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、当該遺伝子断片を順方向、シロイヌナズナのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(AT4g14210)の第3イントロン、当該遺伝子断片を逆方向、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターの順に連結を行い、植物形質転換用ベクターpKT230を作成した(図2)。
実施例3で作製したベクターをエレクトロポレーション法(GelvinとSchilperoor編, Plant Molecular Biology Manual, C2, 1-32 (1994), Kluwer Academic Publishers)により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/lスクロ−ス、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5 mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために1mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5 mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
実施例4で得られた30個体のin vitro茎を継代後一ヶ月伸張させ、その部分2-4本をまとめて約100mgにしアルカリ耐性の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーを用いた以下の方法(該方法は、日本国特許出願 特願2009-170317として出願済み)によりグリコアルカロイド含量を測定した。
1. 試料の調製
実施例4で得られた30個体のin vitro茎を継代後一ヶ月伸張させ、その部分を2-4本をまとめて約100mgにし0.1%ギ酸 in 80%MeOH aq. 990μLおよび内部標準としてブラシノライド(ブラシノ)10μg/10μLを添加し、ミキサーミルで破砕した(1/25 sec, 5 min, 4℃)。得られた破砕物を遠心分離(10,000 rpm, 5 min)に供しアルコール沈殿を行った後、上清25μLを分取し、0.1%ギ酸水で500μLにフィルアップした。これを試料として、以下の条件でLC-MSに用いた。LC-MS装置は、LCMS-2010EV(島津製作所)を用いた。
(i)LC条件
LC系には、アルカリ耐性に優れたエチレン架橋カラム(XBridgeTM Shield RP18-5(φ2.1×150 mm, Waters社))を採用した。移動相には、移動相A:10 mM炭酸水素アンモニウム水(pH 10)および移動相B:MeCNを、上記試料溶媒についてA:B=40:60の割合でアイソクラティック条件で用いた。その他の条件は以下のものを用いた:
流速:0.2 mL/min
カラムオーブン:40℃
まず各成分のMSスペクトルをスキャンモードで確認し(図3参照)、その結果として検出法:SIMモード
m/z:481(ブラシノライド)、869(α−ソラニン)、853(α−チャコニン)
を用いた。
その他MS条件は以下のものを用いた。
MS検出:ポジティブイオンモード
イオン化法:ESI
イベント時間:1 sec
検出器電圧:1.5 kV
分析時間:8 min
α−ソラニン(和光純薬)2mgとα−チャコニン(シグマアルドリッチ)2mgをそれぞれ1mLの0.1%(v/v)ギ酸水に溶解した(それぞれ2μg/μL溶液)。2種類の溶液を等容で混和し、α−ソラニンとα−チャコニンが1μg/μL(=1000ng/μL)の溶液を調製した。これを0.1%(v/v)ギ酸水で段階的に10倍希釈後、LC-MSに供して検量線を作製した。また、両物質の検出限界値を求めた。
上記1.にて調製した各試料の10μLまたは20μLを上記条件を用いたLC-MS系にインジェクトした。
正を行い、各試料に含まれるα-ソラニンおよびα-チャコニンの量について上記検量線を用いて定量し、試料100 mg(FW)あたりに含まれる量として算出した。
当該分析における典型的クロマトグラムを図6に示す。
トマトの形質転換は[Sunら (2006) Plant Cell Physiol. 47:426-431.]に従い実施した。(実施例3)で作製したベクターpKT230を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を培養し感染用菌液とした。トマト(Solanum lycopersicum)実験系統「マイクロトム」の無菌播種植物体の子葉を5mm以下の切片を、上記のアグロバクテリウム懸濁液に浸し、10分間感染した後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内の共存MS培地(ゼアチン1.5mg/l、アセトシリンゴン40μM及びゲルライト0.3%を含む)[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]上に葉を置き、シャーレを暗所で3日間25℃で培養した。切片は選択MS培地1(ゼアチン1.5mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)で25℃、16時間照明(光量子束密度32μE/m2s)/8時間無照明の条件下で2週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。さらにシュートを伸張させるため、選択MS培地2(ゼアチン1.0mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)に移植し、伸張したシュートは選択1/2濃度MS培地(カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)で発根させた。シュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、PCR(条件:95℃5分、(95℃30秒、55℃30秒、72℃1分)を30回、72℃10分)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。ここで、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、TAAAGCACGAGGAAGCGGT(配列番号18)、及びGCACAACAGACAATCGGCT(配列番号19)を用いた。以上から、ベクターpKT230が導入されたトマトの形質転換植物体13系統を取得した。得られた13個体を温室に馴化し約1ヶ月栽培し、新しく展開した若い葉の3枚から各約100mg秤量し、バレイショと同様にアルカリ耐性の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーを用いた実施例5の方法によりグリコアルカロイド含量を測定した。ただし、分析条件は、移動相には、移動相A:10 mM炭酸水素アンモニウム水(pH 10)および移動相B:MeCNを、上記試料溶媒についてA:B=60:40の割合でアイソクラティック条件を用いた。13系統のうち4系統は対照の1/5である新鮮重100mgあたり280μg以下と顕著にトマチン含量が低かった(図10)。
バレイショの品種「サッシー」を量子ビーム照射(NIRS-HIMAC照射装置、アルゴンイオンビーム500MeV/核子を0.1から3Gyまたは、ネオンイオンビーム400Mev/核子を0.2から3Gy、または炭素イオンビーム290MeV/核子を0.5Gyから5Gy)で変異処理を行ったin vitroの植物体(キリンアグリバイオ(株)岡村主研分譲)の10個体からそれぞれ葉を採取しDNeasyでゲノムDNAを採取した。これをプライマー[U890: GAGGCTAAGAAAAAGAGAGAGAGA (配列番号6)、U889:CGTTCTACAAAAACATCCAATTT (配列番号7)U904: TGATAAGGAAATCCTGGGAGA(配列番号8)、U901: AGAGAAGCCATGAAGGATGG(配列番号9))、さらに第2イントロンは酵素をPrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社)とプライマー(U898: GAAATACGCTACTACGGAAGAACC(配列番号10)とU899: CGTCATTTGCCTAATCTCATC(配列番号11)]を用いて構造遺伝子を、PCRを行い、遺伝子領域を取得した。さらにTOPOTAクローニングキットシークエンシング用を用いてクローニングした。さらにABI310を用いて塩基配列を決定した。その結果、今回分譲を受けた10株の中に変異遺伝子を持つ系統は存在しないことがわかった。しかし、十分な変異処理を施した植物に対し、この操作を繰り返すことで変異遺伝子を持つ植物を獲得することは可能である。
Claims (15)
- 以下の(a)または(b)のタンパク質:
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(b) 配列番号1に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。 - 以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子;
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA;
(d) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(e) 配列番号2に示す塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(f) 配列番号2に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。 - 以下の(g)又は(h)のタンパク質:
(g) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(h) 配列番号3に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。 - 以下の(i)〜(l)のいずれかのDNAからなる遺伝子:
(i) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA;
(j) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(k) 配列番号4に示す塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、
グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(l) 配列番号4に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。 - 請求項2または4に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
- 植物体である請求項6記載の形質転換体。
- (i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号2、配列番号4または配列番号5に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異および/または多型の存在を決定する工程、
とを含む、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および/または多型の存在を検出する方法。 - 植物がナス科植物である請求項8に記載の方法。
- 請求項8または9に記載の方法によってグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および/または多型を検出し、突然変異および/または多型を有する植物体を選抜する方法。
- 請求項10に記載の方法により選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異および/または多型を有する植物体。
- ナス科植物である請求項11記載の植物体。
- グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするグリコアルカロイド生合成酵素の活性が、既存品種に対して変化している植物を選抜する、請求項8または9に記載の植物体を選抜する方法。
- 請求項13に記載の方法によって選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能が既存品種に対して変化しているか、またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して変化している植物体。
- ナス科植物である請求項14記載の植物体。
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